本公开涉及制药领域，更具体而言涉及一种含人血清白蛋白与疏水性药物的纳米粒子及其制备方法，特别是涉及特定物理属性药物的白蛋白纳米粒子及其制备方法。
背景技术：
：紫杉醇作为一种抗癌药物，属有丝分裂的微管抑制剂，其具有聚合和稳定细胞内微管的作用。有丝分裂阶段，紫杉醇使微管不能分开，从而将细胞阻断于细胞周期G2与M期。因此，紫杉醇致使快速分裂的肿瘤细胞被固定在有丝分裂阶段，使细胞复制受阻断而死亡。紫杉醇对多种癌症(例如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌等)具有重要的临床活性。然而，由于水溶性较差，紫杉醇在人体的用药上遇到了困境。为了使紫杉醇适宜静脉内注射，百时美施贵宝(Bristol-MyersSquibb，BMS)开发了在其中表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油(EL)和无水乙醇共同作为溶剂以增大紫杉醇的溶解度。泰素对卵巢癌、乳腺癌、肺癌、食管癌和头颈癌具有显著活性。然而，已经显示出泰素能够诱导与给药有关的毒性，以及显著的急性和累积毒性，如骨髓抑制、中性粒细胞减少性发热、过敏反应等。这些副作用与所用的表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油有关(Anantbhushan等人，AsiaPacJClinOncol.2013；9：176-181)。根据临床研究报告及上市后安全性资料，泰素过敏反应的总体发生率约为39％。目前在使用泰素时，需预先给与患者抗组胺药和类固醇类激素以减弱表面活性剂引起的副作用。也有研究人员为了改进紫杉醇的水溶解度，使用能够赋予较高水溶解度的官能团对其结构进行修饰，例如磺化衍生物(Kingstonetal.，U.S.Patent5059699(1991))和氨基酸酯衍生物(Mathewetal.，J.Med.Chem.35：145-151(1992))显示出明显的生物活性。然而，这种修饰会增加药物制剂成本，并且可能诱发不需要的副反应或降低药物疗效。为了避免上述紫杉醇药物制剂使用中EL的各种不利影响，人们开发了不含有乳化剂或增溶剂的药物传送体系。在这一药物输送体系中，紫杉醇能够以微米颗粒或纳米颗粒输送。然而这一体系仍有许多缺陷。例如需要大量使用可能引起过敏的人血清白蛋白(HSA)。HSA的来源仍是人类的血液，由于血液采集、储存等过程中可能存在污染，使得血液制品的安全性存在隐患。另外，HSA价格高昂并且在某些地区仍然短缺。发明概述本发明提供了纯化的治疗性纳米粒子，其组合物，制备该纳米粒子或组合物的方法以及使用该纳米粒子或组合物的方法。一方面，本发明提供了由活性成分和人血清白蛋白组成的纯化的治疗性纳米粒子，其中人血清白蛋白和活性成分的重量比选自0.01∶1、0.02∶1、0.04∶1、0.05∶1、0.06∶1、0.07∶1、0.08∶1、0.09∶1、0.10∶1、0.11∶1、0.12∶1、0.13∶1、0.14∶1、0.15∶1、0.16∶1、0.17∶1、0.18∶1、0.19∶1、0.2∶1、0.21∶1、0.22∶1、0.23∶1、0.24∶1、0.25∶1、0.26∶1、0.27∶1、0.28∶1、0.29∶1、0.3∶1、0.31∶1、0.32∶1、0.33∶∶、0.34∶1、0.35∶1、0.36∶1、0.37∶1、0.38∶1、0.39∶1、0.4∶1、0.41∶1、0.42∶1、0.43∶1、0.44∶1、0.45∶1、0.46∶1、0.47∶1、0.48∶1、0.49∶1、0.5∶1、0.51∶1、0.52∶1、0.53∶1、0.54∶1、0.55∶1、0.56∶1、0.57∶∶、0.58∶1、0.59∶1、0.6∶1、0.65∶1、0.70∶1、0.75∶1、0.8∶1、0.85∶1、0.9∶1、0.95∶1、1∶∶、1.5∶∶、2∶∶、2.5∶∶、3∶∶、3.5∶∶、4∶∶、4.5∶1、5∶1、5.5∶1、6∶1、6.5∶1、7∶1、7.5∶1、8∶1、8.5∶1或上述任意两个比例之间的范围，其中治疗性纳米粒子基本不含有未包含于纳米粒子中的游离的HSA。在一些具体的实施方式中，人血清白蛋白和活性成分的重量比选自0.03∶1、0.04∶1、0.05∶1、0.06∶1、0.07∶1、0.08∶1、0.09∶1、0.10∶1、0.11∶1、0.12∶1、0.13∶1、0.14∶1、0.15∶1、0.16∶1、0.17∶1、0.18∶1、0.19∶1、0.2∶1、0.21∶1、0.22∶1、0.23∶1、0.24∶1、0.25∶1、0.26∶1、0.27∶1、0.28∶1、0.29∶1、0.3∶1、0.31∶1、0.32∶1、0.33∶1、0.34∶1、0.35∶1、0.36∶1、0.37∶1、0.38∶1、0.39∶1、0.4∶1、0.41∶1、0.42∶1、0.43∶1、0.44∶1、0.45∶1、0.46∶1、0.47∶1、0.48∶1、0.49∶1、0.5∶1、0.6∶1、0.7∶1、0.8∶1、0.9∶1或上述任意两个比例之间的范围。在一些具体的实施方式中，纳米粒子含有最多5％的游离HSA(以重量计)。在一些实施方式中，适于被包裹在人血清白蛋白中的活性成分应具有以下特性：水中不溶或微溶、在特定有机溶剂中可溶或易溶。在一些实施方式中，活性成分选自紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛、多西他赛亲脂衍生物等紫杉烷类、大环内酯类药物，其包括但不限于雷帕霉素及其衍生物、埃博霉素B及其衍生物，坦螺旋霉素及其衍生物等；喜树碱类药物，其包括但不限于10-羟基喜树碱、SN38及其衍生物等；蒽环类药物，其包括但不限于阿柔比星、吡柔比星等；以及其他活性成分包括秋水仙碱及其衍生物、硫代秋水仙碱二聚体、胺碘达隆、碘塞罗宁、环孢菌素、依西美坦、氟他胺、氟维司群、罗米地辛、司莫司汀、长春碱、布洛芬等等。在一些实施方式中，活性成分选自紫杉烷类，例如紫杉醇或多西他赛中的一种或多种，在另一些实施方式中，活性成分是多西他赛、雷帕霉素及其衍生物、依西美坦、氟他胺、氟维司群等。在一些实施方式中，有机溶剂是低水溶性、低沸点的纯溶剂或者其与小分子醇类的混合溶剂。在一些实施方式中，活性成分被包裹于人血清白蛋白内。在一些实施方式中，治疗性纳米粒子的平均粒径选自30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、165、170、175、180、185、190、195、200nm、或上述任意两个数值之间的范围。另一方面，本发明提供了一种含有活性成分和血清白蛋白的纯化的治疗性纳米粒子，活性成分被包裹在人血清白蛋白内；人血清白蛋白和紫杉醇的重量为0.03∶1到0.7∶1；治疗性纳米粒子的平均粒径为50nm到190nm；纳米粒子基本上不含有未包含于纳米粒子中的游离HSA。另一方面，本公开的一些实施方式提供了一种药物组合物，其含有根据本公开的纯化的治疗性纳米粒子，该组合物中基本不含有未包含于纳米粒子中的游离的HSA。在一些实施方式中，药物组合物为液体或冻干粉形式。在一些实施方式中，当药物组合物以冻干粉形式提供时，其含有一种或多种冻干赋形剂，选自甘露醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、右旋糖酐或其组合。在一些具体的实施方式中，组合物中含有最多5％的游离HSA(以重量计)。另一方面，本公开的一些实施方式提供了一种制备治疗性纳米粒子的方法，包括或由如下步骤组成：1)将活性成分溶解于有机溶剂中形成油相，将人血清白蛋白溶解于水中形成水相；2)将油相和水相形成水包油的乳剂；3)去除乳剂中的有机溶剂，得到含治疗性纳米粒子的混悬液；4)从混悬液中除去未包含于纳米粒子中的游离HSA，获得纯化的治疗性纳米粒子；在一些实施方式中，有机溶剂选自氯仿和乙醇中的一种或多种。在一些实施方式中，该方法进一步在步骤3)和4)之间还有一步使用水性溶液对步骤3)的混悬液的透析过程，以除去残留的有机溶剂。在一些实施方式中，水性溶液为水。在一些实施方式中，所述的分离步骤4)所用方法选自离心、透析、和排阻色谱。另一方面，本公开的一些实施方式还提供了一种制备包含治疗性纳米粒子的药物组合物的方法，包括或由如下步骤组成：1)将活性成分溶解于有机溶剂中形成油相，将人血清白蛋白溶解于水中形成水相；2)将油相和水相形成水包油的乳剂；3)去除乳剂中的有机溶剂，得到含治疗性纳米粒子的混悬液；4)去除游离的HSA获得纯化的治疗性纳米粒子；5)用含有可药用载体的溶液将纯化的治疗性纳米粒子重悬；6)任选地，当制备固体形式的药物组合物时，还包括冻干的步骤。在一些实施方式中，该方法进一步在步骤3)和4)之间还有一步使用水性溶液对步骤3)的混悬液的透析过程，以除去残留的有机溶剂。在一些实施方式中，水性溶液为水。另一方面，本发明提供了一种制备包含治疗性纳米粒子的药物组合物的方法，方法包括或由如下步骤组成：1)将活性成分溶解于有机溶剂中形成油相，将人血清白蛋白溶解于水中形成水相；2)将上述油相和水相形成水包油的乳剂；3)去除乳剂中的有机溶剂，得到含治疗性纳米粒子的混悬液；4)使用含有赋形剂的溶液对去除有机溶剂后得到的混悬液进行透析以去除未包含于纳米粒子中的游离的HSA；5)任选地，冻干透析后的混悬液，得到所述药物组合物。在一些实施方式中，该方法进一步在步骤3)和4)之间还有一步使用水性溶液对步骤3)的混悬液的透析过程，以除去残留的有机溶剂。在一些实施方式中，水性溶液为水。另一方面，本公开还提供了一种治疗癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的所述治疗性纳米粒子或所述药物组合物的步骤。另一方面，本公开还提供了一种含有治疗性纳米粒子的药物组合物，所述组合物进一步含有HSA作为冻干赋形剂。附图说明图1.实施例5的样品的电镜扫描照片。图2.从实施例5的样品制得的纳米粒子的电镜扫描照片。图3.紫杉醇的X衍射图谱。图4.白蛋白冻干粉的X衍射图谱。图5.对应于实施例2的紫杉醇白蛋白纳米粒子的X衍射图谱。图6.对应于实施例4的紫杉醇白蛋白纳米粒子的X衍射图谱。图7.对应于实施例6的紫杉醇白蛋白纳米粒子的X衍射图谱。图8.对应于实施例8的紫杉醇白蛋白纳米粒子的X衍射图谱。图9.不同制剂中纯化粒子的体外释放曲线。图10.纯化粒子与普通制剂体外释放曲线。图11.纯化粒子与普通制剂的犬药代动力学曲线。图12血清白蛋白含量影响药物对MCF-7细胞的抑制作用图13血清白蛋白含量影响药物对SPC-A-1细胞的抑制作用图14血清白蛋白含量影响血管内皮细胞EA.hy926对药物的摄取发明详述本发明提供了纯化的含有HSA治疗性纳米粒子，其组合物，以及制备和使用该纳米粒子或组合物的方法。含有所述纳米粒子的纯化的治疗性纳米粒子或其组合物具有一种或多种优势：(1)与已知的含有HSA的纳米粒子的组合物相比，纯化的治疗性纳米粒子或其组合物可以减少患者的过敏反应(见实施例25，27和61)。过敏反应的减少可能是由于纯化的纳米粒子或其组合物中HSA聚合物含量的减少。本发明发现在纳米粒的制备中，一部分HSA单体聚合形成了HSA聚合物，引起了更严重的过敏反应(见实施例32和60)。从初始的制剂中对纳米粒子进行纯化去除了多数游离的未与纳米粒结合的HSA(包括游离的HSA聚合物)。(2)与已知的含有HSA的纳米粒子的组合物相比，纯化的治疗性纳米粒子或其组合物更加稳定(见实施例62和63)。考虑到本发明中纯化的纳米粒子或组合物中HSA与活性成分的比例的显著降低，以及考虑到大量HSA对于稳定含有纳米粒子的组合物很重要或是必要这一理念，纯化的治疗性纳米粒子或其组合物更加稳定这一现象是出人意料的。(3)纯化的治疗性纳米粒子或其组合物保持了体外释放性质，最大的耐受剂量，药动学性质和动物研究的有效性(见实施例22和26到31)，纯化的治疗性纳米粒子或其组合物更容易被转运并被人类靶细胞所摄取(例如人肿瘤细胞和人血管内皮细胞)，而且在这些细胞中达到所需的更好的效果(见实施例58和59)。除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。尽管本发明所示的数字范围和参数近似值范围宽泛，但是具体实施例中所示的数值尽可能准确的进行记载。然而，任何数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自的测量中存在的标准偏差所致。另外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如记载的“1至10”的范围应认为包含最小值1和最大值10之间(包含端点)的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值1或更大起始的子范围，例如1至6.1，以及以最大值10或更小终止的子范围，例如5.5至10。另外，任何称为“并入本文”的参考文献应理解为以其整体并入。另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非清楚且明确的限于一个所指对象。术语“或”可与术语“和/或”互换使用，除非上下文另有清楚指明。