口用组合物的制作方法

本发明涉及一种组合物，其包含含量不足以提供抗菌效果的抗菌剂、非常低浓度的生理上可接受的二价金属离子和生理上可接受的聚合物，用于预防和/或治疗口臭、呼吸异味、口干或咽喉肿痛。

发明背景

口臭，是带有令人不愉快气味的呼吸，这种气味可能周期性冲击或者是持续性的，取决于原因。口臭主要是由一些在口腔内形成天然菌落的细菌引起，特别是位于舌头后部的隐窝内和牙周袋中的细菌引起。所述细菌通过厌氧代谢产生挥发性硫化物，其主要是硫化氢和甲硫醇，它们产生令人不快的气味。

本领域公知，锌离子具有一些抗菌活性，并在一定程度上可减少口腔中挥发性硫化物的产生。已经建议并研究了抗菌剂，诸如氯己定、氯化十六烷吡啶以及壳聚糖来减少挥发性硫化物的产生，从而消除令人不快的气味，这些已经被公开如下：

Young等人(Eur J Oral Sci 2003；111:400-404)公开了通过锌、氯己定或氯化十六吡啶抑制口腔产生的挥发性硫化物，以及与浓度相关的作用。

Roldan等人(J Clin Periodontol 2004；31:1128-1134)公开了不同氯己定漱口剂对挥发性硫化物和唾液细菌计数的对比效果。

Verkaik等人(J Dentistry 2011；39:218-224)公开了天然抗微生物剂在牙膏配方中对抗口腔生物膜的体外功效。

第307168号公开了锌离子的抗挥发性硫化物的作用主要是对抗硫化氢产生，而对于抗甲硫醇的产生作用很小，这解释了不能完全消除口臭的原因。然而，当将锌离子和低浓度的某些阳离子抗菌剂组合时，则以协同作用联合抑制了硫化氢和甲硫醇两者的形成。

口腔中的微生物菌群是精细调节的保护性系统，在免疫系统以及降解我们吃进去的营养物中起到重要作用，并进一步负责保持消化系统的平衡。由于抗菌剂的抗菌活性导致的这种精密系统的变化可以导致真菌生长，口疮、腹泻等。所述药剂还可以引起牙齿污染。

在导致本发明的研究中，本发明人出人意料地发现通过将量不足以提供抗细菌效果的抗菌剂与非常低浓度的生理上可接受的二价金属离子和生理上可接受的聚合物组合，这种组合可以以协同方式减少硫化物气体，同时对口腔内微生物菌群没有任何干扰。该组合物显示了可以预防和/或治疗口臭、呼吸异味、口干或咽喉肿痛。

已经有推荐锌锭剂可用于治疗感冒(Eby III等人Medical Hypotheses 2010；74:482-92)。这仍然存在争议，用于该目的的锌的浓度比用于本发明组合物中的锌浓度要高得多，且可能是通过抗细菌和/或抗病毒作用实现的。因此，非常令人吃惊和出人意料的是，即使没有呈现明显的抗菌效果，但本发明已经被证明了能够有效地对抗咽喉肿痛。这其中的机制尚未明了。

因此相信，本发明在预防和/或治疗口臭、呼吸异味、口干或咽喉肿痛方面将是更安全和更有效的组合物。

附图简述

图1：示出了对照的硫化氢百分含量。

该对照是在用半胱氨酸冲洗后在气相色谱法中测定的硫化氢的含量。

单独使用浓度为0.0049％的氯己定的结果显示，在1小时后硫化氢气体下降12％，2小时后下降8％，3小时后下降7％。

浓度为0.0049％的氯己定组合浓度为0.049％的Zn²⁺的结果显示，1小时后硫化氢气体减少39％，2小时后减少26％，3小时后减少17％。

浓度为0.0049％的氯己定组合浓度为0.049％的Zn²⁺和0.1％的壳聚糖的结果显示，在1小时后硫化氢气体下降58％，2小时后下降41％，3小时后下降32％。

