一种可降解的脑膜修复材料及其制备方法与流程

本发明涉及一种可降解的脑膜修复材料及其制备方法，属于天然生物医用材料领域。

背景技术：

硬脑膜是一层厚而坚韧的双层膜，内层光滑、外层粗糙，具有保护脑和防止脑脊液与外界沟通的功能。开放性颅脑损伤、炎症、脑肿胀、脑瘤侵犯、过分电灼脑膜等因素均可导致脑膜缺损，从而导致脑功能障碍、脑组织黏连、癫痫等的发作。硬脑膜修补材料的使用对于硬脑膜重建修复具有重要作用。

虽然目前国内外硬脑膜替代材料种类很多，但是仍存在着较多的问题。异体人硬脑膜、阔筋膜，无细胞人体真皮层等同种异体材料，来源有限、价格昂贵，且有传播“克罗伊茨费尔特-雅各布病”等疾病的风险，存在伦理方面的问题，且制品的细胞组织间隙较大，术后易致脑脊液漏，在一定程度上限制了其应用。异种生物材料硬脑膜取材包括胶原海绵、牛心包、猪心包、牛腹膜、猪腹膜、猪肠系膜及羊心包等。该种材料虽是临床上应用较多的品种，但加工过程中多需经环氧化物或戊二醛等消毒剂处理，有残留毒性；代谢缓慢，可引起炎症反应，并难以解决脑脊液渗漏等术后不良问题；且存在动物源材料安全性的潜在风险。因此，有的国家已经禁用这类材料的使用。合成材料类硬脑膜如聚氨甲酸乙酯、膨体聚四氟乙烯、聚丙烯等，易于成型和消毒，无传播病毒疾病的风险，材料的结构和机械性能比较理想，但是植入后有可能导致慢性炎症反应、瘢痕或包裹反应、术腔感染、迟发性出血、机械压迫等，还存在组织相容性等问题，且此类材料大多依赖进口，价格昂贵，难于在基层医院临床中应用推广。

理想的硬脑膜替代材料应有以下特点：1、生物相容性好；2、一定的弹性和韧性，能承受缝合；3、结构致密，能防粘连和脑脊液漏；4、能起到支架作用，以利于成纤维细胞迁入、粘附和增值，从而促使硬膜再生；5、新硬膜形成后，能被逐渐吸收，以防长期存在的异物带来不良影响；6、易于消毒储存，使用方便，手术操作简单；7、取材广泛，价格低廉。

细菌纤维素(BC)是由微生物合成的新型纳米级生物材料。该材料具有很好的生物相容性、高抗张强度和弹性模量、极佳的抗撕拉能力、吸水和持水性能好等优点。因此在生物医用领域有广泛的应用前景。目前已经商品化的医用敷料有皮肤替代品Biofill、Bioprocess，治疗牙周组织疾病的Gengflex，治疗溃疡的prima Cel等。而BC在硬脑膜修补方面的应用，目前市场仅有Dura Repair，并且该产品无法实现体内降解。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种可降解的脑膜修复材料及其制备方法，本发明脑膜修复材料具有防黏连和防脑脊液漏功能，且能在引导自体硬脑膜组织缺损修复的同时逐步降解。