本文使用的术语“纳米粒子”表示在至少一个维度(例如一个、两个或三个维度)上具有纳米级尺寸的粒子，例如约1nm、约10nm、约100nm级别的尺寸。本文使用的术语”约”表示大于或小于具体值的10％。例如，“约50nm”指45nm到55nm。本文使用的术语“治疗性纳米粒子”表示可用于治疗或预防疾病的纳米粒子，所述疾病例如癌症，优选肝癌、前列腺癌和肺癌。“人血白蛋白单体”或“HSA单体”：是指由585个氨基酸组成可溶的球蛋白，分子量约6.6万道尔顿，是人血浆中最丰富的蛋白质，在分子排阻色谱中最晚出峰，在正常人血白蛋白产品中占绝大多数。HSA具有多个疏水结合位点，可以结合一组不同的药物，特别是中性或带负电荷的疏水性化合物。“人血白蛋白聚合体”或“HSA聚合体”：在人血白蛋白中除单体外，所有的由白蛋白单体聚合而成的聚合物形式的总和，包括二聚体、三聚体、多聚体等，在分子排阻色谱中出峰较HSA单体出峰早，在正常人血白蛋白产品中所占比例较小(＜5％)。在迅速增长的肿瘤组织中，HSA通常作为氨基酸和能量来源被肿瘤细胞摄取，血管内皮细胞高表达gp60蛋白(albondin)，这种蛋白能够结合HSA，并能够通过转胞吞作用(transcytosis)将HSA转移到下层组织。但是这种蛋白在组织细胞中不表达，并不参与将HSA向组织细胞内的转运。SPARC蛋白(富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白)具有与gp60同源的序列，能够结合HSA以及gp60的抗体，这种蛋白在许多肿瘤组织高表达。许多研究表明SPARC蛋白与组织细胞摄取HSA有关。有研究认为，药物与HSA形成的纳米粒子也可以利用体内天然的gp60-SPARC跨膜转运通路，使HSA结合的药物通过跨细胞作用越过肿瘤血管内皮细胞屏障将其递送到肿瘤区。术语“基本纯的纳米粒子”或“纯化纳米粒子”指由人血白蛋白和活性成分形成的纳米粒子，其中只有小于10％(例如，小于9％，小于8％，小于7％，小于6％，小于5％，小于4％，小于3％，小于2％，小于1％，小于0.5％，或小于0.1％)的HSA为游离的HSA。类似地，“基本上不含游离人血清白蛋白”或“基本上不含游离HSA”是指游离的HSA少于10％(例如，小于9％，小于8％，小于7％，小于6％，小于5％，小于4％，小于3％，小于2％，小于1％，小于0.5％，或小于0.1％)。术语“游离的人血清白蛋白”或“游离的HSA”是指未与纳米粒子结合的HSA。纳米粒子或组合物中游离HSA的含量可以通过已知方法或本发明公开的方法(例如实施例11和17-19)进行测定。本文使用的术语“活性成分”表示药物活性成分。特别地，所述活性成分表示能够起到治疗作用(例如治疗、预防、缓解或抑制任何疾病和/或病症)的任何物质或实体其包括但不限于：化学治疗剂、放射治疗剂、免疫治疗剂、热治疗剂(thermallytherapeuticagent)等。例如氨鲁米特、硫唑嘌呤、硫酸博来霉素、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、环孢霉素、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、紫杉醇、依托泊苷、氟尿嘧啶、干扰素-α、洛莫司汀、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托坦、盐酸丙卡巴肼、硫鸟嘌呤、硫酸长春碱和硫酸长春新碱。术语“透析倍数”是指采用等体积透析过程中，料液的体积不发生变化，透析结束后所消耗透析液的体积与料液体积的比值。术语“冻干赋形剂”是指加入到含有纯化的治疗性纳米粒子的药物组合物中的物质，以便在冻干过程中保护纳米粒子。术语“治疗”或“疗法”是指用于病人的疾病、障碍或健康状况的临床方案(参见，例如，Stedman′sMedicalDictionary)，“治疗肿瘤”是指减少肿瘤症状的数目，降低一种或多种肿瘤症状的程度，或延缓肿瘤进程。一种特定治疗剂的“治疗有效量”是指足以减少肿瘤症状的数目，降低一种或多种肿瘤症状的程度，延缓肿瘤侵袭或复发，并具有统计学意义的治疗剂的剂量。一方面，本发明提供了一种纯化的治疗性纳米粒子，其包含活性成分和HSA。在一些实施方式中，治疗性纳米粒子中人血清白蛋白和活性成分的重量比选自0.01∶1、0.02∶1、0.04∶1、0.05∶1、0.06∶1、0.07∶1、0.08∶1、0.09∶1、0.10∶1、0.11∶1、0.12∶1、0.13∶1、0.14∶1、0.15∶1、0.16∶1、0.17∶1、0.18∶1、0.19∶1、0.2∶1、0.21∶1、0.22∶1、0.23∶1、0.24∶1、0.25∶1、0.26∶1、0.27∶1、0.28∶1、0.29∶1、0.3∶1、0.31∶1、0.32∶1、0.33∶1、0.34∶1、0.35∶1、0.36∶1、0.37∶1、0.38∶1、0.39∶1、0.4∶1、0.41∶1、0.42∶1、0.43∶∶、0.44∶1、0.45∶1、0.46∶1、0.47∶1、0.48∶1、0.49∶1、0.5∶1、0.51∶1、0.52∶1、0.53∶1、0.54∶1、0.55∶1、0.56∶1、0.57∶1、0.58∶1、0.59∶1、0.6∶1、0.65∶1、0.70∶1、0.75∶1、0.8∶1、0.85∶1、0.9∶1、0.95∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1、4∶1、4.5∶1、5∶1、5.5∶1、6∶1、6.5∶1、7∶1、7.5∶1、8∶1、8.5∶1或上述任意两个比例之间的范围。在一些具体的实施方式中，人血清白蛋白和活性成分的重量比选自0.03∶1、0.04∶1、0.05∶1、0.06∶1、0.07∶1、0.08∶1、0.09∶1、0.10∶1、0.11∶1、0.12∶1、0.13∶1、0.14∶1、0.15∶1、0.16∶1、0.17∶1、0.18∶1、0.19∶1、0.2∶1、0.21∶1、0.22∶1、0.23∶1、0.24∶1、0.25∶1、0.26∶1、0.27∶1、0.28∶1、0.29∶1、0.3∶1、0.31∶1、0.32∶1、0.33∶1、0.34∶1、0.35∶1、0.36∶1、0.37∶1、0.38∶1、0.39∶1、0.4∶1、0.41∶1、0.42∶1、0.43∶1、0.44∶1、0.45∶1、0.46∶1、0.47∶1、0.48∶1、0.49∶1、0.5∶1、0.6∶1、0.7∶1、0.8∶1、0.9∶1或上述任意两个比例之间的范围，例如0.03∶1至0.19∶1、0.21∶1至0.9∶1。更具体地，在一些具体的实施方式中，人血清白蛋白和活性成分的重量比是0.043∶1、0.071∶1、0.13∶1、0.15∶1、0.16∶1、0.17∶1、0.18∶1、0.24∶1或0.57∶1，或上述任意两个比例之间的范围，例如0.043∶1至0.071∶1、0.043∶1至0.13∶1、0.043∶1至、0.043∶1至0.15∶1、0.043∶1至0.16∶1、0.043∶1至0.17∶1、0.043∶1至0.18∶1、0.043∶1至0.24∶1、0.043∶1至0.57∶1、0.071∶1至0.13∶1、0.071∶1至0.15∶1、0.071∶1至0.16∶1、0.071∶1至0.17∶1、0.071∶1至0.18∶1、0.071∶1至0.24∶1、0.071∶1至0.57∶1、0.13∶1至0.15∶1、0.13∶1至0.16∶1、0.13∶1至0.17∶1、0.13∶1至0.18∶1、0.13∶1至0.24∶1、0.13∶1至0.57∶1、0.15∶1至0.16∶1、0.15∶1至0.17∶1、0.15∶1至0.18∶1、0.15∶1至0.24∶1、0.15∶1至0.57∶1、0.16∶1至0.17∶1、0.16∶1至0.18∶1、0.16∶1至0.24∶1、0.16∶1至0.57∶1、0.17∶1至0.18∶1、0.17∶1至0.24∶1、0.17∶1至0.57∶1、0.18∶1至0.24∶1、0.18∶1至0.57∶1或者0.24∶1至0.57∶1。在一些实施方式中，适于被包裹在人血清白蛋白中的活性成分应具有以下特性：水中不溶或微溶、在特定有机溶剂中可溶或易溶，其中特定有机溶剂为：水中溶解度低(例如水中溶解度小于6％)、沸点低(例如沸点低于80℃)的纯溶剂或者其与乙醇、叔丁醇、异丙醇等小分子醇类的混合溶剂，包括但不限于三氯甲烷、二氯甲烷等。尤其适用于本公开的活性成分是紫杉烷类药物，其包括但不限于紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛、多西他赛亲脂衍生物(例如，2’-乙酰基多西紫杉醇，2’-苯甲酰基多西紫杉醇)；大环内酯类药物，其包括但不限于雷帕霉素及其衍生物、埃博霉素B及其衍生物，坦螺旋霉素及其衍生物等；喜树碱类药物，其包括但不限于10-羟基喜树碱、SN38及其衍生物等；蒽环类药物，其包括但不限于阿柔比星、吡柔比星等；以及其他活性成分包括秋水仙碱及其衍生物、硫代秋水仙碱二聚体、胺碘达隆、碘塞罗宁、环孢菌素、依西美坦、氟他胺、氟维司群、罗米地辛、司莫司汀、长春碱、布洛芬等等。在一些实施方式中，活性成分选自紫杉醇和多西他赛中的一种或多种。在一些特定实施方式中，活性成分是紫杉醇。在另一些实施方式中，活性成分是多西他赛、雷帕霉素及其衍生物、依西美坦、氟他胺、氟维司群等。在一些具体实施方式中，活性成分包括但不限于化学治疗药物，放射治疗药物，免疫治疗药物，和热疗药物。例如，氨鲁米特，咪唑巯嘌呤，博来霉素，卡氯芥，瘤可宁，顺铂，环磷酰胺，环孢霉素，氮烯唑胺，放线菌素D，正定霉素，阿霉素，紫杉醇，依托泊苷，氟尿嘧啶，干扰素-α，环己亚硝脲，巯基嘌呤，甲氨蝶呤，米托坦，盐酸甲基苄肼，硫鸟嘌呤，硫酸长春碱和硫酸醛基长春碱。在一些实施方式中，治疗性纳米粒子的平均粒径选自30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、165、170、175、180、185、190、195、200nm，或上述任意两个数值之间的范围。技术人员理解，可以使用任何现有的或未来适当方法测量粒子的粒径，包括但不限于沉降法、筛分法、显微镜观察、或激光粒度测量仪。还应当理解的是，当本公开的治疗性纳米粒子是多个时，并非每一个治疗性纳米粒子的粒径都是一致的，只要其平均粒径满足上述限定，也包含在本公开所涵盖的范围内。在一些具体的实施方式中，粒径是采用激光粒度测定仪确定的；治疗性纳米粒子的平均粒径在选自50、60、70、80、90、100、110、120、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160nm或上述任意两个数值之间的范围。在一些实施方式中，治疗性纳米粒子的平均粒径在一个更具体的范围，例如30nm到200nm，优选50到190nm。更优选的是纳米粒子的粒径基本一致。在一个具体的实施方式中，提供了一种纯化的治疗性纳米粒子，其包含紫杉醇和人血清白蛋白，紫杉醇包裹在人血清白蛋白内；人血清白蛋白和紫杉醇的重量为0.043∶1，治疗性纳米粒子的平均粒径为140nm。在另一个具体的实施方式中，提供了一种纯化的治疗性纳米粒子，其包含紫杉醇和人血清白蛋白，紫杉醇包裹在人血清白蛋白内；人血清白蛋白和紫杉醇的重量为0.071∶1，治疗性纳米粒子的平均粒径为134nm。在另一个具体的实施方式中，提供了一种纯化的治疗性纳米粒子，其包含紫杉醇和人血清白蛋白，紫杉醇包裹在人血清白蛋白内；人血清白蛋白和紫杉醇的重量为0.13∶1，治疗性纳米粒子的平均粒径为125nm。在另一个具体的实施方式中，提供了一种纯化的治疗性纳米粒子，其包含紫杉醇和人血清白蛋白，紫杉醇包裹在人血清白蛋白内；人血清白蛋白和紫杉醇的重量为0.15∶1，治疗性纳米粒子的平均粒径为136nm。在另一个具体的实施方式中，提供了一种纯化的治疗性纳米粒子，其包含紫杉醇和人血清白蛋白，紫杉醇包裹在人血清白蛋白内；人血清白蛋白和紫杉醇的重量为0.16∶1，治疗性纳米粒子的平均粒径为133nm。在另一个具体的实施方式中，提供了一种纯化的治疗性纳米粒子，其包含紫杉醇和人血清白蛋白，紫杉醇包裹在人血清白蛋白内；人血清白蛋白和紫杉醇的重量为0.17∶1，治疗性纳米粒子的平均粒径为136nm。在另一个具体的实施方式中，提供了一种纯化的治疗性纳米粒子，其包含紫杉醇和人血清白蛋白，紫杉醇包裹在人血清白蛋白内；人血清白蛋白和紫杉醇的重量为0.18∶1，治疗性纳米粒子的平均粒径为138nm。在另一个具体的实施方式中，提供了一种纯化的治疗性纳米粒子，其包含紫杉醇和人血清白蛋白，紫杉醇包裹在人血清白蛋白内；人血清白蛋白和紫杉醇的重量为0.24∶1，治疗性纳米粒子的平均粒径为141nm。在另一个具体的实施方式中，提供了一种纯化的治疗性纳米粒子，其包含紫杉醇和人血清白蛋白，紫杉醇包裹在人血清白蛋白内；人血清白蛋白和紫杉醇的重量为0.57∶1，治疗性纳米粒子的平均粒径为145nm。在另一个具体的实施方式中，提供了一种纯化的治疗性纳米粒子，其包含多西他赛和人血清白蛋白，多西他赛包裹在人血清白蛋白内；人血清白蛋白和多西他赛的重量为0.1∶1，治疗性纳米粒子的粒径在110至150nm范围内。本发明的纯化的治疗性纳米粒子基本上不包含游离的人血清白蛋白。