交叉引用
本申请基于2015年5月8日在日本提出申请的日本特愿2015-095610号要求优先权，该申请中记载的内容全部作为参考而被直接援引在本说明书中。另外，本申请中引用的全部专利、专利申请及文献中记载的内容全部作为参考而被直接援引在本说明书中。
本发明涉及含有糖皮质激素的纳米微粒的水性悬浮液剂及其应用。
背景技术：
糖皮质激素由于是疏水性的，因此以往以水性悬浮液的形式提供。但是，由于糖皮质激素化合物的水性悬浮液所含有的类固醇粒子会随着时间的经过而发生沉淀，因此患者在使用时必须振荡容器以使活性成分均匀地分散在液相中。另外，尽管患者在使用时必须振荡容器，但悬浮液中的粒子仍然容易凝聚成块状，随着药剂粒径的增加，容易丧失均匀性。这样，由于分散会变得不均匀，因此存在无法以预定的给药量给药，对炎症、疼痛的抑制变得不充分的问题。
在此，作为解决类固醇所存在的这样的问题的方法之一，已提出了乳液制剂(专利文献1，非专利文献1、2)。例如，对于二氟泼尼酯的水包油(o/w型)乳液制剂(durezol(注册商标)：0.05％difluprednate制剂)，无论其保存状态及使用前是否振荡，均确认到了能够向患部稳定地提供均匀的药剂。
但是，水包油(o/w型)乳液制剂由于必须使用油性的溶剂，因此，存在会确认到异物感、充血等刺激作用这样的问题。因此，要求即使不使用油性溶剂也能够保证均匀性的糖皮质激素的水性制剂。
另外，已尝试了像地塞米松磷酸钠那样，通过使化合物的结构为亲水性而使其溶解在水中。但是，溶解在水中的制剂，存在由于溶解度导致的限制而使得能够含有的有效成分浓度存在界限的问题。
另一方面，作为含有难溶性药剂的水性液剂，已提出了使水性悬浮液中的有效成分的粒子为纳米尺寸的纳米悬浮液剂(nanosuspensions)。就纳米悬浮液剂而言，已知通过将粒径缩小到纳米尺寸而实质上增加比表面积，从而增加溶解度，由此使血清水平更快达到最大，使得能够以各种给药形态提供，能够提高含有的有效成分量。到目前为止，作为糖皮质激素化合物的纳米悬浮液剂，已公开了利用使用玻璃珠的湿磨机制造的含有氟替卡松(d900.4μm)及布地奈德(d900.4μm)的水性悬浮液剂，在4℃下经过5周后仍保持均匀性、晶体结构、粒径(非专利文献3)。另外，作为纳米粒子形成的自下而上方法，已报道了通过沉淀而使糖皮质激素化合物的氢化可的松生成平均粒径约为300nm的纳米粒子，从而形成水性悬浮液的方法(非专利文献4)。但是，该报道显示，无论是在眼压升高还是稳定性方面，自上而下的方法(milling)均是更优异的。另外，作为主要用于经鼻给药的皮质类固醇(具体为糠酸莫米松)的纳米悬浮液剂，已公开了包含d50为50～500nm的皮质类固醇、亲水性聚合物、润湿剂及络合剂的制剂(专利文献2)。除此之外，还报道了能够实现高压釜灭菌的糖皮质激素化合物的水性悬浮液剂(专利文献3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开wo97/05882号公报
专利文献2：美国公开2011/0008453号公报
专利文献3：国际公开wo2007/089490号公报
非专利文献
非专利文献1：ericddonnenfeld，clinicalopthalmology(2011)5:811-816
非专利文献2：hetalk.patel等人，colloidsandsurfaces:biointerfaces(2013)102:86-94
非专利文献3：jerryz.yang等人，journalofpharmaceuticalsciences(2008)97(11):4869-4878
非专利文献4：hanys.m.ali等人，journalofcontrolledrelease(2011)149:175-181
技术实现要素：
发明要解决的问题
尽管对于这样的含有难溶性药物的水性液剂已进行了各种研究，但仍然难以实现含有氯倍他索丙酸酯等糖皮质激素化合物的注射剂、滴眼剂、滴耳剂等水性悬浮液剂的实用化，期望开发出经时稳定性和分散稳定性优异、以糖皮质激素化合物作为有效成分的注射剂及局部给药用水性悬浮液剂，尤其是滴眼剂及滴耳剂。
由此，在一个实施方式中，本发明的目的在于提供经时稳定性和分散稳定性优异、含有糖皮质激素化合物作为有效成分的水性悬浮液。更具体来说，本发明的目的在于提供含有糖皮质激素化合物作为有效成分，澄清性、分散性、保存稳定性优异的注射剂、滴眼剂、滴耳剂、滴鼻剂和/或吸入剂等水性药物组合物。进一步，本发明的目的在于提供角膜滞留性及房水转移性优异的含有糖皮质激素化合物作为有效成分的滴眼剂。另外，本发明的目的在于提供含有作为糖皮质激素化合物的氯倍他索丙酸酯作为有效成分的上述水性悬浮液或水性药物组合物。
解决问题的方法
