本发明属于天然产物提取
技术领域：
，尤其涉及一种从大豆干细胞培养物中提取植物甾醇的方法。
背景技术：
：植物干细胞是所有植物细胞的起源，植物是由植物干细胞分裂形成的。植物干细胞技术被认为是21世纪生物
技术领域：
最具竞争力的技术之一。植物干细胞培养，是在传统组培技术的基础上，改进了现有方法，以植物干细胞为目标，诱导、分离和培养外植体，建立相应的干细胞培养体系。通过同步的植物干细胞培养，可实现次生代谢物批量生产的稳定性和目标活性物质的大量生产，为功能食品的研发提供大量的原材料。通过植物干细胞培养，不仅丰富了植物培养技术，而且为天然产物的商业化生产，乃至植物生物技术的发展，提供了新的研究方向和契机。植物甾醇是一种广泛存在于植物根、茎、叶、果实和种子中的一种天然活性成分，尤其在大豆中含量较高。植物甾醇的种类繁多，目前，从植物中鉴定出了250多种植物甾醇，它们主要以游离态、甾醇酯(脂肪酸酯和酚酸酯)、甾基糖苷和酰化甾基糖苷等形式存在。不同的植物种类，其含量不同，植物油及其加工副产物是植物甾醇最丰富的自然来源。植物甾醇在结构上与胆固醇相似，但是它比胆固醇更易形成胶束，可以降低胆固醇进入血液中的几率，从一定程度上限制外源胆固醇的摄入量，因此能够抑制人体对胆固醇的吸收、促进胆固醇的降解代谢、抑制胆固醇的生化合成等作用。此外植物甾醇可用于预防治疗冠状动脉粥样硬化类的心脏病，对治疗溃疡、皮肤鳞癌、宫颈癌等有明显的疗效，植物甾醇还是重要的甾体药物和维生素D3的生产原料。关于植物甾醇的提取方法有多种，其原理一般是基于原料组成、化学性质、物理性质及生化反应等方面的差异，如利用皂化、中和、酶解、溶解度、蒸气压、吸附力的差异及在不同温度、真空、表面活性剂下物理、化学性质变化等以分离除去非甾醇类物质。常见的提取方法有溶剂结晶法、络合法、皂化法、蒸馏法(简单蒸馏法、分子蒸馏法)、吸附法(柱吸附法、高压流体吸附法)、超临界CO2萃取法、酶法等。传统有机溶剂提取方法不但需要耗费大量溶剂，还牵涉到长时间较高温度提取，影响产品质量。目前，没有关于从植物干细胞培养物中提取植物甾醇的报道。技术实现要素：本发明的目的是提供一种从大豆干细胞培养物中提取植物甾醇的方法。该方法以含有高含量植物甾醇的大豆干细胞培养物为原料，为植物甾醇的提取提供一种新途径，同时结合亚临界萃取技术，提供一种工艺操作简单、安全性高、植物甾醇含量高的植物甾醇提取方法。为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：一种从大豆干细胞培养物中提取植物甾醇的方法，该方法包括：(1)将大豆干细胞培养物冻干，粉碎过20～80目筛，送入亚临界萃取器中，密闭萃取器，控制萃取器内的真空度至-0.5～-0.8MPa；(2)打入液化的萃取溶剂进行逆流萃取；(3)萃取结束后将萃取液打入蒸发罐，去除溶剂，得到萃取物粗品；(4)将萃取物粗品进行结晶纯化，得到植物甾醇。上述方法中，所述萃取溶剂优选为正丁烷或丙烷。进一步地，步骤(2)中，料液比为1∶(5～20)，萃取温度35～70℃，萃取时间30～60min，萃取压力0.1～1.0MPa，萃取次数2～4次。进一步地，步骤(3)中，去除溶剂时温度控制在20～65℃。进一步地，结晶纯化的步骤：取所述萃取物粗品，加入乙酸乙酯，料液比1∶(3～10)，用磁力搅拌器一边加热一边搅拌，加热温度控制在35～50℃，待样品完全溶解后停止加热和搅拌，自然降温结晶，降至室温后维持1～3h，抽滤得到植物甾醇精品。