图2：示出了全唾液的需氧培养和厌氧培养

i)在孔中用20μl溶液A(0.0049％CHX+0.049％Zn²⁺+0.1％的壳聚糖壳聚糖)进行全唾液的需氧培养显示没有抑制；

ii)在孔中用20μl溶液A进行全唾液的厌氧培养，显示没有抑制；

iii)在孔中用20μl溶液B(0.025％CHX+0.3％Zn²⁺)进行厌氧菌培养显示10mm的抑菌圈。

发明详述

本发明的目的是提供一种组合物，其显示对引起口臭、呼吸异味、口干或咽喉肿痛的挥发性硫化物气体具有最大抑制效果，而对正常口腔菌群抑制作用最小。本发明因此提供了一种组合物，其包含含量不足以提供抗菌效果的抗菌剂、非常低浓度的生理上可接受的二价金属离子和生理上可接受的聚合物，用于预防和/或治疗口臭、呼吸异味、口干或咽喉肿痛。

目前，在口腔组合物中使用抗菌剂诸如双胍类和季胺类化合物，以提供抗菌效果。

本发明人出人意料地发现通过将量不足以提供抗细菌效果的抗菌剂、非常低浓度的生理上可接受的二价金属离子和生理上可接受的聚合物组合，这种组合能够减少口腔中硫化物气体和预防和/或治疗口臭、呼吸异味、口干或咽喉肿痛。

进一步出人意料地发现在微酸性条件下，壳聚糖与锌和氯己定以非常低的浓度一起起到了协同作用。

壳聚糖是一种多糖，衍生自几丁质的脱乙酰，所述几丁质是天然存在的聚合物，是仅次于纤维素的天然第二大丰富的聚合物。已经显示壳聚糖是生物相容的和生物可降解的，具有一些抗菌作用，尽管其准确的抗菌机制尚不知晓。然而，壳聚糖具有强烈的生物黏附特性，结合于带负电荷的表面和结构。

在本发明一个实施方式中，没有显示抗菌效果，因此，本发明组合物中壳聚糖或其衍生物的作用据信是通过结合到抗菌剂，例如氯己定来增强所述效果，将其靠近形成挥发性硫化物组合物的荷负电表面上的细菌，并连接抗菌剂，例如氯己定到锌，以发挥它的据信是切断SH键的作用。

壳聚糖对于锌的作用据信是壳聚糖结合到粘膜和荷负电的牙齿表面，从而延长了锌在口腔中的存留时间和作用。

在实施例1中，测试了包含如下组合的三种不同组合物:

-组合物1；氯己定，浓度为0.0049％重量。

-组合物2:浓度为0.0049％重量的氯己定组合浓度为0.049％重量的Zn²⁺。

-组合物3：浓度为0.0049％重量的氯己定组合浓度为0.049％重量的Zn²⁺和浓度为0.1％重量的壳聚糖。

如从实施例1和图1中可以看出的，清楚地显示组合物3在减少挥发性硫化物方面最有效。获得了1个小时后下降58％，2小时后下降41％，3小时后下降32％的结果。与溶液2相比，作用分别增加19％、15％和15％。与溶液1相比，作用上差别分别为46％、33％和25％。

与组合物1和2相比，如上组合物3所述的氯己定、Zn²⁺和壳聚糖的组合显示了协同作用。在实施例2中还进一步显示，实施例1中包含浓度为0.0049％的氯己定组合浓度为0.049％的Zn²⁺和浓度为0.1％的壳聚糖的组合物3，其浓度不足以显示抗菌效果，对口腔内菌群没有任何影响。