本发明人等经过深入研究的结果，发现：含有糖皮质激素化合物的纳米微粒、以及根据需要的分散稳定剂、表面活性剂、抗凝聚剂、和/或粘度调节剂的水性悬浮液剂，其澄清性、(长期)分散性、保存稳定性、角膜滞留性及房水转移性优异，作为水性药物组合物是优异的。特别是，本发明人等发现，含有糖皮质激素化合物的纳米微粒、以及根据需要的分散稳定剂、表面活性剂、抗凝聚剂和/或粘度调节剂的水性悬浮液剂，不含具有异物感、充血等刺激作用的有机化合物，可以实现优异的澄清性、(长期)分散性、及保存稳定性，由此，完成了尽管刺激性小，但能够向患部稳定地提供均匀的药剂，并且抗炎症效果高的糖皮质激素化合物的水性制剂。
更具体来说，本发明涉及以下方案。
(1)一种水性悬浮液剂，其含有糖皮质激素化合物的纳米微粒。
(2)根据(1)所述的水性悬浮液剂，其中，所述纳米微粒的平均粒径为300nm以下、且d90粒径为450nm以下。
(3)根据(1)或(2)所述的水性悬浮液剂，其中，所述纳米微粒为通过将糖皮质激素化合物、生理学上可接受的盐、生理学上可接受的多元醇及表面修饰剂进行混合而制造的微粒。
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的水性悬浮液剂，其中，所述糖皮质激素化合物为选自丙酸氯倍他索、醋酸双氟拉松、丙酸地塞米松、二氟泼尼酯、糠酸莫米松、戊酸双氟可龙、倍他米松丁酸丙酸酯、醋酸氟轻松、丙酸丁酸氢可的松、丙酸倍氯米松、丙酸地泼罗酮、戊酸倍他米松、戊酸地塞米松、泼尼松龙醋酸戊酸酯、氟轻松、丁酸氢化可的松、丁酸氯倍他松、丙酸阿氯米松、曲安奈德、氟米松新戊酸酯、泼尼松龙、及氢化可的松中的一种以上物质。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的水性悬浮液剂，其还含有分散稳定剂。
(6)根据(5)所述的水性悬浮液剂，其中，所述分散稳定剂为聚氧亚乙基聚氧亚丙基二醇和/或聚乙烯醇。
(7)根据(1)～(6)中任一项所述的水性悬浮液剂，其还含有粘度调节剂。
(8)根据(7)所述的水性悬浮液剂，其中，所述粘度调节剂为选自甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、及聚乙烯醇中的一种以上物质。
(9)根据(7)或(8)所述的水性悬浮液剂，其含有1～10mg/ml的所述粘度调节剂。
(10)一种药物组合物，其含有(1)～(9)中任一项所述的水性悬浮液剂。
(11)根据(10)所述的药物组合物，其为非口服给药用药物组合物。
(12)根据(11)所述的药物组合物，其为注射剂或局部适用制剂。
(13)根据(12)所述的药物组合物，其为眼用局部适用制剂、耳用局部适用制剂、鼻用局部适用制剂、或肺用局部适用制剂。
(14)根据(13)所述的药物组合物，其为滴眼剂、滴耳剂、滴鼻剂、或吸入剂。
(15)根据(10)～(14)中任一项所述的药物组合物，其为炎症性疾病或感染性疾病的治疗药或预防药。
(16)根据(15)所述的药物组合物，其中，炎症性疾病或感染性疾病为全身性的炎症性疾病或感染性疾病。
(17)根据(15)所述的药物组合物，其中，炎症性疾病或感染性疾病为局部性的炎症性疾病或感染性疾病。
(18)根据(17)所述的药物组合物，其中，局部为选自眼、耳、鼻(上呼吸道)、及肺(下呼吸道)中的一种以上的组织或脏器。
(19)一种试剂盒，其用于制备(10)～(18)中任一项所述的药物组合物，该试剂盒具备糖皮质激素化合物的纳米微粒。
(20)(10)～(18)中任一项所述的药物组合物的制造方法，其包括：
将糖皮质激素化合物、生理学上可接受的盐、生理学上可接受的多元醇和/或水、及分散稳定剂进行混合。
(21)根据(20)所述的制造方法，其包括：将糖皮质激素化合物、生理学上可接受的盐、甘油、柠檬酸酐及氢化大豆卵磷脂进行混合。
特别地，本发明人等发现：通过使糖皮质激素化合物的纳米微粒为平均粒径(以下称为“dv”)为300nm以下且90％粒径(以下称为“d90”)为450nm以下(优选dv为250nm以下且d90为300nm以下、或dv为200nm以下且d90为250nm以下)的微粒，其向眼房水中的转移性非常优异且抗炎症作用优异。另外，通过采用这样的纳米粒子，可以期待糖皮质激素化合物的溶解性的提高，由此，可以期待提高生物学利用性而减少给药量。平均粒径可以作为散射强度(intensitydistribution)平均粒径、体积(volumedistribution)平均粒径及个数(numberdistribution)平均粒径而测定。优选本说明书中的dv表示散射强度平均粒径。
由此，在一实施方式中，本发明涉及以含有糖皮质激素化合物的纳米微粒为特征的水性悬浮液剂，优选涉及纳米微粒的dv为300nm以下且d90为450nm以下的水性悬浮液剂。例如，本发明的水性悬浮液剂含有通过将糖皮质激素化合物、生理学上可接受的盐、生理学上可接受的多元醇和/或水、及分散稳定剂进行混合而制造的糖皮质激素化合物的纳米微粒。更优选本发明的水性悬浮液剂含有通过将糖皮质激素化合物、生理学上可接受的盐、甘油、柠檬酸酐及氢化大豆卵磷脂进行混合而制造的糖皮质激素化合物的纳米微粒。
