专利名称：一种双层复合再生膜及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物医用材料领域的引导组织再生膜及其制备方法，该材料可用于缺损组织的修复，尤其是骨组织和牙周组织的修复。
背景技术：
引导组织再生术(guided tissue regeneration,GTR)已广泛用于牙周手术中，被认为是引起牙周组织生理性再生的有效手段。目前，用于引导组织再生术的膜材料分为可降解膜材料和不可降解膜材料两类。不可降解膜材料虽然具有良好的生物相容性和力学性能，并取得一定的疗效，但是不能被组织吸收，需要二次手术取出，增加了病人的痛苦，所以不被患者接受。生物可降解膜材料由于其具有可选择性地引导缺损组织再生，并且完全可降解，不需要二次手术，手术方便等优点，被受瞩目。但现有技术的生物可降解膜材料在力学性能、降解性能、生物活性等问题，均无法满足骨组织和牙周组织缺损修复的要求。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种双层复合引导再生膜及其制备方法，以改善引导膜的生物活性，促进伤口的愈合，改善其力学性能，为组织缺损修复提供了一种新型膜材料。本发明采用如下技术方案:一种双层复合再生膜，包括致密层和疏松层，其特征在于:所述致密层由可降解高分子纤维网与胶原膜复合而成。所述胶原膜中复合有纳米银粒子和/或药物；所述疏松层是由选自壳聚糖，丝素蛋白，角质蛋白，或胶原蛋白中的一种或几种作为基体材料而形成。所述致密层为可降解 高分子纤维网与胶原膜交替层层叠加，最上层和最下层为胶原膜，厚度为0.5 2mm;所述疏松层中含有一定量的选自透明质酸，硫酸软骨素，钙盐，或骨形态发生蛋白BMP生长因子中的一种或者几种形成。进一步地，所述可降解高分子纤维网的材料选自医用级聚二氧六环酮，聚乳酸，聚乙丙交酯，聚己内酯，聚(3-羟基丁酸酯-3-羟基戊酸酯)中的一种或几种的组合。进一步地，所述药物选自紫杉醇、阿霉素、链霉素、头孢拉定、庆大霉素、乙酰螺旋霉素、红霉素、白霉素、阿莫西林、土霉素、卡那霉素、青霉素、甲硝唑、丹参素、新霉素、核糖霉素、四环素、万古霉素、阿奇霉素中的一种或多种的组合。本发明还提供所述的双层复合再生膜的制备方法，主要包括以下步骤:
步骤1，纤维增强致密层的制备，步骤I进一步包括以下工艺:
用有机酸溶解胶原形成胶原溶液，将胶原溶液注入到模具中，然后冷冻干燥，制备胶原海绵膜；
用可降解高分子纤维编织成网作为增强层；以及
把制备好的胶原海绵膜和可降解高分子纤维网层叠压制形成由可降解高分子纤维网与胶原膜复合的可降解医用高分子纤维增强的致密层；步骤2，疏松层的制备，步骤2进一步包括以下工艺:
用有机酸溶解选自壳聚糖，丝素蛋白，角质蛋白，胶原蛋白聚合物中的一种或几种形成溶液；以及
将所得的溶液注入模具中，然后冷冻干燥，制备疏松层胶原海绵；
步骤3，致密层和疏松层进行复合形成双层复合再生膜。其中，步骤I中，所述胶原溶液为I型胶原蛋白，或I型胶原蛋白中含有少量III型胶原蛋白溶解于有机酸中形成的溶液；所述胶原溶液中进一步复合有药物和/或纳米银粒子。进一步地，步骤I中，胶原溶液的质量体积比浓度范围为0.Γ2%,粘度系数为100(T4000Cp ;在胶原溶液中所述药物的浓度为10-3 20mmol/L，纳米银的浓度为4(T800ppm;胶原海绵膜和可降解高分子纤维网层叠后，最上层和最下层为胶原海绵膜，然后放入平板之间压制形成一定厚度的致密层。步骤2中，所述溶液注入模具之前进一步复合一定量的选自透明质酸，复合硫酸软骨素，钙盐，BMP生长因子中的一种或几种物质；溶液中所述壳聚糖的质量体积比浓度为
