聚多巴胺包覆的金纳米棒材料及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及聚多巴胺包覆的金纳米棒材料及其制备方法，以及在构建肿瘤细胞拉曼成像检测与实时光热治疗平台中应用。

背景技术：

成像引导是一项发展迅速的肿瘤细胞检测和治疗技术，是未来实现精准医疗的一项重要的手段。在成像引导的肿瘤治疗技术中，光热治疗由于其高效性、微创性以及对周围组织低损伤性的优势，受到了越来越多的关注。近年来，随着多种同时具有光热转化效率以及高成像灵敏度的多功能纳米材料被不断合成，人们发展了多种不同的成像引导的肿瘤光热治疗技术。由于成像和光热治疗需要不同的激光进行激发，所以这些成像引导的肿瘤光热治疗技术往往需要多种仪器的联合使用才能完成，不仅步骤繁琐，而且降低了肿瘤治疗的特异性，限制了其在临床中的应用。

金纳米棒在近红外区有强烈的吸收，并且具有良好的光热转化效率，是光热治疗中常用的一种纳米材料。此外，金纳米棒还具有很多独特的光学性质，作为显影剂广泛地应用于多种模式的肿瘤成像中，例如近红外光成像、核磁成像、CT成像以及拉曼成像。在这些成像模式中，拉曼成像，特别是表面增强拉曼（SERS）成像，因为具有极高的灵敏度、良好的光稳定性以及多目标同时检测的能力，被认为是一种理想的肿瘤成像检测手段。值得注意的是，金纳米棒在近红外光的激发下可以同时产生光热转化效应以及拉曼增强效应。金纳米棒在近红外激发光下的这种独特的光学性质为开发肿瘤细胞拉曼成像检测与实时光热治疗一体化平台提供了可能。

十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）是金纳米棒材料的合成过程中一种常用的模板剂分子。然而，CTAB分子具有强烈的细胞毒性，在金纳米棒应用于生物实验之前必须去除。聚多巴胺是多巴胺单体分子在碱性条件下自聚合的一种聚合物大分子，具有良好的生物相容性，在生理盐溶液中具有良好的稳定性，其表面的邻苯二酚集团在弱碱性条件下可以转变为醌基，通过醌基同蛋白末端的氨基或巯基的偶联作用，可以将抗体等蛋白分子连接到聚多巴胺表面。在这个过程中不需要加入任何其他的活化分子，可以最大限度的保持抗体分子的生物活性。

为了实现肿瘤的特异性检测以及有效治疗，本发明设计了基于聚多巴胺包覆的金纳米棒的肿瘤细胞拉曼成像检测与实时光热治疗一体化平台，简化了肿瘤检测和治疗的步骤，提高了肿瘤检测和治疗的特异性和效果，进一步减少了对健康组织的损伤。实验结果显示，该一体化平台具有巨大的临床应用潜力。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种聚多巴胺包覆的金纳米棒材料及其制备方法，以及在构建肿瘤细胞拉曼成像检测与实时光热治疗平台中应用。

本发明提出的聚多巴胺包覆的金纳米棒的制备方法，具体步骤如下：

（1）金纳米种子的合成：在室温下，将1-10mL氯金酸溶液（0.5-1mM）同1-10mL CTAB溶液（0.2-0.5 M）充分混匀，随后加入0.5-1mL预冷的硼氢化钠溶液（0.01-0.05 M），28-37℃避光反应2-5小时，得到棕色的金纳米种子溶液；

（2）金纳米棒（长宽比3-5）的合成：将1-10mL氯金酸溶液（1-2 mM）同1-10mLCTAB溶液（0.2-0.5M）充分混匀，加入0.1-0.5 mL硝酸银溶液（5-20mM）充分混匀，加入0.05-0.1 mL抗坏血酸溶液（0.1-0.2 M，现用现配）充分混匀，加入0.01-0.02 mL步骤（1）中合成的金纳米种子溶液，充分混匀后28-37 ℃反应过夜，得到长宽比为3-5的金纳米棒材料，8000-10000rpm离心，用水洗涤2-3遍；

（3）金纳米棒表面聚多巴胺包覆：将洗涤后的金纳米棒材料重溶于Tris缓冲溶液中（10-20mM，pH8.0-10.0），加入0.01-0.02 mL对巯基苯硼酸溶液（10-20 mM），震荡反应1-2小时，随后加入0.05-0.02mL多巴胺溶液（1-2 mg/mL），28-37℃震荡反应过夜，得到聚多巴胺包覆的金纳米棒材料；

