对相关申请的交叉引用
基于37cfr§1.53(b)提交的本非临时申请要求于2014年12月3日提交的美国临时申请62/087127基于35usc§119(e)的权益，其通过引用整体并入本申请。
本申请涉及新颖的季铵化合物，其可用作抗体-药物缀合物(adc)的连接基。本申请也涉及含有季铵连接基的adc。本申请也涉及在人类中治疗疾病的方法。
背景技术：
使用单克隆抗体(mab)将抗癌药物直接递送至肿瘤细胞近年来已引起了大量关注。两种新的抗体-药物缀合物已被fda批准用于治疗癌症。
技术实现要素：
本申请涉及由式(i)表示的抗体-药物缀合物：
ab—(l—d)p
ab是抗体；
p是1-8；
l—d是由下式表示的化学部分：
—str—(pep)—sp—d
str是与ab共价连接的伸展基单元；
pep是连接基；
d是由下式表示的抗肿瘤剂：
其中r20和r30各自独立为c1-c6烷基，且
r10是非氢取代基；或
r30是c1-c6烷基，且r10和r20与n一起形成取代的c3-c7杂环烷基环；或
r30不存在，且r10和r20与n一起形成取代的杂芳基环；
sp—d是下式的间隔基部分：
本申请也涉及治疗癌症的方法、式(i)的抗体-药物缀合物在疗法中的用途及式(i)的抗体-药物缀合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。本申请也涉及制备式(i)的抗体-药物缀合物的方法。
附图说明
图1显示了多种cd22adc在具有wsu-dlcl2人弥漫性大b细胞淋巴瘤的scid小鼠中的效力比较。cd22adc1-2和adc2-2与媒介物组相比都对肿瘤生长显示出剂量依赖性抑制，且adc1-2显示出比adc2-2更强的抗肿瘤活性。非结合对照napi2badc对肿瘤生长具有最小的影响。
具体实施方式
本申请涉及式(i)的抗体-缀合物。
在一个实施方案中，d是具有ic50为10nm或更低的效能的抗肿瘤部分。
在一个实施方案中，pep是肽基部分。
在一个实施方案中，pep是val-cit部分。
在一个实施方案中，pep是phe-lys部分。
在一个实施方案中，pep是val-ala部分。
在一个实施方案中，pep是选自以下的非肽化学部分：：
w是-nh-杂环烷基-或杂环烷基；
y是杂芳基、芳基、-c(o)c1-c6亚烷基、c2-c6烯基、c1-c6亚烷基或-c1-c6亚烷基-nh-；
每个r1独立为c1-c10烷基、c2-c10烯基、(c1-c10烷基)nhc(nh)nh2或(c1-c10烷基)nhc(o)nh2；
r3和r2各自独立为h、c1-c10烷基、c2-c10烯基、芳基烷基或杂芳基烷基，或r3和r2一起可形成c3-c7环烷基；
r4和r5各自独立为c1-c10烷基、c2-c10烯基、芳基烷基、杂芳基烷基、(c1-c10烷基)och2-，或r4和r5可形成c3-c7环烷基环；且
p是1-8的整数。
本申请也涉及式(i)的抗体-缀合物，其由下式表示：
ab—(l—d)p
其中ab是抗体；l—d是由下式表示的化学部分：
r1是c1-c6烷基、c2-c6烯基、(c1-c6烷基)nhc(nh)nh2或(c1-c6烷基)nhc(o)nh2；且
r3和r2各自独立为h、c1-c10烷基。
本申请也涉及式(i)的抗体-缀合物，其由下式表示：
ab—(l—d)p
其中ab是抗体；l—d是下式的化学部分：
r1是c1-c6烷基、(c1-c6烷基)nhc(nh)nh2或(c1-c6烷基)nhc(o)nh2；且
r4和r5一起形成c3-c7环烷基环。
本申请也涉及式(i)的抗体-缀合物，其由下式表示：
ab—(l—d)p
其中ab是抗体；
l—d是由下式表示的化学部分：
r1是c1-c6烷基、(c1-c6烷基)nhc(nh)nh2或(c1-c6烷基)nhc(o)nh2。
本申请也涉及由下式表示的式(i)的抗体-缀合物：
其中
str是由下式表示的化学部分：
其中r6选自c1-c10亚烷基和c1-c10亚烷基-c(o)n(ra)-c2-c6亚烷基，其中每个亚烷基可被选自以下的1-5个取代基取代：卤素、三氟甲基、二氟甲基、氨基、烷基氨基、氰基、磺酰基、磺酰胺基团、亚砜基团、羟基、烷氧基、酯基团、羧酸基团、烷基硫基芳基、c3-c8环烷基、c4-c7杂环烷基、杂芳基烷基和杂芳基；
每个ra独立为h或c1-c6烷基；且
p是1、2、3或4。
本申请也涉及由下式表示的式(i)的抗体-缀合物：
其中
str是由下式表示的化学部分：
其中r6选自c1-c10亚烷基和c1-c10亚烷基-c(o)n(ra)-c2-c6亚烷基，其中每个亚烷基可被选自以下的1-5个取代基取代：卤素、三氟甲基、二氟甲基、氨基、烷基氨基、氰基、磺酰基、磺酰胺基团、亚砜基团、羟基、烷氧基、酯基团、羧酸基团、烷基硫基芳基、c3-c8环烷基、c4-c7杂环烷基、杂芳基烷基和杂芳基；
每个ra独立为h或c1-c6烷基；且
p是1、2、3或4。
本申请也涉及由下式表示的式(i)的抗体-缀合物：
其中
str是由下式表示的化学部分：
其中r6选自c1-c10亚烷基和c1-c10亚烷基-c(o)n(ra)-c2-c6亚烷基，其中每个亚烷基可被选自以下的1-5个取代基取代：卤素、三氟甲基、二氟甲基、氨基、烷基氨基、氰基、磺酰基、磺酰胺基团、亚砜基团、羟基、烷氧基、酯基团、羧酸基团、烷基硫基芳基、c3-c8环烷基、c4-c7杂环烷基、杂芳基烷基和杂芳基；
每个ra独立为h或c1-c6烷基；且
p是1、2、3或4。
本申请也涉及由下式表示的式(i)(a1)的抗体-缀合物：
其中
r1是c1-c6烷基-nh2、(c1-c6烷基)nhc(nh)nh2或(c1-c6烷基)nhc(o)nh2；且
p是1、2、3或4。
本申请也涉及由下式表示的式(i)(b1)的抗体-缀合物：
其中
p是1、2、3或4；
r1是c1-c6烷基-nh2、(c1-c6烷基)nhc(nh)nh2或(c1-c6烷基)nhc(o)nh2；且
r4和r5各自独立为c1-c6烷基，其中所述烷基是未取代的，或r4和r5可形成c3-c7环烷基环。
本申请也涉及由下式表示的式(i)(c1)的抗体-缀合物：
其中
r1是c1-c6烷基-nh2、(c1-c6烷基)nhc(nh)nh2或(c1-c6烷基)nhc(o)nh2；且
p是1、2、3或4。
在一个实施方案中，ab—(l—d)p是式(ii)的化学部分：
在一个实施方案中，ab—(l—d)p是式(iii)：
本申请也涉及式(i)、(i)(a1)、(i)(a2)的抗体-缀合物，其中y是杂芳基、芳基或烯基；且r6是c1-c10亚烷基。
本申请也涉及式(i)、(i)(a1)、(i)(a2)的抗体-缀合物，其中y是
本申请也涉及上述抗体-缀合物中的任何一种，其中y是
本申请也涉及上述抗体-缀合物中的任何一种，其中y是
本申请也涉及上述抗体-缀合物中的任何一种，其中
str是由下式表示的化学部分：
其中r6选自c1-c10亚烷基、c2-c10烯基、c3-c8环烷基、(c1-c8亚烷基)o-和c1-c10亚烷基-c(o)n(ra)-c2-c6亚烷基，其中每个亚烷基可被选自以下的1-5个取代基取代：卤素、三氟甲基、二氟甲基、氨基、烷基氨基、氰基、磺酰基、磺酰胺基团、亚砜基团、羟基、烷氧基、酯基团、羧酸基团、烷基硫基芳基、c3-c8环烷基、c4-c7杂环烷基、杂芳基烷基和杂芳基；且
每个ra独立为h或c1-c6烷基。
本申请也涉及上述抗体-缀合物中的任何一种，其中str具有下式：
其中r7选自c1-c10亚烷基、c2-c10烯基、(c1-c10亚烷基)o-、n(rc)-(c2-c6亚烷基)-n(rc)和n(rc)-(c2-c6亚烷基)；且
每个rc独立为h或c1-c6烷基。
本申请也涉及上述抗体-缀合物中的任何一种，其中
str是由下式表示的化学部分：
r6是c1-c6亚烷基。
连接基-药物
本申请也涉及式l—d的化合物，其由下式表示：
—str—(pep)—sp—d
str是与ab共价连接的伸展基单元；
pep是连接基；
d是由下式表示的抗肿瘤抗生素药物：
其中r20和r30各自独立为c1-c6烷基，且
r10是非氢取代基；或
r30是c1-c6烷基，且r10和r20与n一起形成取代的c3-c7杂环烷基环；或
r30不存在，且r10和r20与n一起形成取代的杂芳基环；且
sp—d是下式的化学部分：
本申请也涉及下式的非肽化合物：
其中
str是可与抗体共价连接的伸展基单元；
y是杂芳基、芳基、-c(o)c2-c6烯基、c2-c6烯基或-c2-c6烯基-nh-；
r1是c1-c10烷基、(c1-c10烷基)nhc(nh)nh2或(c1-c10烷基)nhc(o)nh2；
r3和r2各自独立为h、c1-c10烷基、芳基烷基或杂芳基烷基，或r3和r2一起可形成c3-c7环烷基；且
d是药物。
本申请也涉及由下式表示的非肽化合物：
其中r6是c1-c10亚烷基。
本申请也涉及由下式表示的非肽化合物：
本申请也涉及下式的非肽化合物：
其中
str是可与抗体共价连接的伸展基单元；
r1是c1-c10烷基、(c1-c10烷基)nhc(nh)nh2或(c1-c10烷基)nhc(o)nh2；且
r4和r5各自独立为c1-c10烷基、芳基烷基、杂芳基烷基、(c1-c10烷基)och2-，或r4和r5可形成c3-c7环烷基环。
本申请也涉及由下式表示的非肽化合物：
其中r6是c1-c10亚烷基；且r4和r5一起形成c3-c7环烷基环。
本申请也涉及由下式表示的非肽化合物：
本申请也涉及下式的化合物：
其中het是任选取代的杂芳基。
本申请也涉及下式的化合物：
其中q是0-5；且r11是no2或cn。
本申请也涉及下式的化合物：
本申请也涉及下式的化合物：
本申请也涉及上述式(i)(a1)(ld)、(i)(a2)(ld)、(i)(a3)(ld)、(i)(b1)(ld)、(i)(b2)(ld)、(i)(b3)(ld)、(ii)(a1)(ld)或(iii)(a1)(ld)的化合物中的任何一种，其中str具有下式：
其中r6选自c1-c10亚烷基、c3-c8环烷基、o-(c1-c8亚烷基)和c1-c10亚烷基-c(o)n(ra)-c2-c6亚烷基，其中每个亚烷基可被选自以下的1-5个取代基取代：卤素、三氟甲基、二氟甲基、氨基、烷基氨基、氰基、磺酰基、磺酰胺基团、亚砜基团、羟基、烷氧基、酯基团、羧酸基团、烷基硫基芳基、c3-c8环烷基、c4-c7杂环烷基和杂芳基；
每个ra独立为h或c1-c6烷基；
sp是—ar—rb—，其中ar是芳基或杂芳基；且
rb是(c1-c10亚烷基)o-。
本申请也涉及式(i)(a1)(ld)、(i)(a2)(ld)、(i)(a3)(ld)、(i)(b1)(ld)、(i)(b2)(ld)、(i)(b3)(ld)、(ii)(a1)(ld)、(ii)(a2)(ld)、(ii)(a3)(ld)和(iv)(a1)(ld)的化合物，其中r6是c1-c10亚烷基；
sp是—ar—rb—，其中ar是芳基；且
rb是c1-c6亚烷基。
本申请也涉及式(i)(a1)(ld)、(i)(a2)(ld)、(i)(a3)(ld)、(i)(b1)(ld)、(i)(b2)(ld)、(i)(b3)(ld)、(ii)(a1)(ld)或(iii)(a1)(ld)的任何化合物，其中r6是-(ch2)q是1-10。
本申请也涉及式(i)(a1)(ld)、(i)(a2)(ld)、(i)(a3)(ld)、(i)(b1)(ld)、(i)(b2)(ld)、(i)(b3)(ld)、(ii)(a1)(ld)、(ii)(a2)(ld)、(ii)(a3)(ld)和(iv)(a1)(ld)的化合物，其中
str是由下式表示的化学部分：
其中r6选自c1-c10亚烷基、c2-c10烯基、c3-c8环烷基、(c1-c8亚烷基)o-和c1-c10亚烷基-c(o)n(ra)-c2-c6亚烷基，其中每个亚烷基可被选自以下的1-5个取代基取代：卤素、三氟甲基、二氟甲基、氨基、烷基氨基、氰基、磺酰基、磺酰胺基团、亚砜基团、羟基、烷氧基、酯基团、羧酸基团、烷基硫基芳基、c3-c8环烷基、c4-c7杂环烷基、杂芳基烷基和杂芳基；且
每个ra独立为h或c1-c6烷基。
本申请也涉及式(i)(a1)(ld)、(i)(a2)(ld)、(i)(a3)(ld)、(i)(b1)(ld)、(i)(b2)(ld)、(i)(b3)(ld)、(ii)(a1)(ld)、(ii)(a2)(ld)、(ii)(a3)(ld)和(iv)(a1)(ld)的化合物，其中str具有下式：
其中r7选自c1-c10亚烷基、c2-c10烯基、(c1-c10亚烷基)o-、n(rc)-(c2-c6亚烷基)-n(rc)和n(rc)-(c2-c6亚烷基)；且
每个rc独立为h或c1-c6烷基。
本申请也涉及非肽化合物，其中r6是c1-c10亚烷基。
本申请也涉及上述抗体-药物缀合物中的任何一种，其中p是1。
本申请也涉及上述抗体-药物缀合物中的任何一种，其中p是2。
本申请也涉及上述抗体-药物缀合物中的任何一种，其中所述抗体结合至选自以下的多肽中的一种或多种：
cll1；bmpr1b；e16；steap1；0772p；mpf；napi2b；sema5b；pscahlg；etbr；msg783；steap2；trpm4；cripto；cd21；cd79b；fcrh2；her2；nca；mdp；il20rα；短小蛋白聚糖；ephb2r；aslg659；psca；geda；baff-r；cd22；cd79a；cxcr5；hla-dob；p2x5；cd72；ly64；fcrh1；irta2；tenb2；pmel17；tmeff1；gdnf-ra1；ly6e；tmem46；ly6g6d；lgr5；ret；ly6k；gpr19；gpr54；asphd1；酪氨酸酶；tmem118；gpr172a；muc16；和cd33。
本申请也涉及在有此需要的人类中治疗疾病的方法，其包括向所述人类施用有效量的上述实施方案中的任何一个的抗体-药物缀合物。
本申请也涉及药物组合物，其包含上述实施方案中的任何一个的抗体-药物缀合物及其药用载体。
本申请也涉及上述抗体-药物缀合物中的任何一种，其中所述抗体结合至选自以下的多肽中的一种或多种：
cll1；steap1；napi2b；steap2；trpm4；cripto；cd21；cd79b；fcrh2；her2；cd22；cd79a；cd72；ly64；ly6e；muc16；和cd33。
本申请也涉及上述抗体-药物缀合物中的任何一种，其中所述抗体结合至cd33。
本申请也涉及上述抗体-药物缀合物中的任何一种，其中所述抗体结合至cd33，且所述抗cd33抗体包含含有seqidno:11的氨基酸序列的hvr-l1、含有seqidno:12的氨基酸序列的hvr-l2、含有seqidno:13的氨基酸序列的hvr-l3、含有seqidno:14的氨基酸序列的hvr-h1、含有seqidno:15的氨基酸序列的hvr-h2和含有seqidno:16的氨基酸序列的hvr-h3。
本申请也涉及上述抗体-药物缀合物中的任何一种，其中所述抗体结合至cd33，且所述抗cd33抗体包含含有seqidno:17的氨基酸序列的vl结构域和含有seqidno:18的氨基酸序列的vh结构域。
在一些实施方案中，所述抗体-药物缀合物的抗体结合cd33。在一些实施方案中，所述抗体-药物缀合物的抗体包含(a)含有seqidno:22的氨基酸序列的hvr-h1；(b)含有seqidno:23的氨基酸序列的hvr-h2；(c)含有seqidno:24的氨基酸序列的hvr-h3；(d)含有seqidno:19的氨基酸序列的hvr-l1；(e)含有seqidno:20的氨基酸序列的hvr-l2；和(f)含有选自seqidno:21的氨基酸序列的hvr-l3。
在一些实施方案中，所述抗体包含上述实施方案中的任何一个的vh和上述实施方案中的任何一个的vl。在一个实施方案中，所述抗体包含seqidno:25和seqidno:26中相应的vl和vh序列，包括那些序列的翻译后修饰。
本申请也涉及上述抗体-药物缀合物中的任何一种，其中所述抗体结合至napi2b。
本申请也涉及上述抗体-药物缀合物中的任何一种，其中所述抗体结合至napi2b，且所述napi2b抗体包含含有seqidno:1的氨基酸序列的hvr-l1、含有seqidno:2的氨基酸序列的hvr-l2、含有seqidno:3的氨基酸序列的hvr-l3、含有seqidno:4的氨基酸序列的hvr-h1、含有seqidno:5的氨基酸序列的hvr-h2和含有seqidno:6的氨基酸序列的hvr-h3。
本申请也涉及上述抗体-药物缀合物中的任何一种，其中所述抗体结合至napi2b，且所述napi2b抗体包含含有seqidno:7的氨基酸序列的vl结构域和含有seqidno:8的氨基酸序列的vh结构域。
本申请也涉及上述抗体-药物缀合物中的任何一种，其中所述抗体结合至napi2b，且所述napi2b抗体包含seqidno:9的氨基酸序列和seqidno:10的氨基酸序列。
本申请也涉及上述抗体-药物缀合物中的任何一种，其中所述抗体结合至napi2b。
本申请也涉及上述抗体-药物缀合物中的任何一种，其中所述抗体结合至cd-22，且所述抗cd-22抗体包含含有seqidno:41的氨基酸序列的hvr-l1、含有seqidno:42的氨基酸序列的hvr-l2、含有seqidno:43的氨基酸序列的hvr-l3、含有seqidno:44的氨基酸序列的hvr-h1、含有seqidno:45的氨基酸序列的hvr-h2和含有seqidno:46的氨基酸序列的hvr-h3。
本申请也涉及上述抗体-药物缀合物中的任何一种，其中所述抗体结合至cd-22，且所述cd-22抗体包含含有seqidno:47的氨基酸序列的vl结构域和含有seqidno:48的氨基酸序列的vh结构域。
本申请也涉及上述抗体-药物缀合物中的任何一种，其中所述抗体结合至cd-22，且所述cd-22抗体包含seqidno:49的氨基酸序列和seqidno:50的氨基酸序列。
定义
除非另有说明，否则本申请使用的以下术语和短语意在具有以下含义。当本申请使用商品名称时，申请人意在独立包括商品名称产品制剂、通用名称药物和商品名称产品的活性药物成分。
本申请使用的术语“肽模拟物”或pm是指非肽化学部分。肽是氨基酸单体通过肽(酰胺)键(即当一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基反应时形成的共价化学键)连接的短链。最短的肽是由通过一个肽键连接的2个氨基酸构成的二肽，然后是三肽、四肽等。季胺化学部分包括非氨基酸化学部分。季胺化学部分也可包括被一个或多个非氨基酸化学单元隔开的一个或多个氨基酸。季胺化学部分在其化学结构的任何部分中都不含有通过肽键连接的两个或更多个相邻的氨基酸。
本申请使用的术语“氨基酸”是指甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或瓜氨酸。
本申请中的术语“抗体”以最广泛的含义使用且具体涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需要的生物活性(miller等人(2003)jour.ofimmunology170:4854-4861)。抗体可为鼠类、人类、人源化、嵌合或衍生自其它物种。抗体是免疫系统产生的能够识别和结合至特异性抗原的蛋白质。(janeway,c.,travers,p.,walport,m.,shlomchik(2001)immunobiology,第5版,garlandpublishing,newyork)。靶抗原通常具有多个被多种抗体上的cdr识别的结合位点(也称为表位)。特异性结合至不同表位的每种抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可具有多于一种的相应抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分即含有免疫特异性结合具体靶标的抗原或其部分的抗原结合位点的分子，上述靶标包括但不限于不限于癌细胞或产生与自身免疫疾病相关的自身免疫抗体的细胞。本申请公开的免疫球蛋白可为任何类型(例如igg、ige、igm、igd和iga)、免疫球蛋白分子的类别(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亚类。免疫球蛋白可衍生自任何物种。然而，在一个方面，免疫球蛋白是人类、鼠类或兔源性的。
本申请使用的术语“抗体片段”包含全长抗体的一部分，通常为其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括fab、fab’、f(ab’)2和fv片段；双体；线性抗体；微抗体(olafsen等人(2004)proteineng.design&sel.17(4):315-323)、由fab表达文库产生的片段、抗个体基因型(抗id)抗体、cdr(互补决定区)和上述任何一种的免疫特异性结合至癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的表位结合片段、单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
本申请使用的术语“单克隆抗体”是指由基本上同质的抗体群获得的抗体，即构成所述群的各个抗体是相同的，除可能天然存在的可按很少量存在的突变外。单克隆抗体针对单一抗原位点是高度特异性的。另外，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同的是，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除其特异性外，单克隆抗体由于其可在未被其它抗体污染的情况下合成而是有利的。修饰词“单克隆”表示抗体由基本上同质的抗体群获得的特征且不被解释为抗体需要通过任何具体方法产生。例如，根据本申请使用的单克隆抗体可通过首次在kohler等人(1975)nature,256:495中描述的杂交瘤方法制备或可通过重组dna方法制备(参见例如us4816567；us5807715)。单克隆抗体也可使用例如在clackson等人(1991)nature,352:624-628；marks等人(1991)j.mol.biol.,222:581-597中描述的技术由噬菌体抗体文库分离。
本申请中的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体及上述抗体的片段，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自具体物种或属于具体抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与衍生自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，只要它们显示出所需要的生物活性(us4816567；和morrison等人(1984)proc.natl.acad.sci.usa,81:6851-6855)。本申请关注的嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其包含衍生自非人类灵长类动物(例如旧世界猴、猿等)的可变域抗原结合序列和人类恒定区序列。
本申请使用的术语“完整抗体”是包含vl和vh结构域及轻链恒定域(cl)和重链恒定域ch1、ch2和ch3的抗体。恒定域可为天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。完整抗体可具有一种或多种“效应子功能”，其是指可归因于抗体的fc恒定区(天然序列fc区或氨基酸序列变体fc区)的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括c1q结合；补体依赖性细胞毒性；fc受体结合；由细胞介导的抗体依赖性细胞毒性(adcc)；吞噬；及细胞表面受体例如b细胞受体和bcr的下调。
本申请使用的术语“fc区”是指免疫球蛋白重链的含有恒定区的至少一部分的c末端区。所述术语包括天然序列fc区和变体fc区。在一个实施方案中，人igg重链fc区由cys226或由pro230延伸到重链的羧基末端。然而，fc区的c末端赖氨酸(lys447)可存在或可不存在。除非本申请另有说明，否则fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号符合在kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md,1991中描述的eu编号系统(也称为eu索引)。