在一些具体实施方式中，纯化的治疗性纳米粒子含有最多以重量计占到总的HSA的8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％或0.1％的游离HSA(例如纯化的治疗性纳米粒子中总HSA中最多8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％或0.1％的游离HSA是游离的HSA，其中游离的HSA指未与活性成分结合或未与纳米粒结合的HSA)。在一些实施方式中，纯化的治疗性纳米粒子基本上由活性成分和HSA组成，其中基本上所有的HSA(例如，大于90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或99.9％的HSA)均与活性成分相结合。在一些实施方式中，纯化的治疗性纳米粒子含有最少量的(例如小于0.05，0.04，0.03，0.02，or0.01mg/ml，或小于5，1，0.5，0.1，0.05，或0.01μg/ml)一种或多种在制备所述纳米粒子中所用的有机溶剂。在一些实施方式中，纯化的治疗性纳米粒子不含有任何表面活性剂。在一些实施方式中，本发明的纯化的纳米粒子具有较高的zeta电位，例如-20到-45或-25到-40。另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有根据本公开的纯化的治疗性纳米粒子，并且基本不含有游离的HSA。在一些实施方式中，药物组合物中的游离HSA含量小于10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，或0.1％。在一些实施方式中，以液体形式提供药物组合物，包括但不限于适于向受试者注射施用的形式。在一个具体的实施方式中，药物组合物制备成注射液。在另一些实施方式中，以固体的形式提供药物组合物，包括但不限于干粉或冻干粉。在某些具体实施方式中，本发明的纳米粒子或者药物组合物不含去铁胺或其盐，例如去铁胺甲磺酸盐。在某些具体实施方案中，本发明的纯化的纳米粒子或者药物组合物不含额外的稳定剂。当药物组合物以液体形式提供时，药物组合物包含本公开的治疗性纳米粒子和可药用载体。治疗性纳米粒子悬浮于可药用载体中。可药用载体包括但不限于缓冲液、防腐剂、注射用水、生理盐水、等渗溶液。在一些具体的实施方式中，治疗性纳米粒子在液体形式的药物组合物中的浓度为1-10mg/ml，例如5mg/ml。当药物组合物以固体形式提供时，药物组合物包含或由如下组成：本公开的治疗性纳米粒子和冻干赋形剂。在一些具体的实施方式中，冻干赋形剂选自甘露醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、右旋糖酐中的一种或多种。在某些具体的实施方式中，治疗性纳米粒子悬浮于5％至10％的冻干赋形剂溶液中，然后经冻干制备成冻干粉形式的药物组合物。在具体的实施方式中，冻干赋形剂溶液选自5％甘露醇溶液、10％蔗糖溶液、5％右旋糖酐溶液、10％乳糖溶液、10％海藻糖溶液、10％麦芽糖溶液中的一种或多种。在一些具体的实施方式中，治疗性纳米粒子在固体形式的药物组合物中的含量为按重量计4.8％-10％。本发明还提供了制备本发明的纯化的治疗性纳米粒子的方法，其包括：(1)通过将活性成分与人血清白蛋白相接触制备含治疗性纳米粒子的混悬液，和(2)纯化上述混悬液得到基本上纯的治疗性纳米粒子。另一方面，本发明还提供了由本发明的方法制得的治疗性纳米粒子。另一方面，本公开的一些实施方式提供了一种制备治疗性纳米粒子的方法，包括如下步骤：1)将活性成分溶解于有机溶剂中形成油相，将人血清白蛋白溶解于水中形成水相；2)将油相和水相形成水包油的乳剂；3)去除乳剂中的有机溶剂，得到含治疗性纳米粒子的混悬液；4)从混悬液中除去未与纳米粒结合的游离HSA，获得纯化的治疗性纳米粒子。技术人员能够根据活性成分的性质选择适当的有机溶剂。在一些具体的实施方式中，当活性成分是紫杉烷类药物时，可用的有机溶剂选自氯仿和乙醇中的一种或多种。更具体而言，当活性成分是紫杉醇或多西他赛时，可用的有机溶剂是氯仿和乙醇的混合体系。在一些具体的实施方式中，氯仿和乙醇的体积比在1∶1至20∶1范围内；例如选自1∶1、4∶1、9∶1和11∶1。在一些具体的实施方式中，人血清白蛋白在水相中的浓度在2％至10％w/v范围内；例如选自2％、4％、5％和10％。在一些实施方式中，油相中的活性成分与有机溶剂的比例在0.3-7.5g/15-20ml范围之间。在一些具体的实施方式中，油相中的活性成分与有机溶剂的比例选自：0.3g/15ml、0.6g/15ml、1g/20ml、1.25g/15ml、1.8g/15ml、2g/15ml、2.5g/15ml、3g/20ml、3g/15ml、5g/15ml、7.5g/15ml、或上述任意两个数值之间的范围。当油相和水相形成水包油的乳剂时，油相和水相的体积比选自1∶10至1∶100的范围内。在一些实施方式中，油相和水相的混合比例是3∶100或1∶25。采用本领域已知的方法形成水包油的乳剂，包括但不限于均质法。在具体的实施方式中，采用高剪切分散机将油相和水相的混合物进行匀浆，然后采用高压均质机进行均质，得到水包油的乳剂。在具体的实施方式中，采用高剪切分散机将油相和水相的混合物匀浆2-10分钟，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到水包油的乳剂。任何适当的方法均可用于去除乳剂中的有机溶剂。在一些实施方式中，采用旋转蒸发的方法去除乳剂中的有机溶剂。在具体的实施方式中，用旋转蒸发仪将乳剂在40℃下，以40mbar减压去除乳剂中的有机溶剂。去除有机溶剂之后，得到的混悬液中即包含了本公开的治疗性纳米粒子。然而，此时的混悬液中还包含了过量的白蛋白，而这些白蛋白实际上并没有参与纳米粒子的构成。随后需要将多余的游离HSA从混悬液中除去而获得本公开的纯化的治疗性纳米粒子。在一些实施方式中，分离是通过选自如下的方法进行的：离心、透析、和排阻色谱。在具体的实施方式中，去除有机溶剂之后得到的混悬液可以直接进行去除HSA处理。或者，也可以也留待后续使用。本公开所涉及的治疗性纳米粒子是希望通过静脉输注的方式给药，因此需保证产品的无菌。纳米粒子以及人血清白蛋白均是温度敏感的，因此无法通过加热灭菌的方式除菌，可行的除菌方案包括全程无菌生产，或通过除菌过滤。在这种情况下，去除有机溶剂之后得到的混悬液经过滤膜过滤除菌，随后进行冷冻干燥而得到固体。将这种固体重悬于氯化钠溶液中。在一些实施方式中，将这种固体重悬于0.9％氯化钠溶液中，使紫杉醇调整至5mg/ml附近。当采用离心方式纯化治疗性纳米粒子时，在21000×g下离心60分钟或等同的离心条件来除去游离的HSA。当采用透析方式纯化治疗性纳米粒子时，步骤3)得到的含有纳米粒子的混悬液是采用超滤膜透析以除去游离的HSA。对根据本发明的方法所得到的纳米粒子液体进行透析。在具体的实施方式中，采用截留分子量为300K的再生纤维素超滤膜，以5％甘露醇为透析液对根据本发明的方法所得到的纳米粒子液体进行等体积透析，透析倍数为5倍。当采用排阻色谱的方式纯化治疗性纳米粒子时，采用排阻色谱柱分离治疗性纳米粒子。在具体的实施方式中，采用琼脂糖凝胶色谱柱对根据本发明的方法所得到的纳米粒子液体进行分离，收集对应于治疗性纳米粒子的洗脱峰的洗脱液。在一些实施方式中，该方法进一步在步骤3)和4)之间还有一步使用水性溶液(例如，水，5％的甘露醇溶液，10％的蔗糖溶液，5％的右旋糖酐溶液，10％的乳糖溶液，10％海藻糖溶液和10％麦芽糖溶液)的透析过程，以除去残留的有机溶剂。例如，使用可以透过有机溶剂但不能透过HSA或纳米粒的超滤膜(例如截流分子量30K的纤维素超滤膜)在水中或水性溶液中透析混悬液。在从含有纳米粒的混悬液中除去游离HSA之前除去或减少残留有机溶剂，可以改善纯化的纳米粒子或其组合物的稳定性。另一方面，本公开的一些实施方式还提供了一种制备包含治疗性纳米粒子的药物组合物的方法，包括如下步骤：1)将活性成分溶解于有机溶剂中形成油相，将人血清白蛋白溶解于水中形成水相；2)将油相和水相形成水包油的乳剂；3)去除乳剂中的有机溶剂，得到含治疗性纳米粒子的混悬液；4)除去未与纳米粒结合的游离HSA以获得纯化的治疗性纳米粒子；5)用含有可药用载体的溶液将治疗性纳米粒子重悬，得到所述药物组合物；6)任选地，当制备固体形式的药物组合物时，还包括冻干的步骤。步骤1)到4)与制备纯化的治疗性纳米粒子的方法一样。另外，在一些实施方式中，该方法进一步在步骤3)和4)之间还有一步使用水性溶液的透析过程，以除去残留的有机溶剂，也与制备纯化的治疗性纳米粒子的方法一样。在一些实施方式中，含有可药用载体的溶液是含有冻干赋形剂的溶液。在一些具体的实施方式中，冻干赋形剂选自甘露醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、右旋糖酐中的一种或多种。在其他一些具体实施方式中，冻干赋形剂为HSA。在具体实施方式中，治疗性纳米粒子悬浮于5％至10％的冻干赋形剂溶液中。任选地，然后经冻干制备成冻干粉形式的药物组合物。在具体的实施方式中，冻干赋形剂溶液选自5％甘露醇溶液、10％蔗糖溶液、5％右旋糖酐溶液、10％乳糖溶液、10％海藻糖溶液、10％麦芽糖溶液、10％人血白蛋白溶液中的一种或多种。在一些具体的实施方式中，治疗性纳米粒子在液体形式的药物组合物中的含量为0.1％-30％，优选0.2％-10％，更优选0.5％-5％，例如1％。在一些具体的实施方式中，本发明的液体形式药物组合物中活性药物(例如紫杉醇)的含量为0.1-100mg/ml，优选0.5-50mg/ml，更优选1-20mg/ml，例如5mg/ml。在一些具体的实施方式中，治疗性纳米粒子在固体形式的药物组合物中的含量为按重量计0.1％-80％，优选0.5％-50％，更优选1％-30％，例如2％-10％。在一些具体的实施方式中，本发明的液体形式药物组合物中活性药物(例如紫杉醇)的含量为按重量计0.1％-80％，优选0.5％-50％，更优选1％-30％，例如2％-10％。作为一个替代，还可以采用另一种透析方式制备本公开的药物组合物，方法包括如下步骤：1)将活性成分溶解于有机溶剂中形成油相，将人血清白蛋白溶解于水中形成水相；2)将上述油相和水相形成水包油的乳剂；3)去除乳剂中的有机溶剂，得到含治疗性纳米粒子的混悬液；4)使用含有可药用载体的溶液对去除有机溶剂后得到的混悬液进行透析，得到所述药物组合物；5)任选地，当制备固体形式的药物组合物时，还包括冻干的步骤。在用透析的方式除去游离HSA时，步骤1)到4)与制备纯化的治疗性纳米粒子的方法一样。另外，在一些实施方式中，该方法进一步在步骤3)和4)之间还有一步使用水性溶液的透析过程，以除去残留的有机溶剂，也与制备纯化的治疗性纳米粒子的方法一样。在一些实施方式中，含有可药用载体的溶液作为透析液，其是含有冻干赋形剂的溶液。在一些具体的实施方式中，冻干赋形剂选自甘露醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、右旋糖酐中的一种或多种。在具体实施方式中，治疗性纳米粒子悬浮于5％至10％的冻干赋形剂溶液中。任选地，然后经冻干制备成冻干粉形式的药物组合物。在具体的实施方式中，冻干赋形剂溶液选自5％甘露醇溶液、10％蔗糖溶液、5％右旋糖酐溶液、10％乳糖溶液、10％海藻糖溶液、10％麦芽糖溶液、10％人血白蛋白溶液中的一种或多种。在一些实施方式中，采用300k的超滤膜进行透析。另一方面，本公开还提供了使用该纯化的治疗性纳米粒子或其组合物的方法。因为该纯化的治疗性纳米粒子或其组合物可有效转运多种活性成分，因此它们可用于治疗对所述活性成分有应答的疾病。例如，所述该纯化的治疗性纳米粒子或其组合物可用于治疗癌症，如肝癌、前列腺癌和肺癌。其他疾病还包括乳腺癌、多发性骨髓瘤、移植排斥、结肠癌、淋巴瘤和发热等等。另一方面，本公开还提供了一种治疗癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的所述治疗性纳米粒子或所述药物组合物的步骤。在具体实施方式中，受试者是哺乳动物，包括但不限于人类、犬、小鼠、大鼠。药物组合物的治疗有效量取决于多种因素，包括具体的治疗剂或药物组合物，给药途径，患者情况(疾病阶段，疾病引起的症状，基本健康情况，年龄，性别以及体重)，以及其他情况。类似地，治疗疾病或失调的剂量取决于医疗领域技术人员所理解的参数。最佳剂量决定于实验模型和/或临床试验。根据本发明的药物组合物、疫苗或者药物制剂可通过任何适宜的途径施用，例如可口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉内施用。另一方面，本公开还提供了一种药盒，其含有根据本公开的纯化的治疗性纳米粒子或药物组合物。根据需要，药盒还包含使用说明书、包装、容纳治疗性纳米粒子或药物组合物的容器。实施例下述实施例旨在为了更好的揭示本公开的治疗性纳米粒子及药物组合物，而非限制本公开的任何方面。