本发明属于药物筛选技术领域，具体涉及一种抗真菌增效药物体内筛选方法。
背景技术：
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近年随着高效广谱抗生素、免疫抑制剂和细胞毒药物的广泛应用，致使侵袭性念珠菌感染的发病率和死亡率不断上升。念珠菌治疗特别是耐药白色念珠菌感染治疗已成为困扰临床的棘手问题。组合药物治疗以其可以同时针对多个靶点、提高药效、降低药量、减少不良反应发生、延迟抗药性形成的优点，成为未来药物研发的热点和趋势。因此，建立白色念珠菌互动增效药物体内筛选系统，对加速抗真菌药物研发，解决临床治疗的棘手问题具有重要意义。
随着不同组学技术的进步，生物信息学与计算生物学的发展，整合多种数据资源，建立计算机模型，成为筛选药物-靶标关系和有效药物组合的重要手段。但是这些被筛选出的有效药物组合真正运用到临床，需要进一步的验证。不但需要体外试验的验证，同样需要体内有效性的检验。到目前为止的大部分报道中，联合药敏方法是最常用的体外检测药物联合作用的实验方法，而将此方法体系直接运用到体内试验，需要进行大量的实验，耗费时间和成本。关于体内增效药物筛选体系还未见报导。
技术实现要素：
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本发明的目的在于提供一种抗真菌增效药物体内筛选方法，利用已有的数据库和文献中的信息、毒性评价、药代动力学及体内药效学研究去筛选有效药物组合。
一种抗真菌增效药物体内筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：1)收集已知的抗真菌增效药物组合及生物实验信息；2)查询组合药物的药代动力学资料，获得药物组合中单药的药代动力学特征，剔除临床使用存在安全隐患的药物组合；3)进行联合给药毒性评价，确定联合给药毒性特征，剔除联合给药毒性增强或有协同作用的药物组合；4)进行联合给药药代动力学评价，药代动力学测试结果显示单药AUC值增加的药物组合进入药效评价；5)利用真菌系统性感染实验动物模型，测定单药起效剂量，选择其中一个药物起效剂量以下第一个无效剂量作为药物组合的基础值，选择FIC<0.5时对应的A药的MICA值和B药的MICB值，根据MICA:MICB比值进行体内联合给药组合配对，采用肾组织载菌量作为药效评价指标，判断该药物组合是否具有增效作用。
所述的真菌的临床感染特征优选为系统性真菌感染。
所述的系统性真菌感染病原菌优选为白色念珠菌。
所述的实验动物模型优选为小鼠模型。
所述的确定联合给药毒性特征，是基于联合给药后毒性反应是否增强或有协同作用进行判断，为临床应用提供安全性数据。
所述的进行联合给药药代动力学评价，是选择药代动力学测试结果显示单药AUC值增加的药物组合进入药效评价。
所述的联合给药药效评价，是利用真菌系统性感染实验动物模型，测定单药起效剂量，选择其中一个药物起效剂量以下第一个无效剂量作为药物组合的基础值，选择FIC<0.5时对应的A药的MICA值和B药的MICB值，根据MICA:MICB比值进行体内联合给药组合配对。
本发明的抗真菌增效药物体内筛选方法，筛选得到一组新的抗真菌药物组合，可以降低药量提高药效。本发明建立的抗真菌增效药物体内筛选方法，通过逐级剔除的策略，大量减少实验的数目、时间和成本，有效的引导药物学实验。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备为本技术领域常规试剂和设备。
实施例1：
本发明提出的抗真菌增效药物体内筛选方法，包括以下步骤：
1)收集已知的抗真菌增效药物组合以及它们的体外生物实验信息(来自中国发明专利：专利号ZL201110210508)。
收集以下三组药物组合信息，针对白色念珠菌(Candida albicans)SC5314，以RPMI1640液体培养基作为培养基，以下三组药物均具有互动抗真菌活性。
第一组：伊曲康唑(Itraconazole)和洛伐他汀(Lovastatin)。棋盘法测得在培养16h、24h、48h，和72h，FIC(分级抑菌浓度指数)<0.5，两个药物联用具有互动抗真菌活性(见表1)。
表1伊曲康唑和洛伐他汀组合使用对白色念珠菌抗菌活性影响
注：MICLovas为洛伐他汀的MIC值
第二组：伏立康唑(Voriconazole)和卡泊芬净(Caspofungin)。棋盘法测得在培养24h，FIC(分级抑菌浓度指数)<0.5，两个药物联用具有互动抗真菌活性(见表2)。
表2伏立康唑和卡泊芬净组合使用对白色念珠菌抗菌活性影响
注：MICCaspo为卡泊芬净的MIC值
第三组：泊沙康唑(Posaconazole)和特比萘芬(Terbinafine)。棋盘法测得在培养24h，FIC(分级抑菌浓度指数)<0.5，两个药物联用具有互动抗真菌活性(见表3)。
表3泊沙康唑和特比萘芬组合使用对白色念珠菌抗菌活性影响
注：MICTerb为特比萘芬的MIC值
2)首先，通过查询组合药物的药代动力学资料，获得药物组合中单药的药代动力学特征，通过分析两个药物在药代动力学方面的相互影响，剔除临床使用存在安全隐患的药物组合。
第一组：通过查阅文献，洛伐他汀(Lovastatin)是一种对体内细胞色素CYP3A4酶敏感的底物，伊曲康唑(Itraconazole)是CYP3A4的强抑制剂，两药联合使用时伊曲康唑(Itraconazole)可使洛伐他汀(Lovastatin)的暴露量升高达20倍，这种药物相互作用可导致横纹肌溶解。因此，伊曲康唑(Itraconazole)被例为禁止与洛伐他汀(Lovastatin)联用的药物，该组药物在该阶段被剔除，无需进入以下筛选。