（4）抗体的修饰：采用醌基共价偶联的方法将上皮细胞粘附分子抗体（anti-EpCAM）修饰于金纳米棒材料表面，将聚多巴胺包覆的金纳米棒材料重溶于PBS缓冲溶液中（0.02-0.05 mMmM），加入0.02-0.05mL抗体溶液，25-37 ℃偶联12-20 h，即将抗体修饰到金纳米棒材料表面，并用牛血清白蛋白（BSA）进行封端，可实现对肿瘤靶细胞的特异性标记。

本发明合成的金纳米棒材料，聚多巴胺的修饰可以有效地包覆金纳米棒表面的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）分子，进而提高了金纳米棒材料的生物相容性和稳定性，该聚多巴胺包覆的金纳米棒材料在近红外激光（785nm）的激发下，同时具有良好的表面增强拉曼效应与光热转化效应，在聚多巴胺表面修饰抗体之后，材料可以实现对肿瘤靶细胞的特异性标记。

正因为上述金纳米棒材料具有特异的性能，所以可用于构建肿瘤细胞拉曼成像检测与实时光热治疗平台，该平台包括：

细胞培养基，用于孵育细胞；

抗体修饰的聚多巴胺包覆的金纳米棒溶液，用于在近红外激光（785nm）的激发下，表面增强拉曼效应与光热转化效应，并用作肿瘤靶细胞特异性标记；

拉曼显微镜载物台，用于放置细胞培养器皿；

装备有近红外激光（785nm）的拉曼成像显微镜，其中，拉曼成像显微镜用于对细胞进行快速拉曼扫描，并利用对巯基苯硼酸的特征拉曼信号峰（1080cm^-1）的信号强度进行成像，成像结果显示肿瘤细胞的位置；近红外激光（785nm）用于照射肿瘤细胞，利用金纳米棒的光热转化效应使材料升温，坏死肿瘤细胞。

上述构建的肿瘤细胞拉曼成像检测与实时光热治疗平台，具体使用方法如下：

（1）材料与细胞孵育：首先在玻底培养皿中加入10⁵-10⁶/mL的细胞，用细胞培养基培养过夜，使细胞贴壁生长。取10-30 μL抗体修饰的聚多巴胺包覆的金纳米棒溶液，加入培养皿中，37℃条件下轻微震荡孵育1-2 h, 弃去上层培养基，用PBS洗涤三次后，并加入100 -200uL的PBS；

（2）肿瘤拉曼成像：将玻底培养皿放置于拉曼显微镜载物台上，调整焦距使细胞可以清晰的显现在视野中，选择合适的激发光（785nm）并调整相应的测试参数，利用拉曼显微镜点扫描的方法对细胞进行快速拉曼扫描，利用对巯基苯硼酸的特征拉曼信号峰（1080cm^-1）的信号强度进行成像，成像结果显示肿瘤细胞的位置；

（3）光热杀伤：根据拉曼成像结果，将激光定点到肿瘤细胞表面（1-2分钟/每个细胞），延长对靶细胞的激光照射时间（4-5分钟/每个细胞），利用金纳米棒的光热转化效应使材料升温，进而引起细胞坏死，达到肿瘤细胞光热杀伤的效果。

本发明提供的基于聚多巴胺包覆的金纳米棒的肿瘤细胞拉曼成像检测与实时光热治疗一体化平台，利用近红外激光（785nm）作为激发光，对肿瘤组织进行快速的点扫描（1-2分钟每个细胞），通过拉曼成像图可以快速准确地辨别出肿瘤细胞的具体位置。随后，利用近红外激光（785nm）定点照射肿瘤细胞，延长照射时间（4-5分钟每个细胞），通过金纳米棒的光热转化效应实现肿瘤细胞的实时光热杀伤。由于金纳米棒的表面增强拉曼效应和光热转化效应都可以在近红外激光（785nm）的激发下产生，因此只需要一台装备有近红外激光（785nm）的拉曼成像显微镜，根据拉曼成像结果可以准确辨别出肿瘤靶细胞，随后仅需要延长激发光对肿瘤细胞的照射时间，便可以实现肿瘤细胞的光热杀伤。

本发明的主要优势在于简便高效，可以实现肿瘤细胞的特异性检测以及实时光热治疗，避免了因肿瘤检测和治疗仪器不同而导致的繁琐步骤，进一步减少对健康细胞的损伤，可以提高肿瘤细胞治疗的有效性和特异性。

附图说明

图1聚多巴胺包覆的金纳米棒透射电镜图。其中，A为低倍镜下金纳米棒电镜图；B为高倍镜下金纳米棒电镜图；C为低倍镜下聚多巴胺包覆的金纳米棒电镜图；D为高倍镜下聚多巴胺包覆的金纳米棒电镜图。