本发明提供的可降解的脑膜修复材料，包括设有孔隙的细菌纤维素膜；

所述细菌纤维素膜为通过氧化处理将C6位羟基氧化为羧基的氧化细菌纤维素。

上述的脑膜修复材料中，所述脑膜修复材料的厚度为0.1mm～3mm；

所述脑膜修复材料的一面孔隙的孔径为纳米级至微米级，另一面孔隙的孔径为微米级。

上述的脑膜修复材料中，所述脑膜修复材料的孔隙包括多层，其孔径大小可由所述脑膜修复材料的一面至另一面递减。

本发明中，所述脑膜修复材料的孔隙的孔径为纳米级至微米级的一面，称为防黏连层；

所述脑膜修复材料的孔隙的孔径为微米级的另一面，称为诱导组织再生的支架层；

所述脑膜修复材料的多层孔隙的孔径由防黏连层至诱导组织再生的支架层递减；

上述两层之间还可包括至少一层孔径的孔隙的过渡层细菌纤维素膜，该过渡层细菌纤维素膜的孔隙介于所述防黏连层和所述诱导组织再生的支架层之间。

本发明使用时，所述脑膜修复材料中所述防黏连层为面向大脑的一面，其结构致密且光滑，具有防黏连和防止脑脊液漏的作用；

所述脑膜修复材料中所述诱导组织再生的支架层为背向大脑的一面，其孔径较所述防黏连层，为粗糙层，能诱导组织再生。

上述的脑膜修复材料中，所述脑膜修复材料一面的孔径可为0nm～10μm，但不包括0；优选采用纳米级，具体可为100nm、500nm、10nm～500nm或10nm～500nm，此面可作为防黏连层；

另一面的孔径可为50～500μm，具体可为100μm、500μm或100～500μm，此面可作为诱导组织再生的支架层。

本发明中，所述脑膜修复材料的孔隙具有纵向差异化；在人体内可降解，降解时间为3～6个月。

本发明还提供了上述的脑膜修复材料的制备方法，包括如下步骤：(1)在所述细菌纤维素膜上制备所述孔隙，得到设有孔隙的细菌纤维素膜；

(2)经步骤(1)得到的所述设有孔隙的细菌纤维素膜进行C6位羟基基团的氧化反应，即得到所述可降解的脑膜修复材料。

上述的制备方法中，所述孔隙梯度模板致孔法；

步骤(1)中还包括将所述设有孔隙的细菌纤维素膜依次经碱液和表面活性剂中浸泡纯化并洗涤的步骤。

上述的制备方法中，所述梯度模板致孔法按照包括如下步骤：

1)将颗粒大小分别为50～500μm和0～10μ(但不包括0)的致孔剂依次铺展在培养容器的上下层或下上层，2层所述致孔剂按相同厚度铺展，所述铺展的总厚度为0.1～3mm；

2)将活化的菌种接入到细菌培养液处理中的容器中培养。

本发明所述梯度模板致孔法中，所述能够合成纤维素的菌种是本领域技术人员可以根据本领域常识选择任何能够产纤维素的菌，具体可如醋杆菌属、无色杆菌属、气杆菌属、土壤杆菌属、产碱杆菌属、根瘤菌属、假单胞杆菌属、八叠球菌属和动胶菌属中的一种或几种微生物；

所述相应的菌培养液指的是本领域技术人员可以根据本领域常识选择任何适合于培养上述菌以产生纤维素的培养液；具体采用木醋杆菌时，所述步骤1)的中的细菌培养液具体为：甘露醇25g/L，胰蛋白胨3g/L，酵母粉5g/L，pH5.0，121℃灭菌20min，冷却至30℃后使用；其他菌种所用的培养液属于本领域内公知的特定培养液配方。

上述的制备方法中，所述致孔剂选自a)-d)中至少一种材料：a)常温下不熔、40～100℃可熔融的材料；b)酸性条件下可溶解的材料；c)碱性条件下可溶解的材料；d)有机溶剂可溶解的材料；

所述常温下不熔、40～100℃可熔融的材料具体包括石蜡、琼脂和固态油脂中的至少一种；

所述酸性条件下可溶解的材料具体包括CaCO₃、MgCO₃、BaCO₃和壳聚糖中的至少一种；

所述碱性条件下可溶解的材料具体包括石英；

所述有机溶剂可溶解的材料具体包括玉米朊；

步骤2)中，所述培养的温度可为10～35℃，时间可为1～30d。

上述的制备方法中，所述方法中，步骤(1)中还包括除去所述致孔剂的步骤；

采用加热熔融、酸溶、碱溶和有机溶剂溶解中至少一种方法除去所述致孔剂。

上述的制备方法中，所述碱液为NaOH、KOH、Na₂CO₃、K₂CO₃、Ca(OH)₂、Mg(OH)₂中至少一种的水溶液；使用所述碱液的目的是去除产物中的菌体、内毒素、残留培养基等成分；

所述碱液的浓度为0.1～10mol/L；

在所述碱液中浸泡纯化并洗涤条件为在0～35℃浸泡20min～24h；

所述表面活性剂为聚乙二醇辛基苯基醚、吐温-80和吐温-40中的至少一种的水溶液；使用所述表面活性剂的目的在于通过表面活性剂溶解细胞壁中的脂质，从而破坏细胞壁，使菌体细胞破碎释放，并具有进一步去除内毒素及其他残留成分的作用，提高纯化程度；