另外，本发明人等发现：以含有糖皮质激素化合物的纳米微粒为特征的水性悬浮液剂，通过使用聚氧亚乙基聚氧亚丙基二醇(以下称为“poe-pop二醇”)和/或聚乙烯醇(以下称为“pva”)作为分散稳定剂、和/或使用羟丙基甲基纤维素和/或甲基纤维素作为增粘剂，可长时间具有优异的澄清性、分散性，且保存稳定性优异。
由此，在一实施方式中，本发明涉及以含有dv为300nm以下且d90为450nm以下(优选dv为250nm以下且d90为300nm以下、或dv为200nm以下且d90为250nm以下)的糖皮质激素化合物的纳米微粒为特征的水性悬浮液剂。另外，在其他的实施方式中，本发明涉及以含有糖皮质激素化合物的纳米微粒作为有效成分、含有分散稳定剂和/或粘度调节剂作为添加物为特征的水性药物组合物。
在本说明书中，“水性药物组合物”是指水性的液体状或凝胶状的药物组合物，具体来说是指在水性的液体或凝胶中悬浮有糖皮质激素化合物的纳米微粒的状态的药物组合物。由此，在没有特别的相反记载的情况下，本说明书中的药物组合物是指水性的药物组合物。水性药物组合物包含注射剂及局部适用制剂。由此，在没有特别的相反记载的情况下，本说明书中的局部适用制剂是指用于局部给药的水性的制剂。水性药物组合物只要是在不妨碍其作为药物使用的范围内也可以具有粘性，除了水状制剂以外，还包括凝胶状制剂。
在本说明书中，“局部”是指身体的一部分，例如为患部、其周边、或存在患部的脏器等，优选为眼、耳、鼻(上呼吸道)或肺(下呼吸道)。
具体来说，本发明的注射剂可以是用于治疗或预防全身性或局部性的炎症性疾病或感染性疾病的注射剂，包括静脉注射用、皮下注射用、肌肉注射用、点滴用等注射剂。
在本说明书中，“局部适用制剂”是指以局部地给药为目的的药物组合物。优选局部适用制剂为眼用局部适用制剂(例如，滴眼剂)、耳用局部适用制剂(例如，滴耳剂)、鼻用局部适用制剂(例如，滴鼻剂)、及肺用局部适用制剂(例如，吸入剂)。这样的局部适用制剂可以是用于治疗或预防眼、耳、鼻或肺的炎症性疾病或感染性疾病的局部适用制剂。另外，作为制剂形态，可以为例如滴眼剂、滴耳剂、滴鼻剂、及吸入剂。本发明的局部适用制剂可优选为用于治疗或预防眼的炎症性疾病或感染性疾病的眼用局部适用制剂(包括滴眼剂)、用于治疗或预防耳的炎症性疾病或感染性疾病的耳用局部适用制剂(包括滴耳剂)、用于治疗或预防鼻的炎症性疾病或感染性疾病的鼻用局部适用制剂(包含滴鼻剂)、或用于治疗或预防肺的炎症性疾病或感染性疾病的肺用局部适用制剂(包括吸入剂)。
另外，通过向有此需要的患者的局部给药有效量的本发明的水性药物组合物，可以用于治疗或预防炎症性疾病或感染性疾病。即，在一个实施方式中，本发明涉及炎症性疾病或感染性疾病的治疗方法或预防方法，其包括：向有此需要的患者给药有效量的水性悬浮液剂或含有该水性悬浮液剂的药物组合物，所述水性悬浮液剂的特征在于含有糖皮质激素化合物的纳米微粒、并任选含有分散稳定剂和/或粘度调节剂。例如，本发明包含炎症性疾病或感染性疾病的治疗方法或预防方法，其包括：向有此需要的患者的局部给药有效量的局部适用制剂，所述局部适用制剂的特征在于含有糖皮质激素化合物的纳米微粒、并任选还含有分散稳定剂。
或者，本发明涉及糖皮质激素化合物的纳米微粒(以及任选的分散稳定剂和/或粘度调节剂)或含有该纳米微粒的水性悬浮液剂的用于制造水性药物组合物(例如，注射剂及局部适用制剂)的用途。
在本说明书中，所述“糖皮质激素化合物”，只要是糖皮质激素及其衍生物化合物则没有特别地限定。作为糖皮质激素化合物，可以列举例如：丙酸氯倍他索、醋酸双氟拉松、丙酸地塞米松、二氟泼尼酯、糠酸莫米松、戊酸双氟可龙、倍他米松丁酸丙酸酯、醋酸氟轻松、丙酸丁酸氢可的松、丙酸倍氯米松、丙酸地泼罗酮、戊酸倍他米松、戊酸地塞米松、泼尼松龙醋酸戊酸酯、氟轻松、丁酸氢化可的松、丁酸氯倍他松、丙酸阿氯米松、曲安奈德、氟米松新戊酸酯、泼尼松龙、及氢化可的松，优选为丙酸氯倍他索。
在本说明书中，所述“水性悬浮液剂”，是指悬浮有糖皮质激素化合物的纳米微粒的水性液剂。在本说明书中，水性悬浮液剂可以是其自身构成能够作为药物给药的药物组合物，也可以是通过适当添加其它成分、稀释剂而构成药物组合物的物质(例如，药物组合物的原料)，特别地，还可以是不被作为药物使用的物质。
本说明书中的水性悬浮液剂包含经分散稳定化的水性悬浮液剂。所述分散稳定化是指，在通过搅拌等而分散后，在室温(25℃)下静置24小时(优选为2天、3天、4天、5天、6天、7天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、或2年)后具有下述中的任一种或两种以上的性质：(1)无法通过肉眼而确认到沉淀；(2)澄清性高；(3)无法通过显微镜观察而观察到凝聚物/结晶；(4)dv的值实质上无变化(没有50％以上的增加)。优选为：本说明书中的含有糖皮质激素化合物的纳米微粒的水性悬浮液剂自封入试验管开始的7天后，不会通过肉眼而确认到沉淀物、澄清性高、且不会通过显微镜观察而确认到凝聚物/结晶的水性悬浮液剂。