在本发明的上述方法中，本发明所使用的大豆干细胞培养物是通过下述方法制备获得的：(1)将大豆种子用乙醇溶液浸泡，无菌水冲洗后，再用次氯酸钠溶液浸泡，然后无菌水冲洗，获得无菌大豆；(2)取上述无菌大豆的下胚轴，将其切成长度为1.5-2.5mm，获取无菌大豆组织；(3)将获得的无菌大豆组织，接种于诱导培养基进行诱导培养，获得愈伤组织，其中，1g无菌大豆组织接种于25-35mL的诱导培养基；(4)将上述获得的愈伤组织，接种于增殖培养基，摇床培养，同时于第2天开始进行稳态磁场干预，即可获得富含植物甾醇的大豆干细胞培养物；所述诱导培养基为含8-28mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、15-17mg/L柠檬酸铵和0.1-0.5mg/L萘乙酸的MS培养基，pH调至6.0-6.3；所述增殖培养基为含8-28mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、1.5-2.5mg/L的蔗糖和0.1-0.5mg/L水解酪蛋白的MS培养基，pH调至6.8-7.0。进一步地，上述方法中，所述乙醇溶液的质量浓度为75-90％，次氯酸钠溶液的质量浓度为2-10％。进一步地，所述诱导培养为暗培养，温度为30-32℃，6-7天为一个培养周期，优选培养2-3个培养周期。进一步地，所述增殖培养温度为30-32℃，光照10-12h/d，摇床培养转速为110-130r/min，7天为一个培养周期，优选培养2-3个培养周期。进一步地，在增殖培养中，稳态磁场干预具体参数为每个培养周期中加载稳态磁场5-6天，每天曝磁6-8h，强度为0.9-3T。本发明的有益效果如下：本发明提供了一种工艺操作简单、安全性高的植物甾醇提取方法：首先传统上提取植物甾醇的原料多为植物油脱臭馏出物，本发明以含有高含量植物甾醇的大豆干细胞培养物为原料，该原料不仅植物甾醇含量高，而且制备周期短，经检测大豆干细胞中植物甾醇含量不低于6000mg/100g，普通大豆中植物甾醇含量大约为310mg/100g，二者植物甾醇含量相差近20倍，而且大豆干细胞培养周期仅为普通大豆生长周期的1/3，可见本发明所述的大豆干细胞培养物不仅缩短了生长周期，而且降低了生产成本，为植物甾醇的提取用原料提供了一种新途径。其次本发明采用亚临界萃取技术，整个萃取过程中低温、低压，可有效保护植物甾醇活性不被破坏，工艺简单，对设备要求低，溶剂残留少，产品不仅安全性高而且可大幅度提高植物甾醇提取率，提取成本低，最终得到含量和纯度都较高的植物甾醇，因此应用亚临界萃取技术提取制备大豆干细胞培养物中植物甾醇具有很大的应用价值。应用本发明提取制备的植物甾醇提取率达5.95％，提取物中植物甾醇相对纯度达97.98％。附图说明图1植物甾醇亚临界萃取工艺流程图。具体实施方式为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。实施例1富含植物甾醇大豆干细胞培养物的培养：一、培养基配制1、诱导培养基：含8-28mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、15-17mol/L柠檬酸铵和0.1-0.5mg/L萘乙酸的MS培养基，pH调至6.0-6.3；所述增殖培养基为2、增殖培养基：含8-28mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、1.5-2.5mg/L的蔗糖和0.1-0.5mg/L水解酪蛋白的MS培养基，pH调至6.8-7.0。二、获取无菌大豆将大豆种子用质量浓度为75-90％的乙醇浸泡15min，无菌水洗净；用质量浓度为2-10％的次氯酸钠浸泡2-5min，无菌水洗净；取上述无菌大豆下胚轴，将其切成长度为1.5-2.5mm。三、诱导培养取按照上述方法获得的无菌大豆组织，放于以上所述诱导培养基中，于30-32℃条件下避光培养6-8天，按照1g样品接种于25-35mL培养基的比例进行诱导，6-7天为一个周期，培养2-3个周期，获得愈伤组织。四、高温胁迫协同稳态磁场诱导大豆干细胞培养物富集植物甾醇取按上述方法获得的愈伤组织，将其接种在增殖培养基中，于30-32℃，光照10-12h/d条件下，进行摇床培养，转速为110-130r/min。