一种感染响应型引导组织再生膜的制备方法与流程

本发明属于材料表面改性领域，具体涉及一种感染响应型释放抗菌药物的引导组织再生膜的制备方法。

背景技术：

引导组织再生(Guide Tissue Regeneration,GTR)技术是80年代末90年代初发展起来的一项新技术。其原理是利用膜的物理屏障功能将受损部位与周围组织隔离，创造一个相对封闭的组织环境，从而使成骨细胞优先迁移、生长。GTR的应用为牙周病的治疗、牙种植区骨量不足及其它骨缺损的修复、骨折的愈合提供了一个新的有效途径。

虽然GTR技术可取得长期稳定的疗效，但是由于手术中和术后以及二次取出过程中，引入到损伤部位的厌氧菌以及需氧细菌等引发的感染将影响其新组织的获得。目前对于术后抗感染还主要采用全身系统用药，但药物利用率较低，且容易引起胃肠道副反应。局部释药可以增强治疗效果，降低不良反应。

共混载药方式往往伴有药物突释现象，不能达到药物缓释的目的，采用共价键载药的方式可以实现药物的持续释放，通过pH或者酶等选择性切断相关的化学键,局部靶向释药可以增强治疗效果，从而降低不良反应。

当感染发生的时候，会有大量的巨噬细胞聚集，聚集的巨噬细胞会分泌大量的胆固醇酯酶(cholesterol esterase,CE)，并且感染越严重释放的CE量越多，而CE对酰胺键及酯键具有选择性酶解作用。将药物通过酯键接枝到引导膜表面，对感染发生过程中产生的酶具有响应性。当感染发生时，酯键在酶的作用下断裂，药物释放；感染程度越高，周围聚集的巨噬细胞越多，释放的酶的含量越高，释放的药物的量越多。利用CE对酯键的选择性酶解，将药物分子通过酯键固定在引导组织再生膜表面，就可能构建感染响应型释放药物的引导组织再生膜。从而达到克服不同患者发病时间及严重程度不同的临床差异，高效针对性预防抑制感染的目的。

多巴胺广泛应用于材料表面改性。对于疏水性材料，通过多巴胺改性，可以在疏水材料表面引入大量的官能团：氨基(-NH₂)和羟基(-OH)，极大的改善疏水表面的亲水性。

技术实现要素：

1.一种感染响应型引导组织再生膜表面改性方法，其特征是：以可降解脂肪族聚酯及可降解天然高分子引导组织再生膜为基体材料，通过一系列化学改性方法将抗菌药物以酯键接枝在膜表面，该改性膜表面对感染生理环境下机体分泌的酯酶具有响应性药物释放的效应。

具体方法是：通过多巴胺包覆，在膜表面引入羟基；通过硅烷偶联剂上的硅氧键与膜表面羟基反应，从而在膜表面引入氨基；然后将带羟基的抗菌药物与丙烯酰氯反应，在药物上引入酯键及碳碳双键；最后将碳碳双键与膜表面的氨基进行迈克尔加成反应，从而实现将药物通过酯键接枝到纤维膜表面。

2.所述的一系列化学改性方法，其特征在于，其具体操作步骤为：

(1)将引导组织再生膜浸泡在0.05g/L-10g/L的多巴胺溶液中(多巴胺盐酸盐：三羟甲基氨基甲烷＝5：3(摩尔比)，pH＝5-10)，搅拌反应6-48h后，将膜取出，浸泡清洗去除未反应的多巴胺溶液。

(2)将步骤(1)中获得的引导组织再生膜浸泡在浓度为1.25g/L-5.0g/L的硅烷偶联剂溶液中，在25℃-50℃温度下，在磁力搅拌机下搅拌反应3h-72h，将膜取出，浸洗去除未反应的硅烷偶联剂。