实施例1将3g的紫杉醇(CAS：33069-62-4，云南汉德生物技术有限公司)溶解在20ml的氯仿/乙醇(9∶1，v/v)中，然后上述溶液加入500ml的人血白蛋白溶液(5％w/v)(CAS：70024-90-7，广东双林生物制药有限公司)，将混合物采用高剪切分散机(型号F22E，上海弗鲁克流体机械制造有限公司)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机(型号M110-EH30K，美国MFIC公司)在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪(型号R-210，瑞士Buchi公司)中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的紫杉醇白蛋白纳米粒子平均直径为136nm，混悬液呈半透明状。混悬液可顺利经0.22微米的除菌滤膜(德国赛多利斯公司)过滤，滤后粒子粒径未发生显著改变，混悬液室温放置48小时未见有显著变化。将混悬液分装后置于冻干机(型号LD-85S，美国Millrock公司)中冷冻干燥24小时，得到稳定的类白色饼块。实施例2将0.32g的紫杉醇(CAS：33069-62-4，云南汉德生物技术有限公司)溶解在15ml的氯仿/乙醇(11∶1，v/v)中，然后上述溶液加入500ml的人血白蛋白溶液(4％w/v)(CAS：70024-90-7，广东双林生物制药有限公司)，将混合物采用高剪切分散机(型号F22E，上海弗鲁克流体机械制造有限公司)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机(型号M110-EH30K，美国MFIC公司)在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪(型号R-210，瑞士Buchi公司)中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的紫杉醇白蛋白纳米粒子平均直径为145nm，混悬液呈半透明状。混悬液可顺利经0.22微米的除菌滤膜(德国赛多利斯公司)过滤，滤后粒子粒径未发生显著改变，混悬液室温放置48小时未见有显著变化。将混悬液分装后置于冻干机(型号LD-85S，美国Millrock公司)中冷冻干燥24小时，得到稳定的类白色饼块。实施例3将0.63g的紫杉醇(CAS：33069-62-4，云南汉德生物技术有限公司)溶解在15ml的氯仿/乙醇(11∶1，v/v)中，然后上述溶液加入500ml的人血白蛋白溶液(4％w/v)(CAS：70024-90-7，广东双林生物制药有限公司)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机(型号M110-EH30K，美国MFIC公司)在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪(型号R-210，瑞士Buchi公司)中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的紫杉醇白蛋白纳米粒子平均直径为141nm，混悬液呈半透明状。混悬液可顺利经0.22微米的除菌滤膜(德国赛多利斯公司)过滤，滤后粒子粒径未发生显著改变，混悬液室温放置48小时未见有显著变化。将混悬液分装后置于冻干机(型号LD-85S，美国Millrock公司)中冷冻干燥24小时，得到稳定的类白色饼块。实施例4将1.25g的紫杉醇(CAS：33069-62-4，云南汉德生物技术有限公司)溶解在15ml的氯仿/乙醇(11∶1，v/v)中，然后上述溶液加入500ml的人血白蛋白溶液(4％w/v)(CAS：70024-90-7，广东双林生物制药有限公司)，将混合物采用高剪切分散机(F22Z型，fluko)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机(型号M110-EH30K，美国MFIC公司)在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪(型号R-210，瑞士Buchi公司)中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的紫杉醇白蛋白纳米粒子平均直径为138nm，混悬液呈半透明状。混悬液可顺利经0.22微米的除菌滤膜(德国赛多利斯公司)过滤，滤后粒子粒径未发生显著改变，混悬液室温放置48小时未见有显著变化。将混悬液分装后置于冻干机(型号LD-85S，美国Millrock公司)中冷冻干燥24小时，得到稳定的类白色饼块。实施例5将1.88g的紫杉醇(CAS：33069-62-4，云南汉德生物技术有限公司)溶解在15ml的氯仿/乙醇(11∶1，v/v)中，然后上述溶液加入500ml的人血白蛋白溶液(4％w/v)(CAS：70024-90-7，广东双林生物制药有限公司)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机(型号M110-EH30K，美国MFIC公司)在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪(型号R-210，瑞士Buchi公司)中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的紫杉醇白蛋白纳米粒子平均直径为133nm，混悬液呈半透明状。混悬液可顺利经0.22微米的除菌滤膜(德国赛多利斯公司)过滤，滤后粒子粒径未发生显著改变，混悬液室温放置48小时未见有显著变化。将混悬液分装后置于冻干机(型号LD-85S，美国Millrock公司)中冷冻干燥24小时，得到稳定的类白色饼块。实施例6将2.5g的紫杉醇(CAS：33069-62-4，云南汉德生物技术有限公司)溶解在15ml的氯仿/乙醇(11∶1，v/v)中，然后上述溶液加入500ml的人血白蛋白溶液(4％w/v)(CAS：70024-90-7，广东双林生物制药有限公司)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机(型号M110-EH30K，美国MFIC公司)在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪(型号R-210，瑞士Buchi公司)中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的紫杉醇白蛋白纳米粒子平均直径为125nm，混悬液呈半透明状。混悬液可顺利经0.22微米的除菌滤膜(德国赛多利斯公司)过滤，滤后粒子粒径未发生显著改变，混悬液室温放置48小时未见有显著变化。将混悬液分装后置于冻干机(型号LD-85S，美国Millrock公司)中冷冻干燥24小时，得到稳定的类白色饼块。实施例7将5g的紫杉醇(CAS：33069-62-4，云南汉德生物技术有限公司)溶解在15ml的氯仿/乙醇(11∶1，v/v)中，然后上述溶液加入500ml的人血白蛋白溶液(4％w/v)(CAS：70024-90-7，广东双林生物制药有限公司)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机(型号M110-EH30K，美国MFIC公司)在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪(型号R-210，瑞士Buchi公司)中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的紫杉醇白蛋白纳米粒子平均直径为134nm，混悬液呈半透明状。混悬液可顺利经0.22微米的除菌滤膜(德国赛多利斯公司)过滤，滤后粒子粒径未发生显著改变，混悬液室温放置48小时未见有显著变化。将混悬液分装后置于冻干机(型号LD-85S，美国Millrock公司)中冷冻干燥24小时，得到稳定的类白色饼块。实施例8将7.5g的紫杉醇(CAS：33069-62-4，云南汉德生物技术有限公司)溶解在15ml的氯仿/乙醇(11∶1，v/v)中，然后上述溶液加入500ml的人血白蛋白溶液(4％w/v)(CAS：70024-90-7，广东双林生物制药有限公司)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机(型号M110-EH30K，美国MFIC公司)在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪(型号R-210，瑞士Buchi公司)中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的紫杉醇白蛋白纳米粒子平均直径为140nm，混悬液呈半透明状。混悬液可顺利经0.22微米的除菌滤膜(德国赛多利斯公司)过滤，滤后粒子粒径未发生显著改变，混悬液室温放置48小时未见有显著变化。将混悬液分装后置于冻干机(型号LD-85S，美国Millrock公司)中冷冻干燥24小时，得到稳定的类白色饼块。实施例9将1g的紫杉醇(CAS：33069-62-4，云南汉德生物技术有限公司)溶解在20ml的氯仿/乙醇(4∶1，v/v)中，然后上述溶液加入500ml的人血白蛋白溶液(2％w/v)(CAS：70024-90-7，广东双林生物制药有限公司)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机(型号M110-EH30K，美国MFIC公司)在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪(型号R-210，瑞士Buchi公司)中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的紫杉醇白蛋白纳米粒子平均直径为136nm，混悬液呈半透明状。混悬液可顺利经0.22微米的除菌滤膜(德国赛多利斯公司)过滤，滤后粒子粒径未发生显著改变，混悬液室温放置48小时未见有显著变化。将混悬液分装后置于冻干机(型号LD-85S，美国Millrock公司)中冷冻干燥24小时，得到稳定的类白色饼块。实施例10.人血白蛋白和紫杉醇含量的测定方法人血白蛋白含量测定采用HPLC法。在228nm的检测波长下，使用配有TosohaasTSKG3000SWXL凝胶色谱柱的紫外检测器(1260VWDG1314B，Agilenttechnologies)，流动相为0.1mol/L磷酸氢二钾溶液，进样体积10μl，采用外标法计算白蛋白含量。供试品溶液制备：采用0.9％氯化钠溶液将待测溶液稀释至白蛋白浓度低于3mg/ml，作为供试品溶液。紫杉醇含量测定采用HPLC法。使用配有C18反相色谱柱的紫外检测器(1260VWDG1314B，Agilenttechnologies)，检测波长228nm，流动相为乙腈-水(1∶1，v/v)，进样体积10μl，采用外标法计算紫杉醇含量。供试品溶液制备：采用乙腈将待测溶液稀释至紫杉醇完全溶解，浓度20-200μg/ml，作为供试品溶液。实施例11取实施例1所得产品加入0.9％氯化钠溶液复溶得到样品1，使得紫杉醇含量为5mg/ml。然后，使用含5％白蛋白的模拟血浆稀释样品1，使得紫杉醇含量至20μg/ml，得到样品2(该条件下粒子已完全崩解，无紫杉醇和人血清白蛋白结合的粒子存在)。分别取样品1和样品2各1ml，在21000×g条件下离心不同时间。采用实施例10中的方法测定上清液中紫杉醇和白蛋白浓度，结果见表1。表1.不同离心时间上清液中紫杉醇和白蛋白浓度结果显示，对于完全崩解的样品(样品2)离心不会产生沉淀。不同离心时间，上清液中紫杉醇和白蛋白浓度无显著改变，即溶液中无紫杉醇结晶或较重的粒子。未崩解样品(样品1)离心后底部出现沉淀。上清液中紫杉醇浓度随离心时间而降低，并最终达到平衡。白蛋白浓度也是随着时间而略微升高，最终达到平衡(上清液体积约为总体积的90％)。因此，样品中的纳米粒子可通过离心的方式分离和纯化。离心60分钟后，上清中紫杉醇浓度达到平衡。因此，采用21000×g离心60分钟，可以获得分离的紫杉醇白蛋白粒子。实施例12.纯化的纳米粒子的制备采用实施例11中离心方法，分别从实施例1-9中所得样品中分离粒子。离心后，弃去上清液，得到的沉淀即为紫杉醇白蛋白纳米粒子，对应于上述实施例1-9分别称为粒子1、2、3、4、5、6、7、8和9。实施例13.扫描电镜观察分离前后粒子形态取实施例5中所得样品冻干粉末及在实施例12中分离得到的实施例5所得样品的沉淀(粒子5)于扫描电镜(S-4800，Hitachi)下观察。图1结果可见，实施例5样品中少量粒子镶嵌于大量白蛋白形成的支撑剂中。而粒子5中，粒子独立存在(参见图2)。可以判断，通过实施例11的分离方法得到的沉淀为纯的或基本上纯的纳米粒子。实施例14.粒子中白蛋白与紫杉醇的比例将实施例12所得紫杉醇白蛋白纳米粒子(对应着实施例1至9)分别加入0.9％氯化钠溶液1ml重悬。采用实施例10中的测定方法分别测定样品中紫杉醇和白蛋白含量，结果如下：表2.离心得到的不同纯化的纳米粒子中白蛋白与紫杉醇的比例上述结果显示，不同制剂工艺所得的产品中纯化的纳米粒子中白蛋白与紫杉醇的比例是不相同的，并且具有一定规律性。可以看出，油相中紫杉醇浓度的提高与白蛋白量是成反比的。实施例15.