从培养的第2天起加载稳态磁场，每个周期(7天)加载5-6天，每天曝磁6-8h，强度为0.9-3T，培养3个周期，即可获得富含植物甾醇的大豆干细胞培养物。植物甾醇测定一、植物甾醇提取准确称取10g大豆或大豆干细胞培养物(大豆干细胞培养物使用前先作冻干处理)，将其粉碎过60目筛，以无水乙醇为提取液，按照料液比1:20，超声波功率500W，提取温度50℃，提取时间60min的工艺参数进行超声波提取后，以4000r/min离心5分钟，冷却至室温后真空抽滤，弃去沉淀，旋转蒸发后定容，得到植物甾醇粗提液。二、大豆甾醇含量的测定参照GB/T25223-2010甾醇总量测定方法测定甾醇含量，测定结果如下：名称植物甾醇含量(mg/100g)本发明培育大豆干细胞培养物6025普通大豆310.63大豆干细胞培养物中植物甾醇含量为6025mg/100g，普通大豆中植物甾醇含量为310.63mg/100g，二者植物甾醇含量相差近20倍。实施例2植物甾醇的提取(1)取100g实施例1制备的大豆干细胞培养物冻干，然后粉碎过60目筛；送入亚临界萃取器中，密闭萃取器，控制萃取器内的真空度至-0.5～-0.8MPa；(2)通入液化的正丁烷进行逆流萃取，样品与正丁烷的料液比为1∶10，萃取温度40℃，萃取时间30min，萃取压力0.6MPa，萃取2次；(3)萃取结束后将萃取液打入蒸发罐，使溶剂与样品分离，脱溶过程中温度控制在50℃左右，保持恒温，最终得到萃取物粗品；(4)取一定量的萃取物粗品，加入乙酸乙酯，料液比1∶8，用磁力搅拌器一边加热一边搅拌，加热温度控制在50℃，待样品完全溶解后停止加热和搅拌，让其自然降温结晶，降至室温后维持2h，抽滤得到植物甾醇精品。植物甾醇检测及提取率测定：参照GB/T25223-2010甾醇总量测定方法测定大豆干细胞培养物、植物甾醇萃取物粗品、植物甾醇精制品中甾醇含量并计算提取率。提取率/％＝萃取物中甾醇总量/大豆干细胞培养物总量×100％；植物甾醇相对纯度/％＝萃取处理后甾醇总量/萃取处理前甾醇总量×100％测定结果如下：经计算，应用本方法制备的植物甾醇萃取物粗品提取率可达到5.95％，最后制得精品相对纯度可达到97.98％，表明应用本发明提取大豆干细胞培养物中植物甾醇方法具有较高的提取效率。实施例3植物甾醇的提取(1)取100g实施例1制备的大豆干细胞培养物冻干，然后粉碎过60目筛；送入亚临界萃取器中，密闭萃取器，控制萃取器内的真空度至-0.5～-0.8MPa；(2)通入液化的正丁烷进行逆流萃取，样品与正丁烷的料液比为1∶20，萃取温度70℃，萃取时间60min，萃取压力1.0MPa，萃取3次；(3)萃取结束后将萃取液打入蒸发罐，使溶剂与样品分离，脱溶过程中温度控制在60℃左右，保持恒温，最终得到萃取物粗品；(4)取一定量的萃取物粗品，加入乙酸乙酯，料液比1∶10，用磁力搅拌器一边加热一边搅拌，加热温度控制在40℃，待样品完全溶解后停止加热和搅拌，让其自然降温结晶，降至室温后维持3h，抽滤得到植物甾醇精品。实施例4植物甾醇的提取(1)取100g实施例1制备的大豆干细胞培养物冻干，然后粉碎过60目筛；送入亚临界萃取器中，密闭萃取器，控制萃取器内的真空度至-0.5～-0.8MPa；(2)通入液化的正丁烷进行逆流萃取，样品与正丁烷的料液比为1∶5，萃取温度35℃，萃取时间30min，萃取压力0.2MPa，萃取3次；(3)萃取结束后将萃取液打入蒸发罐，使溶剂与样品分离，脱溶过程中温度控制在30℃左右，保持恒温，最终得到萃取物粗品；(4)取一定量的萃取物粗品，加入乙酸乙酯，料液比1∶4，用磁力搅拌器一边加热一边搅拌，加热温度控制在35℃，待样品完全溶解后停止加热和搅拌，让其自然降温结晶，降至室温后维持2h，抽滤得到植物甾醇精品。显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。当前第1页1 2 3