澄清性可基于日本药典收录的澄清性试验法而进行判定。具体而言，可按照以下程序进行判定：在福尔马肼(formazin)标准乳浊液5ml中加入水并使其达到100ml，得到浑浊的比较液。以使液层达到深度30mm或40mm的方式分别取被检水性悬浮液剂及新配制的浑浊的比较液置于内径15mm的无色透明的玻璃制平底试验管中，在散射光中使用黑色的背景、自上方进行观察并加以比较。当被检水性悬浮液剂的澄清性与水或所使用的溶剂相同、或其浑浊程度在浑浊的比较液以下时，可判定为澄清性高。或者，针对被检水性悬浮液剂及新配制的浑浊的比较液，使用层长50mm的吸收池，以水或所使用的溶剂作为对照，通过紫外可见吸光度测定法进行试验，测定660nm处的透过率，当被检水性悬浮液剂的透过率在浑浊的比较液以上时，可判定为澄清性高。
在另一实施方式中，本发明的局部适用制剂为具有向眼房水的转移性的眼用局部适用制剂。在此，“具有向眼房水的转移性”是指在调整为0.05％(w/v)的糖皮质激素化合物的水性局部适用制剂的1次滴眼给药的60分钟后，眼房水中的糖皮质激素化合物浓度(平均值)为45ng/ml以上(优选为50ng/ml以上、55ng/ml以上、60ng/ml以上、65ng/ml以上、70ng/ml以上、75ng/ml以上)。或者，“具有眼房水的转移性”是指在调整为0.05％(w/v)的糖皮质激素化合物的水性局部适用制剂的1次滴眼给药的30分钟后，眼房水中的糖皮质激素化合物浓度(平均值)为40ng/ml以上(优选为50ng/ml以上、55ng/ml以上、60ng/ml以上、63ng/ml以上、64ng/ml以上、65ng/ml以上、70ng/ml以上、75ng/ml以上)。
进一步，在另一实施方式中，本发明的局部适用制剂为具有向结膜的转移性的眼用局部适用制剂。在此，“具有向结膜的转移性”是指在调整为0.05％(w/v)的糖皮质激素化合物的水性局部适用制剂的1次滴眼给药的15分钟后，结膜中的糖皮质激素化合物浓度(平均值)为500ng/ml以上(优选为659ng/ml以上、900ng/ml以上、972ng/ml以上、1000ng/ml以上、1200ng/ml以上、1210ng/ml以上、1400ng/ml以上、1455ng/ml以上、1500ng/ml以上或2000ng/ml以上、2141ng/ml以上)。
向眼房水的转移性及向结膜的转移性可以使用适当的实验动物，基于本申请实施例中记载的方法进行，例如，可以按照以下的方法进行。缓慢拨开兔子的下眼睑，使用移液器向左眼的结膜囊内滴眼(单次滴眼给药)被检物质，滴眼后，慢慢地闭合上下眼睑并保持约2秒钟。在滴眼15分钟、30分钟、60分钟及90分钟后，进行麻醉，放血使其安乐死，利用注射用水充分清洗眼睛，然后采集眼房水或结膜。采集的眼房水中的糖皮质激素化合物浓度可以如下地确定：向采集的眼房水中添加甲醇和内标准(泼尼松龙)溶液并进行搅拌后，进一步添加乙腈并进行搅拌，进行离心(13100×g，4℃，5分钟)，将得到的上清利用lc-ms/ms法进行测定。另外，采集的结膜中的糖皮质激素化合物浓度可以如下地确定：相对于得到的结膜的湿重添加9倍容量的超纯水并将其搅匀，添加甲醇和内标准(泼尼松龙)溶液并进行搅拌后，进一步添加乙腈进行搅拌，进行离心(13100×g，4℃，5分钟)，将得到的上清通过lc-ms/ms法进行测定。
在另外的实施方式中，本发明的局部适用制剂为能够降低眼房水中的蛋白质浓度的升高率的眼用局部适用制剂。在此，“能够降低眼房水中的蛋白质浓度的升高率”是指，在实验动物(例如，兔子)的角膜穿刺前后，将调整为0.05％(w/v)或0.1％(w/v)的糖皮质激素化合物的水性局部适用制剂40μl以30～60分钟的间隔进行7次给药(优选将角膜穿刺设为0分钟，在180分钟前、120分钟前、60分钟前、30分钟前、30分钟后、60分钟后、及90分钟后的7次给药)，在给药结束的30分钟后的眼房水中的蛋白质浓度低于未进行角膜穿刺的眼房水中的蛋白质浓度的3倍(优选低于2.5倍或低于2倍)。
在另一实施方式中，本发明的局部适用制剂为能够发挥眼的炎症抑制作用的眼用局部适用制剂。更详细来说，本发明的局部适用制剂为能够抑制作为炎症介质的前列腺素e2(pge2)的产生的眼用局部适用制剂。在此，“能够抑制pge2的产生”是指，在实验动物(例如，兔子)的角膜穿刺前后，将调整为0.05％(w/v)或0.1％(w/v)的糖皮质激素化合物的水性局部适用制剂40μl以30～60分钟的间隔进行7次给药(优选将角膜穿刺设为0分钟，在180分钟前、120分钟前、60分钟前、30分钟前、30分钟后、60分钟后、及90分钟后的7次给药)，在给药结束的30分钟后的眼房水中的pge2浓度低于同样进行给药的durezole(注册商标)给药组中的pge2浓度。