透析法制备纯化的纳米粒子采用截留分子量300K、材质为再生纤维素的超滤膜包(PXC300C50，Millipore)，使用5％甘露醇为透析液分别对实施例2、实施例5、实施例8所制备样品用注射水复溶后进行等体积透析，透析倍数为5倍。采用实施例10中的测定方法分别测定上述粒子中紫杉醇和白蛋白含量，结果如下：表3.透析法得到的不同制剂纯化的纳米粒子中白蛋白与紫杉醇比例上述结果显示采用超滤膜透析得到的粒子中白蛋白与紫杉醇的重量比与离心法得到的粒子基本相似，因此也可以用于分离混悬液中的粒子与多余的白蛋白，并将粒子外围的溶液进行置换。实施例16.采用柱分离法制备纯化的纳米粒子将sepharose4B的凝胶装入直径10mm的玻璃柱(Φ10mm*230mm，北京满仓科技有限公司)中，共填装20ml凝胶。采用0.9％氯化钠平衡3倍柱体积。分别取实施例2、实施例5、实施例8所制备样品各1ml在凝胶柱顶端上样，0.9％氯化钠作为洗脱液，使用在线紫外检测器280nm波长进行监测。在监测图上第一个峰出现时，流出液为略显浊光的混悬液，收集该部分混悬液用于测定紫杉醇和白蛋白。继续记录直至第二个峰完毕。两峰分离度良好，因此采用sepharose4B凝胶柱可以将混悬液中的粒子和游离白蛋白有效分离。采用实施例10中的测定方法分别测定上述粒子中紫杉醇和白蛋白含量，结果如下：表4.柱分离法得到的不同制剂纯化的纳米粒子中白蛋白与紫杉醇比例上述结果显示采用凝胶柱分离得到的粒子中白蛋白与紫杉醇的重量比与离心法和透析法得到的粒子基本相似，因此也可以用于分离混悬液中的粒子与多余的白蛋白。实施例17.采用离心法检测透析法所制备纯化的纳米粒子中游离白蛋白量将实施例15中通过透析法得到的粒子混悬液，采用实施例11中的离心条件进行离心分离，粒子全部沉淀于离心管底部后，取上清液测定白蛋白浓度，结果见表5，表5.透析法得到的不同制剂纯化的纳米粒子离心前后白蛋白浓度变化ND表示低于检测线，无法检测到。由上述结果可以看出，通过透析法制备得到的紫杉醇白蛋白纳米粒子混悬液中，游离的白蛋白所占比例非常少，绝大部分白蛋白是与紫杉醇结合形成纳米粒子的。实施例18.采用离心法检测柱分离法所制备纯化的纳米粒子中游离白蛋白量将实施例16中通过柱分离法得到的粒子混悬液，采用实施例11中的离心条件进行离心分离，粒子全部沉淀于离心管底部后，取上清液测定白蛋白浓度，结果见表6。表6.柱分离法得到的不同制剂纯化的纳米粒子离心前后白蛋白浓度变化离心前浓度(mg/ml)离心后上清(mg/ml)实施例20.68ND实施例50.33ND实施例80.10NDND表示低于检测线，无法检测到。由上述结果可以看出，通过柱分离法制备得到的紫杉醇白蛋白纳米粒子混悬液中，几乎没有游离的白蛋白，绝大部分白蛋白是与紫杉醇结合形成纳米粒子的。实施例19.采用柱分离法检测离心法所制备纯化的纳米粒子中游离白蛋白量将实施例12所得紫杉醇白蛋白纳米粒子分别加入0.9％氯化钠溶液重悬得到粒子混悬液，采用实施例16中的sepharose4B柱分离方法分离纯化的纳米粒子和可能存在的游离白蛋白。在洗脱过程中观察紫外监测曲线，在粒子完全流出后，收集后续洗脱液，测定白蛋白浓度，结果见表7。表7.离心法得到的不同制剂纯化的纳米粒子采用柱分离峰测定白蛋白浓度变化柱分离前浓度(mg/ml)柱分离后白蛋白(mg/ml)实施例20.57ND实施例50.16ND实施例80.043NDND表示低于检测线，无法检测到。由上述结果可以看出，通过离心法制备得到的紫杉醇白蛋白纳米粒子混悬液中，几乎没有游离的白蛋白，绝大部分白蛋白是与紫杉醇结合形成纳米粒子的。在实施例17、18、19中，三种粒子分离的手段互相印证，均证明了三种方法可以得到几乎没有游离白蛋白的纯化的纳米粒子。实施例20.粒径及电位的测定将实施例12对应于实施例1-9所得紫杉醇白蛋白纳米粒子分别加入纯化水使之重悬。采用马尔文NANO-ZS激光粒度测定仪分别测定纯化的纳米粒子的粒径及zeta电位，结果如下：表8.离心所得纯化的纳米粒子的粒径及电位由结果可以看出，经过离心所得到纯化的纳米粒子的平均粒径与初始制备所得粒子的初始平均粒径基本一致，粒子的zeta电位仍较高，因此能够利用其电荷稳定作用使粒子的混悬液保持稳定。实施例21.X衍射图谱取紫杉醇原料与白蛋白冻干粉于粉末X光射线衍射仪中测定其结晶形式，结果见图3和图4。可见，紫杉醇原料为结晶性粉末，白蛋白冻干粉为无定形粉末。取实施例12中有代表性的纯化的纳米粒子(对应于实施例2、4、6和8)，于冻干机中冷冻干燥得到固体粉末，于粉末X光射线衍射仪中测定其结晶形式，结果见图5、6、7和8。由X衍射图谱可以看出，在粒子中白蛋白对紫杉醇的比例在0.043∶1至0.57∶1范围内，白蛋白和紫杉醇均是以无定形存在的，与紫杉醇原料药显著不同，与白蛋白冻干粉略有差异。实施例22.紫杉醇从粒子中的释放采用实施例11中建立的粒子分离方法，可以有效分离游离的组分和以纳米粒子形式存在的组分。因此，该方法可以用来测定不同浓度时紫杉醇从粒子中释放的情况，具体操作如下：将实施例12所得紫杉醇白蛋白纳米粒子(分别对应于实施例1-9)，根据白蛋白与紫杉醇的比例，挑选其中有代表性的纯化的纳米粒子(对应于实施例2、4、6和8，分别称为粒子2、4、6和8)加0.9％氯化钠溶液，配制成紫杉醇浓度为5mg/ml的储备液。将储备液和模拟血浆溶液分别于37℃恒温。取储备液用模拟血浆溶液稀释，得到紫杉醇浓度分别为5000、1000、200、150、100、80、50、30、10μg/ml的溶液。释放率测定：取配制好的样品溶液分别测定紫杉醇浓度，同时取各样品1ml于21000×g离心60分钟后取上清液测定紫杉醇浓度。用上清液中紫杉醇浓度除以离心前样品紫杉醇浓度计算各浓度点紫杉醇释放比例，并绘制释放曲线的图，见图9和图10。由释放曲线图可以看出，粒子中白蛋白对紫杉醇的比例在0.043∶1至0.57∶1范围内，粒子中紫杉醇的释放行为基本一致，均与浓度相关。实施例23.含治疗性纳米粒子的组合物的制备方法一(离心-重悬法)：将实施例12得到的对应于实施例1-9的治疗性纳米粒子(以下称为粒子1、2、3、4、5、6、7、8和9)分别采用5％甘露醇溶液、10％蔗糖溶液、5％右旋糖酐溶液、10％乳糖溶液、10％海藻糖溶液、10％麦芽糖溶液、10％人血白蛋白溶液重悬，使得紫杉醇浓度为5mg/ml。将重悬液经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变。将各混悬液置于冻干机中冷冻干燥，即得含药物纳米粒子的组合物。方法二(透析法)：将实施例1-9得到的样品复溶至紫杉醇浓度为5mg/ml后采用300k的超滤膜进行透析，透析液分别采用5％甘露醇溶液、10％蔗糖溶液、5％右旋糖苷溶液、10％乳糖溶液、10％麦芽糖、10％海藻糖溶液、10％人血白蛋白溶液，透析5倍体积后混悬液中游离的人血白蛋白被全部置换。将混悬液经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，将各混悬液置于冻干机中冷冻干燥，即得含治疗性纳米粒子的组合物。实施例24.将实施例23中方法一(离心-重悬法)和方法二(透析法)所得的含治疗性纳米粒子的组合物分别加入注射水复溶至紫杉醇浓度为5mg/ml后，观察各溶液稳定性，判断室温下12h稳定性。可见，常规冻干保护剂均可对纯化的紫杉醇白蛋白纳米粒子起到保护作用。结果见表9和表10：表9.离心-重悬法所得的组合物的稳定性表10.透析法所得组合物的稳定性可见采用离心分离-重悬的方式(方法一)与透析的方式(方法二)置换粒子周围的白蛋白均可保证粒子的稳定性。实施例25.豚鼠致敏实验试验药物选用实施例6得到的产品及实施例24中包含粒子6的5％甘露醇制剂，其中所述制剂中紫杉醇浓度为如下表所示的浓度。致敏剂量选择3mg/只和1.25mg/只，致敏采用腹腔注射的方式，隔日一次，共三次。同时设阳性对照组(0.2％卵白蛋白)和阴性对照组(0.9％氯化钠注射液组)。具体给药情况见下表。表11.豚鼠致敏实验方案致敏给药方法：用左手手掌成杯状紧握豚鼠背使得腹部皮肤伸展，固定好动物。使豚鼠腹部抬高，头部放低，用酒精棉球将注射部位消毒后，右手持2ml一次性注射器的针头刺入皮肤。其部位是从下腹部腹中线稍偏左1mm的位置进针。针头到达皮下后，继续向前进针5mm-10mm后，再以45°角刺入腹腔。固定针尖，缓慢注入药液。注射完毕后，用干棉球压迫针眼，以防药物外流。致敏3次后实施例6制剂，3mg/只剂量组的豚鼠消瘦、死亡。其他组未见异常。过敏激发：激发采用静脉注射方式，在末次致敏后第10天一次激发，激发剂量为6mg/只和2.5mg/只。激发给药方法：外侧跖静脉注射，由助手将豚鼠固定好。操作者从后膝关节抓住动物肢体，压迫静脉，将腿呈伸展状态。剪去注射部位的毛(或者剪开注射部位的皮肤)，酒精棉球擦拭消毒后，可见粗大的外侧跖静脉，右手持1ml一次性注射器沿向心方向刺入血管注射。注射完后，用干棉球压迫针眼，以防流血。激发后立刻至30min详细观察每只动物的反应，过敏症状出现及消失的时间。最长观察3小时。过敏反应结果见表14。表12.过敏反应症状表13，全身过敏反应评价标准表14.豚鼠主动过敏试验结果＊表示动物致敏后全部消瘦、死亡。豚鼠主动致敏试验结果显示，含过量白蛋白的纳米粒子制剂对于豚鼠具有较强的致敏性，而含纯化的纳米粒子的制剂能够显著降低药物的致敏反应。实施例26.犬药代研究试验药物选用实施例6得到的产品及实施例24中包含粒子6的5％甘露醇制剂，其中紫杉醇浓度为5mg/ml。采用比格(beagle)犬进行两个制剂的体内药代动力学研究。每组3只比格犬，给药剂量为5mg/kg，给药时间控制在30分钟。于给药前(0h)、输液过程中15min(从给药开始计0.25h)、拔针点(从给药开始计0.5h)以及从给药开始计0.58、0.75、1.0、1.5、2.5、3.5、4.5、6.5、8.5、24.5h由比格犬前肢头静脉采血2ml，分别置于肝素抗凝管中，摇匀，3000rpm离心10min，分取血浆。采用HPLC/MS/MS测定血浆中紫杉醇浓度，并绘制药物浓度与时间曲线，见图11。由两种制剂的药物浓度-时间曲线图可以看出，两者的体内行为几乎完全一致，因此产品中多余的白蛋白对粒子的体内行为无影响。实施例27.犬药代研究中的过敏现象在实施例26进行的犬药代研究中，在给药过程中观察了两种制剂对于犬产生的不良反应情况。在实施例6样品组中，三只犬均出现不同程度的明显过敏反应，主要为给药过程中的剧烈挣扎、大量流涎、口周围皮肤出现红斑、个别实验动物给药过程中出现呕吐、尿失禁等。而粒子6样品组仅部分动物出现轻微挣扎、流涎、口周围皮肤红斑，且症状较轻。可见，纯化的纳米粒子的制剂能够显著降低药物的致敏反应。实施例28.将实施例24方法一中以甘露醇为冻干保护剂的含治疗性纳米粒子的组合物(对应于实施例2、6和8的纳米粒子，以下称为粒子2、粒子6、粒子8)，与实施例6所得产品、Cremophor制剂的进行最大耐受剂量考察的试验。根据美国NCI的推荐，对确定药物单次给药急性毒性最大耐受剂量实验方法加以改进。对于粒子2、粒子6、粒子8和实施例6冻干粉，选取400mg/kg作为最大给药剂量，以1.2比率递减给药剂量，即剂量分别为400、333、278、231和193mg/kg。对于选取48mg/kg作为最大给药剂量，以1.2比率递减给药剂量，即剂量分别为48、40、33.3、27.8、23.1和19.3mg/kg。每个剂量组分别给予3只KM雄性小鼠。观察给药后动物一般状况及动物体重变化，观察期10天。如在观察期内动物没有出现死亡、不可恢复的毒性反应，或者与实验前体重比较体重减轻无连续3天超过15％的最大给药剂量即被认为是单次给药的最大耐受剂量。结果显示最大耐受剂量为33.3mg/kg。所有给药组中，在给药时小鼠剧烈挣扎，给药后昏迷、呼吸加快，40mg/kg和48mg/kg组出现死亡例，其余剂量组小鼠在给药后逐渐恢复正常，毒性症状的严重程度和症状恢复时间与给药剂量相关。实施例6和粒子2、粒子6、粒子8的最大耐受剂量均为193mg/kg。193mg/kg以上剂量小鼠主要不良症状为体重减轻、肛门处污垢、后肢无力/瘫痪和死亡，随给药剂量增加不良症状增强。粒子2、粒子6、粒子8和实施例6产品之间对小鼠的毒性无明显差异，但毒性均显著低于Cremophor制剂实施例29对小鼠肝癌H22肿瘤的抑制作用采用粒子2、粒子6、粒子8，与实施例6产品、Cremophor制剂对小鼠肝癌H22肿瘤的抑制作用进行考察试验。将动物按体重分层，肝癌H22腹水细胞皮下接种于雄性KM小鼠前肢腋部皮下组织，接种体积为0.2mL，含瘤细胞约1.0×106个。根据接瘤时间先后将动物均衡分成6组。接种24h后，粒子2、粒子6、粒子8、实施例6产品、以小鼠最大耐受剂量单次静脉给药。即：粒子2、粒子6、粒子8、实施例6产品给药剂量为193mg/kg，给药剂量为33.3mg/kg，空白对照组单次静脉给予0.9％氯化钠注射液。给药第12天，采用CO2窒息处死小鼠，剖取瘤块并称重。根据公式计算肿瘤抑制率(％)，肿瘤抑制率＝(1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％。实验结果采用SPSS19.0统计软件，One-wayANOVA统计分析。实验结果见表15。以小鼠最大耐受剂量单次静脉给药，所有组别均可显著抑制小鼠H22肿瘤生长。