(3)将抗菌药物与丙烯酰氯反应，从而在甲硝唑分子上引入酯键。反应过程如下：①称取药品甲硝唑：丙烯酰氯：三乙胺＝1:1:1(摩尔比)以及三氯甲烷。②用三氯甲烷稀释丙烯酰氯，转移至恒压滴液漏斗中；称取的甲硝唑、三乙胺和三氯甲烷转入容器中。③通N₂，使得整个体系在N₂的氛围中。④将容器置于冰浴中，滴加体积比为1:15-1:20丙烯酰氯和三氯甲烷的混合溶液；滴完后，在冰浴中放置20min-30min，撤冰浴，常温反应12h。⑤向容器中滴加2ml-5ml去离子水终止反应。⑥将容器中的混合液体转入分液漏斗中，用二氯甲烷萃取。⑦往萃取所得溶液中加入足量无水Na₂SO₄至液体澄清，静置2-3h；所得溶液在30℃-40℃条件下旋蒸，获得所需产物。

(4)将步骤(2)中获得的引导组织再生膜浸泡在甲醇：水(体积比)＝4:1的的体系中，称取步骤(3)中所得的产物溶解其中，在30℃-50℃的条件下，不断搅拌，反应6h-72h。将膜取出，浸洗去除未反应的步骤(3)中所得的产物。

3.所述的引导组织再生膜，其厚度为100-500μm,具有无孔或有孔的结构，孔径1-10μm，其制备方法包括但不限于：静电纺丝、熔融浇注及真空模压法。

4.制备的材料为可降解脂肪族聚酯，包括：聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物、聚乳酸-羟基乙酸-己内酯共聚物其中一种或者两种以上的混合物；可降解天然高分子材料包括：Ⅰ型胶原、明胶、壳聚糖、淀粉、纤维素、弹性蛋白中的一种或者两种以上的混合物。

5.所述的抗菌药，其特征在于，结构上含有羟基(-OH)，易溶于有机溶剂，且具有抑菌或杀菌性，包括但不限于：甲硝唑、红霉素，哌拉西林、氯霉素等。

6.所述的相关酶，其特征在于，感染生理反应下机体分泌的对酯基敏感的酶，包括但不限于：胆固醇酯酶及磷脂酶A2(PLA2)。

7.所述的硅烷偶联剂，其特征在于，结构上含有氨基(-NH₂)和烷氧基，包括但不限于：γ-氨丙基三乙氧基硅烷(KH550)、3-氨丙基三甲氧基硅烷(A-1110)、N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷等(A-1120)。

附图说明

图1是静电纺丝聚己内酯纤维膜表面接枝甲硝唑反应步骤原理图。

图2是改性前后膜片的表面形貌SEM图；其中左图为改性前的引导组织再生膜，右图为改性后的引导组织再生膜。

图3是各步反应获得膜片的红外谱图。其中:a指聚己内酯静电纺丝膜；b表示经过多巴胺包覆的聚己内酯静电纺丝膜；c表示在b的基础上，经过硅烷偶联剂KH550改性得到的聚己内酯静电纺丝膜；d表示在c的基础上，经过迈克尔加成反应将药物甲硝唑(MNA)接枝到聚己内酯静电纺丝膜上获得的膜片。

对比a和b，b的FTIR曲线在1620cm^-1位置多了个聚多巴胺中的吲哚结构峰，在3000-3500cm^-1波数处明显的出现了羟基(-OH)的吸收峰，说明在多巴胺溶液中浸泡后，纤维上包覆上聚多巴胺壳层。

对比b和c，在3000-3500cm^-1波数处羟基(-OH)的吸收峰消失。因为硅烷偶联剂KH550是通过KH550上的乙氧基与聚多巴胺壳层上的羟基(-OH)反应接枝到聚己内酯纳米纤维上的，因而使得羟基(-OH)的吸收峰消失，说明b接枝上硅烷偶联剂KH550。同时，而1000-1100cm^-1波数处为Si-O-Si键的吸收峰，说明KH550已经接枝到聚己内酯纳米纤维上。