本申请使用的术语“框架”或“fr”是指除高变区(hvr)残基外的可变域残基。可变域的fr通常由四个fr结构域即fr1、fr2、fr3和fr4构成。因此，hvr和fr序列通常在vh(或vl)中按以下顺序出现：fr1-h1(l1)-fr2-h2(l2)-fr3-h3(l3)-fr4。完整抗体取决于其重链的恒定域的氨基酸序列而可归属于不同的“类别”。完整免疫球蛋白抗体有五种主要类别即iga、igd、ige、igg和igm，且其中几种可进一步分为“亚类”(同工型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga和iga2。与不同类别的抗体对应的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是已知的。ig形式包括铰链修饰或无铰链形式(roux等人(1998)j.immunol.161:4083-4090；lund等人(2000)eur.j.biochem.267:7246-7256；us2005/0048572；us2004/0229310)。
本申请使用的术语“人抗体”是指以下抗体，其具有与由人类或人类细胞产生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列或由使用人抗体库或其它人抗体编码序列的非人类来源衍生。关于人抗体的该定义具体排除了包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。
本申请使用的术语“人共有框架”是指以下框架，其代表了在对人免疫球蛋白vl或vh框架序列进行的选择中最常出现的氨基酸残基。通常，从可变域序列的亚组中对人免疫球蛋白vl或vh序列进行选择。通常，序列的亚组是kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,nihpublication91-3242,bethesdamd(1991),第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于vl，亚组是上述kabat等人中的亚组κi。在一个实施方案中，对于vh，亚组是上述kabat等人中的亚组iii。
本申请使用的术语“人源化抗体”是指包含来自非人类hvr的氨基酸残基和来自人fr的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有可变域(至少一个且通常两个)，其中所有或基本上所有hvr(例如cdr)对应于非人类抗体的那些hvr，且所有或基本上所有fr对应于人抗体的那些fr。人源化抗体任选可包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体例如非人类抗体的“人源化形式”是指已进行人源化的抗体。
本申请使用的术语“高变区”或“hvr”是指抗体可变域的每个以下区域，其在序列中是高度可变的和/或形成结构上限定的环(“高变环”)。通常，天然四链抗体包含六个hvr；vh中有三个(h1、h2、h3)，且vl中有三个(l1、l2、l3)。hvr通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(cdr)的氨基酸残基，后者具有最高的序列变异性和/或参与抗原识别。示例性高变环出现在氨基酸残基26-32(l1)、50-52(l2)、91-96(l3)、26-32(h1)、53-55(h2)和96-101(h3)处。(chothia和lesk,j.mol.biol.196:901-917(1987)。示例性cdr(cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3、cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3)出现在l1的氨基酸残基24-34、l2的氨基酸残基50-56、l3的氨基酸残基89-97、h1的氨基酸残基31-35b、h2的氨基酸残基50-65和h3的氨基酸残基95-102处。(kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)。除vh中的cdr1外，cdr通常包含形成高变环的氨基酸残基。cdr也包含“特异性决定残基”或“sdr”，其为接触抗原的残基。sdr包含在称为短缩cdr或a-cdr的cdr的区域中。示例性a-cdr(a-cdr-l1、a-cdr-l2、a-cdr-l3、a-cdr-h1、a-cdr-h2和a-cdr-h3)出现在l1的氨基酸残基31-34、l2的氨基酸残基50-55、l3的氨基酸残基89-96、h1的氨基酸残基31-35b、h2的氨基酸残基50-58和h3的氨基酸残基95-102处。(参见almagro和fransson,front.biosci.13:1619-1633(2008)。除非另有说明，否则本申请根据上述kabat等人对可变域中的hvr残基和其它残基(例如fr残基)进行编号。
本申请使用的术语“可变区”或“可变域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链(分别为vh和vl)的可变域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(fr)和三个高变区(hvr)。(参见例如kindt等人,kubyimmunology,第6版,w.h.freemanandco.,第91页(2007)。单个vh或vl结构域可足以赋予抗原结合特异性。另外，结合具体抗原的抗体可使用来自结合所述抗原的抗体的vh或vl结构域来分离以分别筛选互补的vl或vh结构域的文库。参见例如portolano等人,j.immunol.150:880-887(1993)；clarkson等人,nature352:624-628(1991)。
本申请使用的术语“载体”是指以下核酸分子，其能够使与其连接的另一种核酸得以传播。所述术语包括作为自身复制核酸结构的载体及引入到其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够引导与它们可操作地连接的核酸的表达。上述载体在本申请中称为“表达载体”。
本申请使用的术语“游离的半胱氨酸”是指已被工程化成亲本抗体的具有硫醇官能团(-sh)的且不配对为分子内或分子间二硫键的半胱氨酸残基。
本申请使用的术语“连接基”、“连接基单元”或“连接”是指包含以下原子链的化学部分，所述原子链将药物部分共价连接至抗体。在各个实施方案中，连接基是被指定为l的二价基团。
本申请使用的术语“药物部分”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于放射性同位素(例如at211、i131、i125、y90、re186、re188、sm153、bi212、p32、pb212和lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如甲氨蝶呤、阿霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素c、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，例如溶核酶；及下述各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
除非在权利要求中另有定义，否则本申请使用的术语“酰基”是指基团-c(o)r’，其中r’是各自如本申请所定义的烷基、c3-c6环烷基或杂环基。
除非在权利要求中另有定义，否则本申请使用的术语“烷氧基”是指基团-or’，其中r’是如上定义的c1-c4烷基或c3-c6环烷基。“烷氧基”的实例包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基、丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、异丁氧基、环丙氧基和环丁氧基及其卤化形式例如氟甲氧基和二氟甲氧基。
除非在权利要求中另有定义，否则本申请使用的术语“烷基”是指具有1-12个(c1-c12)碳原子的直链或支链的单价或二价的烃链基团，其可为未取代的或以多个取代度被取代，例如包括在本申请中的一个、二个、三个、四个、五个或六个。取代基的实例选自卤素、三氟甲基、二氟甲基、氨基、烷基氨基、氰基、磺酰基、磺酰胺基团、亚砜基团、羟基、烷氧基、酯基团、羧酸基团和烷基硫基。本申请使用的“烷基”的实例包括但不限于甲基(me、-ch3)、乙基(et、-ch2ch3)、1-丙基(n-pr、正丙基、-ch2ch2ch3)、2-丙基(i-pr、异丙基、-ch(ch3)2)、1-丁基(n-bu、正丁基、-ch2ch2ch2ch3)、2-甲基-1-丙基(i-bu、异丁基、-ch2ch(ch3)2)、2-丁基(s-bu、仲丁基、-ch(ch3)ch2ch3)、2-甲基-2-丙基(t-bu、叔丁基、-c(ch3)3)、1-戊基(正戊基、-ch2ch2ch2ch2ch3)、2-戊基(-ch(ch3)ch2ch2ch3)、3-戊基(-ch(ch2ch3)2)、2-甲基-2-丁基(-c(ch3)2ch2ch3)、3-甲基-2-丁基(-ch(ch3)ch(ch3)2)、3-甲基-1-丁基(-ch2ch2ch(ch3)2)、2-甲基-1-丁基(-ch2ch(ch3)ch2ch3)、1-己基(-ch2ch2ch2ch2ch2ch3)、2-己基(-ch(ch3)ch2ch2ch2ch3)、3-己基(-ch(ch2ch3)(ch2ch2ch3))、2-甲基-2-戊基(-c(ch3)2ch2ch2ch3)、3-甲基-2-戊基(-ch(ch3)ch(ch3)ch2ch3)、4-甲基-2-戊基(-ch(ch3)ch2ch(ch3)2)、3-甲基-3-戊基(-c(ch3)(ch2ch3)2)、2-甲基-3-戊基(-ch(ch2ch3)ch(ch3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-c(ch3)2ch(ch3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-ch(ch3)c(ch3)3及其二价(“亚烷基”)和取代形式。取代的烷基的实例包括但不限于羟基甲基、二氟甲基和三氟甲基。
除非在权利要求中另有定义，否则本申请使用的术语“烯基”是指任何长度为2-8个碳原子(c2-c10)的具有至少一个不饱和位点即碳-碳sp2双键的直链或支链的一价或二价的烃链基团，其中烯基可任选独立被一个或多个以上在关于“烷基”的定义中描述的取代基取代且包括具有“顺式”和“反式”取向或“e”和“z”取向的基团。烯基的实例包括但不限于乙烯基(-ch＝ch2)、丙-1-烯基(-ch＝chch3)、丙-2-烯基(-ch2ch＝ch2)、2-甲基丙-1-烯基、丁-1-烯基、丁-2-烯基、丁-3-烯基、丁-1,3-二烯基、2-甲基丁-1,3-二烯基、己-1-烯基、己-2-烯基、己-3-烯基、己-4-烯基、己-1,3-二烯基及其二价(“亚烯基”)和取代形式。
除非在权利要求中另有定义，否则本申请使用的术语“炔基”是指任何长度为2-8个碳原子(c2-c10)的具有至少一个不饱和位点即碳-碳sp叁键的直链或支链的一价或二价的烃基，其中炔基可任选独立被一个或多个以上在关于烷基的定义中描述的取代基取代，炔基的实例包括但不限于乙炔基(-c≡ch)、丙-1-炔基(-c≡cch3)、丙-2-炔基(炔丙基，-ch2c≡ch)、丁-1-炔基、丁-2-炔基和丁-3-炔基及其二价(“亚炔基”)和取代形式。
除非在权利要求中另有定义，否则本申请使用的术语“烷基氨基”是指基团-nr’r”，其中r’是h、c1-c6烷基或c3-c6环烷基，且r”是c1-c6烷基或c3-c6环烷基，烷基氨基的实例包括但不限于甲基氨基、二甲基氨基、乙基氨基、二乙基氨基、丙基氨基和环丙基氨基。
除非在权利要求中另有定义，否则本申请使用的术语“酰胺”是指基团-c(o)nr’r”，其中r’和r”各自独立为h、c1-c6烷基或c3-c6环烷基；酰胺的实例包括但不限于-c(o)nh2、-c(o)nhch3和-c(o)n(ch3)2。
除非在权利要求中另有定义，否则本申请使用的术语“芳基”是指芳烃环系。环系可为单环或稠合多环(例如二环、三环等)和取代或未取代的。在各个实施方案中，单环芳基环是c5-c10或c5-c7或c5-c6，其中这些碳数是指形成环系的碳原子的数目。c6环系即苯基环是一种芳基。在各个实施方案中，多环是二环芳基，其中二环芳基的实例包括c8-c12或c9-c10。具有10个碳原子的萘基环是多环芳基。用于芳基的取代基的实例描述在以下关于“任选取代”的定义中。
除非在权利要求中另有定义，否则本申请使用的术语“氰基”是指基团-cn。
除非在权利要求中另有定义，否则本申请使用的“环烷基”是指非芳族的取代或未取代的饱和或部分不饱和的烃环基团。取代基的实例描述在关于“任选取代”的定义中。在一个实例中，环烷基具有3-12个碳原子(c3-c12)。在其它实例中，环烷基是c3-c8、c3-c10或c5-c10。在其它实例中，作为单环的环烷基是c3-c8、c3-c6或c5-c6。在另一个实例中，作为二环的环烷基是c7-c12。在另一个实例中，作为螺环系统的环烷基是c5-c12。单环环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、全氘代环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环己二烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、环十一烷基和环十二烷基。具有7-12个环原子的二环环烷基的示例性排列包括但不限于[4,4]、[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]环系。示例性桥接二环环烷基包括但不限于二环[2.2.1]庚烷、二环[2.2.2]辛烷和二环[3.2.2]壬烷。螺环环烷基的实例包括螺[2.2]戊烷、螺[2.3]己烷、螺[2.4]庚烷、螺[2.5]辛烷和螺[4.5]癸烷。
除非在权利要求中另有定义，否则本申请使用的术语“酯”是指基团-c(o)or’，其中r’是c1-c6烷基或c3-c6环烷基。
除非在权利要求中另有定义，否则本申请使用的术语“杂环”、“杂环烷基”或“杂环基”是指含有2-12个环碳原子和1-3个环杂原子的未取代和取代的单环或多环的非芳族的环系。多环环系可为稠合二环或三环、螺环或桥接的。杂原子的实例包括n、o和s，包括n-氧化物、硫氧化物和二氧化物。在一个实施方案中，环为3-8元且完全饱和或具有一个或多个不饱和度。在本定义中包括多个取代度。取代基的实例如下定义。“杂环”基团的实例包括但不限于四氢呋喃基、吡喃基、1,4-二噁烷基、1,3-二噁烷基、氧杂环戊烷基、氧杂环丁烷基、2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基、哌啶基、吡咯烷基、吗啉基、氮杂环丁烷基、哌嗪基、吡咯烷酮基、哌嗪酮基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基及其各种互变异构体。
除非在权利要求中另有定义，否则本申请使用的术语“杂芳基”是指含有1-9个碳和至少一个杂原子的芳族环系。杂原子的实例包括n、o和s。杂芳基可为单环或多环和取代或未取代的。单环杂芳基可在环中具有2-6个环碳原子和1-3个环杂原子，而多环杂芳基可含有3-9个环碳原子和1-5个环杂原子。多环杂芳基环可含有稠合、螺环或桥接的环结合方式，例如二环杂芳基是一种多环杂芳基。二环杂芳基环可含有8-12个成员原子。单环杂芳基环可含有5-8个成员原子(碳和杂原子)。示例性杂芳基包括但不限于苯并呋喃基、苯并噻吩基、呋喃基、咪唑基、吲哚基、氮杂吲哚基、氮杂苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、苯并咪唑基、四嗪基、四唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、三嗪基、三唑基、噻唑基和噻吩基。用于杂芳基的取代基的实例描述在以下关于“任选取代”的定义中。
除非在权利要求中另有定义，否则本申请使用的术语“芳基烷基”是指基团(芳基)c1-c3烷基。
除非在权利要求中另有定义，否则本申请使用的术语“脲”是指基团-nr’c(o)nr”，其中r’和r”各自独立为h、c1-c6烷基或c3-c6环烷基。
除非在权利要求中另有定义，否则本申请使用的术语“任选”是指随后描述的事件可发生或可不发生且包括发生的事件和不发生的事件。
除非另有定义，否则本申请使用的短语“任选取代”、“取代”或其变体是指任选被一个或多个例如一个、两个或三个取代基取代，包括多个取代度。所述短语不应被解释为对本申请描述和描绘的取代的重复。示例性任选取代基包括酰基、c1-c6烷基、磺酰基、氨基、磺酰胺基团、亚砜基团、烷氧基、氰基、卤素、脲基团、酯基团、羧酸基团、酰胺基团、羟基、氧代和硝基。
除非在权利要求中另有定义，否则本申请使用的术语“治疗”是指缓解所述病症，消除或减少所述病症的一种或多种症状，减缓或消除所述病症的进展。
除非在权利要求中另有定义，否则本申请使用的术语“有效量”是指药物或药剂的以下量，其将引起组织、系统、动物或人类的生物或医药响应，而这是例如研究人员或临床医生所寻求的。
除非在权利要求中另有定义，否则本申请使用的术语“治疗有效量”是指以下任何量，其与未接受上述量的相应受试者相比实现对疾病、病症或副作用的治疗或降低疾病或病症的进展速率。所述术语在其范围内也包括可有效增强正常生理功能的量。为了在疗法中使用，治疗有效量的式i的化合物及其盐可按原料化学品形式施用。另外，活性成分可按药物组合物形式提供。
本申请也涉及实验部分中的任何一个实施例。
本申请使用的术语“药用盐”是指抗体-药物缀合物(adc)或连接基-药物部分的药用有机或无机盐。示例性盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即1,1’-亚甲基-二(2-羟基-3-萘甲酸盐))。药用盐可包含另一种分子例如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其它抗衡离子。抗衡离子可为使母体化合物上的电荷得以稳定的任何有机或无机部分。另外，药用盐在其结构中可具有多于一个荷电原子。当多个荷电原子是药用盐的一部分时，可具有多个抗衡离子。因此，药用盐可具有一个或多个荷电原子和/或一个或多个抗衡离子。
非药用的其它盐可用于制备本申请化合物，且这些盐应被认为构成本申请另一个方面。这些盐例如草酸盐或三氟乙酸盐虽然本身不是药用的，但是可用于制备可用作获得本申请化合物及其药用盐的中间体的盐。
本申请化合物可按固体或液体形式存在。在固体状态下，其可按结晶或非结晶形式存在或按其混合物形式存在。技术人员将认识到的是，对于结晶或非结晶化合物来说，可形成药用溶剂化物。在结晶溶剂化物中，溶剂分子在结晶过程中进到晶格中。溶剂化物可涉及非水溶剂例如但不限于乙醇、异丙醇、dmso、乙酸、乙醇胺或乙酸乙酯或可涉及水作为进到晶格中的溶剂。其中水是进到晶格中的溶剂的溶剂化物通常称为“水合物”。水合物包括化学计量的水合物及含有可变量的水的组合物。本申请包括所有上述溶剂化物。
技术人员还将认识到的是，以结晶形式存在的包括其各种溶剂化物在内的本申请某些化合物可显示出多态性(即以不同结晶结构出现的能力)。这些不同的结晶形式通常称为“多晶型物”。本申请包括所有上述多晶型物。多晶型物具有相同的化学组成，但是在结晶固态的堆积、几何排列和其它描述性性质方面是不同的。因此，多晶型物可具有不同的物理性质，例如形状、密度、硬度、可变形性、稳定性和溶解性。多晶型物通常显示出不同的熔点、ir光谱和x射线粉末衍射图，其可用于鉴定。技术人员将认识到的是，不同的多晶型物可例如通过改变或调节用于制备化合物的反应条件或试剂来产生。例如，温度、压力或溶剂的变化可导致多晶型物。另外，一种多晶型物可在某些条件下自发地转化成另一种多晶型物。
本申请化合物或其盐可按立体异构形式存在(例如其含有一个或多个不对称碳原子)。单独的立体异构体(对映异构体和非对映异构体)及其混合物包括在本申请范围内。类似地，应理解的是，式(i)的化合物或盐可按与式(i)所示不同的互变异构形式存在，且这些也包括在本申请范围内。应理解的是，本申请包括上述具体组的所有组合和子集。本申请范围包括立体异构体的混合物及纯化的对映异构体或富含对映异构体/非对映异构体的混合物。应理解的是，本申请包括上述具体组的所有组合和子集。
本申请也包括本申请化合物的同位素标记形式，其中一个或多个原子被替代为原子质量或质量数与通常在自然界中发现的原子质量或质量数不同的原子。可引入到本申请化合物及其药用盐中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘和氯的同位素，例如2h、3h、11c、13c、14c、15n、17o、18o、31p、32p、35s、18f、36cl、123i和125i。
含有上述同位素和/或其它原子的其它同位素的本申请化合物和所述化合物的药用盐在本申请范围内。经同位素标记的本申请化合物例如引入有放射性同位素例如3h、14c的那些本申请化合物可用于药物和/或底物组织分布测定。氚即3h和碳-14即14c同位素由于其易于制备和检测而经常使用。11c和18f同位素可用于pet(正电子发射断层扫描术)，且125i同位素可用于spect(单光子发射计算机断层扫描术)，都可用于脑成像。另外，用较重的同位素例如氘即2h进行的替代可提供由于较大的代谢稳定性而带来的某些治疗优点例如增加的体内半衰期或降低的剂量需求且因此在一些情况下可为优选的。经同位素标记的本申请式i的化合物和以下化合物通常可如下制备：通过用容易获得的经同位素标记的试剂替代未经同位素标记的试剂来进行在以下方案和/或实施例中公开的方法。
adc的药物组合物
本申请治疗性抗体-药物缀合物(adc)的药物制剂通常用药用胃肠外媒介物制备成用于胃肠外给药即推注、静脉内注射、肿瘤内注射且呈单位剂量注射用形式。具有所需纯度的抗体-药物缀合物(adc)任选与药用稀释剂、载体、赋形剂或稳定剂(remington’spharmaceuticalsciences(1980)第16版,osol,a.编辑)混合成冻干制剂或水性溶液剂形式。
半胱氨酸工程化抗体
本申请化合物包括抗体-药物缀合物，其包含半胱氨酸工程化抗体，其中野生型或亲本抗体的一个或多个氨基酸被半胱氨酸置换。任何形式的抗体可如此工程化即突变。例如，可对亲本fab抗体片段进行工程化以形成半胱氨酸工程化fab，其在本申请中称为“thiofab”。类似地，可对亲本单克隆抗体进行工程化以形成“thiomab”。应注意的是，单位点突变在thiofab中产生一个工程化半胱氨酸残基，而单位点突变在thiomab中由于igg抗体的二聚体性质而产生两个工程化半胱氨酸残基。针对新引入的工程化半胱氨酸巯基的反应性对具有所置换(“工程化”)的半胱氨酸(cys)残基的突变体进行评估。巯基反应性值是范围为0至1.0的相对数值且可针对任何半胱氨酸工程化抗体进行测量。本申请半胱氨酸工程化抗体的巯基反应性值为0.6至1.0、0.7至1.0或0.8至1.0。为了通过致突变来制备半胱氨酸工程化抗体，通过本领域已知的多种方法来制备对起始多肽的氨基酸序列变体进行编码的dna。这些方法包括但不限于通过对先前制备的编码多肽的dna进行由位点引导(或由寡核苷酸介导)的致突变、pcr致突变和盒式致突变来制备。重组抗体的变体也可通过限制性片段操作或通过用合成的寡核苷酸进行重叠延伸pcr来构建。致突变引物编码半胱氨酸密码子置换。标准致突变技术可用于产生编码上述突变型半胱氨酸工程化抗体的dna。一般指导可参见sambrook等人,molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,1989；和ausubel等人,currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingandwiley-interscience,newyork,n.y.,1993。
可将半胱氨酸工程化在抗体的反应性位点且不形成链内或分子间二硫键(junutula等人,2008bnaturebiotech.,26(8):925-932；dornan等人(2009)blood114(13):2721-2729；us7521541；us7723485；wo2009/052249，shen等人(2012)naturebiotech.,30(2):184-191；junutula等人(2008)jourofimmun.methods332:41-52)。工程化半胱氨酸巯基可与具有巯基反应性亲电基团例如马来酰亚胺或α-卤代酰胺的本申请连接基试剂或连接基-药物中间体反应以形成具有半胱氨酸工程化抗体(thiomabs)和药物(d)部分的adc。因此，可设计、控制和知晓药物部分的位置。可控制药物负载，这是因为工程化半胱氨酸巯基通常以高收率与巯基反应性连接基试剂或连接基-药物中间体反应。通过在重链或轻链上的一个位点进行置换对抗体进行工程化以引入半胱氨酸而在对称抗体上得到两个新的半胱氨酸。可实现近2的药物负载，且缀合产物adc具有近同质性。