粒子2、粒子6、粒子8和实施例6产品对H22肿瘤的抑制作用组间无差异。粒子2、粒子8和实施例6产品对肿瘤的抑制率显著高于表15.对荷瘤H22小鼠体重的影响(n＝10，)实施例30对小鼠前列腺癌RM-1肿瘤的抑制作用采用粒子2、粒子6、粒子8，与实施例6产品、Cremophor制剂对小鼠前列腺癌RM-1肿瘤的抑制作用进行考察试验。收集对数生长期RM-1肿瘤细胞，调整细胞数为2.5×106个细胞/ml。将瘤细胞悬液接种于体重7-8周C57雄性小鼠前肢腋下皮下组织，接种体积为0.2ml，含瘤细胞约5×105个。接种完成后，剩余的瘤细胞悬液在光镜下计数，活瘤细胞数＞95％。按照接种时间将小鼠分成6组。接种72h后，粒子2、粒子6、粒子8、实施例6产品、以小鼠最大耐受剂量单次静脉给药，即粒子2、粒子6、粒子8、实施例6产品给药剂量为193mg/kg，给药剂量为33.3mg/kg，空白对照组单次静脉给予0.9％氯化钠注射液。至肿瘤长出后，采用以游标卡尺测量瘤径的方法，动态观察受试药的抗肿瘤作用。肿瘤体积(tumorvolume，TV)的计算公式为：V＝1/2×a×b2。其中a和b分别表示肿瘤长和宽。根据测量结果计算出肿瘤体积。根据公式计算肿瘤体积抑制率(％)，肿瘤抑制率＝(1.给药组平均肿瘤体积/对照组平均肿瘤体积)×100％。实验结果采用SPSS19.0统计软件，RepeatedMeasure过程分析随时间变化多次测量间肿瘤体积变化，Multivariate过程比较各次测量时组间肿瘤体积差异。实验结果见表16。各药物以小鼠最大耐受剂量，在接种小鼠前列腺癌RM-1肿瘤细胞3d时单次静脉给药，与空白对照组相比，粒子2、粒子6、粒子8和实施例6产品对小鼠前列腺癌RM-1肿瘤的生长具有显著抑制作用，而Cremophor制剂对肿瘤无抑制作用。粒子2、粒子6、粒子8和实施例6产品对小鼠RM-1肿瘤的抑制作用无明显差异，但与相比，均显著抑制肿瘤生长。表16.对小鼠前列腺癌RM-1肿瘤的抑制作用(n＝10，)实施例31：对小鼠Lewis肺癌肿瘤的抑制作用采用粒子2、粒子6、粒子8，与实施例6产品、Cremophor制剂对小鼠肺癌Lewis肿瘤的抑制作用进行考察试验。收集对数生长期Lewis肿瘤细胞，调整细胞数为2.5×106个细胞/ml。将瘤细胞悬液接种于体重7-8周C57雄性小鼠前肢腋下皮下组织，接种体积为0.2ml，含瘤细胞约5×103个。同实施例18的分组、给药、指标观察及数据统计方法。实验结果见表17。各药物以小鼠最大耐受剂量，在接种小鼠肺癌Lewis肿瘤细胞3d时单次静脉给药，与空白对照组相比，粒子2、粒子6、粒子8和实施例6产品对小鼠肺癌Lewis肿瘤的生长具有显著抑制作用，而Cremophor制剂对肿瘤无抑制作用。粒子2、粒子6、粒子8和实施例6产品对小鼠Lewis肺癌肿瘤的抑制作用无明显差异，但与相比，均显著抑制肿瘤生长。表17.对小鼠Lewis肺癌肿瘤的抑制作用(n＝10，)实施例32人血清白蛋白作为一种市售药物，其质量标准中规定产品中聚合体比例不得超过5％，因为白蛋白聚合体可能产生过敏反应。采用实施例10中白蛋白的测定方法能够区分白蛋白单体和聚合体。采用实施例10中白蛋白和紫杉醇的检测方法分别检测实施例1-9(称为初始制剂)以及实施例24方法一中分别以甘露醇和人血清白蛋白为冻干保护剂的对应于实施例1-9的组合物中，白蛋白聚合体和紫杉醇的含量，并计算每毫克紫杉醇对应的白蛋白聚合体量，结果见表18。表18.不同制剂产品中白蛋白聚合体与紫杉醇相对量结果显示采用现有技术的方法(均质法)直接制备出的产品中白蛋白聚合体的量显著高于本公开的组合物制备方法中后加入的白蛋白中的量。这是由于在现有技术的均质过程中或蒸发过程中产生了新的白蛋白聚合体，而甘露醇保护剂的制剂中白蛋白聚合体的含量更低这是因为制剂中仅含有极少量的白蛋白，其总量就低于初始制剂中聚合体的量。实施例33.回收白蛋白用于制备纳米粒子收集实施例15中透析过程中的透过液，使用10K截留分子量、材质为再生纤维素的超滤膜包进行超滤浓缩，浓缩至白蛋白含量约为4％时，采用纯水作为透析液进行等体积透析，透析5倍体积后结束，可得到回收的4％白蛋白溶液。按照实施例5中制备方法采用回收的白蛋白溶液制备紫杉醇白蛋白纳米粒子。结果，所制备紫杉醇白蛋白纳米粒平均直径在134nm，混悬液呈半透明状，与实施例5的产品相近。混悬液可顺利经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤后粒子粒径未发生显著改变，混悬液室温放置48小时未见有显著变化。将混悬液分装后置于冻干机中冷冻干燥24小时，得到稳定的类白色饼块。实施例34.多西他赛白蛋白纯化的纳米粒子的制备将3g的多西他赛溶解在15ml的氯仿/乙醇(1∶1，v/v)中，然后上述溶液加入500ml的人血白蛋白溶液(4％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的多西他赛白蛋白纳米粒直径在110-150nm，混悬液呈半透明状。所得多西他赛白蛋白纳米粒混悬液采用实施例11中离心的方式分离纳米粒子，离心条件为21000×g离心60分钟，弃去上清液得到纯化的纳米粒子。纯化的纳米粒子加入5％甘露醇溶液重悬，将重悬液经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中多西他赛含量，根据含量调整装量，为50mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥48小时即可。所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和多西他赛含量，得出白蛋白与多西他赛的比例为0.1∶1。实施例35.多西他赛己酰衍生物白蛋白纯化的纳米粒子的制备将695mg的多西他赛己酰衍生物溶解在6ml的氯仿/乙醇(10∶1，v/v)中，然后上述溶液加入102ml的人血白蛋白溶液(10％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的多西他赛己酰衍生物白蛋白纳米粒直径在75-100nm，混悬液呈半透明状。所得多西他赛己酰衍生物蛋白纳米粒混悬液采用实施例15中5％甘露醇透析的方法得到纯化的纳米粒子，经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中多西他赛己酰衍生物含量，根据含量调整装量，为50mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥48小时即可。所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和多西他赛己酰衍生物含量，得出白蛋白与多西他赛己酰衍生物的比例为0.27∶1。实施例36.多西他赛苯酰衍生物白蛋白纯化的纳米粒子的制备将226mg的多西他赛苯酰衍生物溶解在2ml的氯仿/乙醇(9∶1，v/v)中，然后上述溶液加入35ml的人血白蛋白溶液(5％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在18000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的多西他赛苯酰衍生物白蛋白纳米粒直径在30-60nm，混悬液呈半透明状。所得多西他赛苯酰衍生物白蛋白纳米粒混悬液使用10％乳糖溶液作为透析液，采用实施例16中柱分离的方式得到纯化的纳米粒子，经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中多西他赛苯酰衍生物含量，根据含量调整装量，为50mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥65小时即可。所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和多西他赛苯酰衍生物含量，得出白蛋白与多西他赛苯酰衍生物的比例为0.95∶1。实施例37.雷帕霉素白蛋白纯化的纳米粒子的制备将166mg的雷帕霉素溶解在1ml的氯仿/乙醇(11∶1，v/v)中，然后上述溶液加入37ml的人血白蛋白溶液(5％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的雷帕霉素白蛋白纳米粒直径在50-85nm，混悬液呈半透明状。所得雷帕霉素白蛋白纳米粒混悬液使用5％右旋糖酐溶液作为透析液，采用实施例16中柱分离的方式分离得到纯化的纳米粒子，经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中雷帕霉素含量，根据含量调整装量，为10mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥48小时即可。所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和雷帕霉素含量，得出白蛋白与雷帕霉素的比例为0.63∶1。实施例38.替西罗莫司白蛋白纯化的纳米粒子的制备将101mg的替西罗莫司溶解在0.5ml的氯仿/乙醇(7∶1，v/v)中，然后上述溶液加入19.5ml的人血白蛋白溶液(5％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的替西罗莫司白蛋白纳米粒直径在80-115nm，混悬液呈半透明状。所得替西罗莫司白蛋白纳米粒混悬液采用实施例11中离心的方式分离纳米粒子，离心条件为21000×g离心60分钟，弃去上清液得到纯化的纳米粒子。纯化的纳米粒子加入5％甘露醇溶液重悬，将重悬液经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中替西罗莫司含量，根据含量调整装量，为10mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥48小时即可。所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和替西罗莫司含量，得出白蛋白与替西罗莫司的比例为0.16∶1。实施例39.依维莫司白蛋白纯化的纳米粒子的制备将78mg的依维莫司溶解在1ml的氯仿/乙醇(9∶1，v/v)中，然后上述溶液加入22ml的人血白蛋白溶液(8％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的依维莫司白蛋白纳米粒直径在80-110nm，混悬液呈半透明状。所得依维莫司白蛋白纳米粒混悬液采用实施例15中5％右旋糖酐透析的方式得到纯化的纳米粒子，经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中依维莫司含量，根据含量调整装量，为10mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥60小时即可。所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和依维莫司含量，得出白蛋白与替西罗莫司的比例为0.32∶1。实施例40.罗米地辛白蛋白纯化的纳米粒子的制备将113mg的罗米地辛溶解在2ml的氯仿/乙醇(8∶1，v/v)中，然后上述溶液加入35ml的人血白蛋白溶液(10％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的罗米地辛白蛋白纳米粒直径在120-150nm，混悬液呈半透明状。所得罗米地辛白蛋白纳米粒混悬液使用10％蔗糖溶液作为透析液，采用实施例16中柱分离的方式分离纳米粒子。纯化的纳米粒子加入5％甘露醇溶液重悬，将重悬液经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中罗米地辛含量，根据含量调整装量，为50mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥48小时即可。所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和罗米地辛含量，得出白蛋白与罗米地辛的比例为0.25∶1。实施例41.吡柔比星白蛋白纯化的纳米粒子的制备将147mg的吡柔比星溶解在0.75ml的氯仿/乙醇(5∶1，v/v)中，然后上述溶液加入19.5ml的人血白蛋白溶液(5％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的吡柔比星白蛋白纳米粒直径在100-120nm，混悬液呈半透明状。所得吡柔比星白蛋白纳米粒混悬液实施例15中采用5％甘露醇透析的方式分离纳米粒子，纯化的纳米粒子经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中吡柔比星含量，根据含量调整装量，为10mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥48小时即可。所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和吡柔比星含量，得出白蛋白与吡柔比星的比例为0.47∶1。