0.广3%，丝素蛋白的质量体积比浓度为0.2飞％，角质蛋白的质量体积比浓度为0.广8%，胶原蛋白聚合物的质量体积比浓度为0.广2%，透明质酸的质量体积比浓度为0.05^1.5%，硫酸软骨素的质量体积比浓度为0.05、.3%，钙盐的质量体积比浓度为0.05 3% ；BMP生长因子的质量体积比浓度为0.0000Γ0.015%。步骤3中，是将纤维增强致密层进行高温交联、疏松层进行高温交联和化学交联，然后对交联的疏松层进行清洗，冷冻干燥；最后进行致密层和疏松层的复合，从而获得双层复合再生膜；致密层和疏松层复合的操作方法是在致密层的一面涂覆一层步骤I所制备的胶原溶液，然后放上疏松层、冷冻干燥。本发明的有益效果是:
本发明的双层复合引导再生膜材料，用于骨组织，牙组织等组织修复的新型医用膜材料，该膜具有以下特点:(I)采用生物相容性和生物可降解的高分子聚合物制备引导膜，组织反应小，不会引起机体免疫反应和验证反应；(2)有治疗效果药物的加入，促进伤口的愈合作用；(3)纤维网的加入提高引导膜的机械强度，降解时间可控。进一步地，无机成分和BMP生长因子的加入增加的引导膜的成骨生物活性，促进成骨细胞的生长。实践证明，本发明制备的复合引导膜具有良好的生物活性，抗菌性，较好的力学强度，降解速率可调，促进伤口愈合等优点，在体内降解或被机体完全吸收的时间为Γ12个月。采用GB/T 528来测试，该膜在湿态下的断裂拉伸强度为5 40MPa。采用国家标准测试细胞毒性为O级。该多层复合再生膜应用于缺损组织的修复，特别是骨组织和牙组织的修复，具有广阔的应用前景。
具体实施例方式本发明的双层复合再生膜，主要是用作口腔修复膜，是一种引导组织再生膜，其由纤维增强的致密层和疏松层组成。 所述致密层由可降解高分子纤维网复合胶原膜而形成的，所述胶原中可进一步掺杂纳米银粒子和/或治疗效果的药物。疏松层是由壳聚糖，或丝素蛋白，或角质蛋白，或胶原蛋白等为基体材料，可进一步复合一定量的透明质酸，或复合硫酸软骨素，或复合一定量的钙盐，或骨形态发生蛋白(BMP)因子中的一种或者多种构成。该纤维增强致密层由可降解高分子纤维网与胶原膜交替层层叠加，较佳地，最上层和最下层为胶原膜，之后放入两个平板之间，用一定机械力压制一段时间制备得到一定厚度，如0.5 2mm的致密层。该纤维增强致密层中的可降解高分子纤维网的材料选自医用级聚二氧六环酮(PDO)，或聚乳酸(PLA )，或聚乙丙交酯(PLGA)，聚己内酯(PCL)，或聚(3-羟基丁酸酯_3_羟基戊酸酯)(PHBV)，或其类似物，以其中的一种或几种组合而制成的。所述纤维增强致密层中的胶原膜是由胶原溶液、或胶原溶液复合纳米银粒子，或胶原溶液复合水溶性的药物制备得到的。其中，胶原溶液主要是指由I型胶原蛋白，或I型胶原蛋白中掺合有少量(占总胶原蛋白的质量比含量小于5%)的III胶原蛋白溶解于有机酸溶剂中形成的一种天然高分子聚合物溶液。纳米银粒子尺寸可选择为Γιοο纳米的纳米银颗粒。其中水溶性的药物选自紫杉醇、阿霉素、链霉素、头孢拉定、庆大霉素、乙酰螺旋霉素、红霉素、白霉素、阿莫西林、土霉素、卡那霉素、青霉素、甲硝唑、丹参素、新霉素、核糖霉素、四环素、万古霉素、阿奇霉素中的一种或多种的组合。也可根据使用需要选择使用其它药物。