本申请半胱氨酸工程化抗体优选保留对其野生型亲本抗体对应物的抗原结合能力。因此，半胱氨酸工程化抗体能够与抗原优选特异性结合。上述抗原包括例如肿瘤相关抗原(taa)、细胞表面受体蛋白和其它细胞表面分子、跨膜蛋白、信号传导蛋白、细胞存活调节因子、细胞增殖调节因子、与组织发育或分化相关(例如已知或怀疑在功能上促进组织发育或分化)的分子、淋巴因子、细胞因子、参与细胞周期调节的分子、涉及血管发生的分子和与血管发生相关(例如已知或怀疑在功能上促进血管发生)的分子。肿瘤相关抗原可为簇分化因子(即cd蛋白)。半胱氨酸工程化抗体能够结合的抗原可为上述类别之一的子集的成员，其中所述类别的其它子集包括具有独特特征(就所关注的抗原而言)的其它分子/抗原。
制备半胱氨酸工程化抗体以通过对链内二硫化物基团进行还原和再氧化而与连接基-药物中间体缀合。
肿瘤相关抗原
可在治疗癌症中用于本申请抗体-药物缀合物的抗体(包括但不限于半胱氨酸工程化抗体)包括但不限于针对细胞表面受体和肿瘤相关抗原(taa)的抗体。某些肿瘤相关抗原是本领域已知的且可使用本领域已知的方法和信息来制备以用于产生抗体。为了发现用于癌症诊断和治疗的有效细胞靶标，研究人员已试图鉴定与一种或多种正常非癌细胞相比在一种或多种具体类型的癌细胞的表面上特异性表达的跨膜肿瘤相关多肽或其它肿瘤相关多肽。通常，与非癌细胞的表面相比，上述肿瘤相关多肽在癌细胞的表面上较丰富地表达。对上述肿瘤相关细胞表面抗原多肽的鉴定已能够通过基于抗体的疗法较特异性地靶向于癌细胞以进行破坏。
肿瘤相关抗原taa的实例包括但不限于下列那些。为了方便起见，以下列出了与这些抗原相关的都是本领域已知的信息且遵循nationalcenterforbiotechnologyinformation(ncbi)的核酸和蛋白质序列鉴定协约包括名称、替代名称、genbank登录号和主要参考文献。与下列taa对应的核酸和蛋白质序列可在公共数据库例如genbank中获得。抗体所靶向的肿瘤相关抗原包括以下所有氨基酸序列变体和同工型，其与在所引用的参考文献中鉴定的序列具有至少约70％、80％、85％、90％或95％序列同一性和/或显示出与具有在所引用的参考文献中发现的序列的taa基本上相同的生物性质或特征。例如，具有变体序列的taa通常能够与以下抗体特异性结合，所述抗体与具有所列相应序列的taa特异性结合。本申请具体记载的参考文献中的序列和内容通过引用明确地并入本申请。
(1)bmpr1b(骨形态发生蛋白受体ib型,genbank登录号nm_001203)
tendijke,p.等人,science264(5155):101-104(1994),oncogene14(11):1377-1382(1997)；wo2004063362(权利要求2)；wo2003042661(权利要求12)；us2003134790a1(第38-39页)；wo2002102235(权利要求13；第296页)；wo2003055443(第91-92页)；wo200299122(实施例2；第528-530页)；wo2003029421(权利要求6)；wo2003024392(权利要求2；图112)；wo200298358(权利要求1；第183页)；wo200254940(第100-101页)；wo200259377(第349-350页)；wo200230268(权利要求27；第376页)；wo200148204(实施例；图4)
np_001194骨形态发生蛋白受体ib型/pid＝np_001194.1-
交叉引用:mim:603248；np_001194.1；ay065994
(2)e16(lat1,slc7a5,genbank登录号nm_003486)
biochem.biophys.res.commun.255(2),283-288(1999),nature395(6699):288-291(1998),gaugitsch,h.w.等人(1992)j.biol.chem.267(16):11267-11273；wo2004048938(实施例2)；wo2004032842(实施例iv)；wo2003042661(权利要求12)；wo2003016475(权利要求1)；wo200278524(实施例2)；wo200299074(权利要求19；第127-129页)；wo200286443(权利要求27；第222,393页)；wo2003003906(权利要求10；第293页)；wo200264798(权利要求33；第93-95页)；wo200014228(权利要求5；第133-136页)；us2003224454(图3)；wo2003025138(权利要求12；第150页)；
np_003477溶质载体家族7(阳离子氨基酸转运蛋白,y+系统),成员5/pid＝np_003477.3-智人
交叉引用:mim:600182；np_003477.3；nm_015923；nm_003486_1
(3)steap1(前列腺6跨膜上皮抗原,genbank登录号nm_012449)
cancerres.61(15),5857-5860(2001),hubert,r.s.等人(1999)proc.natl.acad.sci.u.s.a.96(25):14523-14528；wo2004065577(权利要求6)；wo2004027049(图1l)；ep1394274(实施例11)；wo2004016225(权利要求2)；wo2003042661(权利要求12)；us2003157089(实施例5)；us2003185830(实施例5)；us2003064397(图2)；wo200289747(实施例5；第618-619页)；wo2003022995(实施例9；图13a,实施例53；第173页,实施例2；图2a)；
np_036581前列腺六跨膜上皮抗原
交叉引用:mim:604415；np_036581.1；nm_012449_1
(4)0772p(ca125,muc16,genbank登录号af361486)
j.biol.chem.276(29):27371-27375(2001)；wo2004045553(权利要求14)；wo200292836(权利要求6；图12)；wo200283866(权利要求15；第116-121页)；us2003124140(实施例16)；交叉引用:gi:34501467；aak74120.3；af361486_1
(5)mpf(mpf,msln,smr,巨核细胞增强因子,间皮素,genbank登录号nm_005823)yamaguchi,n.等人,biol.chem.269(2),805-808(1994),proc.natl.acad.sci.u.s.a.96(20):11531-11536(1999),proc.natl.acad.sci.u.s.a.93(1):136-140(1996),j.biol.chem.270(37):21984-21990(1995)；wo2003101283(权利要求14)；(wo2002102235(权利要求13；第287-288页)；wo2002101075(权利要求4；第308-309页)；wo200271928(第320-321页)；wo9410312(第52-57页)；交叉引用:mim:601051；np_005814.2；nm_005823_1
(6)napi2b(napi-3b,nptiib,slc34a2,溶质载体家族34(磷酸钠),成员2,ii型钠依赖性磷酸转运蛋白3b,genbank登录号nm_006424)
j.biol.chem.277(22):19665-19672(2002),genomics62(2):281-284(1999),feild,j.a.等人(1999)biochem.biophys.res.commun.258(3):578-582)；wo2004022778(权利要求2)；ep1394274(实施例11)；wo2002102235(权利要求13；第326页)；ep875569(权利要求1；第17-19页)；wo200157188(权利要求20；第329页)；wo2004032842(实施例iv)；wo200175177(权利要求24；第139-140页)；
交叉引用:mim:604217；np_006415.1；nm_006424_1
(7)sema5b(flj10372,kiaa1445,mm.42015,sema5b,semag,信号素5bhlog,sema结构域,7凝血酶敏感蛋白重复(1型和1型样),跨膜结构域(tm)和短胞质结构域,(信号素)5b,genbank登录号ab040878)
nagaset.等人(2000)dnares.7(2):143-150；wo2004000997(权利要求1)；wo2003003984(权利要求1)；wo200206339(权利要求1；第50页)；wo200188133(权利要求1；第41-43,48-58页)；wo2003054152(权利要求20)；wo2003101400(权利要求11)；
登录:q9p283；embl；ab040878；baa95969.1.genew；hgnc:10737；
(8)pscahlg(2700050c12rik,c530008o16rik,rikencdna2700050c12,rikencdna2700050c12基因,genbank登录号ay358628)；ross等人(2002)cancerres.62:2546-2553；us2003129192(权利要求2)；us2004044180(权利要求12)；us2004044179(权利要求11)；us2003096961(权利要求11)；us2003232056(实施例5)；wo2003105758(权利要求12)；us2003206918(实施例5)；ep1347046(权利要求1)；wo2003025148(权利要求20)；
交叉引用:gi:37182378；aaq88991.1；ay358628_1
(9)etbr(内皮缩血管肽b型受体,genbank登录号ay275463)；
nakamutam.等人,biochem.biophys.res.commun.177,34-39,1991；ogaway.等人,biochem.biophys.res.commun.178,248-255,1991；araih.等人,jpn.circ.j.56,1303-1307,1992；araih.等人,j.biol.chem.268,3463-3470,1993；sakamotoa.,yanagisawam.等人,biochem.biophys.res.commun.178,656-663,1991；elshourbagyn.a.等人,j.biol.chem.268,3873-3879,1993；haendlerb.等人,j.cardiovasc.pharmacol.20,s1-s4,1992；tsutsumim.等人,gene228,43-49,1999；strausbergr.l.等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.99,16899-16903,2002；bourgeoisc.等人,j.clin.endocrinol.metab.82,3116-3123,1997；okamotoy.等人,biol.chem.272,21589-21596,1997；verheijj.b.等人,am.j.med.genet.108,223-225,2002；hofstrar.m.w.等人,eur.j.hum.genet.5,180-185,1997；puffenbergere.g.等人,cell79,1257-1266,1994；attiet.等人,hum.mol.genet.4,2407-2409,1995；auricchioa.等人,hum.mol.genet.5:351-354,1996；amielj.等人,hum.mol.genet.5,355-357,1996；hofstrar.m.w.等人,nat.genet.12,445-447,1996；svenssonp.j.等人,hum.genet.103,145-148,1998；fuchss.等人,mol.med.7,115-124,2001；pingaultv.等人(2002)hum.genet.111,198-206；wo2004045516(权利要求1)；wo2004048938(实施例2)；wo2004040000(权利要求151)；wo2003087768(权利要求1)；wo2003016475(权利要求1)；wo2003016475(权利要求1)；wo200261087(图1)；wo2003016494(图6)；wo2003025138(权利要求12；第144页)；wo200198351(权利要求1；第124-125页)；ep522868(权利要求8；图2)；wo200177172(权利要求1；第297-299页)；us2003109676；us6518404(图3)；us5773223(权利要求1a；第31-34栏)；wo2004001004；
(10)msg783(rnf124,假想蛋白flj20315,genbank登录号nm_017763)；
wo2003104275(权利要求1)；wo2004046342(实施例2)；wo2003042661(权利要求12)；wo2003083074(权利要求14；第61页)；wo2003018621(权利要求1)；wo2003024392(权利要求2；图93)；wo200166689(实施例6)；
交叉引用:locusid:54894；np_060233.2；nm_017763_1
(11)steap2(hgnc_8639,ipca-1,pcanap1,stamp1,steap2,stmp,前列腺癌相关基因1,前列腺癌相关蛋白1,前列腺6跨膜上皮抗原,6跨膜前列腺蛋白,genbank登录号af455138)
lab.invest.82(11):1573-1582(2002)；wo2003087306；us2003064397(权利要求1；图1)；wo200272596(权利要求13；第54-55页)；wo200172962(权利要求1；图4b)；wo2003104270(权利要求11)；wo2003104270(权利要求16)；us2004005598(权利要求22)；wo2003042661(权利要求12)；us2003060612(权利要求12；图10)；wo200226822(权利要求23；图2)；wo200216429(权利要求12；图10)；
交叉引用:gi:22655488；aan04080.1；af455138_1
(12)trpm4(br22450,flj20041,trpm4,trpm4b,瞬时受体电位阳离子通道,亚家族m,成员4,genbank登录号nm_017636)
xu,x.z.等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.98(19):10692-10697(2001),cell109(3):397-407(2002),j.biol.chem.278(33):30813-30820(2003)；us2003143557(权利要求4)；wo200040614(权利要求14；第100-103页)；wo200210382(权利要求1；图9a)；wo2003042661(权利要求12)；wo200230268(权利要求27；第391页)；us2003219806(权利要求4)；wo200162794(权利要求14；图1a-d)；
交叉引用:mim:606936；np_060106.2；nm_017636_1
(13)cripto(cr,cr1,crgf,cripto,tdgf1,畸胎癌源性生长因子,genbank登录号np_003203或nm_003212)
ciccodicola,a.等人,emboj.8(7):1987-1991(1989),am.j.hum.genet.49(3):555-565(1991))；us2003224411(权利要求1)；wo2003083041(实施例1)；wo2003034984(权利要求12)；wo200288170(权利要求2；第52-53页)；wo2003024392(权利要求2；图58)；wo200216413(权利要求1；第94-95,105页)；wo200222808(权利要求2；图1)；us5854399(实施例2；第17-18栏)；us5792616(图2)；
交叉引用:mim:187395；np_003203.1；nm_003212_1
(14)cd21(cr2(补体受体2)或c3dr(c3d/epsteinbarr病毒受体)或hs.73792,genbank登录号m26004)
fujisaku等人(1989)j.biol.chem.264(4):2118-2125；weisj.j.等人,j.exp.med.167,1047-1066,1988；moorem.等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.84,9194-9198,1987；barelm.等人,mol.immunol.35,1025-1031,1998；weisj.j.等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.83,5639-5643,1986；sinhas.k.等人(1993)j.immunol.150,5311-5320；wo2004045520(实施例4)；us2004005538(实施例1)；wo2003062401(权利要求9)；wo2004045520(实施例4)；wo9102536(图9.1-9.9)；wo2004020595(权利要求1)；
登录:p20023；q13866；q14212；embl；m26004；aaa35786.1
(15)cd79b(cd79b,cd79b,igb(免疫球蛋白相关β),b29,genbank登录号nm_000626或11038674)
proc.natl.acad.sci.u.s.a.(2003)100(7):4126-4131,blood(2002)100(9):3068-3076,muller等人(1992)eur.j.immunol.22(6):1621-1625)；wo2004016225(权利要求2,图140)；wo2003087768；us2004101874(权利要求1,第102页)；wo2003062401(权利要求9)；wo200278524(实施例2)；us2002150573(权利要求5,第15页)；us5644033；wo2003048202(权利要求1,第306和309页)；wo99/558658；us6534482(权利要求13,图17a/b)；wo200055351(权利要求11,第1145-1146页)；
交叉引用:mim:147245；np_000617.1；nm_000626_1
(16)fcrh2(ifgp4,irta4,spap1a(含有sh2结构域的磷酸酶锚定蛋白1a),spap1b,spap1c,genbank登录号nm_030764,ay358130)
genomeres.13(10):2265-2270(2003),immunogenetics54(2):87-95(2002),blood99(8):2662-2669(2002),proc.natl.acad.sci.u.s.a.98(17):9772-9777(2001),xu,m.j.等人(2001)biochem.biophys.res.commun.280(3):768-775；wo2004016225(权利要求2)；wo2003077836；wo200138490(权利要求5；图18d-1-18d-2)；wo2003097803(权利要求12)；wo2003089624(权利要求25)；
交叉引用:mim:606509；np_110391.2；nm_030764_1
(17)her2(erbb2,genbank登录号m11730)
coussensl.等人,science(1985)230(4730):1132-1139)；yamamotot.等人,nature319,230-234,1986；sembak.等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.82,6497-6501,1985；swierczj.m.等人,j.cellbiol.165,869-880,2004；kuhnsj.j.等人,j.biol.chem.274,36422-36427,1999；choh.-s.等人,nature421,756-760,2003；ehsania.等人(1993)genomics15,426-429；wo2004048938(实施例2)；wo2004027049(图1i)；wo2004009622；wo2003081210；wo2003089904(权利要求9)；wo2003016475(权利要求1)；us2003118592；wo2003008537(权利要求1)；wo2003055439(权利要求29；图1a-b)；wo2003025228(权利要求37；图5c)；wo200222636(实施例13；第95-107页)；wo200212341(权利要求68；图7)；wo200213847(第71-74页)；wo200214503(第114-117页)；wo200153463(权利要求2；第41-46页)；wo200141787(第15页)；wo200044899(权利要求52；图7)；wo200020579(权利要求3；图2)；us5869445(权利要求3；第31-38栏)；wo9630514(权利要求2；第56-61页)；ep1439393(权利要求7)；wo2004043361(权利要求7)；wo2004022709；wo200100244(实施例3；图4)；
登录:p04626；embl；m11767；aaa35808.1.embl；m11761；aaa35808.1
(18)nca(ceacam6,genbank登录号m18728)；
barnettt.等人,genomics3,59-66,1988；tawaragiy.等人,biochem.biophys.res.commun.150,89-96,1988；strausbergr.l.等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.99:16899-16903,2002；wo2004063709；ep1439393(权利要求7)；wo2004044178(实施例4)；wo2004031238；wo2003042661(权利要求12)；wo200278524(实施例2)；wo200286443(权利要求27；第427页)；wo200260317(权利要求2)；
登录:p40199；q14920；embl；m29541；aaa59915.1.embl；m18728；
(19)mdp(dpep1,genbank登录号bc017023)
proc.natl.acad.sci.u.s.a.99(26):16899-16903(2002))；wo2003016475(权利要求1)；wo200264798(权利要求33；第85-87页)；jp05003790(图6-8)；wo9946284(图9)；
交叉引用:mim:179780；aah17023.1；bc017023_1
(20)il20rα(il20rα,zcytor7,genbank登录号af184971)；
clarkh.f.等人,genomeres.13,2265-2270,2003；mungalla.j.等人,nature425,805-811,2003；blumbergh.等人,cell104,9-19,2001；dumoutierl.等人,j.immunol.167,3545-3549,2001；parrish-novakj.等人,j.biol.chem.277,47517-47523,2002；pletnevs.等人(2003)biochemistry42:12617-12624；sheikhf.等人(2004)j.immunol.172,2006-2010；ep1394274(实施例11)；us2004005320(实施例5)；wo2003029262(第74-75页)；wo2003002717(权利要求2；第63页)；wo200222153(第45-47页)；us2002042366(第20-21页)；wo200146261(第57-59页)；wo200146232(第63-65页)；wo9837193(权利要求1；第55-59页)；
登录:q9uhf4；q6uwa9；q96sh8；embl；af184971；aaf01320.1
(21)短小蛋白聚糖(bcan,behab,genbank登录号af229053)