本发明的眼用局部适用制剂可以具有选自下述中的两种以上(2种、3种、或全部)性质：上述的向眼房水的转移性、向结膜的转移性、眼房水中的蛋白质浓度的升高率低、及眼的炎症抑制作用。
在某一实施方式中，本发明的水性悬浮液剂为刺激性低的水性悬浮液剂。这里，所述刺激性低是指，在将该水性悬浮液剂向对象给药时，与以往被使用的含有相同有效成分的水性制剂相比，刺激性的反应(例如，发红、肿胀、充血等炎症性反应)的程度低。关于被检水性悬浮液剂的刺激性高低与否，例如，可基于jonas,j.kuehne等、amjophthalmol(2004)138:547-553中记载的方法对兔眼给药被检水性悬浮液剂并测定眼的炎症的程度，当其炎症的程度低于标准液剂(同上)的情况下，可判定为刺激性低。更具体而言，对于滴眼剂的情况而言，可如下地判定刺激性：将糖皮质激素化合物的浓度为1.0％的制剂以30分钟～数小时的间隔在1天滴眼1～20次，观察给药前、最终给药后1、3、5、24小时的角膜、虹膜及结膜，并按照draize的评价基准(参见oecdguidelinesfortestingofchemicals405(24feb.1987)acuteeyeirritation/corrosion)进行评分。
本发明的水性悬浮液剂或药物组合物可以含有1种或2种以上的生理学上可接受的盐。作为本说明书中的“生理学上可接受的盐”，可以列举例如：氯化钠、氯化钾、氯化铵、硫酸钠、硫酸镁、硫酸钾、硫酸钙、苹果酸钠、柠檬酸钠、柠檬酸二钠、柠檬酸二氢钠、柠檬酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、及磷酸氢二钾等。可以列举氯化钠、氯化钾、硫酸镁、硫酸钙、柠檬酸钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾等，优选氯化钠。
本发明的水性悬浮液剂或药物组合物可以含有0.01～10％的生理学上可接受的盐，优选含有0.1～5％，例如0.5～3％、0.8～2％的生理学上可接受的盐。或者，本发明的水性悬浮液剂或药物组合物可以含有0.01～50mg/ml、0.1～20mg/ml或1～5mg/ml的生理学上可接受的盐。
本发明的水性悬浮液剂或药物组合物也可以含有1种或2种以上的表面活性剂，和/或可以含有1种或2种以上的抗凝聚剂。
在本说明书中，所述“表面活性剂”是指，即使作为医药品添加物向人给药也不显示毒性的表面活性剂，只要是不会妨碍糖皮质激素化合物的作用的表面活性剂则没有特殊限制，例如，可列举poloxamer407、poloxamer235、poloxamer188等聚氧乙烯(以下称为“poe”)-聚氧丙烯(以下称为“pop”)嵌段共聚物；poloxamine等乙二胺的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物加成物；poe(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯(聚山梨酯20)、poe(20)山梨糖醇酐单油酸酯(聚山梨酯80)、聚山梨酯60等poe山梨糖醇酐脂肪酸酯类；poe(60)氢化蓖麻油等poe氢化蓖麻油；poe(9)月桂基醚等poe烷基醚类；poe(20)pop(4)十六烷基醚等poe-pop烷基醚类；poe(10)壬基苯基醚等poe烷基苯基醚类；poe(105)pop(5)二醇、poe(120)pop(40)二醇、poe(160)pop(30)二醇、poe(20)pop(20)二醇、poe(200)pop(70)二醇、poe(3)pop(17)二醇、poe(42)pop(67)二醇、poe(54)pop(39)二醇、poe(196)pop(67)二醇等poe-pop二醇类等非离子型表面活性剂；烷基二氨基乙基甘氨酸等甘氨酸型、月桂基二甲基氨基乙酸甜菜碱等乙酸甜菜碱型、咪唑啉型等的两性表面活性剂；poe(10)月桂基醚磷酸钠等poe烷基醚磷酸及其盐、月桂酰基甲基丙氨酸钠等n-酰基氨基酸盐、烷基醚羧酸盐、n-椰油酰基甲基牛磺酸钠等n-酰基牛磺酸盐、十四烯磺酸钠等磺酸盐、月桂基硫酸钠等烷基硫酸盐、poe(3)月桂基醚硫酸钠等poe烷基醚硫酸盐、α-烯烃磺酸盐等阴离子表面活性剂；烷基胺盐、烷基季铵盐(苯扎氯铵、苄索氯铵等)、烷基吡啶鎓盐(十六烷基氯化吡啶鎓、十六烷基溴化吡啶鎓等)等阳离子表面活性剂等。本发明的水性悬浮液剂中，作为表面活性剂，可含有1种表面活性剂，或者也可以含有2种以上表面活性剂。