该疏松层由选自壳聚糖、丝素蛋白、角质蛋白、胶原蛋白中的一种或多种为基体材料，并复合一定量选自透明质酸、硫酸软骨素、钙盐，或BMP生长因子中的一种或者多种物质而组成。钙盐包括但不限于羟基磷灰石、磷酸三钙、硫酸钙等。本发明的双层复合再生膜(口腔修复膜)，其制备方法主要包括四个步骤，后文按步骤f步骤4的顺序依次进行详细描述。其中，步骤广3中的有些具体工艺，可适用于现有技术的其它方式来实现，而步骤4作为后处理的工序，可以选择进行或取舍，并非作为限定。步骤1，纤维增强致密层的制备，本实施例中制成的是可降解高分子纤维增强的致密层，步骤I具体包括以下工艺:
用有机酸溶剂包括但不限于醋酸或丙二酸，溶解胶原形成胶原溶液，从而形成混合天然高分子聚合物的溶液；可选择性地进一步复合选自有治疗效果的水溶性药物和/或纳米银粒子，将所得的溶液可先进行真空脱出气泡后再注入到自行设计的模具(或现有技术的其它模具)中，把模具进行预冷冻一段时间，再冷冻干燥，制备得到胶原海绵膜，备用；
同时，将可降解高分子纤维编织成网备用；以及
最后把制备好的胶原海绵膜和可降解高分子纤维网交替层层叠加，最上层和最下层选择为胶原海绵膜，放入两个平板之间，用一定机械力，压制一段时间，制备出由可降解高分子纤维网复合胶原膜形成的纤维增强致密层。
在具体实施方式
中，该步骤I中有机酸的pH=f 4，所述胶原溶液，主要是指由I型胶原蛋白，或I型胶原蛋白中掺合有少量(占总胶原蛋白的质量比含量小于5%)的III胶原蛋白溶解于有机酸溶剂中形成的一种天然高分子聚合物溶液。胶原溶液的溶质质量体积比(m/v)浓度范围为0.广2%，且粘度系数为100(T4000Cp。在胶原溶液中，所述纳米银的浓度为4(T800ppm，水溶性药物的浓度为10_P20mmol/L。纳米银粒子尺寸可选择为f 100纳米的纳米银颗粒。真空脱出气泡时的真空度可为(TlOOPa。所述冷冻干燥条件可以是:在零下4(T90°C超低温下冷冻2h，冷冻后放入冷冻干燥机内，在零下5(T60°C条件下冷冻干燥24h。可降解医用高分子纤维的直径范围可为但不限于0.f 1_，编织交织成网的方法可采用医用织物的常用编织方法。胶原海绵膜和可降解高分子纤维网交替叠加的层数为3 15层，压制是在5 10 KN范围的作用力下压制4 24 h，从而形成厚度在0.5 2mm的致密层。压制条件和层数可以根据实际需要而进行调整和选择。所指自行设计的模具，实质包括一大面积的长方形平板，模具可自动控温加热和烘干，例如温度控制范围为(T80°C ;所述模具内配套设置有展开器，模具和展开器一起使用时，可一次性制备大尺寸的均匀膜；展开器是一个内部可盛装溶液的微孔滚轴，滚轴内的溶液在一定压力下从微孔中缓慢流出，并随自动控制的滚轴不断来回滚动，均匀地将溶液在模具内铺展开；溶液通过连续进料管注入展开器的滚轴内。现有技术的其它模具和方法同样适用于本发明，因此本发明的步骤并不限定为自行设计的模具。步骤2，疏松层的制备，步骤2具体包括以下工艺:
用有机酸溶剂包括但不限于醋酸或丙二酸，溶解壳聚糖，或丝素蛋白，或角质蛋白，或胶原蛋白聚合物中的一种或几种配制成溶液，且还可进一步复合一定量的透明质酸，或复合硫酸软骨素，或复合一定量的钙盐，或BMP生长因子中的一种或者几种配制成成溶液；将所得的溶液注入自行设计的模具(模具结构同上且现有技术的模具同样适用)；以及然后把模具放入超低温冰箱里冷冻一段时间，再冷冻干燥，从而制得疏松层胶原海绵，其厚度小于3毫米，但可以根据实际适用进行厚度调整。在具体实施方式