在实施例1中，作为抗菌剂已经测试氯己定，但也可以使用选自双胍类和季胺类化合物的任何其他试剂或其盐，或其任意组合。

可以选择Cu或Sn替代Zn来作为生理上可接受的二价金属离子。所述金属离子可以以盐、螯合物或其任意混合物的形式存在。

本发明组合物中也可以使用生理上可接受的聚合物，如壳聚糖以外的其他多糖或多糖衍生物。

可以单独使用或与生理上可接受的聚合物组合使用具有pKa范围在2-6，并选自苯甲酸、甘氨酸或其任何混合物的生理上可接受的有机酸。

组合物的pH可以在大约2.5-9.0，优选大约2.5-大约6.5范围。

组合物可以进一步包括至少一种氟化物源。所述至少一种氟化物源可以以大约0.005％-2.5％重量的量存在于组合物中。所述至少一种氟化物源可以是可溶性无机氟化物盐、可溶性有机氟化物盐、HF或其任意混合物。

在实施例2中，测试了溶液A和B的提供抗微生物作用的能力。将来自口腔的微生物培养于陪替式培养皿中，并接受：

溶液A包含：氯己定(0.0049％重量)、Zn²⁺(0.049％重量)和壳聚糖(0.1％重量)；和

溶液B包含：氯己定(0.025％重量)和Zn²⁺(0.3％重量)。

表1和图2i)和ii)所示的测试结果显示，包含氯己定(0.0049％重量)、Zn²⁺(0.049％重量)和壳聚糖(0.1％重量)的溶液A没有抑制微生物生长，除了两个真菌菌株：白色念珠菌(C.albicans)和假丝酵母(C.parapsil)。然而，所述真菌不涉及硫化物气体的生产。

如可以从表1和图2iii)中看出的，包含氯己定(0.025％重量)和Zn²⁺(0.3％重量)的溶液B抑制生长。

因此，本发明组合物的技术效果可以被描述成通过中和(neutralizing)气体来减少硫化物气体。这背后的机制据信是抗菌剂切断了硫化物气体的S-H键；Zn以及可能还有壳聚糖将硫沉淀为硫化物，硫化物被吞咽并随后被排泄。由于抗菌剂的低浓度，因此，口腔中的细菌/微生物菌群保持完好无损。

在实施例3中，显示本发明的组合物还对咽喉肿痛具有作用，因为受试者在第一次冲洗后数小时后感觉到不适缓解。这背后的机制尚不清楚。

因此，本发明一个方面涉及包含抗菌剂、生理上可接受的二价金属离子和生理上可接受的聚合物的组合物，所述抗菌剂可选自双胍类和季胺类化合物或其组合；所述生理上可接受的二价金属离子可选自Zn，Cu和Sn。

本文中所用的“抗菌剂”是指杀灭或抑制微生物生长的药剂。

在组合物进一步的实施方式中，所述抗菌剂可以是氯己定或其盐。所述组合物中氯己定的存在量可以是0.001％-1％，优选0.002-0.5％，更优选0.004-0.01重量。

在组合物进一步的实施方式中，所述抗菌剂可以以不足以有效杀灭或抑制口腔中细菌的生长的量存在于所述组合物中。

本文所用的“不足以提供抗菌效果的量”指的是一种药剂的浓度或剂量不能杀灭或不能抑制微生物的生长。

在所述组合物的一个或多个实施方式中，所述二价金属离子的生理上可接受的盐和/或二价金属离子螯合物在组合物中的存在量可以为0.01％-0.5％重量，或0.01％-0.049％重量，或0.01％-0.04％重量。

在所述组合物的一个或多个实施方式中，所述二价金属离子的生理上可接受的盐和/或二价金属离子螯合物的存在量可以为0.01％-0.19％重量，或0.01％-0.15％重量。进一步的，所述生理上可接受的二价金属离子可以以盐、螯合物或其任意混合物的形式存在。

在所述组合物的一个或多个实施方式中，所述生理上可接受的聚合物在组合物中的存在量可以为0.1％-2％重量，且可进一步为包封的形式、微粒形式或纳米粒形式，或它们的任意混合物。所述生理上可接受的聚合物可进一步为包封的形式，其中聚合物可以包封在pH为3-7的水溶液中。此外，生理上可接受的聚合物可以为多糖或多糖衍生物。所述生理上可接受的聚合物可以为壳聚糖或壳聚糖衍生物。所述壳聚糖或壳聚糖衍生物可以以不足以提供抗菌效果的量存在于所述组合物中。