实施例42.阿柔比星白蛋白纯化的纳米粒子的制备将135mg的阿柔比星溶解在2ml的氯仿/乙醇(8∶1，v/v)中，然后上述溶液加入25ml的人血白蛋白溶液(8％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的阿柔比星白蛋白纳米粒直径在80-150nm，混悬液呈半透明状。所得阿柔比星白蛋白纳米粒混悬液使用5％甘露醇溶液作为透析液，采用实施例16中柱分离的方法得到纯化的纳米粒子。纯化的纳米粒子加入5％甘露醇溶液重悬，将重悬液经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中阿柔比星含量，根据含量调整装量，为10mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥48小时即可。所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和阿柔比星含量，得出白蛋白与阿柔比星的比例为0.13∶1。实施例43.卡巴他赛白蛋白纯化的纳米粒子的制备将289mg的卡巴他赛溶解在3ml的氯仿/乙醇(10∶1，v/v)中，然后上述溶液加入67ml的人血白蛋白溶液(5％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的卡巴他赛白蛋白纳米粒直径在65-85nm，混悬液呈半透明状。所得卡巴他赛白蛋白纳米粒混悬液采用实施例15中5％甘露醇透析的方法得到纯化的纳米粒子。经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中卡巴他赛含量，根据含量调整装量，为50mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥55小时即可。所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和卡巴他赛含量，得出白蛋白与卡巴他赛的比例为0.27∶1。实施例44.胺碘达隆白蛋白纯化的纳米粒子的制备将90mg的胺碘达隆溶解在2ml的氯仿/乙醇(11∶1，v/v)中，然后上述溶液加入58ml的人血白蛋白溶液(8％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的胺碘达隆白蛋白纳米粒直径在70-105nm，混悬液呈半透明状。所得胺碘达隆白蛋白纳米粒混悬液采用实施例17中实施例11中离心的方式分离纳米粒子，离心条件为21000×g离心60分钟，弃去上清液得到纯化的纳米粒子。纯化的纳米粒子加入5％甘露醇溶液重悬，将重悬液经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中胺碘达隆含量，根据含量调整装量，为10mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥57小时即可。所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和胺碘达隆含量，得出白蛋白与胺碘达隆的比例为0.43∶1。实施例45.碘塞罗宁白蛋白纯化的纳米粒子的制备将93mg的碘塞罗宁溶解在2ml的氯仿/乙醇(9∶1，v/v)中，然后上述溶液加入46ml的人血白蛋白溶液(8％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的碘塞罗宁白蛋白纳米粒直径在85-125nm，混悬液呈半透明状。所得碘塞罗宁白蛋白纳米粒混悬液采用实施例17中离心的方法分离纳米粒子，离心条件为21000×g离心60分钟，弃去上清液得到纯化的纳米粒子。纯化的纳米粒子加入5％甘露醇溶液重悬，将重悬液经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中碘塞罗宁含量，根据含量调整装量，为10mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥50小时即可。所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和碘塞罗宁含量，得出白蛋白与碘塞罗宁的比例为0.39∶1。实施例46.埃博霉素B白蛋白纯化的纳米粒子的制备将127mg的埃博霉素B溶解在2ml的氯仿/乙醇(10∶1，v/v)中，然后上述溶液加入52ml的人血白蛋白溶液(5％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的埃博霉素B白蛋白纳米粒直径在80-115nm，混悬液呈半透明状。所得埃博霉素B白蛋白纳米粒混悬液采用实施例15中5％甘露醇透析的方法得到纯化的纳米粒子，经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中埃博霉素B含量，根据含量调整装量，为10mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥65小时即可。所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和埃博霉素B含量，得出白蛋白与埃博霉素B的比例为0.14∶1。实施例47.10-羟喜树碱白蛋白纯化的纳米粒子的制备将93mg的10-羟喜树碱溶解在2ml的氯仿/乙醇(10∶1，v/v)中，然后上述溶液加入48ml的人血白蛋白溶液(5％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的10-羟喜树碱白蛋白纳米粒直径在100-135nm，混悬液呈半透明状。所得10-羟喜树碱白蛋白纳米粒混悬液采用实施例17中离心的方法分离纳米粒子，离心条件为21000×g离心60分钟，弃去上清液得到纯化的纳米粒子。纯化的纳米粒子加入5％甘露醇溶液重悬，将重悬液经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中10-羟喜树碱含量，根据含量调整装量，为20mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥72小时即可。所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和10-羟喜树碱含量，得出白蛋白与10-羟喜树碱的比例为0.26∶1。实施例48.环孢菌素白蛋白纯化的纳米粒子的制备将148mg的环孢菌素溶解在1.5ml的氯仿/乙醇(11∶1，v/v)中，然后上述溶液加入18.5ml的人血白蛋白溶液(4％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的环孢菌素蛋白纳米粒直径在100-135nm，混悬液呈半透明状。所得环孢菌素白蛋白纳米粒混悬液使用10％乳糖溶液作为透析液，采用实施例16中柱分离的方法得到纯化的纳米粒子，经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中环孢菌素含量，根据含量调整装量，为50mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥72小时即可。所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和环孢菌素含量，得出白蛋白与环孢菌素的比例为0.26∶1。实施例49.坦螺旋霉素白蛋白纯化的纳米粒子的制备将88mg的坦螺旋霉素溶解在2ml的氯仿/乙醇(8∶1，v/v)中，然后上述溶液加入18.5ml的人血白蛋白溶液(10％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的坦螺旋霉素蛋白纳米粒直径在85-105nm，混悬液呈半透明状。所得坦螺旋霉素白蛋白纳米粒混悬液使用5％甘露醇溶液作为透析液，采用实施例16中柱分离的方法得到纯化的纳米粒子，经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中环孢菌素含量，根据含量调整装量，为50mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥72小时即可。所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和坦螺旋霉素含量，得出白蛋白与坦螺旋霉素的比例为0.62∶1。实施例50.异丙酚白蛋白纯化的纳米粒子的制备将603mg的异丙酚溶解在6ml的氯仿/乙醇(10∶1，v/v)中，然后上述溶液加入73ml的人血白蛋白溶液(10％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的异丙酚白蛋白纳米粒直径在70-115nm，混悬液呈半透明状。所得异丙酚白蛋白纳米粒混悬液采用实施例17中离心的方法分离纳米粒子，离心条件为21000×g离心60分钟，弃去上清液得到纯化的纳米粒子。纯化的纳米粒子加入5％甘露醇溶液重悬，将重悬液经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中异丙酚含量，根据含量调整装量，为50mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥72小时即可。所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和异丙酚含量，得出白蛋白与异丙酚的比例为0.58∶1。实施例51.硫酸长春碱白蛋白纯化的纳米粒子的制备将1.25g的硫酸长春碱溶解在10ml的氯仿/乙醇(10∶1，v/v)中，然后上述溶液加入202ml的人血白蛋白溶液(5％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的硫酸长春碱白蛋白纳米粒直径在90-130nm，混悬液呈半透明状。所得硫酸长春碱白蛋白纳米粒混悬液采用实施例15中5％甘露醇透析的方法得到纯化的纳米粒子。经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中硫酸长春碱含量，根据含量调整装量，为50mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥72小时即可。所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和硫酸长春碱含量，得出白蛋白与硫酸长春碱的比例为0.23∶1。实施例52.依西美坦白蛋白纯化的纳米粒子的制备将155mg的依西美坦溶解在3ml的氯仿/乙醇(6∶1，v/v)中，然后上述溶液加入27ml的人血白蛋白溶液(5％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的依西美坦白蛋白纳米粒直径在70-100nm，混悬液呈半透明状。所得依西美坦白蛋白纳米粒混悬液采用实施例15中5％甘露醇透析的方法得到纯化的纳米粒子，经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中依西美坦含量，根据含量调整装量，为50mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥72小时即可。所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和依西美坦含量，得出白蛋白与依西美坦的比例为0.19∶1。实施例53.氟他胺白蛋白纯化的纳米粒子的制备将189mg的氟他胺溶解在2ml的氯仿/乙醇(6∶1，v/v)中，然后上述溶液加入38ml的人血白蛋白溶液(8％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的氟他胺白蛋白纳米粒直径在100-120nm，混悬液呈半透明状。所得氟他胺白蛋白纳米粒混悬液使用5％右旋糖酐溶液作为透析液，采用实施例16中柱分离的方法得到纯化的纳米粒子，经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中氟他胺含量，根据含量调整装量，为50mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥60小时即可。所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和氟他胺含量，得出白蛋白与氟他胺的比例为0.35∶1。实施例54.氟维司群白蛋白纯化的纳米粒子的制备将350mg的氟维司群溶解在3ml的氯仿/乙醇(6∶1，v/v)中，然后上述溶液加入67ml的人血白蛋白溶液(5％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的氟维司群白蛋白纳米粒直径在105-150nm，混悬液呈半透明状。