中，该步骤2的溶液中所述壳聚糖的m/v浓度为0.1^3%,丝素蛋白的m/v浓度为0.2^5%,角质蛋白的m/v浓度为0.1^8%,胶原蛋白聚合物的m/v浓度为
0.1~2%，透明质酸的m/v浓度为0.05^1.5%，硫酸软骨素的m/v浓度为0.05、.3%，钙盐的m/V浓度为0.05 3% ；BMP生长因子的m/v浓度为0.0OOOf 0.015%，其中m/v是指质量体积比。冷冻干燥条件可以是:在零下4(T90°C超低温下冷冻2h，冷冻后放入冷冻干燥机内，在零下5(T60°C条件下冷冻干燥24h。步骤3，引导膜的制备，步骤3具体包括以下工艺:
将纤维增强的致密层进行高温交联；
疏松层进行真空高温交联和化学交联，然后对交联的疏松层进行清洗，预冷冻、然后冷冻干燥一段时间；以及
最后进行致密层和疏松层的复合、制备双层复合的引导膜。在具体实施方式
中，该步骤3中，高温交联及真空高温交联是在8(Tl30°C下交联反应8 30h。进行化学交联时，是在交联剂中浸泡8 24 h，所述交联剂选自戊二醛、京尼平、碳化二亚胺中的一种或多种，交联剂的m/v浓度为0.广2%。所述的清洗工艺是:进行化学交联后的样品在PBS溶液中浸泡l 3h，再20 60%的酒精溶液中浸泡0.5 2h，然后再生理盐水中浸泡24h，不断清洗，最后用蒸馏水进行清洗24 h，不断换水，除去样品中残留的交联剂，并将样品中的低分子物水洗掉。其它清洗工艺同样适用；清洗完样品后再在零下2(T80°C冷冻2h，然后在零下4(T60°C条件下冷冻干燥。致密层和疏松层复合的操作方法是在致密层的一面涂覆一层步骤I所制备的天然高分子聚合物溶液，然后放上疏松层、冷冻干燥，制备出由纤维增强的致密层和疏松层构成的引导再生膜，冷冻及干燥工艺可按具体需要进行调整或选择。步骤4，把制备的引导膜直接从模具中取出，进行裁剪、包装和灭菌等工艺制备出引导膜产品。以下为具体实例，来说明本发明口腔修复膜及其制备方法，但不作为本发明保护范围的限制。实施例1:增强致密层的制备
(1)取胶原样品，用有机酸溶剂按照一定浓度溶解胶原形成天然高分子聚合物溶液，有机酸为醋酸或丙二酸；其中溶剂的PH=f 3，形成的混合液粘度2300cp，加入浓度为80ppm的纳米银，然后在室温充分搅拌12h，得到均一混合的溶液，待用；
(2)取均一的胶原混合溶液，在真空度为OPa，静置时间f IOmin ;脱出溶液中的大部分气泡；
(3)将脱出气泡的胶原与纳米银混合溶液浇注到自制的聚四氟模具中，然后铺展开，把模具放入零下80°C条件下冷冻2h，然后在O Pa，零下56°C条件下冷冻干燥24 h，制备得到胶原海绵膜，备用；
(4)采用通用的医用织物的制备方 法，将直径为0.1mm的可降解高分子纤维编织成网，备用;
(5)然后把制备好的胶原海绵膜和可降解高分子纤维网交替层层叠加，最上层和最下层为胶原海绵膜，共7层，放入两个聚四氟平板之间，在9 KN的作用力下压制24h，制备出可降解医用高分子纤维增强的致密层，厚度在0.5^1mm范围内。实施例2:疏松层的制备
(1)取胶原样品，用有机酸溶剂溶解胶原蛋白聚合物形成溶液，并加入一定量的透明质酸和BMP生长因子；其中溶剂的PH=f 3，胶原蛋白溶液的粘度系数1200cp ;透明质酸的质量分数为0.05 1.5% (m/v) ；BMP生长因子的浓度为0.00008% (m/v)；