garys.c.等人,gene256,139-147,2000；clarkh.f.等人,genomeres.13,2265-2270,2003；strausbergr.l.等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.99,16899-16903,2002；us2003186372(权利要求11)；us2003186373(权利要求11)；us2003119131(权利要求1；图52)；us2003119122(权利要求1；图52)；us2003119126(权利要求1)；us2003119121(权利要求1；图52)；us2003119129(权利要求1)；us2003119130(权利要求1)；us2003119128(权利要求1；图52)；us2003119125(权利要求1)；wo2003016475(权利要求1)；wo200202634(权利要求1)；
(22)ephb2r(drt,erk,hek5,epht3,tyro5,genbank登录号nm_004442)
chan,j.和watt,v.m.,oncogene6(6),1057-1061(1991),oncogene10(5):897-905(1995),annu.rev.neurosci.21:309-345(1998),int.rev.cytol.196:177-244(2000)；wo2003042661(权利要求12)；wo200053216(权利要求1；第41页)；wo2004065576(权利要求1)；wo2004020583(权利要求9)；wo2003004529(第128-132页)；wo200053216(权利要求1；第42页)；
交叉引用:mim:600997；np_004433.2；nm_004442_1
(23)aslg659(b7h,genbank登录号ax092328)
us20040101899(权利要求2)；wo2003104399(权利要求11)；wo2004000221(图3)；us2003165504(权利要求1)；us2003124140(实施例2)；us2003065143(图60)；wo2002102235(权利要求13；第299页)；us2003091580(实施例2)；wo200210187(权利要求6；图10)；wo200194641(权利要求12；图7b)；wo200202624(权利要求13；图1a-1b)；us2002034749(权利要求54；第45-46页)；wo200206317(实施例2；第320-321页,权利要求34；第321-322页)；wo200271928(第468-469页)；wo200202587(实施例1；图1)；wo200140269(实施例3；第190-192页)；wo200036107(实施例2；第205-207页)；wo2004053079(权利要求12)；wo2003004989(权利要求1)；wo200271928(第233-234,452-453页)；wo0116318；
(24)psca(前列腺干细胞抗原前体,genbank登录号aj297436)
reiterr.e.等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.95,1735-1740,1998；guz.等人,oncogene19,1288-1296,2000；biochem.biophys.res.commun.(2000)275(3):783-788；wo2004022709；ep1394274(实施例11)；us2004018553(权利要求17)；wo2003008537(权利要求1)；wo200281646(权利要求1；第164页)；wo2003003906(权利要求10；第288页)；wo200140309(实施例1；图17)；us2001055751(实施例1；图1b)；wo200032752(权利要求18；图1)；wo9851805(权利要求17；第97页)；wo9851824(权利要求10；第94页)；wo9840403(权利要求2；图1b)；
登录:o43653；embl；af043498；aac39607.1
(25)geda(genbank登录号ay260763)；
aap14954脂肪瘤hmgic融合伴侣样蛋白/pid＝aap14954.1-智人
物种:智人(人类)
wo2003054152(权利要求20)；wo2003000842(权利要求1)；wo2003023013(实施例3,权利要求20)；us2003194704(权利要求45)；
交叉引用:gi:30102449；aap14954.1；ay260763_1
(26)baff-r(b细胞活化因子受体,blys受体3,br3,genbank登录号af116456)；baff受体/pid＝np_443177.1-智人
thompson,j.s.等人,science293(5537),2108-2111(2001)；wo2004058309；wo2004011611；wo2003045422(实施例；第32-33页)；wo2003014294(权利要求35；图6b)；wo2003035846(权利要求70；第615-616页)；wo200294852(第136-137栏)；wo200238766(权利要求3；第133页)；wo200224909(实施例3；图3)；
交叉引用:mim:606269；np_443177.1；nm_052945_1；af132600
(27)cd22(b细胞受体cd22-b同工型,bl-cam,lyb-8,lyb8,siglec-2,flj22814,genbank登录号ak026467)；
wilson等人(1991)j.exp.med.173:137-146；wo2003072036(权利要求1；图1)；
交叉引用:mim:107266；np_001762.1；nm_001771_1
(28)cd79a(cd79a,cd79α,免疫球蛋白相关α,与igβ共价相互作用的与igm分子在表面上形成复合物的转导b细胞分化所涉及的信号的b细胞特异性蛋白(cd79b),),pi:4.84,mw:25028tm:2[p]genechromosome:19q13.2,genbank登录号np_001774.10)
wo2003088808；us20030228319；wo2003062401(权利要求9)；us2002150573(权利要求4,第13-14页)；wo9958658(权利要求13,图16)；wo9207574(图1)；us5644033；ha等人(1992)j.immunol.148(5):1526-1531；mueller等人(1992)eur.j.biochem.22:1621-1625；hashimoto等人(1994)immunogenetics40(4):287-295；preud’homme等人(1992)clin.exp.immunol.90(1):141-146；yu等人(1992)j.immunol.148(2)633-637；sakaguchi等人(1988)emboj.7(11):3457-3464；
(29)cxcr5(伯基特淋巴瘤受体1,由cxcl13趋化因子活化的在淋巴细胞迁移和体液防御中发挥作用的在hiv-2感染中发挥作用的可能在aids,淋巴瘤,骨髓瘤和白血病的发展中发挥作用的g蛋白偶联受体)；372aa,pi:8.54mw:41959tm:7[p]genechromosome:11q23.3,genbank登录号np_001707.1)
wo2004040000；wo2004015426；us2003105292(实施例2)；us6555339(实施例2)；wo200261087(图1)；wo200157188(权利要求20,第269页)；wo200172830(第12-13页)；wo200022129(实施例1,第152-153页,实施例2,第254-256页)；wo9928468(权利要求1,第38页)；us5440021(实施例2,第49-52栏)；wo9428931(第56-58页)；wo9217497(权利要求7,图5)；dobner等人(1992)eur.j.immunol.22:2795-2799；barella等人(1995)biochem.j.309:773-779；
(30)hla-dob(结合肽并将其呈递给cd4+t淋巴细胞的mhcii类分子(ia抗原)的β亚基)；273aa,pi:6.56mw:30820tm:1[p]genechromosome:6p21.3,genbank登录号np_002111.1)
tonnelle等人(1985)emboj.4(11):2839-2847；jonsson等人(1989)immunogenetics29(6):411-413；beck等人(1992)j.mol.biol.228:433-441；strausberg等人(2002)proc.natl.acad.sciusa99:16899-16903；servenius等人(1987)j.biol.chem.262:8759-8766；beck等人(1996)j.mol.biol.255:1-13；naruse等人(2002)tissueantigens59:512-519；wo9958658(权利要求13,图15)；us6153408(第35-38栏)；us5976551(第168-170栏)；us6011146(第145-146栏)；kasahara等人(1989)immunogenetics30(1):66-68；larhammar等人(1985)j.biol.chem.260(26):14111-14119；
(31)p2x5(嘌呤能受体p2x配体门控离子通道5,一种由细胞外atp门控的离子通道,可能参与突触传递和神经发生,缺陷可能促进特发性逼尿肌不稳定的病理生理学)；422aa),pi:7.63,mw:47206tm:1[p]genechromosome:17p13.3,genbank登录号np_002552.2)
le等人(1997)febslett.418(1-2):195-199；wo2004047749；wo2003072035(权利要求10)；touchman等人(2000)genomeres.10:165-173；wo200222660(权利要求20)；wo2003093444(权利要求1)；wo2003087768(权利要求1)；wo2003029277(第82页)；
(32)cd72(b细胞分化抗原cd72,lyb-2)proteinsequencefullmaeaity...tafrfpd(1..359；359aa),pi:8.66,mw:40225tm:1[p]genechromosome:9p13.3,genbank登录号np_001773.1)
wo2004042346(权利要求65)；wo2003026493(第51-52,57-58页)；wo200075655(第105-106页)；vonhoegen等人(1990)j.immunol.144(12):4870-4877；strausberg等人(2002)proc.natl.acad.sciusa99:16899-16903；
(33)ly64(淋巴细胞抗原64(rp105),亮氨酸富含重复(lrr)家族的i型膜蛋白,调节b细胞活化和凋亡,功能丧失与系统性红斑狼疮患者疾病活动增加相关)；661aa,pi:6.20,mw:74147tm:1[p]genechromosome:5q12,genbank登录号np_005573.1)
us2002193567；wo9707198(权利要求11,第39-42页)；miura等人(1996)genomics38(3):299-304；miura等人(1998)blood92:2815-2822；wo2003083047；wo9744452(权利要求8,第57-61页)；wo200012130(第24-26页)；
(34)fcrh1(fc受体样蛋白1,一种含有c2型ig样和itam结构域的免疫球蛋白fc结构域的推定受体,可能在b淋巴细胞分化中发挥作用)；429aa,pi:5.28,mw:46925tm:1[p]genechromosome:1q21-1q22,genbank登录号np_443170.1)
wo2003077836；wo200138490(权利要求6,图18e-1-18-e-2)；davis等人(2001)proc.natl.acad.sciusa98(17):9772-9777；wo2003089624(权利要求8)；ep1347046(权利要求1)；wo2003089624(权利要求7)；
(35)irta2(免疫球蛋白超家族受体易位相关2,一种推定的免疫受体,可能在b细胞发育和淋巴瘤生成中发挥作用；通过易位使基因失调在一些b细胞恶性肿瘤中出现)；977aa,pi:6.88mw:106468tm:1[p]genechromosome:1q21,genbank登录号human:af343662,af343663,af343664,af343665,af369794,af397453,ak090423,ak090475,al834187,ay358085；mouse:ak089756,ay158090,ay506558；np_112571.1
wo2003024392(权利要求2,图97)；nakayama等人(2000)biochem.biophys.res.commun.277(1):124-127；wo2003077836；wo200138490(权利要求3,图18b-1-18b-2)；
(36)tenb2(tmeff2,tomoregulin,tpef,hpp1,tr,推定的跨膜蛋白聚糖,与egf/神经生长因子家族的生长因子和卵泡抑素相关)；374aa,ncbi登录:aad55776,aaf91397,aag49451,ncbirefseq:np_057276；ncbigene:23671；omim:605734；swissprotq9uik5；genbank登录号af179274；ay358907,caf85723,cq782436
wo2004074320(seqidno810)；jp2004113151(seqidno2,4,8)；wo2003042661(seqidno580)；wo2003009814(seqidno411)；ep1295944(第69-70页)；wo200230268(第329页)；wo200190304(seqidno2706)；us2004249130；us2004022727；wo2004063355；us2004197325；us2003232350；us2004005563；us2003124579；horie等人(2000)genomics67:146-152；uchida等人(1999)biochem.biophys.res.commun.266:593-602；liang等人(2000)cancerres.60:4907-12；glynne-jones等人(2001)intjcancer.oct15；94(2):178-84；
(37)pmel17(银同系物；silv；d12s53e；pmel17；(si)；(sil)；me20；gp100)bc001414；bt007202；m32295；m77348；nm_006928；mcglinchey,r.p.等人(2009)proc.natl.acad.sci.u.s.a.106(33),13731-13736；kummer,m.p.等人(2009)j.biol.chem.284(4),2296-2306；
(38)tmeff1(具有egf样和两个卵泡抑素样结构域的跨膜蛋白1；tomoregulin-1；h7365；c9orf2；c9orf2；u19878；x83961)nm_080655；nm_003692；harms,p.w.(2003)genesdev.17(21),2624-2629；gery,s.等人(2003)oncogene22(18):2723-2727；
(39)gdnf-ra1(gdnf家族受体α1；gfra1；gdnfr；gdnfra；retl1；trnr1；ret1l；gdnfr-α1；gfr-α-1；u95847；bc014962；nm_145793)nm_005264；kim,m.h.等人(2009)mol.cell.biol.29(8),2264-2277；treanor,j.j.等人(1996)nature382(6586):80-83；
(40)ly6e(淋巴细胞抗原6复合物,基因座e；ly67,rig-e,sca-2,tsa-1)np_002337.1；nm_002346.2；denooij-vandalen,a.g.等人(2003)int.j.cancer103(6),768-774；zammit,d.j.等人(2002)mol.cell.biol.22(3):946-952；
(41)tmem46(shisa同系物2(有爪蟾蜍)；shisa2)np_001007539.1；nm_001007538.1；furushima,k.等人(2007)dev.biol.306(2),480-492；clark,h.f.等人(2003)genomeres.13(10):2265-2270；
(42)ly6g6d(淋巴细胞抗原6复合物,基因座g6d；ly6-d,megt1)np_067079.2；nm_021246.2；mallya,m.等人(2002)genomics80(1):113-123；ribas,g.等人(1999)j.immunol.163(1):278-287；
(43)lgr5(含有亮氨酸富含重复的g蛋白偶联受体5；gpr49,gpr67)np_003658.1；nm_003667.2；salanti,g.等人(2009)am.j.epidemiol.170(5):537-545；yamamoto,y.等人(2003)hepatology37(3):528-533；
(44)ret(ret原癌基因；men2a；hscr1；men2b；mtc1；(ptc)；cdhf12；hs.168114；ret51；ret-ele1)np_066124.1；nm_020975.4；tsukamoto,h.等人(2009)cancersci.100(10):1895-1901；narita,n.等人(2009)oncogene28(34):3058-3068；
(45)ly6k(淋巴细胞抗原6复合物,基因座k；ly6k；hsj001348；flj35226)np_059997.3；nm_017527.3；ishikawa,n.等人(2007)cancerres.67(24):11601-11611；denooij-vandalen,a.g.等人(2003)int.j.cancer103(6):768-774；
(46)gpr19(g蛋白偶联受体19；mm.4787)np_006134.1；nm_006143.2；montpetit,a.andsinnett,d.(1999)hum.genet.105(1-2):162-164；o’dowd,b.f.等人(1996)febslett.394(3):325-329；
(47)gpr54(kiss1受体；kiss1r；gpr54；hot7t175；axor12)np_115940.2；nm_032551.4；navenot,j.m.等人(2009)mol.pharmacol.75(6):1300-1306；hata,k.等人(2009)anticancerres.29(2):617-623；
(48)asphd1(含有天冬氨酸β-羟化酶的结构域1；loc253982)np_859069.2；nm_181718.3；gerhard,d.s.等人(2004)genomeres.14(10b):2121-2127；
(49)酪氨酸酶(tyr；ocaia；oca1a；酪氨酸酶；shep3)np_000363.1；nm_000372.4；bishop,d.t.等人(2009)nat.genet.41(8):920-925；nan,h.等人(2009)int.j.cancer125(4):909-917；
(50)tmem118(环指蛋白,跨膜2；rnft2；flj14627)np_001103373.1；nm_001109903.1；clark,h.f.等人(2003)genomeres.13(10):2265-2270；scherer,s.e.等人(2006)nature440(7082):346-351
(51)gpr172a(g蛋白偶联受体172a；gpcr41；flj11856；d15ertd747e)np_078807.1；nm_024531.3；ericsson,t.a.等人(2003)proc.natl.acad.sci.u.s.a.100(11):6759-6764；takeda,s.等人(2002)febslett.520(1-3):97-101。
在一个实施方案中，所述抗体结合至以下一种或多种多肽：bmpr1b、e16、steap1、0772p、mpf、napi2b、sema5b、pscahlg、etbr、msg783、steap2、trpm4、cripto、cd21、cd79b、fcrh2、her2、nca、mdp、il20rα、短小蛋白聚糖、ephb2r、aslg659、psca、geda、baff-r、cd22、cd79a、cxcr5、hla-dob、p2x5、cd72、ly64、fcrh1、irta2、tenb2、pmel17、tmeff1、gdnf-ra1、ly6e、tmem46、ly6g6d、lgr5、ret、ly6k、gpr19、gpr54、asphd1、酪氨酸酶、tmem118、gpr172a或cd33。
在一个实施方案中，所述抗体结合至bmpr1b。
在一个实施方案中，所述抗体结合至e16。
在一个实施方案中，所述抗体结合至steap1。
在一个实施方案中，所述抗体结合至0772p。
在一个实施方案中，所述抗体结合至mpf。
在一个实施方案中，所述抗体结合至napi2b。
在一个实施方案中，所述抗体结合至sema5b。
在一个实施方案中，所述抗体结合至pscahlg。
在一个实施方案中，所述抗体结合至etbr。
在一个实施方案中，所述抗体结合至msg783。
在一个实施方案中，所述抗体结合至steap2。
在一个实施方案中，所述抗体结合至trpm4。
在一个实施方案中，所述抗体结合至cripto。
在一个实施方案中，所述抗体结合至cd21。
在一个实施方案中，所述抗体结合至cd79b。
在一个实施方案中，所述抗体结合至fcrh2。
在一个实施方案中，所述抗体结合至her2。
在一个实施方案中，所述抗体结合至nca。
在一个实施方案中，所述抗体结合至mdp。
在一个实施方案中，所述抗体结合至il20rα。
在一个实施方案中，所述抗体结合至短小蛋白聚糖。
在一个实施方案中，所述抗体结合至ephb2r。
在一个实施方案中，所述抗体结合至aslg659。
在一个实施方案中，所述抗体结合至psca。
在一个实施方案中，所述抗体结合至geda。
在一个实施方案中，所述抗体结合至baff-r。
在一个实施方案中，所述抗体结合至cd22。
在一个实施方案中，所述抗体结合至cd79a。
在一个实施方案中，所述抗体结合至cxcr5。
在一个实施方案中，所述抗体结合至hla-dob。
在一个实施方案中，所述抗体结合至p2x5。
在一个实施方案中，所述抗体结合至cd72。
在一个实施方案中，所述抗体结合至ly64。
在一个实施方案中，所述抗体结合至fcrh1。
在一个实施方案中，所述抗体结合至irta2。
在一个实施方案中，所述抗体结合至tenb2。
在一个实施方案中，所述抗体结合至pmel17。
在一个实施方案中，所述抗体结合至tmeff1。
在一个实施方案中，所述抗体结合至gdnf-ra1。
在一个实施方案中，所述抗体结合至ly6e。
在一个实施方案中，所述抗体结合至tmem46。
在一个实施方案中，所述抗体结合至ly6g6d。
在一个实施方案中，所述抗体结合至lgr5。
在一个实施方案中，所述抗体结合至ret。
在一个实施方案中，所述抗体结合至ly6k。
在一个实施方案中，所述抗体结合至gpr19。
在一个实施方案中，所述抗体结合至gpr54。
在一个实施方案中，所述抗体结合至asphd1。
在一个实施方案中，所述抗体结合至酪氨酸酶。
在一个实施方案中，所述抗体结合至tmem118。
在一个实施方案中，所述抗体结合至gpr172a。
在一个实施方案中，所述抗体结合至cd33。
亲本抗体也可为包含白蛋白结合肽(abp)序列的融合蛋白(dennis等人(2002)“albuminbindingasageneralstrategyforimprovingthepharmacokineticsofproteins”jbiolchem.277:35035-35043；wo01/45746)。本申请抗体包括具有以下教导的abp序列的融合蛋白：(i)dennis等人(2002)jbiolchem.277:35035-35043,表iii和iv,第35038页；(ii)us20040001827,[0076]；和(iii)wo01/45746,第12-13页，所有这些都通过引用并入本申请。