所述表面活性剂的质量百分浓度为0.1％～10％；

在所述表面活性剂中浸泡纯化并洗涤条件为：在0～35℃浸泡1～100h；

所述氧化反应采用的试剂为氯酸钠、溴酸钠、亚氯酸钠、次氯酸盐、亚硝酸和硝酸钠的磷酸溶液、NO₂和N₂O₄中的至少一种。

本发明中，所述聚乙二醇辛基苯基醚的分子量为646.85。

本发明中，所述氧化反应采用的试剂均为本领域内公知的纤维素氧化体系，其浓度均采用本领域常用的浓度。

上述的制备方法中，若采用氯酸钠反应体系进行所述氧化反应，按照包括如下步骤：

1)经步骤(2)处理的所述设有孔隙的细菌纤维素膜置于-20～60℃的碱溶液中浸泡1～48h；

2)将步骤1)处理的产物抽滤后，用醇的水溶液溶胀；

3)缓慢分次加入氯乙酸进行羧化反应；

4)用醋酸中和，使pH在6.0-8.0，并用乙醇水溶液充分纯化洗涤。

上述的制备方法中采用氯酸钠反应体系进行所述氧化反应时，所述碱溶液为NaOH和/或KOH的水溶液；

所述碱溶液质量百分浓度可为10％～60％；

所述碱溶液体积与所述细菌纤维素膜的干重质量比为10～60ml:1g。

上述的制备方法中采用氯酸钠反应体系进行所述氧化反应时，所述氧化反应的方法中，步骤2)中所述醇为甲醇、乙醇和异丙醇中至少一种；

所述醇的水溶液的质量百分浓度为50％～90％；

所述醇的水溶液的体积与所述细菌纤维素膜的干重质量比为5～30ml:1g；

所述溶胀的温度为0～60℃；所述溶胀的时间为30min～48h。

上述的制备方法中采用氯酸钠反应体系进行所述氧化反应时，所述氯乙酸与所述细菌纤维素膜的干重质量比为1～10:1；

所述羧化反应的温度为0～70℃；所述羧化反应的时间为0.5～100h。

本发明中，采用其他的氧化剂进行所述氧化反应的步骤均为本领域人员公知的方法。

本发明具有以下优点：

(1)提供了一种BC脑膜修复材料纵向孔隙差异化的致孔方法。该方法简单，可控性强；所用试剂绿色环保，去除方便，无残留的风险。

(2)提供了一种纵向孔隙差异化的BC脑膜修复材料，既能起到防止脑脊液漏和防黏连的作用，又能诱导组织细胞的迁入、粘附、聚集和增值，从而促进自体脑膜的再生修复。

(3)热碱法和表面活性剂的共同使用，对BC脑膜修复材料的纯化洗涤具有协同增效的作用，可以最大程度地去除其中残留菌体、内毒素和残留培养基等，大大提高材料的生物相容性和安全性。

(4)提供了BC材料降解性能的调控方法，该方法操作绿色环保，简单可行，有利于BC生物医用材料作为植入医疗器械在人体的广泛使用。

(5)在BC膜的基础上进行降解改性，有利于保留BC膜天然的纳米网络结构和结晶状态，从而保留了BC膜优良的力学性能。

(6)提供了一种可降解的BC脑膜修复材料，实现了降解与诱导组织再生的同步性，避免了材料长期留存体内可能存在的免疫排斥或炎症等副作用。

附图说明

图1为可降解的BC脑膜修复材料电镜下两面的观察结果；其中图1(a)为诱导组织再生的支架层；图1(b)为防黏连层。

图2为可降解的BC脑膜修复材料断面的电镜观察图。

图3为可降解的BC脑膜修复材料防黏连实验图。

图4为可降解的BC脑膜修复材料防渗漏实验图。

图5为可降解的BC脑膜修复材料的皮内刺激实验图。

图6为植入后第4周取样制作成的组织学切片的观察结果。

图7为植入后第12周取样制作成的组织学切片的观察结果。

图8为植入后第24周取样制作成的组织学切片的观察结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、可降解的脑膜修复材料的制备