(2)把配置好的混合溶液按照一定量浇注在自制的聚四氟的模具中，把模具放入零下80°C条件下冷冻2h，然后在O Pa，零下56°C条件下冷冻干燥24h，制备出疏松层。实施例3增强致密层和疏松层的交联及复合
(I)把制备好的致密层和疏松层分别放入真空干燥箱中，抽真空，真空度在0.1 Pa的状态下，高温交联12 30 h ;高温交联的温度为10(Tl30°C。(2)把高温交联后的疏松层放入容器中，加入交联剂，交联剂的浓度为0.Γ1.5%，交联12h，选自戊二醛、京尼平、碳化二亚胺、环氧化合物等交联剂中的一种或多种。(3)把化学交联的疏松层清洗，条件为:在PBS溶液中浸泡I 3h，然后再20 60%的酒精溶液中浸泡0.5 2h，然后再生理盐水中浸泡24h，不断清洗，最后用蒸馏水进行清洗24h，不断换水；除去样品中残留的交联剂，并将样品中的低分子物质用水洗掉。再进行清洗完样品后在零下2(T80°C冷冻2h，然后在零下4(T60°C条件下冷冻干燥，制备得到交联的疏松层；
(4)最后将致密层和疏松层进行复合，操作方法是在致密层的一面涂覆一层实例I所制备的天然高分子聚合物溶液，然后放上疏松层、冷冻干燥，即可制备得到双层引导再生膜。
按上述方法所制备的双层复合膜，该膜可用于骨组织，牙组织等组织修复。它是以天然高分子和合成高分子为基本原料，采用浇注、涂覆、压制、冷冻干燥成型，并经物理交联或化学交联改性制备而成的双层复合膜，具有良好生物相容性和力学性能，生物可降解性能，且免疫排斥反应较低、操作简单等优点。该材料广泛用于组织修复，尤其是骨组织和牙周组织的修复。该膜具有以下特点:(I)采用生物相容性和生物可降解的高分子聚合物制备引导膜，组织反应小，不会引起机体免疫反应和验证反应；(2)有治疗效果药物的加入，促进伤口的愈合作用；(3)纤维网的加入提高引导膜的机械强度，降解时间可控；(4)无机成分和BMP生长因子的加入增加的引导膜的成骨生物活性，促进成骨细胞的生长。经实验证明，本发明制备的复合引导膜具有良好的生物活性，抗菌性，较好的力学强度，降解速率可调，促进伤口愈合等优点，在体内降解或被机体完全吸收的时间为4 12个月。采用GB/T 528来测试，该再生膜湿态下的断裂拉伸强度为5 40 MPa。采用国家标准测试细胞毒性为0级。该多层复合再生膜应用于缺损组织的修复，特别是骨组织和牙组织的修复，具有广阔的应用前景。 ·
权利要求
1.一种双层复合再生膜，包括致密层和疏松层，其特征在于:所述致密层由可降解高分子纤维网与胶原膜复合而成。
2.如权利要求1所述的双层复合再生膜，其特征在于:所述胶原膜中复合有纳米银粒子和/或药物；所述疏松层是由选自壳聚糖，丝素蛋白，角质蛋白，或胶原蛋白中的一种或几种作为基体材料而形成。
3.如权利要求1所述的双层复合再生膜，其特征在于:所述致密层为可降解高分子纤维网与胶原膜交替层层叠加，最上层和最下层为胶原膜，厚度为0.5^2mm ;所述疏松层中含有一定量的选自透明质酸，硫酸软骨素，钙盐，或骨形态发生蛋白BMP生长因子中的一种或者几种形成。
4.如权利要求1所述的双层复合再生膜，其特征在于:所述可降解高分子纤维网的材料选自医用级聚二氧六环酮，聚乳酸，聚乙丙交酯，聚己内酯，聚(3-羟基丁酸酯-3-羟基戊酸酯)中的一种或几种的组合。
5.如权利要求2所述的双层复合再生膜，其特征在于:所述药物选自紫杉醇、阿霉素、链霉素、头抱拉定、庆大霉素、乙酸螺旋霉素、红霉素、白霉素、阿旲西林、土霉素、卡那霉素、青霉素、甲硝唑、 丹参素、新霉素、核糖霉素、四环素、万古霉素、阿奇霉素中的一种或多种的组合。