可使用重组方法和组合物制备抗体，例如如us4816567所述和本领域所已知的那样。在一些实施方案中，抗体在真核宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中产生。在一些实施方案中，抗体在原核宿主细胞(例如大肠杆菌)中产生。
在某些实施方案中，可将一个或多个氨基酸修饰引入本申请提供的抗体的fc区，从而产生fc区变体。fc区变体可包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如取代)的人fc区序列(例如人igg1、igg2、igg3或igg4fc区)。
在某些实施方案中，本申请涉及具有一些但非全部效应子功能的抗体变体，这使其对于体内抗体的半衰期是重要的应用来说是理想的候选物，但是某些效应子功能(例如补体和adcc)是不必要或有害的。可进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认cdc和/或adcc活性的减少/剥夺。例如，可进行fc受体(fcr)结合测定以确保抗体缺乏fcγr结合(因此可能缺乏adcc活性)，但是保留fcrn结合能力。
adc的药物负载量
药物负载量是每个抗体的药物部分的平均数。药物负载量可为1至8个药物(d)/抗体(ab)，即其中1、2、3、4、5、6、7和8个药物部分共价连接至抗体。adc的组成包括与一定范围即1到8个的药物缀合的抗体的集合。来自缀合反应的adc制剂中每个抗体的平均药物数可通过常规手段例如质谱、elisa测定、电泳和hplc来表征。也可确定adc在p方面的定量分布。通过elisa可确定具体的adc制剂中p的平均值(hamblett等人(2004)clin.cancerres.10:7063-7070；sanderson等人(2005)clin.cancerres.11:843-852)。然而，通过elisa的抗体-抗原结合和检测限不可辨别p(药物)值的分布。另外，用于检测抗体-药物缀合物的elisa测定不能确定药物部分连接到抗体的位置例如重链或轻链片段或具体的氨基酸残基。在一些情况下，分离、纯化和表征均质adc(其中p是来自具有其它药物负载量的adc的一定值)可通过反相hplc或电泳等手段来实现。
对于一些抗体-药物缀合物，p可能受抗体上附着位点的数目的限制。例如，抗体可具有仅一个或几个半胱氨酸巯基部分或可具有仅一个或几个足够反应性的巯基部分(连接基可通过其连接)。较高的药物负载量例如p>5可能导致某些抗体-药物缀合物的聚集、不溶性、毒性或细胞通透性的丧失。
通常，在缀合反应期间，小于理论最大值的药物部分与抗体缀合。抗体可含有例如许多不与连接基-药物中间体(x-l-d)或连接基试剂反应的赖氨酸残基。只有最具反应性的赖氨酸基团可与胺反应性连接基试剂反应。另外，只有最具反应性的半胱氨酸巯基可与巯基反应性连接基试剂或连接基-药物中间体反应。通常，抗体不含有可与药物部分连接的许多(若有的话)游离和反应性半胱氨酸巯基部分。化合物的抗体中大多数半胱氨酸巯基残基作为二硫键存在且必须在部分或完全还原条件下用还原剂如二硫苏糖醇(dtt)或tcep还原。可按几种不同的方式控制adc的负载量(药物/抗体比例“dar”)，包括：(i)限制连接基-药物中间体或连接基试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制缀合反应时间或温度，和(iii)半胱氨酸巯基修饰的部分或限制性还原条件。
当抗体的多于一个亲核或亲电子基团与连接基-药物中间体或连接基试剂及随后的二聚体药物部分试剂反应时，所得产物是抗体-药物缀合物的混合物(具有连接至抗体的药物部分的分布例如1、2、3等)。液相色谱例如聚合反相(plrp)和疏水相互作用(hic)可通过药物负载量值分离混合物中的化合物。可分离具有单一药物负载量值(p)的adc的制剂，然而，这些单一负载量值adc可能仍然是非均质混合物，因为药物部分可通过连接基连接在抗体上的不同位点。因此，本申请抗体-药物缀合物组合物包括抗体-药物缀合物化合物的混合物，其中抗体具有一个或多个药物部分，且其中药物部分可在各种氨基酸残基处与抗体连接。
示例性药物部分
含有叔胺或吡啶官能团的药物的实例包括但不限于拓扑替康、lb-100、ib-01212、mcl-1抑制剂、68ga-bnota-prgd2、venetoclax、锝tc99mtilmanocept、e-7016、hm-30181ak、紫杉醇、as-1896596、em-015、钆特醇、bgj-398、ec-1456、度维替尼、pyrroltinib马来酸盐、gsk-923295、伊立替康、bgp-15、90y-依多曲肽、咪拉地尔、resminostat、itarnafloxin、nms-p153、nms-p937、伊立替康硫糖酯、阿比特龙、a-366、sb-743921、gilteritinib、abemaciclib、ipp-204106、长春氟宁、cx-5461、多西环素、tp-0903、tlk-58747、伊立替康、numonafide、on-123300、vintafolide、kx2391、钆喷酸葡胺、gedatolisib、他西多丁hcl、genzyme/ergomed、ttl-1177、纳曲酮、富马酸cfi-400945、pictilisib、felotaxel、otx-008、巴诺蒽醌、g-773、trabicingin、no-沙奎那韦、enmd-2076、钆布醇、bgb-102、ga68-标记、黄芩素缀合物、thz-1、tsr-011、onc-201、asp-3026、半乳糖神经酰胺增强的长春瑞滨、pmx-20005、111in-rp-782、dsr-6434、硫酸长春新碱、j-21475、apitolisib、mdx-1203、镓-68-sh-7139、cnx-1351、ct-1578、tg-02、伊马替尼、luminespib、长春地辛-cb-3717缀合物、amg511、azd1152hqpaaccurins、米帕林、cgm-097、tr-100、bgb-324、cep-37440、otssp-167、apr-246、indotecan、钆特酸葡甲胺、硫蒽酮、navitoclax、来昔决南钐(153sm)、dmdapata、oct-1002、盐酸伊立替康、bay-87-2243、simm-559、cep-33779、xl-388、shr-1258、voruciclib、unbs-5162、诺斯卡品、青蒿素、pha-665752、吡咯并苯并二氮杂环庚三烯类、叶酸-长春地肼酰肼缀合物、brn-103、nsc-134754、amp-53、pki-402、tariquidar、cg-200745、vo-100、prlx-93936、cenisertib、ssr-125329、crd-401、sn-24771、巴拉莫德、bibx-1382、105509、kw-2152、力达霉素、ct-17、sn-23490、l-000021649、u-74389g、jnj-17029259、pak-200、pfp-6、xr-842、rp-697、nco-700、b-220、帕泽普汀、r-116010、nl-2001、rc-3940-ii、bim-46068、mdl-73811、chir-200131、halitulin、氟卓斯汀、辛可宁、bn-52207、abt-546、nsc-639366、达替氯铵、wr-63320、ly-329146、dapaphenine雄甾烷sr-25989、xr-9051、rsu-1069、n-1379、epelmycina、pnu-144113、fce-27726、nsc-357704、pd-171851、dz-3358、b-9309-068、goe-7874、ro-44-5912、mdl-103323、莫法罗汀、ro-46-7864、ru-45144、win-63320、nc-190、nsc-646958、va-033、gi-149893、bbr-2378、nsc-639365、长春磷汀、sdz-62-434、bch-2051、rb-90745、ti-356、er-37328、sr-26050、cl-329753、ly-326315、an-1006、cp-117227、r-替鲁地平、rb-90740、syuiq-05、sr-16388、sn-28049、sn-30000、盐酸托泊替康、长春瑞滨、wbz-7、s-44563、gsk-1070916、rpr-203360、去甲基脱氨基pateaminea、eu-517、at-9283、盐酸螺旋锗、e-7974、azoacridone、长春瑞滨、gtx-134、阿司咪唑、瑞替普汀、米托萘胺、林卡唑、pbt-1、阿替莫德、托匹生琼、a-620223、曲多高舍、tesetaxelemd-94283、a-923573、e-7107、nrc-2694、盐酸阿螺旋霉素、smt-14400、pha-793887、hb-19、s-12363、索利多丁、cep-28122、tks-040、abt-306552、ati-1025、a-928605、pf-3758309、99mtc-rp-527、mln-576、k-454、w-198、debio-0931、佐舒喹达、pf-337210、abt-737、folatetubulysin缀合物、依克立达、cp-31398、av-412、依洛替康、gsk-1838705a、abt-839、aew-541、长春新碱、吉非替尼、多柔比星、yho-13351、培利替尼、西马多丁、a-947864、托泽色替、pd-115934、多拉司他汀-10、su-11274、美琥他辛、eht-1864、多非喹达、dx-52-1、rta-502、卡纽替尼、甲氧氯普胺、bms-753493、pd-166285、auristatinpye、alchemix、c-1305、ang-1009、盐酸普鲁卡因、sirameine、hoe-33342、manzamines、osi-632、stx-1801、bibf-1000、勒托替康、zk-191703、硫姆林、vx-322、多西紫杉醇、ro-28-2653、贝特卡令、gs-164、jnk-401、他莫利嗪、哌溴来新、s-16020-2、nk-611、拉柔比星、top-008、地氯普胺、勒托替康、tas-103、右尼古地平、bam-1120、conophylline、icrf-193、脱水长春碱、tubulysin、依克特纳西啶和l-745631。
适应症和治疗方法
预期本申请抗体-药物缀合物(adc)可用于治疗各种疾病或病症，例如其特征在于肿瘤抗原的过表达。示例性状况或过度增殖性病症包括良性或恶性实体瘤和血液学病症例如白血病和淋巴恶性肿瘤。其它包括神经元、胶质细胞、星形胶质细胞、下丘脑、腺体、巨噬细胞、上皮、间质、囊胚腔、炎症、血管生成和免疫学(包括自身免疫性)疾病。
在某些实施方案中，包含抗napi2b抗体(例如上述那些)的本申请adc用于治疗实体瘤例如卵巢实体瘤的方法。
在另一个实施方案中，包含抗cd33抗体(例如本申请所述的那些)的本申请adc用于治疗血液恶性肿瘤的方法，所述血液恶性肿瘤为例如非霍奇金淋巴瘤(nhl)、弥漫性大造血淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性髓细胞样白血病(aml)和髓细胞白血病(mcl)并包括b细胞相关癌症和增殖性疾病。参见us8226945；li等人(2013)mol.cancer.ther.12(7):1255-1265；polson等人(2010)leukemia24:1566-1573；polson等人(2011)expertopin.investig.drugs20(1):75-85，其内容通过引用并入本申请。
在另一个实施方案中，包含抗muc16抗体(例如本申请所述的那些)的本申请adc用于治疗卵巢癌、乳腺癌和胰腺癌的方法。癌症可与muc16/ca125/o772p多肽的表达或活性相关。参见wo2007/001851；us7989595；us8449883；us7723485；chen等人(2007)cancerres.67(10):4924-4932；junutula等人,(2008)naturebiotech.26(8):925-932，其内容通过引用并入本申请。
在某些实施方案中，包含抗her2抗体(例如上述那些)的本申请adc用于治疗癌症的方法，所述癌症为例如乳腺癌或胃癌，更特别是her2+乳腺癌或胃癌，其中该方法包括向需要这种治疗的患者施用该adc。在一个这样的实施方案中，adc包含抗her2抗体曲妥珠单抗或帕妥珠单抗。
通常，待治疗的疾病或病症是过度增殖性疾病例如癌症。本申请要治疗的癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这样的癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃部癌症或胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾部癌症、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌及头颈癌。
抗体-药物缀合物可用于治疗的自身免疫性疾病包括风湿病(例如类风湿性关节炎、舍格伦综合征、硬皮病、狼疮例如系统性红斑狼疮(sle)和狼疮性肾炎、多发性肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血症、抗磷脂抗体综合征和银屑病关节炎)、骨关节炎、自身免疫性胃肠和肝脏疾病(例如炎性肠病(例如溃疡性结肠炎和克罗恩病)、自身免疫性胃炎和恶性贫血、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎和乳糜泻)、血管炎(例如anca相关血管炎(包括churg-strauss血管炎)、韦格纳肉芽肿病和多动脉炎)、自身免疫性神经学病症(例如多发性硬化症、眼阵挛-肌阵挛综合征、重症肌无力、视神经脊髓炎、帕金森病、阿尔茨海默病和自身免疫性多发性神经病)、肾脏疾病(例如肾小球性肾炎、古德帕斯特综合征和伯格氏病)、自身免疫性皮肤病(例如银屑病、荨麻疹、荨麻疹、寻常型天疱疮、大疱性类天疱疮和皮肤红斑狼疮)、血液病(例如血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、输血后紫癜和自身免疫性溶血性贫血)、动脉粥样硬化、葡萄膜炎、自身免疫性听力疾病(例如内耳疾病和听力损失)、白塞病、雷诺氏综合征、器官移植和自身免疫性内分泌病症(例如糖尿病相关自身免疫疾病例如胰岛素依赖性糖尿病(iddm)、艾迪生病和自身免疫性甲状腺疾病(例如格雷夫斯病和甲状腺炎))。更优选的这样的疾病包括例如类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、anca相关血管炎、狼疮、多发性硬化、舍格伦综合征、格雷夫斯病、iddm、恶性贫血、甲状腺炎和肾小球性肾炎。
为了预防或治疗疾病，adc的适当剂量将取决于如上定义的待治疗的疾病的类型、疾病的严重性和病程、分子是否用于预防或治疗目的而施用、先前的治疗、患者的临床病史和对抗体的反应及主治医师的判断。分子在一次或一系列治疗中适当地施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)分子是用于施用给患者的初始候选剂量，无论例如通过一次或更多次单独的施用或是通过连续输注。取决于上述因素，典型的日剂量可在约1μg/kg至100mg/kg或更高的范围内。要施用给患者的adc的示例性剂量在约0.1至约10mg/kg患者体重的范围内。
实验部分
实施例1(mc-sq-cit-pab-多拉司他汀10)
[4-[[(2s)-2-[[1-[5-(2,5-二氧代吡咯-1-基)戊基氨甲酰基]环丁烷羰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基-[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-2-甲氧基-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[[(1s)-2-苯基-1-噻唑-2-基-乙基]氨基]丙基]吡咯烷-1-基]-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]-二甲基-铵
在小瓶中将n1’-[(1s)-1-[[4-(氯甲基)苯基]氨甲酰基]-4-脲基-丁基]-n1-[5-(2,5-二氧代吡咯-1-基)戊基]环丁烷-1,1-二甲酰胺(100质量％,1当量,0.04713mmol,1.000,27.76mg)、多拉司他汀10(100质量％,37mg,0.04713mmol,1.000,37mg)和四丁基碘化铵(65.65质量％,0.3当量,0.01414mmol,0.3000,7.956mg)合并并溶于n,n-二甲基甲酰胺(100质量％,50μl,0.646mmol,13.7,47.3mg,0.05ml)。将混合物在室温搅拌3小时且没有观察到反应。向反应混合物中加入n,n-二异丙基乙胺(100质量％,1.5当量,0.07069mmol,1.500,9.136mg,0.0123ml)。将反应混合物在室温搅拌过夜。反应混合物的lc/ms显示16％产物。再加入1当量碱，其改善了产物形成并给出了较清晰的lc/ms峰。
将反应混合物用dmf稀释且然后在hplc上在甲酸条件下直接纯化。得到一纯级份的[4-[[(2s)-2-[[1-[5-(2,5-二氧代吡咯-1-基)戊基氨甲酰基]环丁烷羰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基-[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-2-甲氧基-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[[(1s)-2-苯基-1-噻唑-2-基-乙基]氨基]丙基]吡咯烷-1-基]-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨甲酰基]-2-甲基-丙基]氨甲酰基]-2-甲基-丙基]-二甲基-铵(100质量％,c,5mg,0.0037350mmol,0.07925,5mg)m/z＝1338.1(7.9％一纯级份收率)和得到一不纯级份。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.47(d,j＝2.5hz,1h),8.92(q,j＝9.0hz,1h),8.31(s,4h),8.05-7.91(m,0h),7.91-7.75(m,4h),7.67(s,0h),7.63(d,j＝3.2hz,0h),7.62-7.54(m,0h),7.54(s,0h),7.58-7.45(m,2h),7.33-7.11(m,5h),7.08-6.95(m,2h),6.13(t,j＝5.6hz,1h),5.75(s,1h),5.57-5.37(m,3h),4.76-4.55(m,3h),4.41(dt,j＝15.5,6.0hz,1h),3.98(q,j＝6.3hz,2h),3.61-3.28(m,4h),3.28-3.07(m,9h),3.07-2.87(m,10h),2.84-2.68(m,1h),2.49-2.31(m,6h),2.31-1.90(m,0h),1.88-1.54(m,7h),1.41(ddt,j＝28.5,22.6,10.5hz,10h),1.18(tdd,j＝19.3,7.8,4.5hz,3h),1.12-1.02(m,5h),1.02-0.91(m,5h),0.91-0.82(m,6h),0.79(td,j＝7.4,3.0hz,4h)。
实施例2(mc-sq-cit-pab-tubulysinm)
(2r)-2-((2s,3s)-1-(((1r,3r)-1-乙酰氧基-1-(4-((2r,4s)-4-羧基-1-苯基戊-2-基氨甲酰基)噻唑-2-基)-4-甲基戊-3-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代戊-2-基氨甲酰基)-1-(4-((s)-2-(1-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)戊基氨甲酰基)环丁烷甲酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基)-1-甲基哌啶鎓
在小瓶中将n1’-[(1s)-1-[[4-(氯甲基)苯基]氨甲酰基]-4-脲基-丁基]-n1-[5-(2,5-二氧代吡咯-1-基)戊基]环丁烷-1,1-二甲酰胺(100质量％,17mg,0.02886mmol,1.000,17mg)、(2s,4r)-4-[[2-[(1r,3r)-1-乙酰氧基-4-甲基-3-[甲基-[(2s,3s)-3-甲基-2-[[(2r)-1-甲基哌啶-2-羰基]氨基]戊酰基]氨基]戊基]噻唑-4-羰基]氨基]-2-甲基-5-苯基-戊酸(100质量％,1当量,0.02886mmol,1.000,21.01mg)和四丁基碘化铵(65.65质量％,0.3当量,0.008657mmol,0.3000,4.872mg)溶于n,n-二甲基甲酰胺(100质量％,75μl,0.970mmol,33.6,70.9mg,0.075ml)。将所得反应混合物在室温搅拌1小时且没有观察到所需产物。向反应混合物中加入n,n-二异丙基乙胺(100质量％,1.1当量,0.03174mmol,1.100,4.103mg,0.00554ml)并形成少量产物。然后将反应混合物在室温搅拌过夜，然后再加入1当量碱并将混合物搅拌至一天结束。然后观察到所需产物，稀释并在hplc上纯化以避免产物的任何损失。
分离(2s,4r)-4-[[2-[(1r,3r)-1-乙酰氧基-3-[[(2s,3s)-2-[[(2r)-1-[[4-[[(2s)-2-[[1-[5-(2,5-二氧代吡咯-1-基)戊基氨甲酰基]环丁烷羰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-1-甲基-哌啶-1-鎓-2-羰基]氨基]-3-甲基-戊酰基]-甲基-氨基]-4-甲基-戊基]噻唑-4-羰基]氨基]-2-甲基-5-苯基-戊酸(100质量％,11.7mg,0.0091292mmol,0.3164,11.7mg)。31.64％收率。hrms:m/z＝1281.6780。1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ10.80(s,2h),9.50(s,2h),8.48(s,6h),8.36(s,3h),8.12(s,2h),8.05(s,1h),7.75(s,3h),7.33-7.26(m,4h),7.26-7.18(m,5h),7.13(d,j＝7.6hz,5h),6.99(d,j＝5.7hz,2h),6.42(s,2h),5.73(s,2h),5.56(s,3h),4.64(s,4h),4.57(t,j＝7.8hz,2h),4.38(dq,j＝15.0,5.4hz,2h),4.13(dd,j＝13.0,7.6hz,2h),3.05(q,j＝6.9,6.2hz,12h),3.00-2.87(m,10h),2.84-2.70(m,3h),2.50(s,2h),2.40(hept,j＝13.1,10.5hz,9h),2.25(d,j＝11.2hz,1h),2.18-1.94(m,0h),1.91-1.64(m,0h),1.58(s,0h),1.42(ddt,j＝23.8,16.7,8.4hz,15h),1.32-1.23(m,12h),1.17(p,j＝8.3,7.4hz,6h),1.11-0.99(m,6h),0.94-0.85(m,12h),0.80(q,j＝7.6hz,10h)。
实施例3(硝基-mm-pds-pab-tubulysinm)
(2s,4r)-4-[[2-[(1r,3r)-1-乙酰氧基-4-甲基-3-[甲基-[(2s,3s)-3-甲基-2-[[(2r)-1-甲基-1-[[4-[[(2r)-2-[(6-硝基-3-吡啶基)二硫基]丙氧基]羰基氨基]苯基]甲基]哌啶-1-鎓-2-羰基]氨基]戊酰基]氨基]戊基]噻唑-4-羰基]氨基]-2-甲基-5-苯基-戊酸
步骤1：单甲基-硝基-pds-pab-cl
单甲基(r)-2-((6-硝基吡啶-3-基)二硫基)丙基4-(氯甲基)苯基氨基甲酸酯
在小瓶中将单甲基(r)-2-((6-硝基吡啶-3-基)二硫基)丙基4-(羟基甲基)苯基氨基甲酸酯(-硝基-pds-pab-oh)(100质量％,50mg,0.1265mmol,1.000,50mg)溶于n,n-二甲基甲酰胺(100质量％,0.2ml,3mmol,20,200mg,0.2ml)。将所得反应混合物在冰浴中冷却并逐滴加入亚硫酰氯(100质量％,1.2当量,0.1517mmol,1.200,18.05mg,0.01106ml)在二氯甲烷(100质量％,50μl,0.7800mmol,6.168,66.25mg,0.05ml)中的溶液。将反应混合物从冰浴中取出且在室温搅拌30分钟后，lcms显示期望的产物。向反应混合物中逐滴加入一额外当量的亚硫酰氯(在dcm中的溶液)并在室温搅拌过夜。形成新的lcms峰，其接近产物峰且质量为438。将反应混合物用乙酸乙酯稀释，用水淬灭，有机层用水洗涤两次，经mgso4干燥并在硅胶上浓缩并通过快速色谱纯化(用30％etoac/庚烷洗脱)。分离白色固体。lc/ms显示具有醇前体作为杂质的物质。单甲基(r)-2-((6-硝基吡啶-3-基)二硫基)丙基4-(氯甲基)苯基氨基甲酸酯(-硝基-pds-pab-cl)(100质量％,b,38mg,0.09181mmol,0.7260,38mg)(72.6％收率)。m/z＝414.00。