第二组：伏立康唑(Voriconazole)主要被肝细胞色素P450同工酶CYP2C19、CYP2C9和CYP3A4代谢。卡泊芬净(Caspofungin)为棘白菌素类抗真菌药物，对于细胞色素P450系统中任何一种酶都不抑制。因此，两个药物联用不会影响彼此的药物动力学，可进入下一步分析。
第三组：泊沙康唑(Posaconazole)主要通过UDP葡糖苷酸化(2相酶)进行代谢，且是P糖蛋白泵出作用的底物，因此，该清除途径的抑制剂或诱导剂均可对Posaconazole的药动学产生影响。同时，Posaconazole也是CYP3A4的强效抑制剂，故Posaconazole也可增加通过CYP3A4酶代谢药物的血药浓度。Terbinafine几乎不影响经由细胞色素P450酶系代谢的药物的清除，故Terbinafine对其它药物的代谢没有影响。因此，两个药物联用不会影响彼此的药物动力学，可进入下一步分析。
3)其次，进行联合给药毒性评价，确定联合给药毒性特征，剔除联合给药毒性增强的药物组合。
第二组：伏立康唑(Voriconazole)和卡泊芬净(Caspofungin)。经试验，卡泊芬净单次尾静脉给药对ICR小鼠的LD50为82.39mg/kg，伏立康唑单次灌胃给药对ICR小鼠的LD50为261.5mg/kg。卡泊芬净和伏立康唑联合给药，联合作用系数K＝0.65，介于0.57到1.75之间，根据Keplinger法进行评价，卡泊芬净和伏立康唑联合给药对ICR小鼠所产生的毒效应为相加作用。该组合可进入下一步分析。
第三组：泊沙康唑(Posaconazole)和特比萘芬(Terbinafine)。经试验，泊沙康唑(A)单次灌胃给药对ICR小鼠的LD50为463.5mg/kg，特比萘酚(B)单次灌胃给药对ICR小鼠的LD50为>4000mg/kg。采用A药物的给药剂量梯度不变，按临床有效剂量联用比例以A：B＝1:1.2加入B药，采用上下法进行急性毒性试验，观察增加B药后ICR小鼠的毒性反应情况。实验结果显示联合给予特比萘酚后，泊沙康唑对ICR小鼠的LD50不变，毒性作用无增加。该组合可进入下一步分析。
4)再次，进行联合给药药代动力学评价，药代动力学测试结果显示单药AUC值增加的药物组合进入药效评价，否则剔除。
第二组：伏立康唑(Voriconazole)和卡泊芬净(Caspofungin)。联合给药药代动力学结果见表4和表5所示，联合给药后Voriconazole和Caspofungin的AUC均有所增加，该组合可进入下一步分析。
表4伏立康唑的药代动力学参数
表5卡泊芬净的药代动力学参数
第三组：泊沙康唑(Posaconazole)和特比萘芬(Terbinafine)。联合给药药代动力学结果见表6和表7所示，联合给药后Posaconazole和Terbinafine的AUC均有所增加，该组合可进入下一步分析。
表6泊沙康唑的药代动力学参数
表7特比萘芬的药代动力学参数
5)最后，利用白色念珠菌(Candida albicans)SC5314系统性感染小鼠模型，测定单药起效剂量，选择其中任何一个药物起效剂量以下第一个无效剂量作为药物组合的基础值，选择FIC<0.5时对应的A药的MICA值和B药的MICB值，根据MICA:MICB比值进行体内联合给药组合配对，采用肾组织载菌量作为药效评价指标，判断该药物组合是否具有互动增效作用。
第二组：Voriconazole(A)和Caspofungin(B)。FIC<0.5时A药对应的MICA值和B药对应的MICB值分别为0.004μg/mL和0.09375μg/mL，MICA:MICB＝1:23。经动物试验，Caspofungin的起效剂量为2.5mg/kg，Voriconazole的起效剂量为40mg/kg，选择Caspofungin(1.25mg/kg)作为组合配对的初始值，设计实验组合Caspofungin(1.25mg/kg)+Voriconazole(0.05mg/kg)，Caspofungin(2.5mg/kg)+Voriconazole(1mg/kg)进行动物试验。试验结果表明两个试验组合均未表现出明显的互动增效作用。
第三组：Posaconazole(A)和Terbinafine(B)。FIC<0.5时A药对应的MICA值和B药对应的MICB值分别为0.0005μg/mL和0.015625μg/mL，MICA:MICB＝1:31.25。经动物试验，Posaconazole的起效剂量为5mg/kg，Terbinafine的起效剂量为200mg/kg。选择Posaconazole(2.5mg/kg)作为组合配对的初始值，设计实验组合Posaconazole(2.5mg/kg)+Terbinafine(75mg/kg)，Posaconazole(5mg/kg)+Terbinafine(150mg/kg)进行动物试验。试验结果显示Posaconazole(5mg/kg)+Terbinafine(150mg/kg)联合给药组表现出明显的增效作用(见表8)。
表8各组肾组织载菌量比较
注：T表示Terbinafine，P表示Posaconazole，*表示与模型对照组比较P<0.05，**表示与模型对照组比较P<0.01，##表示与Terbinafine(150mg/kg)单独给药组比较P<0.01，△表示与Posaconazole(5mg/kg)单独给药组比较P<0.05。