6.如权利要求1飞中任一项所述的双层复合再生膜，其制备方法包括以下步骤: 步骤1，纤维增强致密层的制备，进一步包括以下工艺: 用有机酸溶解胶原形成胶原溶液，将胶原溶液注入到模具中，然后冷冻干燥，制备胶原海绵膜； 用可降解高分子纤维编织成网作为增强层；以及 把制备好的胶原海绵膜和可降解高分子纤维网层叠压制形成由可降解高分子纤维网与胶原膜复合的可降解医用高分子纤维增强的致密层； 步骤2，疏松层的制备，进一步包括以下工艺: 用有机酸溶解选自壳聚糖，丝素蛋白，角质蛋白，胶原蛋白聚合物中的一种或几种形成溶液；以及 将所得的溶液注入模具中，然后冷冻干燥，制备疏松层胶原海绵； 步骤3，致密层和疏松层进行复合形成双层复合再生膜。
7.如权利要求6所述双层复合再生膜的制备方法，其特征在于:步骤I中，所述胶原溶液为I型胶原蛋白，或I型胶原蛋白中含有少量III型胶原蛋白溶解于有机酸中形成的溶液；所述胶原溶液中进一步复合有药物和/或纳米银粒子。
8.如权利要求7所述双层复合再生膜的制备方法，其特征在于:步骤I中，胶原溶液的质量体积比浓度范围为0.广2%，粘度系数为lOOOlOOOcp ;在胶原溶液中所述药物的浓度为10_，20mmol/L，纳米银的浓度为4(T800ppm ;胶原海绵膜和可降解高分子纤维网层叠后，最上层和最下层为胶原海绵膜，然后放入平板之间压制形成一定厚度的致密层。
9.如权利要求6所述双层复合再生膜的制备方法，其特征在于:步骤2中，所述溶液注入模具之前进一步复合一定量的选自透明质酸，复合硫酸软骨素，钙盐，BMP生长因子中的一种或几种物质；溶液中所述壳聚糖的质量体积比浓度为0.广3%，丝素蛋白的质量体积比浓度为0.2飞％，角质蛋白的质量体积比浓度为0.广8%，胶原蛋白聚合物的质量体积比浓度为0.广2%，透明质酸的质量体积比浓度为0.05^1.5%，硫酸软骨素的质量体积比浓度为0.05、.3%，钙盐的质量体积比浓度为0.05 3% ；BMP生长因子的质量体积比浓度为.0.00001 0.015%。
10.如权利要求6所述双层复合再生膜的制备方法，其特征在于:所述步骤3中，是将纤维增强致密层进行高温交联、疏松层进行高温交联和化学交联，然后对交联的疏松层进行清洗，冷冻干燥；最后进行致密层和疏松层的复合，从而获得双层复合再生膜；致密层和疏松层复合的操作方法是在致密层的一面涂覆一层步骤I所制备的胶原溶液，然后放上疏松层、冷冻 干燥。
全文摘要
本发明涉及一种双层复合再生膜及其制备方法。再生膜包括致密层和疏松层，致密层由可降解高分子纤维网复合胶原膜，或复合胶原和纳米银粒子，或复合胶原和治疗效果的药物而形成；疏松层是由选自壳聚糖，丝素蛋白，角质蛋白，或胶原蛋白中的一种或几种作为基体材料而构成。该制备方法主要包括纤维增强致密层的制备；疏松层的制备以及复合形成引导膜的制备等步骤。本发明的再生膜具有良好生物相容性和力学性能，生物可降解性能，免疫排斥反应较低、操作简单等优点。该材料广泛用于组织修复，尤其是骨组织和牙周组织的修复。
文档编号A61K31/12GK103191085SQ20121000450
公开日2013年7月10日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者佘振定, 江宇 申请人:深圳兰度生物材料有限公司