在小瓶中将n-[4-(氯甲基)苯基]氨基甲酸[(2r)-2-[(6-硝基-3-吡啶基)二硫基]丙基]酯(100质量％)和(2s,4r)-4-[[2-[(1r,3r)-1-乙酰氧基-4-甲基-3-[甲基-[(2s,3s)-3-甲基-2-[[(2r)-1-甲基哌啶-2-羰基]氨基]戊酰基]氨基]戊基]噻唑-4-羰基]氨基]-2-甲基-5-苯基-戊酸(100质量％,9.6mg,0.013mmol,1.0,9.6mg)溶于n,n-二甲基甲酰胺(100质量％)。向反应混合物中加入四丁基碘化铵(65.65质量％,0.2当量,0.0026mmol,0.20,1.5mg)，然后加入n,n-二异丙基乙胺(100质量％,1当量,0.013mmol,1.0,1.7mg,0.0023ml)。将反应混合物温热至38℃保持20分钟，然后在室温搅拌2小时。lc/ms显示期望的产物。将反应在约一半时停止以避免分解，用dmf稀释并在酸性条件下直接在hplc上纯化。分离(2s,4r)-4-[[2-[(1r,3r)-1-乙酰氧基-4-甲基-3-[甲基-[(2s,3s)-3-甲基-2-[[(2r)-1-甲基-1-[[4-[[(2r)-2-[(6-硝基-3-吡啶基)二硫基]丙氧基]羰基氨基]苯基]甲基]哌啶-1-鎓-2-羰基]氨基]戊酰基]氨基]戊基]噻唑-4-羰基]氨基]-2-甲基-5-苯基-戊酸。(100质量％,4.6mg,0.0041576mmol,0.32,4.6mg)(32％收率),m/z＝1106.4。
实施例4(mc-sq-cit-pab倍癌霉素dm)
制备2-[[2-[(1s)-1-(氯甲基)-5-羟基-1,2-二氢苯并[e]吲哚-3-羰基]-1h-吲哚-5-基]氧基]乙基-[[4-[[(2s)-2-[[1-[5-(2,5-二氧代吡咯-1-基)戊基氨甲酰基]环丁烷羰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-二甲基-铵
步骤1：(s)-n-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)戊基)-n-(1-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)环丁烷-1,1-二甲酰胺
方案
程序
将化合物1(150g,1.53mol)加到化合物2(201g,1.53mol)在hoac(1000ml)中的搅拌溶液中。将混合物在室温搅拌2h后，将其加热回流8h。在减压下除去有机溶剂并将残余物用etoac(500ml×3)萃取并用h2o洗涤。将合并的有机层经na2so4干燥并浓缩，得到产物。将所得产物用石油醚洗涤，得到化合物3，其为白色固体(250g,77.4％)。
将dppa(130g,473mmol)和tea(47.9g,473mmol)加到化合物3(100g,473mmol)在t-buoh(200ml)中的溶液中。将混合物在n2下加热回流8h。将混合物浓缩并将残余物通过硅胶柱色谱(pe:etoac＝3:1)纯化，得到化合物4(13g,10％)。
向化合物4(28g,992mmol)在无水etoac(30ml)中的溶液中逐滴加入hcl/etoac(50ml)。将混合物在室温搅拌5h后，将其过滤并将固体干燥，得到化合物5(16g,73.7％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ8.02(s,2h),6.99(s,2h),3.37-3.34(m,2h),2.71-2.64(m,2h),1.56-1.43(m,4h),1.23-1.20(m,2h)。
向化合物6(17.50g,0.10mol)在二噁烷和h2o的混合物(50ml/75ml)中的混合物中加入k2co3(34.55g,0.25mol)。在0℃缓慢加入fmoc-cl(30.96g,0.12mol)。将反应混合物经2h温热至室温。在减压下除去有机溶剂并用6mhcl溶液将水浆调至ph＝3并用etoac(100ml×3)萃取。将有机层经na2so4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到所需产物7(38.0g,95.6％)。(化合物7后来是可商业获得的。)
向化合物7(4g,10mmol)在dcm和meoh的混合物(100ml/50ml)中的溶液中加入4-氨基-苯基-甲醇(8)(1.6g,13mmol,1.3当量)和eedq(3.2g,13mmol,1.3当量)。将混合物在室温在n2下搅拌16h后，将其浓缩，得到棕色固体。加入mtbe(200ml)并将其在15℃搅拌2h。通过过滤收集固体，用mtbe(50ml×2)洗涤，得到粗产物9，其为橙色固体(4.2g,84％)。
lcms(esi):m/z503.0[m+1]。
在室温向化合物9(4.2g,8.3mmol)在无水dmf(20ml)中的搅拌溶液中逐滴加入哌啶(1.65ml,17mmol,2当量)。将混合物在室温搅拌30min并形成固体析出物。加入无水dcm(50ml)且混合物立即变透明。将混合物在室温再搅拌30min且lcms显示化合物9被消耗。将其在减压下浓缩至干(确保无哌啶剩余)并将残余物在etoac和h2o(50ml/20ml)之间分配。将水相用etoac(50ml×2)洗涤并浓缩，得到10，其为油状残余物(2.2g,94％)(含有少量dmf)。
向化合物11(8g,29.7mmol)在dme(50ml)中的溶液中加入化合物10(6.0g,21.4mmol)和nahco3(7.48g,89.0mmol)在水(30ml)中的溶液。将混合物在室温搅拌16h后，将其在减压下浓缩至干并将残余物通过柱色谱纯化(dcm:meoh＝10:1)，得到粗化合物12，其为白色固体(6.4g,68.7％)。
lcms(esi):m/z435.0[m+1]。
在室温向化合物12(6.4g,14.7mmol)在thf和meoh的混合物(20ml/10ml)中的搅拌溶液中加入lioh·h2o(1.2g,28.6mmol)在h2o(20ml)中的溶液。将反应混合物在室温搅拌16h后，在减压下除去溶剂并将所得残余物通过制备型hplc纯化，得到化合物13(3.5g,收率：58.5％)。
lcms(esi):m/z406.9[m+1]。1hnmr(400mhz,甲醇-d4)δ8.86(d,j＝8.4hz,2h),8.51(d,j＝8.4hz,2h),5.88-5.85(m,1h),5.78(s,2h),4.54-4.49(m,3h),4.38-4.32(m,1h),3.86-3.75(m,1h),3.84-3.80(m,2h),3.28-3.21(m,1h),3.30-3.24(m,1h),3.00-2.80(m,1h),2.37-2.28(m,2h)。
在0℃将dipea(1.59g,12.3mmol)和bop-cl(692mg,2.71mmol)加到化合物13(1.0g,2.46mmol)在dmf(10ml)中的溶液中，随后加入化合物5(592mg,2.71mmol)。将混合物在0℃搅拌0.5h。将反应混合物用柠檬酸溶液(10ml)淬灭，用dcm/meoh(10:1)萃取。将有机层干燥并浓缩并将残余物通过硅胶柱色谱(dcm:meoh＝10:1)纯化，得到化合物14(1.0g,71％)。
1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.00(s,1h),7.82-7.77(m,2h),7.53(d,j＝8.4hz,2h),7.19(d,j＝8.4hz,2h),6.96(s,2h),5.95(t,j＝6.4hz,1h),5.39(s,2h),5.08(t,j＝5.6hz,1h),4.40-4.35(m,3h),4.09(d,j＝4.8hz,1h),3.01(d,j＝3.2hz,2h),3.05-2.72(m,4h),2.68-2.58(m,3h),2.40-2.36(m,4h),1.72-1.70(m,3h),1.44-1.42(m,1h),1.40-1.23(m,6h),1.21-1.16(m,4h)。
步骤2：(s)-n-(1-(4-(氯甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)-1-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰氨基)环丁烷甲酰胺
在0℃向化合物14(2.0g,3.5mmol)在nmp(50ml)中的溶液中逐滴加入socl2(1.25g,10.5mmol)。将反应混合物在20℃搅拌30min后，将其用水(50ml)稀释并用etoac(50ml×3)萃取。将有机层干燥，浓缩并通过快速柱纯化(dcm:meoh＝20:1),得到产物15(1.0g,48.4％)，其为灰色固体。lcms:(5-95,ab,1.5min),0.696min,m/z＝589.0[m+1]+。
步骤3：2-[[2-[(1s)-1-(氯甲基)-5-羟基-1,2-二氢苯并[e]吲哚-3-羰基]-1h-吲哚-5-基]氧基]乙基-[[4-[[(2s)-2-[[1-[5-(2,5-二氧代吡咯-1-基)戊基氨甲酰基]环丁烷羰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-二甲基-铵
将n1’-[(1s)-1-[[4-(氯甲基)苯基]氨甲酰基]-4-脲基-丁基]-n1-[5-(2,5-二氧代吡咯-1-基)戊基]环丁烷-1,1-二甲酰胺15(100质量％,1当量,0.04310mmol,1.000,25.39mg)和[(1s)-1-(氯甲基)-5-羟基-1,2-二氢苯并[e]吲哚-3-基]-[5-(2-二甲基氨基乙基氧基)-1h-吲哚-2-基]甲酮(100质量％,20mg,0.04310mmol,1.000,20mg)在n,n-二甲基甲酰胺(100质量％)中合并并将所得混合物搅拌数天。接下来加入四丁基碘化铵(65.65质量％,0.3当量,0.01293mmol,0.3000,7.276mg)并将混合物搅拌过夜。没有观察到碘化物与氯化物的交换。然后加入n,n-二异丙基乙胺(100质量％,1.2当量,0.05172mmol,1.200,6.685mg,0.00902ml)并将混合物搅拌4小时。反应混合物在lcms上含有主峰，其对应于所需产物。然后将反应混合物用dmf稀释，在酸性条件下在hplc上直接纯化并分离纯级份。在室温浓缩级份使一些物质降解。因此，物质被再次纯化。2-[[2-[(1s)-1-(氯甲基)-5-羟基-1,2-二氢苯并[e]吲哚-3-羰基]-1h-吲哚-5-基]氧基]乙基-[[4-[[(2s)-2-[[1-[5-(2,5-二氧代吡咯-1-基)戊基氨甲酰基]环丁烷羰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯基]甲基]-二甲基-铵(100质量％,11.8mg,0.0116mmol,0.269,11.8mg)。26.9％收率。m/z＝1017.35
实施例5：mc-sq-cit-pab-长春碱
(5s,7s,9s)-9-((3ar,3a1r,4r,5s,5ar,10br)-4-乙酰氧基-3a-乙基-5-羟基-8-甲氧基-5-(甲氧基羰基)-6-甲基-3a,3a1,4,5,5a,6,11,12-八氢-1h-吲嗪并[8,1-cd]咔唑-9-基)-3-(4-((s)-2-(1-((5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)戊基)氨甲酰基)环丁烷甲酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基)-5-乙基-5-羟基-9-(甲氧基羰基)-1,2,3,4,5,6,7,8,9,10-十氢-3,7-桥亚甲基[1]氮杂环十一碳并[5,4-b]吲哚-3-鎓
在小瓶中加入在n,n-二甲基甲酰胺(100质量％,100μl,1.29mmol,29.4,94.5mg,0.1ml)中的n1’-[(1s)-1-[[4-(氯甲基)苯基]氨甲酰基]-4-脲基-丁基]-n1-[5-(2,5-二氧代吡咯-1-基)戊基]环丁烷-1,1-二甲酰胺(100质量％,1当量,0.04400mmol,1.000,25.92mg)和长春碱(89.21质量％,b,40mg,0.04400mmol,1.000,40mg)。向该混合物中加入四丁基碘化铵(65.65质量％,0.3当量,0.01320mmol,0.3000,7.428mg)和n,n-二异丙基乙胺(100质量％,1当量,0.04400mmol,1.000,5.687mg,0.00767ml)并将混合物搅拌数天。再加入1当量碱以进一步推动反应。将反应混合物用dmf稀释，在酸性条件下在hplc上直接纯化。分离一个纯级份，得到最终产物(100质量％,8.1mg,0.0059mmol,0.13,8.1mg)m/z＝1364.85(13％收率)。还分离几个不纯级份。1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ10.58(s,1h),9.84(s,1h),8.78(s,1h),8.43(s,2h),8.11(d,j＝7.9hz,1h),7.91(t,j＝5.6hz,1h),7.74(d,j＝8.1hz,2h),7.66(d,j＝8.1hz,1h),7.47(d,j＝8.1hz,2h),7.35(d,j＝8.0hz,1h),7.14-6.99(m,2h),6.98(d,j＝2.4hz,1h),6.57(s,1h),6.41(s,1h),6.31(t,j＝6.6hz,1h),5.80(dd,j＝10.5,4.9hz,1h),5.54(s,2h),5.28(d,j＝10.1hz,1h),5.13(s,2h),4.60(d,j＝12.4hz,2h),4.40(dt,j＝17.3,6.1hz,2h),4.18-4.07(m,2h),3.78(s,3h),3.62(t,j＝14.1hz,6h),3.36(t,j＝7.0hz,2h),3.20(dq,j＝29.0,8.5,6.3hz,2h),3.07(q,j＝6.6hz,2h),2.98(q,j＝6.4hz,2h),2.93-2.86(m,1h),2.83-2.71(m,2h),2.67(s,3h),2.48-2.33(m,5h),2.30(d,j＝14.8hz,1h),2.12-2.04(m,1h),1.97(s,3h),1.70(ddtd,j＝44.3,19.2,9.5,8.5,4.4hz,4h),1.56-1.31(m,14h),1.26-1.14(m,3h),0.81(t,j＝7.4hz,4h),0.60(t,j＝7.3hz,3h)。
实施例6和7
实施例6：mc-sq-cit-pab-经吗啉连接的-吉非替尼
(s)-4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)-4-(4-(2-(1-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)戊基氨甲酰基)环丁烷甲酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基)吗啉-4-鎓
实施例7：mc-sq-cit-pab-经嘧啶连接的-吉非替尼
(s)-4-(3-氯-4-氟苯基氨基)-1-(4-(2-(1-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)戊基氨甲酰基)环丁烷甲酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-1-鎓
方案1
方案2.中间体的合成
将化合物1(113.88mg,0.20mmol)和化合物2(100mg,0.22mmol)在dmf(3.0ml)中的溶液在23℃搅拌18.0h。将反应混合物浓缩并通过硅胶色谱(10-20％meoh/dcm)纯化，得到呈黄色固体的化合物3a(9mg,4.3％收率)和呈白色固体的化合物3(8mg,3.5％收率)。3a的1hnmr:(400mhz,dmso-d6)δ10.10(s,1h),8.31(s,1h),8.17(s,1h),7.87-7.66(d,j＝8.8hz,2h),7.69-7.58(m,6h),7.39-7.02(m,8h),6.86(s,1h),6.0(s,1h),5.43(s,2h),5.33(s,2h),4.25-4.12(m,6h),3.74(s,4h),3.53-3.51(m,5h),2.99-2.92(m,2h),2.40-2.32(m,5h),1.89-1.85(m,2h),1.60-1.36(m,4h)；lcms(5-95ab/1.5min):rt＝0.673min,[m+h]+931.3。3的1hnmr:(dmso,400mhz)δ:10.59(s,1h),10.05(s,1h),8.50(s,2h),8.46(s,1h),8.18-8.16(d,j＝8.0hz,1h),8.00(s,1h),7.88-7.71(m,7h),7.514-7.24(m,8h),6.29(s,1h),5.54(s,2h),4.69(s,2h),4.30-4.14(m,6h),3.97-3.95(m,8h),3.57-3.51(m,6h),2.98-2.97(d,j＝5.6hz,2h),1.68-1.60(m,2h),1.47-1.40(m,2h)；lcms(5-95ab/1.5min):rt＝0.662min,[m+h]+931.3。
向化合物3(50.0mg,0.050mmol)在dmf(1.5ml)中的溶液中加入哌啶(9.13mg,0.110mmol)并将混合物在23℃搅拌3.0h。lcms显示50.6％的产物。将混合物浓缩并将残余物用mtbe(6.0ml)洗涤两次，得到化合物4(31mg,0.044mmol,81.4％)，其为白色固体且直接使用。lcms(5-95ab/1.5min):rt＝0.553min,[m+h]+709.2。
向化合物4(31.0mg,0.040mmol)在dmf(3.0ml)中的溶液中加入化合物5(41.4mg,0.090mmol)和diea(11.3mg,0.090mmol)。将混合物在23℃搅拌18.0h后，lcms显示52％的产物。将残余物通过制备型hplc(fa,乙腈20％-50％)纯化，得到(s)-4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯基氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)丙基)-4-(4-(2-(1-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)戊基氨甲酰基)环丁烷甲酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基)吗啉-4-鎓即实施例6(10.4mg,23.6％收率)，其为白色固体。lcms(5-95ab/1.5min):rt＝0.736min,[m+h]+1001.1。
向化合物3a(110.0mg,0.120mmol)在dmf(2.5ml)中的溶液中加入哌啶(20.1mg,0.240mmol)。将混合物在23℃搅拌3.0h。lcms显示50.7％的产物。将混合物浓缩以除去dmf，用mtbe(10.0ml)洗涤两次，得到粗化合物4a(85mg,100％收率)，其为黄色固体且直接用于下一步。
向化合物4a(40mg,0.060mmol)在dmf(3ml)中的溶液中加入化合物5(53.4mg,0.110mmol)和diea(14.6mg,0.113mmol)。将混合物在23℃搅拌18.0h。将所得残余物通过制备型hplc(fa,乙腈20％-50％)纯化，得到(s)-4-(3-氯-4-氟苯基氨基)-1-(4-(2-(1-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)戊基氨甲酰基)环丁烷甲酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-1-鎓即实施例7(10.3mg,17.9％收率)，其为黄色固体。lcms(5-95ab/1.5min):rt＝0.740min,[m]+1001.6。
在0℃向装有化合物6(1000mg,1.99mmol)的烧瓶中逐滴加入hbr/hoac溶液(4.0ml)。将其在25℃搅拌3.0h。lcms(5-95ab/1.5min)显示90.2％的产物。将混合物浓缩，加入etoac(300ml)并浓缩以除去少量酸，然后将残余物倒入冰-水(50.0ml)并通过过滤收集固体，得到化合物2(726mg,41.3％收率)，其为灰色固体。lcms(5-95ab/1.5min):rt＝0.772min,[m+h]+567.0。
向化合物7(200mg,0.65mmol)在dcm(12ml)中的溶液中加入化合物8(179mg,0.97mmol)和dic(123mg,0.97mmol)，将混合物在23℃搅拌1.5h。lcms显示70.9％的产物。将混合物浓缩并用thf(2.0ml)洗涤两次，得到化合物5(120mg,0.263mmol,40.5％收率)，其为无色油状物且直接用于下一步。
制备adc的方法
通过还原和再氧化制备用于缀合的半胱氨酸工程化抗体
在某些条件下通过用还原剂例如dtt(cleland试剂,二硫苏糖醇)或tcep(三(2-羧基乙基)膦盐酸盐；getz等人(1999)anal.biochem.vol273:73-80；soltecventures,beverly,ma)处理可使半胱氨酸工程化抗体具有反应性以与本申请连接基-药物中间体缀合。还原(例如在室温用约50倍过量的dtt还原过夜)在cho细胞中表达的全长半胱氨酸工程化单克隆抗体(thiomabs)(gomez等人(2010)biotechnologyandbioeng.105(4):748-760；gomez等人(2010)biotechnol.prog.26:1438-1445)以减少可在新引入的半胱氨酸残基和存在于培养基中的半胱氨酸之间形成的二硫键。
轻链氨基酸根据kabat(kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,(1991)第5版,usdeptofhealthandhumanservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md)编号。重链氨基酸根据eu编号系统(edelman等人(1969)proc.natl.acad.ofsci.63(1):78-85)编号，除注明kabat系统外。使用单字母氨基酸缩写。
在cho细胞中表达的全长半胱氨酸工程化单克隆抗体(thiomab)由于细胞培养条件而在工程化半胱氨酸上具有半胱氨酸加合物(胱氨酸)或谷胱甘肽化。为了释放工程化半胱氨酸的反应性巯基，将thiomab溶解在约ph8.0的500mm硼酸钠和500mm氯化钠中并用约50-100倍过量的1mmtcep(三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(getz等人(1999)anal.biochem.vol273:73-80；soltecventures,beverly,ma)在37℃还原约1-2小时。可选择地，dtt可用作还原剂。通过非还原性sds-page或通过变性反相hplcplrp柱色谱监测链间二硫键的形成。将还原的thiomab稀释并加载到在10mm醋酸钠(ph5)中的hitrapspff柱上并用含有0.3m氯化钠的pbs或含有150mm氯化钠的50mmtris-cl(ph7.5)洗脱。
通过进行再氧化在存在于母体mab中的半胱氨酸残基之间重新建立二硫键。用15×或2mm脱氢抗坏血酸(dhaa)在ph7将洗脱的还原的thiomab处理3小时或在50mmtris-cl(ph7.5)中或用2mm硫酸铜(cuso4)水溶液在室温处理过夜。可使用本领域已知的其它氧化剂和氧化条件。环境空气氧化也可为有效的。这种温和的部分再氧化步骤以高精确度有效地形成链内二硫化物。通过在sephadexg25树脂上洗脱来交换缓冲液并用具有1mmdtpa的pbs洗脱。通过由溶液在280nm的吸光度测定还原的抗体浓度及通过与dtnb(aldrich,milwaukee,wi)反应并测定在412nm的吸光度测定巯基浓度来检查巯基/ab值。