1、将颗粒大小为100μm的石蜡颗粒铺展在培养容器的下层，铺展厚度为1mm，用以制备诱导组织再生的支架层(厚度为1mm，孔径为100μm)；上层铺展100nm致孔剂石蜡(厚度为1mm，孔径为100nm)，用以制备防黏连层。将活化的木醋杆菌接入到细菌培养液中混合均匀后加入到培养容器中，培养基液面深度约为2mm，并置于20℃培养20d后，取出BC膜并置于50-70℃水浴中加热去除其中的致孔剂石蜡。细菌培养液为：甘露醇25g/L，胰蛋白胨3g/L，酵母粉5g/L，pH5.0，121℃灭菌20min，冷却至30℃后使用。

2、将上述BC膜用蒸馏水充分洗涤后，离心甩干，再先后置于10℃1mol/L NaOH溶液和5℃4％聚乙二醇辛基苯基醚溶液中分别浸泡15h和80h。浸泡结束后，用蒸馏水充分洗涤并烘干，得到具有双层孔隙的BC膜。

3、用质量百分浓度为50％的氢氧化钾水溶液，以碱液体积ml：BC膜干重g＝30:1的比例于30℃下浸泡BC膜12h。然后将碱化的BC膜抽滤甩干；再置于80％的乙醇水溶液中，置于0℃下溶胀48h。其中乙醇水溶液的体积ml：BC膜干重g＝20:1。

4、缓慢分次加入氯乙酸，于70℃下反应0.5h。氯乙酸重：BC干重＝2:1。

5、反应结束后，中和至pH值在7.0，并用乙醇水溶液充分洗涤干燥，即得到可降解的脑膜修复材料。

实施例2、可降解的脑膜修复材料的制备

1、将颗粒大小分别为500μm和500nm的CaCO₃铺展在培养容器的下层和上层，分别作为诱导组织再生的支架层和防黏连层，铺展厚度均1.5mm。将活化的木醋杆菌接入到细菌培养液中混合均匀后加入到培养容器中，并置于30℃培养14d后，取出BC膜并置于2％的盐酸溶液中浸泡5h以除去其中的CaCO₃致孔剂。细菌培养液为：甘露醇25g/L，胰蛋白胨3g/L，酵母粉5g/L，pH5.0，121℃灭菌20min，冷却至30℃后使用。

2、将上述BC膜用蒸馏水充分洗涤并离心甩干，再先后置于25℃8mol/L NaOH溶液和30℃6％吐温-40溶液中分别浸泡5h和40h。浸泡结束后，用蒸馏水充分洗涤并烘干，得到具有双层孔隙的BC膜。

3、用质量百分浓度30％的NaOH水溶液于15℃下浸泡BC膜24h。其中碱液体积ml：BC膜干重g＝50:1。将碱化的BC膜抽滤甩干。将BC膜加入至无水异丙醇中，置于40℃下溶胀1h。其中异丙醇体积ml：BC膜干重g＝15:1。

4、缓慢分次加入氯乙酸，于25℃下反应60h。氯乙酸重：BC干重＝4:1。

5、反应结束后，中和至pH在7.5，并用乙醇水溶液充分洗涤干燥，即得到可降解的脑膜修复材料。

本发明实施例2制备的可降解的脑膜修复材料的表征实验如下：

1、形貌表征

由图1中BC膜的扫描电镜图示可知，BC膜一面为引导细胞爬行实现组织再生的疏松多孔性支架结构，另一面为防止组织粘连以及脑脊液渗漏的致密型物理屏障结构。

由图2中BC膜的断面电镜图可知，该BC膜纵向孔隙大小呈梯度分布，具有多层结构。膜的外层一侧结构致密且孔隙率小；而另一侧则结构相对疏松且孔隙率大，孔隙大小可达几百微米。中间层的孔隙大小和孔隙率介于之间。这种梯度分布的孔隙结构有利于其同时发挥防黏连和诱导组织再生的双重作用。