所得氟维司群白蛋白纳米粒混悬液使用10％乳糖溶液作为透析液，采用实施例16中柱分离的方法得到纯化的纳米粒子，经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中氟维司群含量，根据含量调整装量，为20mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥60小时即可。所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和氟维司群含量，得出白蛋白与氟维司群的比例为0.29∶1。实施例55.司莫司汀白蛋白纯化的纳米粒子的制备将650mg的司莫司汀溶解在5ml的氯仿/乙醇(6∶1，v/v)中，然后上述溶液加入89ml的人血白蛋白溶液(4％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的司莫司汀白蛋白纳米粒直径在85-120nm，混悬液呈半透明状。所得司莫司汀白蛋白纳米粒混悬液采用实施例11中离心的方法分离纳米粒子，离心条件为21000×g离心60分钟，弃去上清液得到纯化的纳米粒子。纯化的纳米粒子加入5％甘露醇溶液重悬，将重悬液经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中司莫司汀含量，根据含量调整装量，为20mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥70小时即可。所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和司莫司汀含量，得出白蛋白与司莫司汀的比例为0.58∶1。实施例56.硫代秋水仙碱二聚体白蛋白纯化的纳米粒子的制备将456mg的硫代秋水仙碱二聚体溶解在5ml的氯仿/乙醇(9∶1，v/v)中，然后上述溶液加入58ml的人血白蛋白溶液(8％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的硫代秋水仙碱二聚体白蛋白纳米粒直径在65-90nm，混悬液呈半透明状。所得硫代秋水仙碱二聚体白蛋白纳米粒混悬液使用10％乳糖溶液作为透析液，采用实施例16中柱分离的方法得到纯化的纳米粒子，经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中硫代秋水仙碱二聚体含量，根据含量调整装量，为20mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥70小时即可。所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和硫代秋水仙碱二聚体含量，得出白蛋白与硫代秋水仙碱二聚体的比例为0.37∶1。实施例57.布洛芬白蛋白纯化的纳米粒子的制备将348mg的布洛芬溶解在3ml的氯仿/乙醇(11∶1，v/v)中，然后上述溶液加入62ml的人血白蛋白溶液(5％w/v)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的布洛芬白蛋白纳米粒直径在65-95nm，混悬液呈半透明状。所得布洛芬白蛋白纳米粒混悬液使用5％右旋糖酐作为透析液，采用实施例16中柱分离的方法得到纯化的纳米粒子，经0.22微米的除菌滤膜过滤，滤液中粒子粒径未发生显著改变，采用HPLC法测定溶液中布洛芬含量，根据含量调整装量，为20mg/瓶，置于冻干机中冷冻干燥50小时即可。所得冻干产品，加入注射水复溶，饼块溶解迅速，混悬液为半透明状，粒子粒径无明显改变，分别测定产品中人血白蛋白和布洛芬含量，得出白蛋白与布洛芬的比例为0.19∶1。实施例58.血清白蛋白含量影响药物对人肿瘤细胞的抑制作用使用处于对数生长期的肺腺癌细胞系SPC-A-1和乳腺癌细胞系MCF-7，将细胞接种于96孔板，过夜培养使其贴壁。之后将细胞培养液更换为无血清培养基，饥饿细胞4h。将实施例6得到的产品、粒子6和Abraxane，按照640、320、160μg/ml的终浓度(以紫杉醇计)加入到对应孔中，加药后继续培养24h，MTT法比较不同加药组的细胞抑制率差异，并绘制抑制率与药物浓度的曲线，结果见下述表格和附图12、13。由两种细胞的抑制率-药物浓度曲线图可以看出，在各浓度下，粒子6的抑制率显著大于其它两组药物(p＜0.05)，其它两组药物的抑制率没有明显差异。产品中多余的白蛋白会降低紫杉醇对肿瘤细胞的抑制作用。表19细胞抑制率MCF-7cellsSPC-A-1cells实施例59.血清白蛋白含量影响血管内皮细胞对药物的摄取将处于对数生长期的人脐静脉内皮细胞融合细胞EA.hy926按照8×105接种于6孔板，加药前更换为无血清培养基。之后分别加入实验药品，A组为粒子6，B组为实施例6产品，C组为Abraxane，D组为粒子6+0.5％的HSA单体，E组为粒子6+0.5％的HSA多聚体，各组药物的终浓度分别为50、100、200ug/ml(以紫杉醇计)。加药后，37℃孵育2h，之后去掉含药物的培养基，用PBS洗3遍，再用500ul的5％TritonX-100充分裂解细胞，使用实施例10中紫杉醇的测定方法，检测进入到EA.hy926细胞内的紫杉醇含量，比较不同实验组进入细胞的紫杉醇含量的差异，结果见下表和附图14。结果表明，A组的摄取量高于B组和C组，B组和C组间差异不大。D组对药物的摄取量高于E组。这一结果说明随HSA含量的增加血管内皮细胞对紫杉醇的摄取量降低；加入HSA多聚体组的细胞对药物的摄取量低于加入等量HSA单体组。表20细胞内药物浓度实施例60对实施例6中所使用的人血白蛋白及所得产品，以及对应的产品粒子6进行了白蛋白含量、聚合体比例、紫杉醇含量等按照实施例10中所提供方法进行了检测，结果见下表。表21不同产品中白蛋白聚合体量上述结果显示，在白蛋白纳米粒子的制备过程中白蛋白的聚合体比例显著增加，而采用本发明方法制备产品中由于总白蛋白量的显著降低，从而使单位药量的白蛋白聚合体量显著的降低。采用100K的再生纤维素超滤膜包(PXC100C50，Millipore)对人血白蛋白进行透析，得到聚合体含量较高的白蛋白溶液，采用实施例10中所提供方法检测白蛋白聚合体比例，采用凯氏定氮法测定白蛋白含量，以消除HPLC法可能存在的聚合体响应值不同带来的偏差。表22不同产品中白蛋白聚合体量单体(％)聚合体(％)透析前HSA95.84.2透析后HSA25.174.9由测试结果可以看出通过透析处理可以得到聚合体比例占多数的白蛋白溶液。实施例61.聚合体蛋白豚鼠致敏实验试验药物选用实施例60得到的HSA和poly-HSA。致敏剂量选择白蛋白给药量1mg/只和0.3mg/只两个剂量组，致敏采用腹腔注射的方式，隔日一次，共三次。同时设阳性对照组(0.2％卵白蛋白)和阴性对照组(0.9％氯化钠注射液组)。具体给药情况见下表。表23豚鼠致敏实验方案致敏给药方法：用左手手掌成杯状紧握豚鼠背使得腹部皮肤伸展，固定好动物。使豚鼠腹部抬高，头部放低，用酒精棉球将注射部位消毒后，右手持2ml一次性注射器的针头刺入皮肤。其部位是从下腹部腹中线稍偏左1mm的位置进针。针头到达皮下后，继续向前进针5mm-10mm后，再以45°角刺入腹腔。固定针尖，缓慢注入药液。注射完毕后，用干棉球压迫针眼，以防药物外流。过敏激发：激发采用静脉注射方式，在末次致敏后第10天一次激发，激发剂量为2mg/只和0.6mg/只。激发给药方法：外侧跖静脉注射，由助手将豚鼠固定好。操作者从后膝关节抓住动物肢体，压迫静脉，将腿呈伸展状态。剪去注射部位的毛(或者剪开注射部位的皮肤)，酒精棉球擦拭消毒后，可见粗大的外侧跖静脉，右手持1ml一次性注射器沿向心方向刺入血管注射。注射完后，用干棉球压迫针眼，以防流血。激发后立刻至30min详细观察每只动物的反应，过敏症状出现及消失的时间。最长观察3小时。过敏反应结果见下表。表24过敏反应症状表25全身过敏反应评价标准表26豚鼠主动过敏试验结果豚鼠主动致敏试验结果显示，在给药总蛋白量相同的情况下，白蛋白聚合体较多的样品能够产生更强的致敏作用。实施例62将2.5g的紫杉醇(CAS：33069-62-4，云南汉德生物技术有限公司)溶解在15ml的氯仿/乙醇(11∶1，v/v)中，然后上述溶液加入500ml的人血白蛋白溶液(4％w/v)(CAS：70024-90-7，广东双林生物制药有限公司)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机(型号M110-EH30K，美国MFIC公司)在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪(型号R-210，瑞士Buchi公司)中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的紫杉醇白蛋白纳米粒子平均直径为129nm，混悬液呈半透明状。混悬液可顺利经0.22微米的除菌滤膜(德国赛多利斯公司)过滤，滤后粒子粒径未发生显著改变，混悬液室温放置48小时未见有显著变化。分别采用实施例11中的离心分离法、实施例15中的透析分离法、实施例16中的柱层析分离法分离产品中的纯化的纳米粒子。结果发现在透析的过程中混悬液即出现浑浊、沉淀，无法得到纯化的纳米粒子，离心法和柱层析法能够得到纯化的纳米粒子，但是所得的粒子均在60分钟内出现浑浊、沉淀。实施例63将2.5g的紫杉醇(CAS：33069-62-4，云南汉德生物技术有限公司)溶解在15ml的氯仿/乙醇(11∶1，v/v)中，然后上述溶液加入500ml的人血白蛋白溶液(4％w/v)(CAS：70024-90-7，广东双林生物制药有限公司)，将混合物采用高剪切分散机(flukoFZ-20)匀浆2分钟，形成初乳液，然后采用高压均质机(型号M110-EH30K，美国MFIC公司)在10000-20000psi下进行均质，得到纳米乳，将纳米乳转移至旋转蒸发仪(型号R-210，瑞士Buchi公司)中，于40℃水浴加热，40mbar减压蒸发去除溶液中的有机溶剂，产生的紫杉醇白蛋白纳米粒子平均直径为128nm，混悬液呈半透明状。混悬液可顺利经0.22微米的除菌滤膜(德国赛多利斯公司)过滤，滤后粒子粒径未发生显著改变，混悬液室温放置48小时未见有显著变化。采用截留分子量30K、材质为再生纤维素的超滤膜包(PXC030C50，Millipore)，使用纯化水为透析液进行等体积透析，透析倍数为5倍。将透析后的粒子分别采用实施例11中的离心分离法、实施例15中的透析分离法、实施例16中的柱层析分离法分离产品中的纯化的纳米粒子。结果三种方法均可以得到稳定的半透明混悬液，可顺利经0.22微米的除菌滤膜(德国赛多利斯公司)过滤，滤后粒子粒径未发生显著改变，混悬液室温放置48小时未见有显著变化。通过实施例62和63的对比可见，实施例63较实施例62多了一步“使用纯化水为透析液进行等体积透析”的过程，去除了残留的有机溶剂，这对于纯化的纳米粒子的形成至关重要。实施例1-9则是采用“冷冻干燥”的方法来去除残留的有机溶剂。只有经过去除残留有机溶剂这一步骤，才能得到本发明所述的理想的“纯化的纳米粒子”。讨论：现有技术的处方人血清白蛋白与药物活性成分其中所采用的都是较高的白蛋白∶活性成分比例(例如9∶1)。本发明人出人意料地发现，在这种处方中，大量的白蛋白仅仅作为冻干制品中的保护剂和支撑剂存在。绝大多数药物(例如紫杉醇)包裹于纳米粒子中，未形成粒子的白蛋白基本上不含有药物。在现有技术的处方中，大量的人血清白蛋白分子并没有与药物分子结合。给药以后，现有技术的处方的粒子迅速崩解，药物与人体内的人血清白蛋白结合成复合物。因此现有技术的处方的多余的人血清白蛋白并不会对制剂的疗效做出贡献(参见实施例26)，反而由于其免疫原性增加安全风险(参见实施例32，25和27)。另外，多余的白蛋白可能与药物-白蛋白复合物竞争性的结合gp-60受体，从而降低血管内皮细胞对药物的摄取量(参见实施例59)。并且在制备过程中形成的白蛋白多聚体与gp-60受体结合后不能被有效内吞，始终不能将受体释放，进一步了的阻碍内皮细胞对药物的摄取，使药物的有效浓度降低。基于此，本发明人通过降低白蛋白∶活性成分比例获得了本发明的纯化的纳米粒子，并且证实仅需要少量的人血清白蛋白就可以与药物形成稳定的纳米粒子，而且本发明的纳米粒子表现出了更加优异的性质。本发明的纯化的纳米粒子及其组合物中人血清白蛋白的减少，降低了与人血清白蛋白有关的过敏和免疫反应给药后，本发明的纯化的纳米粒子能够迅速崩解与自身白蛋白结合在体内循环。本发明的纳米粒子与现有技术的处方相比，两者在动物安全性和有效性上并未发现显著差异。但是，本发明的纯化的纳米粒子及其组合物改善了人类血管内皮细胞对纳米粒子中活性成分的摄取，转运和利用。上面描述的各种具体方式可以组合形成更多的具体方式。本说明书中的和/或列在申请数据登记表中的所有的美国专利、美国专利申请的公开、美国专利申请，国外专利，国外专利申请和非专利公开，都通过引用并入本申请。应当理解在不脱离本发明精神的情况下，可作出各种改善。基于上述详述，可以对本发明的具体形式作出各种改变。总之，本发明所附权利要求不应局限于说明书和权利要求书公开的具体方式，而应当认为包含了与权利要求等同的所有范围。因此权利要求不应受到具体公开内容的限制。当前第1页1 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