查阅资料可知，脂肪族硝基化合物硝基的反对称伸缩振动峰：1565-1530cm^-1(s)；对称伸缩振动峰：1380-1340cm^-1(s)，而对比c和d，有明显的区别，说明接枝上药物甲硝唑。

图4是不同CE酶浓度下药物释放曲线。随着酶浓度的提高，药物释放速率明显上升。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明，但并不局限于以下的实施例。在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，但凡在本发明的精神和原则之内，这些等价形式的改动、修改等均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例1

(1)将静电纺丝制备的PCL纳米纤维剪成2cm直径的圆片，浸泡在1.0g/L的多巴胺溶液中(以多巴胺盐酸盐：三羟甲基氨基甲烷＝5：3(摩尔比)配制的多巴胺溶液，溶液pH值为8.5)，搅拌下反应12h后，将纺丝膜取出，浸洗去除未反应的多巴胺溶液。

(2)步骤(1)中获得的静电纺丝制备的聚己内酯纳米纤维浸泡在浓度为5.0g/L的硅烷偶联剂KH550溶液中，在40℃条件下，分别反应24h，将纺丝膜取出，浸洗去除未反应的KH550。

(3)药物分子上引入酯键：甲硝唑与丙烯酰氯反应，从而将酯键引入到药物甲硝唑中；反应过程如下：①称取药品甲硝唑：丙烯酰氯：三乙胺＝1:1:1(摩尔比)，三氯甲烷。②用三氯甲烷稀释丙烯酰氯，转移至恒压滴液漏斗中；称取的甲硝唑、三乙胺和三氯甲烷转入茄形瓶中，搭好装置。③通N₂，使得整个体系在N₂的氛围中。④茄形瓶至于冰浴中，加入磁子不断搅拌，滴加丙烯酰氯和三氯甲烷的混合溶液；滴完后，冰浴30min，撤冰浴，常温反应12h。⑤往茄形瓶中滴加去离子水终止反应。⑥将茄形瓶中的混合液体转入分液漏斗中，用二氯甲烷萃取。⑦往萃取所得溶液中加入无水Na₂SO₄至液体澄清，静置3h；所得溶液在30℃-40℃条件下旋蒸，获得所需产物。

(4)将步骤(2)中所得纤维膜片浸泡在体积比4:1的甲醇和水的体系中，称取步骤(3)中所得产物溶解加入，在40℃的条件下，不断搅拌，反应24h。将纺丝膜取出，浸洗去除未反应的步骤(3)中所得的产物。

实施例2

将实施例1中的聚己内酯纳米纤维替换成纤维素膜，其他实验条件与实施例1相同。通过对比多巴胺包覆前纤维膜a和多巴胺包覆后纤维膜b的SEM图，可以发现b表面包覆上一层，且随着浸泡在多巴胺中的时间延长，包覆量增加，说明多巴胺成功接枝到纤维膜表面；经过KH550接枝改性后的纤维膜记为c，对比b和c的红外谱图，在3000-3500cm^-1波数处羟基(-OH)的吸收峰消失，说明KH550通过KH550上的乙氧基与聚多巴胺壳层上的羟基(-OH)反应接枝到纤维膜上的，因而使得羟基(-OH)的吸收峰消失；1000-1100cm^-1波数处为Si-O-Si键的吸收峰，说明KH550已经接枝到纤维膜上；药物接枝改性后获得纤维膜d，测定药物释放曲线，改性获得的膜片d在有酶的条件下释放药物，没有酶的条件下不是释放药物，说明达到了感染响应型释放药物的效果。

实施例3

将实施例1中的γ-氨丙基三乙氧基硅烷(KH550)替换成3-氨丙基三甲氧基硅烷(A-1110)，其他实验条件与实施例1相同。对比多巴胺包覆获得的聚己内酯纳米纤维膜和进一步通过A-1110接枝改性获得的聚己内酯纳米纤维膜的红外谱图，在3000-3500cm^-1波数处羟基(-OH)的吸收峰消失，说明3-氨丙基三甲氧基硅烷(A-1110)通过A-1110上的甲氧基与聚多巴胺壳层上的羟基(-OH)反应接枝到聚己内酯纳米纤维上的，因而使得羟基(-OH)的吸收峰消失；1000-1100cm^-1波数处为Si-O-Si键的吸收峰，说明A-1110已经接枝到聚己内酯纳米纤维上。