另外，在本说明书中，“抗凝聚剂”是可以防止糖皮质激素化合物的凝聚、向人体给药时不显示毒性的物质，只要是不会妨碍糖皮质激素化合物的作用的抗凝聚剂则没有特殊限制，例如，可列举：烷基硫酸盐、n-烷酰基甲基牛磺酸盐、乙醇、甘油、丙二醇、柠檬酸钠、甘油磷脂(卵磷脂(磷脂酰胆碱)(例如，精制大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰甘油、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰肌醇、溶血磷脂酸、及溶血磷脂酰甘油)、及鞘磷脂(sphingophospholipid)(鞘磷脂(sphingomyelin)、神经酰胺、鞘糖脂、或神经节苷脂)等磷脂、d-山梨糖醇、乳糖、木糖醇、阿拉伯树胶、蔗糖脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚乙二醇(peg)、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、烷基苯磺酸盐、磺基琥珀酸酯盐、poe-pop二醇、聚乙烯吡咯烷酮、pva、羟丙基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧基乙烯基聚合物、n-酰基谷氨酸盐、丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物、酪蛋白钠、l-缬氨酸、l-亮氨酸、l-异亮氨酸、苯扎氯铵、苄索氯铵等。本发明的水性悬浮液剂中，作为抗凝聚剂，可含有1种，或者，也可以含有2种以上的抗凝聚剂。
本发明的水性悬浮液剂或药物组合物可以含有0.001～10％、或0.01～10％的抗凝聚剂，优选含有0.02～5％的抗凝聚剂，例如可以含有0.03～1％、0.04～0.5％、0.05～0.2％的抗凝聚剂。或者，本发明的水性悬浮液剂或药物组合物可以含有0.01～50mg/ml、0.1～20mg/ml或1～5mg/ml的抗凝聚剂。
作为表面活性剂和/或抗凝聚剂，优选为选自聚氧乙烯氢化蓖麻油60(hco-60)、聚氧乙烯氢化蓖麻油40(hco-40)、聚山梨酯80(例如，吐温80)、聚山梨酯20(例如，吐温20)、poe-pop二醇(例如，pronon407p、pluronicf68、unirube70dp-950b、及pva(例如，kuraraypoval217c)中的一种以上物质，更优选为选自poe-pop二醇及pva中的一种以上物质。
在本说明书中，所述“粘度调节剂”是能够调节本发明的水性悬浮液剂的粘度的物质，是即使作为医药品添加物向人给药也不显示毒性的物质，只要是不会妨碍糖皮质激素化合物的作用的物质则没有特殊限制，例如，可列举多糖类或其衍生物(阿拉伯树胶、刺梧桐树胶、黄原胶、角豆胶、瓜尔胶、愈创木脂、榅桲籽、达尔曼胶(dalmangum)、黄蓍树胶、安息香胶、刺槐豆胶、酪蛋白、琼脂、藻酸、糊精、葡聚糖、卡拉胶、明胶、胶原蛋白、果胶、淀粉、多聚半乳糖醛酸、甲壳素及其衍生物、壳聚糖及其衍生物、弹性蛋白、肝素、类肝素、硫酸肝素、硫酸乙酰肝素、透明质酸、硫酸软骨素等)、神经酰胺、纤维素衍生物(甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、纤维素、硝基纤维素等)、pva(完全或部分皂化物)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚甲基丙烯酸乙烯酯、聚丙烯酸、羧乙烯基聚合物、聚乙烯亚胺、聚环氧乙烷、聚乙二醇、核糖核酸、脱氧核糖核酸、甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物等、及其药理学可接受的盐类(例如，藻酸钠)等。本发明的水性悬浮液剂中，作为粘度调节剂，可含有1种，或者，也可以含有2种以上粘度调节剂。作为粘度调节剂，优选为选自羟丙基甲基纤维素(例如，tc-5(r)，metlose60sh-50)、pva(kuraraypoval217c)、及甲基纤维素(例如，metlosesm-100、metlosesm-15)中的一种以上物质，更优选为选自羟丙基甲基纤维素及甲基纤维素中的一种以上物质。
本发明的水性悬浮液剂可以含有1～10mg/ml的粘度调节剂，优选含有1～5mg/ml的粘度调节剂，例如可以含有1～4mg/ml、1～3mg/ml、1～2mg/ml的粘度调节剂。
本说明书中的分散稳定剂可以使用作为上述的表面活性剂、抗凝聚剂和/或粘度调节剂记载的物质，优选为选自聚氧乙烯氢化蓖麻油60(hco-60)、聚氧乙烯氢化蓖麻油40(hco-40)、聚山梨酯80、聚山梨酯20、poe-pop二醇、pva、羟丙基甲基纤维素、及甲基纤维素中的一种以上物质，更优选为选自poe-pop二醇、pva、羟丙基甲基纤维素及甲基纤维素中的一种以上物质。