在所述组合物的一个实施方式中，所述组合物可以为水溶液或凝胶形式。

在组合物的一个实施方式中，所述组合物可以具有大约2.5-6.5的pH。

在所述组合物的一个实施方式中，所述抗菌剂可选自双胍类和季胺类化合物，或它们的任意组合，且可以重量比0.001％-1％的量存在于所述组合物中；所述生理上可接受的二价金属离子可以是Zn、Cu或Sn，且可以以重量比0.01％-0.5％的量存在于所述组合物中；以及所述生理上可接受的聚合物可以是多糖或多糖衍生物，且可以以重量比0.1％-2％的量存在于所述组合物中。

在一个进一步的实施方式中，所述生理上可接受的聚合物可以是壳聚糖或壳聚糖衍生物，其可以以0.1％-2％的量存在于所述组合物中。

在一个实施方式中，所述组合物用于预防和/或治疗口臭。

在一个实施方式中，所述组合物用于预防和/或治疗呼吸异味。

在一个实施方式中，所述组合物用于预防和/或治疗口干。

在一个实施方式中，所述组合物用于预防和/或治疗咽喉肿痛。

在一个实施方式中，所述组合物用于预防和/或治疗由病毒感染或细菌感染引起的咽喉肿痛。

在一个实施方式中，所述组合物可以被保持在口腔中大约10-120秒，然后再从口中吐掉。

在一个实施方式中，可以用所述组合物漱口大约10-120秒然后再吐掉。

为了清楚理解的目的，已经通过说明和举例的方式对本发明的一些细节进行了完全描述。对于本领域技术人员显而易见的是，通过在宽的和等同范围的条件、配方和其他参数下，可以通过修饰或改变来实施相同的本发明，并且这些修饰或改变也包括在本发明所附权利要求的范围内。

具体实施方式

实施例1

测定受试者中口腔异味(H₂S)

该实验中待测组合物是：

组合物1：浓度为0.0049％的氯己定。

组合物2：浓度为0.0049％的氯己定组合浓度为0.049％的Zn²⁺。

组合物3：浓度为0.0049％的氯己定组合浓度为0.049％的Zn²⁺和浓度为0.1％的壳聚糖。

测试当天，告诉受试者(三名受试者)早饭后不进行他们通常的口腔卫生程序。通过用5ml的6mM的L-半胱氨酸溶液(pH 7.2)冲洗受试者口腔30秒来引入口中异味。然后让受试者闭住嘴巴1分30秒，之后通过使用连接到气相色谱法的自动进样出口的10ml注射器抽吸口腔气体来记录基线口腔气体样本。然后直接测量挥发性硫化物H₂S。该程序之后立即用三种测试溶液(组合物1-3)之一10ml冲洗受试者1分钟，然后将溶液吐出。在用相应溶液冲洗后的1h、2h和3h重复半胱氨酸冲洗和口腔气体分析。在测试期间不允许喝饮料和抽烟。

结果

从图1可以看出结果，清楚显示包含浓度为0.0049％的氯己定组合浓度为0.049％的Zn²⁺和浓度为0.1％的壳聚糖的溶液在减少挥发性硫化物方面最有效，其获得了在1小时后减少58％，2小时后减少41％，3小时后减少32％的结果，与包含氯己定组合Zn²⁺的溶液相比，分别提高19％、15％和15％。与仅仅包含氯己定的溶液相比，作用的百分比差异分别是46％、33％和25％。

实施例2

由CHX(0.0049％)和Zn²⁺(0.049％)和壳聚糖(0.1％)构成的溶液(A)与由CHX(0.025％)和Zn²⁺(0.3％)构成的溶液(B)的生物溶液测试比较