在具有扩展质量范围的tsqquantumtriplequadrupoletm质谱仪(thermoelectron,sanjosecalifornia)上进行液相色谱/质谱分析。样品在加热至75℃的prlp-
将疏水相互作用色谱(hic)样品注射到butylhicnpr柱(2.5微米粒径,4.6mm×3.5cm)(tosohbioscience)上并以0.8ml/min用0-70％b(a:1.5m硫酸铵在50mm磷酸钾(ph7)中的溶液,b:50mm磷酸钾(ph7),20％异丙醇)的线性梯度进行洗脱。使用配备有多波长检测器和chemstation软件的agilent1100系列hplc系统以解析和定量具有不同的药物/抗体比例的抗体种类。本申请半胱氨酸工程化抗体可按照上述一般方法制备。
连接基-药物中间体与抗体的缀合(程序1)
当在cho细胞中表达时，工程化抗体半胱氨酸作为与谷胱甘肽和/或半胱氨酸的混合二硫化物被封闭。这些半胱氨酸在缀合前必须被“去封闭”。将在20mm琥珀酸盐、150mmnacl、2mmedta中的去封闭的抗体(5-12mg/ml)加到75-100mmtris(ph7.5-8)(使用1mtris)中。将共溶剂(dmso、dmf或dma)加到抗体溶液中，然后加入连接基-药物(在dmso或dmf中)，使有机溶剂的最终％为10-13％且连接基-药物的最终浓度相对于抗体浓度为2.5-10×。使反应在室温进行1-12小时(直到达到最大缀合)。通过阳离子交换色谱和/或使用一次性柱进行凝胶过滤(分别为smaxi或zeba)来纯化缀合反应混合物。若根据分析性sec粗缀合物是显著聚集的(例如>10％)，则通过制备型凝胶过滤(s200柱)进行额外的纯化。随后使用凝胶过滤或透析将缀合物交换到制剂缓冲液(20mmhis-乙酸盐,ph5.5,240mm蔗糖)中。随后将tween-20加到纯化的缀合物中以达到0.02％的最终浓度。最终缀合物浓度范围为2.4-7.5mg/ml(来自去封闭的抗体的％收率为34-81％)。通过lcms分析缀合物以获得药物-抗体比(dar)的测量值，其范围为1.3-2.1(平均值为1.8)。还使用分析型sec(zenix或shodex柱)分析缀合物的高分子量聚集体的存在；纯化的最终缀合物显示0-10％的聚集。还对缀合物进行了内毒素污染评估，其在所有情况下都不超过1.3eu/毫克。游离的非缀合的药物不超过最终缀合物的1％。
连接基-药物中间体与抗体的缀合(方法2即替代方法)
上述实施例的还原和再氧化程序后，将抗体溶于pbs(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液并在冰上冷却。将约1.5摩尔浓度至20当量的过量的具有巯基反应性官能团例如马来酰亚氨基或溴乙酰胺的连接基-药物中间体溶于dmso，稀释在乙腈和水中并加到在pbs中的冷却的还原的再氧化的抗体中。约1小时后，加入过量的马来酰亚胺以淬灭反应并封闭任何未反应的抗体巯基。缀合物混合物可通过hitrapspff柱负载和洗脱以除去过量的药物-连接基中间体和其它杂质。通过离心超滤浓缩反应混合物并通过在pbs中通过g25树脂洗脱来纯化和脱盐半胱氨酸工程化抗体药物缀合物，在无菌条件下通过0.2μm过滤器过滤并冷冻储存。
本申请adc可根据上述章节描述的程序制备。
测定
然后测试所选连接基并在体外和体内测定中发现其是有活性的。裂解数据显示在下表中。
组织蛋白酶b裂解测定
如肽连接基那样，用于adc的非肽连接基预期在溶酶体中可裂解以用于适当的药物释放。作为细胞的消化性细胞器，溶酶体富含一些在酸性ph显示最佳水解活性的蛋白酶。组织蛋白酶b是代表性溶酶体蛋白酶且已被证实有助于adc肽连接基的活化。作为初始筛选，使用纯化的组织蛋白酶b开发用于对适于与抗体缀合的可裂解的连接基-药物构建体进行鉴定的测定。诺氟沙星用于代表连接基-药物的药物组分。在给定的时间点测量相对于对照肽(例如val-cit)的裂解百分比及裂解反应的动力学参数(km和vmax)。关于测定的详细描述如下所示。由该测定可鉴定多种具有蛋白水解活性且在结构上不同的连接基且随后用于制备adc。
使用实验性连接基-药物作为底物的组织蛋白酶b裂解活性通过使用lc/ms监测诺氟沙星的释放来测量。将不同浓度的连接基-药物(3倍连续稀释)在含有20nm组织蛋白酶b(emdmillipore目录号219364,人肝)、10mmmesph6.0、1mmdtt、0.03％chaps和25nm诺氟沙星-d5内标(santacruzbiotechnology,目录号sc-301482)的20μl反应混合物中温育。将反应混合物在37℃温育1小时，然后加入60μl2％甲酸以淬灭反应。通过在watersacquityuplcbehphenyl柱(2.1mm×50mm,waters目录号186002884)上注射2μl停止的反应混合物来分析样品。在wateracquityuplc上使用2分钟线性梯度(0％至80％)的乙腈,0.1％甲酸纯化样品。使用以正mrm模式运行的absciexqtrap5500三重四极质谱仪检测诺氟沙星和诺氟沙星-d5内标(诺氟沙星320→233m/z,诺氟沙星-d5325→233m/z)。将定量的诺氟沙星(用内标归一化)对连接基-药物浓度作图并使用graphpadprism软件用michaelis-menten拟合来曲线拟合所得图以得到动力学常数km和vmax。
体外细胞增殖测定
通过使用以下方案的细胞增殖测定来测量adc的效力(celltiterglotmluminescentcellviabilityassay,promegacorp.technicalbulletintb288；mendoza等人(2002)cancerres.62:5485-5488)：
1.将100μl含有约104个细胞(skbr-3、bt474、mcf7或mda-mb-468)在培养基中的细胞培养物的等分试样沉积在96孔具有不透明壁的板的每个孔中。
2.制备含有培养基且不含细胞的对照孔。
3.将adc加到实验孔中并温育3-5天。
4.将板平衡至室温且保持约30分钟。
5.加入体积与在每个孔中存在的细胞培养基的体积相等的celltiterglotm试剂。
6.将内容物在轨道振荡器上混合2分钟以诱导细胞裂解。
7.将板在室温温育10分钟以稳定发光信号。
8.记录发光并在图中报道为rlu＝相对发光单位。
将数据绘制为每个重复组的发光平均值+标准偏差误差棒。所述方案是celltiterglotm发光细胞培养基的改良：sk-br-3在50/50/10％fbs/谷氨酰胺/250μg/mlg-418中生长，ovcar-3在rpmi/20％fbs/谷氨酰胺中生长。
体内测定
1.在igrov-1(人卵巢癌)的小鼠异种移植物模型中研究抗napi2b抗体-药物缀合物(adc)的效力。
将雌性c.b-17scid米色小鼠(charlesriverlaboratories；sandiego,ca)各自在胸部乳腺脂肪垫区域接种500万个igrov-1细胞。当异种移植物肿瘤达到100-300mm3的平均肿瘤体积(称为第0天)时，将动物随机分成每组7-10只小鼠的组并接受adc的单次静脉内注射。在整个研究期间每周测量1-2次小鼠的肿瘤和体重。当体重减轻为其初始体重的>20％时，将小鼠立即安乐死。所有动物在肿瘤达到3000mm3或显示即将溃疡的迹象前安乐死。
2.在ovcar3-x2.1(人卵巢癌)的小鼠异种移植物模型中研究抗napi2b抗体-药物缀合物(adc)的效力。ovcar3细胞系获自atcc(americantypeculturecollection；manassas,va)并在genentech产生支系ovcar3-x2.1用于在小鼠中最佳生长。
将雌性c.b-17scid米色小鼠(charlesriverlaboratories；sandiego,ca)各自在胸部乳腺脂肪垫区域接种1000万个ovcar3-x2.1细胞。当异种移植物肿瘤达到100-300mm3的平均肿瘤体积(称为第0天)时，将动物随机分成每组7-10只小鼠的组并接受adc的单次静脉内注射。在整个研究期间每周测量1-2次小鼠的肿瘤和体重。当体重减轻为其初始体重的>20％时，将小鼠立即安乐死。所有动物在肿瘤达到3000mm3或显示即将溃疡的迹象前安乐死。
3.在bjab-luc(人伯基特氏淋巴瘤)或wsu-dlcl2(人弥漫性大b细胞淋巴瘤)的小鼠异种移植物模型中研究抗cd22抗体-药物缀合物(adc)的效力。bjab细胞系获自dsmz(germancollectionofmicroorganismsandcellcultures；braunschweig,germany)并在genentech产生支系bjab-luc以稳定表达萤光素酶基因。wsu-dlcl2细胞系也来自dsmz。
将雌性c.b-17scid小鼠(charlesriverlaboratories；sandiego,ca)各自在胁腹区域皮下接种2000万个bjab-luc或wsu-dlcl2细胞。当异种移植物肿瘤达到100-300mm3的平均肿瘤体积(称为第0天)时，将动物随机分成每组7-10只小鼠的组并接受adc的单次静脉内注射。在整个研究期间每周测量1-2次小鼠的肿瘤和体重。当体重减轻为其初始体重的>20％时，将小鼠立即安乐死。所有动物在肿瘤达到3000mm3或显示即将溃疡的迹象前安乐死。
4.在wsu-dlcl2(人弥漫性大b细胞淋巴瘤)的小鼠异种移植物模型中研究抗cd22抗体-药物缀合物(adc)的效力。wsu-dlcl2细胞系获自dsmz(germancollectionofmicroorganismsandcellcultures；braunschweig,germany)。
将雌性c.b-17scid小鼠(charlesriverlaboratories；sandiego,ca)各自在胁腹区域皮下接种2000万个wsu-dlcl2细胞。当异种移植物肿瘤达到100-300mm3的平均肿瘤体积(称为第0天)时，将动物随机分成每组7-10只小鼠的组并接受adc的单次静脉内注射。在整个研究期间每周测量1-2次小鼠的肿瘤和体重。当体重减轻为其初始体重的>20％时，将小鼠立即安乐死。所有动物在肿瘤达到3000mm3或显示即将溃疡的迹象前安乐死。
生物学数据
adc连接基-药物结构
序列
napi2b人源化抗体：
在一个实施方案中，本申请adc的napi2b抗体包含三个轻链高变区和三个重链高变区(seqidno:1-6)，其序列如下所示。
在一个实施方案中，本申请adc的napi2b抗体包含seqidno:7的可变轻链序列和seqidno:8的可变重链序列。
在一个实施方案中，本申请adc的napi2b抗体包含seqidno:9的轻链序列和seqidno:10的重链序列。
抗cd33人源化抗体：
在一个实施方案中，本申请adc的抗cd33抗体包含三个轻链高变区和三个重链高变区，其序列(seqidno:11-16)如下所示。
在一个实施方案中，本申请adc的抗cd33抗体包含seqidno:17的可变轻链序列和seqidno:18的可变重链序列。
在一个实施方案中，本申请adc的抗cd33抗体包含seqidno:19的轻链序列和seqidno:20的重链序列。
在一个实施方案中，本申请adc的抗cd33抗体包含三个轻链高变区和三个重链高变区，其序列(seqidno:19-24)如下所示。
在一个实施方案中，本申请adc的抗cd33抗体包含seqidno:25的可变轻链序列和seqidno:26的可变重链序列。
在一个实施方案中，本申请adc的抗cd33抗体包含seqidno:27的可变轻链序列和seqidno:28的可变重链序列。
在一个实施方案中，本申请adc的抗cd33抗体包含seqidno:29的可变轻链序列和seqidno:30的可变重链序列。
在一个实施方案中，本申请adc的抗cd33抗体包含seqidno:31的可变轻链序列和seqidno:32的可变重链序列。
抗cd22人源化抗体：
在一个实施方案中，本申请adc的抗cd22抗体包含三个轻链高变区和三个重链高变区(seqidno:41-46)，其序列如下所示。
在一个实施方案中，本申请adc的抗cd22抗体包含seqidno:47的可变轻链序列和seqidno:48的可变重链序列。
在一个实施方案中，本申请adc的抗cd22抗体包含seqidno:49的轻链序列和seqidno:50的重链序列。
adc体内数据
抗cd2210f4v3lck149cmc-sq-cit-pab-tubulysinm(adc2-2)在bjab和wsu-dlcl2中显示靶标特异性杀灭
抗cd2210f4v3lck149cmc-sq-cit-pab-多拉司他汀10(adc1-2)在wsu-dlcl2中显示靶标特异性杀灭
抗napi2b10h1.11.4blck149cmc-sq-cit-pab-tubulysinm(adc2-1)在eduprolif测定中在igrov-1和ovcar-3x2.1中显示靶标特异性杀灭
抗napi2b10h1.11.4blck149cmc-sq-cit-pab-多拉司他汀10(adc1-1)在eduprolif测定中在igrov-1和ovcar-3x2.1中显示靶标特异性杀灭
adc体内数据
以下adc在上述体内测定中进行测试且发现其具有活性。所述adc的活性在图1和以下描述中示出。
图1显示了多种cd22adc在具有wsu-dlcl2人弥漫性大b细胞淋巴瘤的scid小鼠中的效力比较。cd22adc1-2和adc2-2与媒介物组相比都对肿瘤生长显示出剂量依赖性抑制，且adc1-2显示出比adc2-2更强的抗肿瘤活性。非结合对照napi2badc对肿瘤生长具有最小的影响。
序列表
<110>基因泰克公司
<120>季铵化合物及其抗体-药物缀合物
<130>p32456-wo
<140>
<141>
<150>62/087,127
<151>2014-12-03
<160>50
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>16
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>1
argsersergluthrleuvalhisserserglyasnthrtyrleuglu
151015
<210>2
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>2
argvalserasnargpheser
15
<210>3
<211>9
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>3
pheglnglyserpheasnproleuthr
15
<210>4
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>4
glypheserpheseraspphealametser
1510
<210>5
<211>18
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>5
alathrileglyargvalalaphehisthrtyrtyrproaspsermet
151015
lysgly
<210>6
<211>13
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>6
alaarghisargglypheaspvalglyhispheaspphe
1510
<210>7
<211>113
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>7
aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly
151015
aspargvalthrilethrcysargsersergluthrleuvalhisser
202530
serglyasnthrtyrleuglutrptyrglnglnlysproglylysala
354045
prolysleuleuiletyrargvalserasnargpheserglyvalpro
505560
serargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthrile
65707580
serserleuglnprogluaspphealathrtyrtyrcyspheglngly
859095
serpheasnproleuthrpheglyglnglythrlysvalgluilelys
100105110
arg
<210>8
<211>120
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>8
gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly
151015
serleuargleusercysalaalaserglypheserpheseraspphe
202530
alametsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
354045
alathrileglyargvalalaphehisthrtyrtyrproaspsermet
505560
lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr
65707580
leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys
859095
alaarghisargglypheaspvalglyhispheaspphetrpglygln
100105110
glythrleuvalthrvalserser
115120
<210>9
<211>219
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>9
aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly
151015
aspargvalthrilethrcysargsersergluthrleuvalhisser
202530
serglyasnthrtyrleuglutrptyrglnglnlysproglylysala
354045
prolysleuleuiletyrargvalserasnargpheserglyvalpro
505560
serargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthrile
65707580
serserleuglnprogluaspphealathrtyrtyrcyspheglngly
859095
serpheasnproleuthrpheglyglnglythrlysvalgluilelys
100105110
argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu
115120125
glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe
130135140
tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln
145150155160
serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser
165170175
thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu
180185190
lyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserser
195200205
provalthrlysserpheasnargglyglucys
210215
<210>10
<211>450
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>10
gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly
151015
serleuargleusercysalaalaserglypheserpheseraspphe
202530
alametsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
354045
alathrileglyargvalalaphehisthrtyrtyrproaspsermet
505560
lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr
65707580
leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys
859095
alaarghisargglypheaspvalglyhispheaspphetrpglygln
100105110
glythrleuvalthrvalsersercysserthrlysglyproserval
115120125
pheproleualaproserserlysserthrserglyglythralaala
130135140
leuglycysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalser
145150155160
trpasnserglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalaval
165170175
leuglnserserglyleutyrserleuserservalvalthrvalpro
180185190
serserserleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislys
195200205
proserasnthrlysvalasplyslysvalgluprolyssercysasp
210215220
lysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleuglygly
225230235240
proservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetile
245250255
serargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisglu
260265270
aspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhis
275280285
asnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrarg
290295300
valvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylys
305310315320
glutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglu
325330335
lysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyr
340345350
thrleuproproserarggluglumetthrlysasnglnvalserleu
355360365
thrcysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrp
370375380
gluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproproval
385390395400
leuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasp
405410415
lysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethis
420425430
glualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserpro
435440445
glylys
450
<210>11
<211>16
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>11
argserserglnserleuleuhisserasnglytyrasntyrleuasp
151015
<210>12