在本说明书中，也可以作为分散稳定剂使用的表面活性剂、抗凝聚剂和/或粘度调节剂(以下，在本段中称为“添加剂”)，可以附着或吸附于糖皮质激素化合物的纳米粒子的表面。这样的添加剂在粉碎工序前被添加的情况下，通过附着或吸附于糖皮质激素化合物的纳米粒子的表面，可抑制粉碎工序中的纳米粒子的凝聚。另外，通过附着或吸附于糖皮质激素化合物的纳米粒子的表面，在水性悬浮液中也具有抑制凝聚的效果。需要说明的是，在本说明书中，作为分散稳定剂的表面活性剂、抗凝聚剂和/或粘度调节剂附着或吸附于糖皮质激素化合物的纳米粒子的表面，是指这些添加剂的至少一部分附着或吸附于纳米粒子表面(贡献于表面修饰)，而并不是指在水性悬浮液剂中不存在既未附着也未吸附的这些添加剂。在本说明书中，“表面修饰剂”是指能够这样地对糖皮质激素化合物的纳米粒子的表面进行表面修饰的作为分散稳定剂的表面活性剂、抗凝聚剂和/或粘度调节剂。
本发明的水性悬浮液剂或药物组合物也可以含有1种或2种以上的生理学上可接受的多元醇。例如，本发明的药物组合物可以含有上述的生理学上可接受的多元醇。作为“生理学上可接受的多元醇”，可以列举例如：甘油、丙二醇、聚乙二醇、二丙二醇、及二乙二醇等，优选为丙二醇或甘油。本发明的水性悬浮液剂或药物组合物可以含有例如0.001～10％、或0.01～10％的生理学上可接受的多元醇，也可优选含有0.02～5％，例如0.03～1％、0.04～0.5％、0.05～0.2％的生理学上可接受的多元醇。或者，本发明的水性悬浮液剂或药物组合物可以含有0.01～10mg/ml、0.05～5mg/ml、或0.1～3mg/ml的生理学上可接受的多元醇。
本发明的水性悬浮液剂或水性药物组合物不含有油性的溶剂。油性的溶剂是指不溶于水、或基本不溶于水的溶剂。
本发明的水性悬浮液剂或水性药物组合物所含有的糖皮质激素化合物为纳米微粒状。该糖皮质激素化合物纳米粒子的平均粒径(dv)在300nm以下，也可以优选为250nm以下、240nm以下、230nm以下、220nm以下、210nm以下、200nm以下、190nm以下、180nm以下、170nm以下、160nm以下、150nm以下、140nm以下、130nm以下、120nm以下、110nm以下。例如，糖皮质激素化合物的平均粒径的范围为50～300nm、50～250nm、50～240nm、50～230nm、50～220nm、50～210nm、50～200nm、50～190nm、50～180nm、50～170nm、50～160nm、50～150nm、50～140nm、50～130nm、50～120nm、50～110nm、100～300nm、100～250nm、100～240nm、100～230nm、100～220nm、100～210nm、100～200nm、100～190nm、100～180nm、100～170nm、100～160nm、100～150nm、100～140nm、100～130nm、100～120nm、或100～110nm。
另外，本发明的水性悬浮液剂或水性药物组合物所含有的糖皮质激素化合物纳米粒子的90％粒径(d90)为450nm以下，优选为400nm以下、350nm以下、300nm以下、290nm以下、280nm以下、270nm以下、260nm以下、250nm以下、240nm以下、230nm以下。例如，糖皮质激素化合物的90％粒径(d90)的范围可以为50～400nm、50～350nm、50～300nm、50～290nm、50～280nm、50～270nm、50～260nm、50～250nm、50～240nm、50～230nm、100～400nm、100～350nm、100～300nm、100～290nm、100～280nm、100～270nm、100～260nm、100～250nm、100～240nm、或100～230nm。
另外，本发明的水性悬浮液剂或水性药物组合物所含有的糖皮质激素化合物纳米粒子的50％粒径(d50)可以为200nm以下，优选为190nm以下、180nm以下、170nm以下、160nm以下、150nm以下、140nm以下、130nm以下、120nm以下、110nm以下、100nm以下。例如，糖皮质激素化合物的50％粒径(d50)的范围可以为50～190nm、50～180nm、50～170nm、50～160nm、50～150nm、50～140nm、50～130nm、50～120nm、50～110nm、50～100nm、80～190nm、80～180nm、80～170nm、80～160nm、80～150nm、80～140nm、80～130nm、80～120nm、80～110nm、或80～100nm。
本发明的水性悬浮液剂或水性药物组合物所含有的糖皮质激素化合物纳米粒子可以是满足选自上述的平均粒径(dv)、90％粒径(d90)及50％粒径(d50)中的两种以上与粒径相关的条件的粒子。另外，例如本发明的水性悬浮液剂所含有的糖皮质激素化合物纳米粒子，其平均粒径(dv)可以为166nm以下，d50可以为138nm以下，和/或d90可以为241nm以下。另外，例如本发明的水性药物组合物所含有的糖皮质激素化合物纳米粒子，其平均粒径(dv)可以为204nm以下，d50可以为177nm以下，和/或d90可以为306nm以下。