实施例4

对真空模压获得的聚己内酯引导组织再生膜进行感染响应型表面改性:将实施例1中的聚己内酯静电纺丝膜替换成真空模压制备的聚己内酯引导组织再生膜，其他实验条件与实施例1相同。并注:a指真空模压获得的聚己内酯引导组织再生膜；b表示经过多巴胺包覆的聚己内酯引导组织再生膜；c表示在b的基础上，经过硅烷偶联剂KH550改性得到的聚己内酯引导组织再生膜；d表示在c的基础上，经过迈克尔加成反应将药物甲硝唑(MNA)接枝到聚己内酯引导组织再生膜获得的膜片。通过对比多巴胺包覆前后聚己内酯引导组织再生膜的SEM图，可以发现聚己内酯引导组织再生膜表面包覆上一层，且随着浸泡在多巴胺中的时间延长，包覆量增加，说明多巴胺成功接枝到聚己内酯引导组织再生膜表面；对比KH550接枝改性后的聚己内酯引导组织再生膜，对比b和c的红外谱图，在3000-3500cm^-1波数处羟基(-OH)的吸收峰消失，说明KH550通过KH550上的乙氧基与聚多巴胺壳层上的羟基(-OH)反应接枝到聚己内酯引导组织再生膜上的，因而使得羟基(-OH)的吸收峰消失；1000-1100cm^-1波数处为Si-O-Si键的吸收峰，说明KH550已经接枝到聚己内酯引导组织再生膜上；药物接枝改性后获得d，测定药物释放曲线，改性获得的膜片在有酶的条件下释放药物，没有酶的条件下不是释放药物，说明达到了感染响应型释放药物的效果。

实施例5

将实施例1中的抗菌药物甲硝唑替换成红霉素，其他实验条件与实施例1相同。测定红霉素与丙烯酰氯反应产物的质谱图和核磁图，发现在质谱图中出现分子量为787的物质，且对比核磁图中相应的H的化学位移，可以确定获得所需产物。经过改性后的膜片做药物释放实验，改性获得的膜片在有酶的条件下释放药物红霉素，没有酶的条件下不释放药物。

实施例6

将实施例1中的抗菌药物甲硝唑替换成氯霉素，药物分子上引入酯键：氯霉素与丙烯酰氯反应，从而将酯键引入到药物氯霉素中；反应过程如下：①称取药品氯霉素：丙烯酰氯：三乙胺＝1:1:1(摩尔比)和丙酮。②用丙酮稀释丙烯酰氯，转移至恒压滴液漏斗中；称取的氯霉素、三乙胺和丙酮转入茄形瓶中，搭好装置。③通N₂，使得整个体系在N₂的氛围中。④茄形瓶至于冰浴中，加入磁子不断搅拌，滴加丙烯酰氯和丙酮的混合溶液；滴完后，冰浴30min，撤冰浴，常温反应12h。⑤往茄形瓶中滴加去离子水终止反应。⑥将茄形瓶中的混合液体滴加入体积为混合溶液体积的10-15倍的去离子水中沉淀，过滤沉淀，并用去离子水多次清洗，以除去残余的丙烯酰氯和三乙胺，在50℃条件下烘干得到产物。其他实验条件与实施例1相同。测定氯霉素与丙烯酰氯反应产物的质谱图和核磁图，发现在质谱图中出现分子量为377.12的物质，且对比核磁图中相应的H的化学位移，可以确定获得所需产物。经过改性后的膜片做药物释放实验，改性获得的膜片在有酶的条件下释放药物氯霉素，没有酶的条件下不释放药物。