来自口腔的微生物在陪替式培养皿上培养，并接受：

溶液A：CHX(0.0049％重量)和Zn²⁺(0.049％重量)和壳聚糖(0.1％重量)，和

溶液B：CHX(0.025％重量)和Zn²⁺(0.3％重量)，和

分别分配在培养皿中间的孔中。可以根据围绕孔的抑菌圈测定抑制活性(见图2iii)。测试结果示于表1。

表1

Ad.2和8.0.5ml未刺激的全唾液样本收集在无菌量度试管中。在实验室中，分散样本(涡旋60秒)，系列稀释并接种在添加有5％绵羊血、0.0005％血晶素和0.00003％甲萘醌的胰蛋白胨-大豆琼脂(BBL Microbiological Systems，Cockeysville，MD，USA)上。

每个琼脂在中央包含标准化孔，其中充满了溶液A或B。

·将20μl溶液A(0.049％CHX+0.049％Zn²⁺+0.1％壳聚糖)施加到孔中。

·将20ml溶液B(0.025％CHX+0.3％Zn²⁺)施加到孔中。

然后将它们都按如下进行温育：

Ad.3.厌氧温育：在37℃厌氧室(90％N₂，5％H₂，5％CO₂)(Anoxomat，WS9000；Mart；Lichtenvoorde，The Netherlands)7-14天。

Ad.8.需氧温育:37℃需氧温育24-48h。

其余的按照如下在选择性介质上培养：

Ad 1.链球菌突变体，如上在轻唾琼脂培养板(Mitis-salivarius-bacitracin agar plates)上厌氧培养3天。链球菌突变体鉴定为小的黏液状菌落。

Ad 2.在37℃空气中，于伊红美蓝琼脂(EMB琼脂)上培养大肠杆菌3天。集落具有黑色中心和绿色金属光泽。

Ad.4.在37℃空气中，于头孢氨曲南糖琼脂(CAA)上培养粪肠球菌3天(Ford等1994)。

Ad 5.在37℃空气中，将金黄色葡萄球菌在葡萄球菌琼脂板上温育3天，并通过它们在DNA琼脂板(Difco)上降解DNA的能力来与表皮葡萄球菌区别。

Ad.6.在37℃空气中，在Sabouraud T琼脂板上培养白色念珠菌3天。它们为无光泽的、乳状白粉，或粉红色菌落。

Ad 7.在37℃空气中，在沙氏葡萄糖琼脂上培养假丝酵母3天。

Ad.9.在胰蛋白胨-大豆-血清-杆菌肽-万古霉素(TSBV)培养基上厌氧温育伴放线菌聚集菌(如上所述)3-5天，用于选择性分离伴放线菌聚集菌(Slots 1982)。

结果

表1和图2i)(需氧培养)和ii)(厌氧培养)的测试结果显示，包含氯己定(0.0049％重量)和Zn²⁺(0.049％重量)和壳聚糖(0.1％重量)的溶液A没有抑制微生物生长，除了两个真菌菌株；白色念珠菌和假丝酵母。然而，所述真菌不涉及产生硫化物气体。

可以从表1和图2iii)看出包含氯己定(0.025％重量)和Zn²⁺(0.3％重量)的溶液B抑制生长，测试为抑菌圈的延伸，以mm计。

实施例3

用本发明组合物冲洗口腔/咽喉对咽喉肿痛具有积极效果。

5名患有咽喉肿痛的受试者用包含本发明组合物的溶液冲洗/漱口他们的口腔/咽喉1分钟，一天两次(在早上和晚上)。冲洗/漱口后吐出所述溶液。

所述溶液包含：

浓度为0.0049％的氯己定组合

浓度为0.049％的Zn²⁺和

浓度为0.1％壳聚糖。

受试者1患有咽喉肿痛2天

受试者2患有咽喉肿痛1天

受试者3患有咽喉肿痛2天

受试者4患有咽喉肿痛3天

受试者4患有咽喉肿痛1天

结果

在一天漱口两次的两天时间内，所有受试者咽喉肿痛的所有症状均消失。