图2聚多巴胺包覆的金纳米棒材料在红外激发照射下的升温曲线图。

图3金纳米棒与聚多巴胺包覆的金纳米棒材料的表面增强拉曼效应对比。

图4金纳米棒与聚多巴胺包覆的金纳米棒材料生物相容性对比。

图5金纳米棒与聚多巴胺包覆的金纳米棒材料在PBS溶液中的稳定性对比。

图6聚多巴胺包覆的金纳米棒材料对前列腺癌靶细胞（DU145）以及对照细胞（U251）的标记以及拉曼成像。其中，A为明场显微镜下DU145细胞；B为DU145细胞的拉曼成像图；C为明场显微镜下U251细胞；D为U251细胞的拉曼成像图。

图7聚多巴胺包覆的金纳米棒材料对前列腺肿瘤组织的标记以及拉曼成像。其中，A左侧为未经HE染色的肿瘤组织切片，其中虚线方框部分为拉曼成像扫描的区域，右侧为拉曼成像图；B为HE染色后的肿瘤组织切片，其中虚线方框部分为拉曼成像扫描的区域，右侧为拉曼成像区域的HE染色图像。

图8聚多巴胺包覆的金纳米棒材料对前列腺癌靶细胞（DU145）以及对照细胞（U251）的光热杀伤结果。

图9聚多巴胺包覆的金纳米棒材料对前列腺癌靶细胞（DU145）的标记、拉曼成像以及光热杀伤。其中，A为拉曼扫描前的DU145细胞明场图；B为DU145细胞的拉曼成像图；C为台盼蓝染料对成像后DU145细胞进行染色的结果；D为台盼蓝染料对长时间激发光照射后的DU145细胞进行染色的结果。

具体实施方式

实施例1：抗体修饰的聚多巴胺包覆的金纳米棒材料合成

在室温下，将5mL氯金酸溶液（0.5 mM）同5mLCTAB溶液（0.2 M）充分混匀，随后加入0.6mL预冷的硼氢化钠溶液（0.01 M），28℃避光反应2小时，得到棕色的金纳米种子溶液。将5mL氯金酸溶液（1 mM）同5mLCTAB溶液（0.2 M）充分混匀，加入0.12mL硝酸银溶液（10mM）充分混匀，加入0.055mL抗坏血酸溶液（0.1M，现用现配）充分混匀，加入0.012mL步骤（1）中合成的金纳米种子溶液，充分混匀后28℃反应过夜，得到长宽比为3.8的金纳米棒材料，8000rpm离心，用水洗涤两遍。将洗涤后的金纳米棒材料重溶于Tris缓冲溶液中（10mM，pH8.0），加入0.01mL对巯基苯硼酸溶液（10mM），震荡反应1小时，随后加入0.05-0.02mL多巴胺溶液（1mg/mL），37℃震荡反应过夜，得到聚多巴胺包覆的金纳米棒材料。采用醌基共价偶联的方法将上皮细胞粘附分子抗体（anti-EpCAM）修饰于金纳米棒材料表面，将聚多巴胺包覆的金纳米棒材料重溶于PBS缓冲溶液中（0.02mM），加入0.02mL抗体溶液，25-37 ℃偶联12-20 h后即可将抗体修饰到金纳米棒材料表面，可实现对肿瘤靶细胞的特异性标记。

实施例2：基于聚多巴胺包覆的金纳米棒的肿瘤细胞拉曼成像检测与实时光热治疗一体化平台在前列腺癌细胞（DU145）拉曼成像和光热治疗中的应用。

首先在玻底培养皿中加入约10⁵/mL的细胞，培养过夜，使细胞贴壁生长。取10-30 μL抗体修饰的聚多巴胺包覆的金纳米棒溶液，加入培养皿中，37℃条件下轻微震荡孵育1-2 h, 弃去上层培养基，用PBS洗涤三次后，并加入100 uL的PBS。

将玻底培养皿放置于拉曼显微镜载物台上，调整焦距使细胞可以清晰的显现在视野中，选择合适的激发光（785nm）并调整相应的测试参数，利用拉曼显微镜点扫描的方法对细胞进行快速拉曼扫描，利用对巯基苯硼酸的特征拉曼信号峰（1080cm^-1）的信号强度进行成像，成像结果显示了肿瘤细胞的位置。

根据拉曼成像结果，将激发光定点到肿瘤细胞表面，延长对靶细胞的激光照射时间，利用金纳米棒的光热转化效应使材料升温，进而引起细胞坏死，达到肿瘤细胞光热杀伤的效果。