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>12
leuglyvalasnservalser
15
<210>13
<211>9
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>13
metglnalaleuglnthrprotrpthr
15
<210>14
<211>5
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽e"
<400>14
asnhisalaileser
15
<210>15
<211>17
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>15
glyileileproilepheglythralaasntyralaglnlysphegln
151015
gly
<210>16
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>16
glutrpalaaspvalpheaspile
15
<210>17
<211>112
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>17
gluilevalleuthrglnserproleuserleuprovalthrprogly
151015
gluproalaserilesercysargserserglnserleuleuhisser
202530
asnglytyrasntyrleuasptrptyrleuglnlysproglyglnser
354045
proglnleuleuiletyrleuglyvalasnservalserglyvalpro
505560
aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysile
65707580
serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysmetglnala
859095
leuglnthrprotrpthrpheglyglnglythrlysvalgluilelys
100105110
<210>18
<211>117
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>18
glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyser
151015
servallysvalsercyslysalaserglyglyilepheserasnhis
202530
alailesertrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet
354045
glyglyileileproilepheglythralaasntyralaglnlysphe
505560
glnglyargvalthrilethralaaspgluserthrserthralaphe
65707580
metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys
859095
alaargglutrpalaaspvalpheaspiletrpglyglnglythrmet
100105110
valthrvalserser
115
<210>19
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>19
argalaserglnglyileargasnaspleugly
1510
<210>20
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>20
alaalaserserleuglnser
15
<210>21
<211>9
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>21
leuglnhisasnsertyrprotrpthr
15
<210>22
<211>5
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>22
glyasntyrmetser
15
<210>23
<211>16
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>23
leuiletyrserglyaspserthrtyrtyralaaspservallysgly
151015
<210>24
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>24
aspglytyrtyrvalseraspmetvalval
1510
<210>25
<211>107
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>25
aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly
151015
aspargvalthrilethrcysargalaserglnglyileargasnasp
202530
leuglytrptyrglnglnlysproglylysalaprolysargleuile
354045
tyralaalaserserleuglnserglyvalproserargphesergly
505560
serglyserglythrgluphethrleuthrileserserleuglnpro
65707580
gluaspphealathrtyrtyrcysleuglnhisasnsertyrprotrp
859095
thrpheglyglnglythrlysleugluilelys
100105
<210>26
<211>118
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>26
gluvalglnleuvalgluserglyglyalaleuileglnproglygly
151015
serleuargleusercysvalalaserglyphethrileserglyasn
202530
tyrmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
354045
serleuiletyrserglyaspserthrtyrtyralaaspservallys
505560
glyargpheasnileserargaspileserlysasnthrvaltyrleu
65707580
glnmetasnserleuargvalgluaspthralavaltyrtyrcysval
859095
argaspglytyrtyrvalseraspmetvalvaltrpglylysglythr
100105110
thrvalthrvalserser
115
<210>27
<211>107
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>27
aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly
151015
aspargvalthrilethrcysargalaserglnglyileargasnasp
202530
leuglytrptyrglnglnlysproglylysalaprolysargleuile
354045
tyralaalaserserleuglnserglyvalproserargphesergly
505560
serglyserglythrgluphethrleuthrileserserleuglnpro
65707580
gluaspphealathrtyrtyrcysleuglnhisasnsertyrprotrp
859095
thrpheglyglnglythrlysleugluilelys
100105
<210>28
<211>118
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>28
gluvalglnleuvalgluserglyglyalaleuileglnproglygly
151015
serleuargleusercysvalalaserglyphethrileserglyasn
202530
tyrmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
354045
serleuiletyrserglyaspserthrtyrtyralaaspservallys
505560
glyargphethrileserargaspileserlysasnthrvaltyrleu
65707580
glnmetasnserleuargvalgluaspthralavaltyrtyrcysval
859095
argaspglytyrtyrvalseraspmetvalvaltrpglylysglythr
100105110
thrvalthrvalserser
115
<210>29
<211>107
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>29
aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly
151015
aspargvalthrilethrcysargalaserglnglyileargasnasp
202530
leuglytrptyrglnglnlysproglylysalaprolysargleuile
354045
tyralaalaserserleuglnserglyvalproserargphesergly
505560
serglyserglythrgluphethrleuthrileserserleuglnpro
65707580
gluaspphealathrtyrtyrcysleuglnhisasnsertyrprotrp
859095
thrpheglyglnglythrlysleugluilelys
100105
<210>30
<211>118
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>30
gluvalglnleuvalgluserglyglyalaleuileglnproglygly
151015
serleuargleusercysvalalaserglyphethrileserglyasn
202530
tyrmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
354045
serleuiletyrserglyaspserthrtyrtyralaaspservallys
505560
glyargpheserileserargaspileserlysasnthrvaltyrleu
65707580
glnmetasnserleuargvalgluaspthralavaltyrtyrcysval
859095
argaspglytyrtyrvalseraspmetvalvaltrpglylysglythr
100105110
thrvalthrvalserser
115
<210>31
<211>107
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>31
aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly
151015
aspargvalthrilethrcysargalaserglnglyileargasnasp
202530
leuglytrptyrglnglnlysproglylysalaprolysargleuile
354045
tyralaalaserserleuglnserglyvalproserargphesergly
505560
serglyserglythrgluphethrleuthrileserserleuglnpro
65707580
gluaspphealathrtyrtyrcysleuglnhisasnsertyrprotrp
859095
thrpheglyglnglythrlysleugluilelys
100105
<210>32
<211>118
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>32
gluvalglnleuvalgluserglyglyalaleuileglnproglygly
151015
serleuargleusercysvalalaserglyphethrileserglyasn
202530
tyrmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
354045
serleuiletyrserglyaspserthrtyrtyralaaspservallys
505560
glyargphealaileserargaspileserlysasnthrvaltyrleu
65707580
glnmetasnserleuargvalgluaspthralavaltyrtyrcysval
859095
argaspglytyrtyrvalseraspmetvalvaltrpglylysglythr
100105110
thrvalthrvalserser
115
<210>33
<400>33
000
<210>34
<400>34
000
<210>35
<400>35
000
<210>36
<400>36
000
<210>37
<400>37
000
<210>38
<400>38
000
<210>39
<400>39
000
<210>40
<400>40
000
<210>41
<211>16
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>41
argserserglnserilevalhisservalglyasnthrpheleuglu
151015
<210>42
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>42
lysvalserasnargpheser
15
<210>43
<211>9
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>43
pheglnglyserglnpheprotyrthr
15
<210>44
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>44
glytyrglupheserargsertrpmetasn
1510
<210>45
<211>17
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>45
argiletyrproglyaspglyaspthrasntyrserglylysphelys
151015
gly
<210>46
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>46
aspglysersertrpasptrptyrpheaspval
1510
<210>47
<211>113
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>47
aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly
151015
aspargvalthrilethrcysargserserglnserilevalhisser
202530
valglyasnthrpheleuglutrptyrglnglnlysproglylysala
354045
prolysleuleuiletyrlysvalserasnargpheserglyvalpro
505560
serargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthrile
65707580
serserleuglnprogluaspphealathrtyrtyrcyspheglngly
859095
serglnpheprotyrthrpheglyglnglythrlysvalgluilelys
100105110
arg
<210>48
<211>120
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>48
gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly
151015
serleuargleusercysalaalaserglytyrglupheserargser
202530
trpmetasntrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
354045
glyargiletyrproglyaspglyaspthrasntyrserglylysphe
505560
lysglyargphethrileseralaaspthrserlysasnthralatyr
65707580
leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys
859095
alaargaspglysersertrpasptrptyrpheaspvaltrpglygln
100105110
glythrleuvalthrvalserser
115120
<210>49
<211>219
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>49
aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly
151015
aspargvalthrilethrcysargserserglnserilevalhisser
202530
valglyasnthrpheleuglutrptyrglnglnlysproglylysala
354045
prolysleuleuiletyrlysvalserasnargpheserglyvalpro
505560
serargpheserglyserglyserglythraspphethrleuthrile
65707580
serserleuglnprogluaspphealathrtyrtyrcyspheglngly
859095
serglnpheprotyrthrpheglyglnglythrlysvalgluilelys
100105110
argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu
115120125
glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe
130135140
tyrproargglualalysvalglntrpcysvalaspasnalaleugln
145150155160
serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser
165170175
thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu
180185190
lyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserser
195200205
provalthrlysserpheasnargglyglucys
210215
<210>50
<211>450
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注释="对人工序列的描述:合成肽"
<400>50
gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly
151015
serleuargleusercysalaalaserglytyrglupheserargser
202530
trpmetasntrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
354045
glyargiletyrproglyaspglyaspthrasntyrserglylysphe
505560
lysglyargphethrileseralaaspthrserlysasnthralatyr
65707580
leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys
859095
alaargaspglysersertrpasptrptyrpheaspvaltrpglygln
100105110
glythrleuvalthrvalserseralaserthrlysglyproserval
115120125
pheproleualaproserserlysserthrserglyglythralaala
130135140
leuglycysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalser
145150155160
trpasnserglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalaval
165170175
leuglnserserglyleutyrserleuserservalvalthrvalpro
180185190
serserserleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislys
195200205
proserasnthrlysvalasplyslysvalgluprolyssercysasp
210215220
lysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleuglygly
225230235240
proservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetile
245250255
serargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisglu
260265270
aspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhis
275280285
asnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrarg
290295300
valvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylys
305310315320
glutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglu
325330335
lysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyr
340345350
thrleuproproserarggluglumetthrlysasnglnvalserleu
355360365
thrcysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrp
370375380
gluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproproval
385390395400
leuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasp
405410415
lysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethis
420425430
glualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserpro
435440445
glylys
450