2、防黏连实验

将健康成年的新西兰兔，禁食但不禁水12h后，用3％异戊巴比妥钠(30mg/kg)，兔耳缘静脉注射麻醉，兔头固定于头架上。腹部脱毛打开腹腔，暴露肝脏，将BC脑膜修复材料贴服在肝脏上，将所有器官回复至腹腔内，缝合腹部，养殖1周后打开腹腔，观察BC脑膜修复材料与邻近组织的黏连情况及剥离能力。

由图3可知，肝脏创面应用BC膜严密缝合，创伤愈合4周后，与周围组织间无明显的膜性黏连或束带黏连，说明BC膜可以有效地减少组织间黏连发生。

3、防渗漏实验

取健康成年的新西兰家兔，用3％异戊巴比妥钠(30mg/kg)，兔耳缘静脉注射麻醉，兔头固定于头架上。严格行备皮消毒后，取头部正中切口纵行切开头皮，逐层分离颞肌直至颅骨骨膜，用微型磨钻在双侧颅顶部对称磨开直径约1.2cm大小的圆形骨窗；再于手术显微镜下剪去0.8mm×0.8cm大小的硬脑膜组织，并将适当大小BC脑膜修复材料植入左侧硬膜缺损区域，通常超过硬脑膜腔边缘5mm左右，直接贴敷于硬膜之上，覆盖硬脑膜缺损区域。必要时用Prolene缝线(5—0缝线)四角行定点缝合固定，防止移动。右侧仅行硬脑膜切除而不行硬脑膜修补以作为对照组。再于颅骨中线处钻一小孔，透明导管通过小孔置入蛛网膜下腔，按实验要求往透明导管中缓慢推入美蓝溶液，观察液体是从何处漏出。

由图4可知，随着液体的不断注射，在第9s时，液体未从BC膜处漏出，而是从注水口漏出，说明BC膜具有良好的脑脊液防渗漏功能。

4、皮内刺激实验

取健康成年的新西兰家兔，兔脊柱两侧脱毛。在兔脊柱两侧的皮内各位点注射0.2ml BC脑膜的生理盐水浸提液和生理盐水空白对照。实验前将注射器及针头、生理盐水、浸提液一起置于高压蒸汽灭菌器121℃消毒30min。对三天内的皮内反应进行评分计数。

由图5可知，与空白对照相比BC膜植入后没有发现明显的红斑或水肿，说明本发明BC膜不会产生皮内刺激反应。

5、组织学观察实验

取健康成年的新西兰家兔，用3％异戊巴比妥钠(30mg/kg)，兔耳缘静脉注射麻醉，兔头固定于头架上。严格行备皮消毒后，取头部正中切口纵行切开头皮，逐层分离颞肌直至颅骨骨膜，用微型磨钻在双侧颅顶部对称磨开直径约1.2cm大小的圆形骨窗；再于手术显微镜下剪去0.8mm×0.8cm大小的硬脑膜组织，并将适当大小BC脑膜修复材料植入左侧硬膜缺损区域，通常超过硬脑膜腔边缘5mm左右，直接贴敷于硬膜之上，覆盖硬脑膜缺损区域。必要时用Prolene缝线(5—0缝线)四角行定点缝合固定，防止移动。手术后第4周、12周、24周时分别无痛处死动物，切取试样周围组织，作病理学检查。

由图6-8可知，BC膜植入动物体内后，从4周至24周，组织学切片几乎无炎性反应发生，材料间隙有散在纤维细胞及成纤维细胞存在并可见新生胶原纤维，说明BC材料生物相容性高安全性良好，并且随着时间的延长BC膜被自体组织再生替代，实现组织再生修复过程。

6、体内降解实验

上述组织学观察实验中，将动物于手术后第4周、12周、24周时处死，并观察BC膜的残留情况。

表1降解时间

7、力学性能实验

BC膜样品在37℃恒温浸泡24h后用万能试验机测试样品的抗拉强度和撕裂力，测试温度为25℃。每组测5个样品取均值。抗拉强度和撕裂力的拉伸速度分别为20mm/min和80mm/min。

表2撕裂力性能和抗张强度

由表1可知，BC膜的撕裂力和抗张强度远远大于市面上胶原膜产品，因此BC膜具有确切的可缝合选择性以及耐受颅内压力所需的抗张性能。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所做的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。