本发明的水性悬浮液剂由于作为其有效成分的糖皮质激素化合物为纳米微粒状，因此可以利用过滤器进行灭菌，由此，可以容易地进行对活性成分的物理化学性质影响少的灭菌。
本发明的水性悬浮液剂所含有的糖皮质激素化合物的纳米微粒优选为通过将糖皮质激素化合物、生理学上可接受的盐、生理学上可接受的多元醇以及分散稳定剂进行混合而制造的纳米微粒。更优选本发明的糖皮质激素化合物的纳米微粒为通过将糖皮质激素化合物、生理学上可接受的盐、生理学上可接受的多元醇及分散稳定剂进行混合而制造，且通过在粉碎中或粉碎后添加卵磷脂(例如氢化大豆卵磷脂)而制造的纳米微粒。
作为本发明的水性悬浮液剂的一个例子，可以列举含有糖皮质激素化合物的纳米微粒；氯化钠；氢化大豆卵磷脂；甘油；柠檬酸酐；选自poe-pop二醇类，聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚山梨酯80、pva、poe-pop嵌段共聚物中的一种以上物质；苯扎氯铵、山梨酸或其盐(山梨酸钾、山梨酸钠、山梨酸三氯卡班等)，或对羟基苯甲酸酯(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯等))；羟丙基甲基纤维素和/或甲基纤维素；以及柠檬酸钠(包括柠檬酸三钠)的制剂。
在本说明书中，水性悬浮液剂及药物组合物可以含有水作为主成分。另外，本说明书的药物组合物、水性悬浮液剂和/或稀释剂可以根据需要而含有稳定(化)剂、矫味剂、增粘剂、表面活性剂、防腐剂、杀菌剂或抗菌剂、ph调节剂、等渗剂、缓冲剂等各种添加剂作为添加物。
作为防腐剂、杀菌剂或抗菌剂，可列举例如：山梨酸或其盐(山梨酸钾、山梨酸钠、山梨酸三氯卡班等)、对羟基苯甲酸酯(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯等)、利凡诺、甲紫(methylrosaniliniumchloride)、苯扎氯铵、苄索氯铵、十六烷基氯化吡啶鎓、十六烷基溴化吡啶鎓、氯己定或其盐、聚六亚甲基双胍、烷基多氨基乙基甘氨酸、苄醇、苯乙醇、氯丁醇、异丙醇、乙醇、苯氧基乙醇、载银磷酸锆、汞溴红、聚维酮碘等、硫柳汞、脱氢乙酸、氯二甲苯酚、氯酚、间苯二酚、邻苯基苯酚、异丙基甲基苯酚、麝香草酚、扁柏油酚、磺酰胺、溶菌酶、乳铁蛋白、三氯生、8-羟基喹啉、十一碳烯酸、辛酸、丙酸、苯甲酸、卤卡班(halocarban)、噻苯达唑、多粘菌素b、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、聚赖氨酸、过氧化氢、泊利氯铵、glokill(商品名:例如glokillpq、rhodia公司制)、聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚塞氯铵、聚亚乙基多胺-环氧氯丙烷二甲胺缩聚物(商品名:例如busan1157、bachmann公司制)、双胍化合物(cosmosilcq(商品名、含有约20重量％的聚六亚甲基双胍盐酸盐、apishia公司制))等、及其药理学可接受的盐类等。优选为苯扎氯铵。
作为ph调整剂，可列举例如：无机酸(盐酸、硫酸、磷酸、多聚磷酸、硼酸等)、有机酸(乳酸、乙酸、柠檬酸、柠檬酸酐、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、草酸、葡萄糖酸、富马酸、丙酸、乙酸、天冬氨酸、ε-氨基己酸、谷氨酸、氨基乙基磺酸等)、葡萄糖酸内酯、乙酸铵、无机碱(碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化镁等)、有机碱(单乙醇胺、三乙醇胺、二异丙醇胺、三异丙醇胺、赖氨酸等)、硼砂、及其药理学可接受的盐类等。
作为等渗剂，可列举例如：无机盐类(例如，氯化钠、氯化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、氯化钙、硫酸镁、磷酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、硫代硫酸钠、乙酸钠等)、多元醇类(例如，甘油、丙二醇、乙二醇、1,3-丁二醇等)、糖类(例如，葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇等)等。
作为缓冲剂，可列举例如：tris缓冲剂、硼酸缓冲剂、磷酸缓冲剂、碳酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、乙酸缓冲剂、ε-氨基己酸、天冬氨酸盐等。具体可列举：硼酸或其盐(硼酸钠、四硼酸钾、偏硼酸钾等)、磷酸或其盐(磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾等)、碳酸或其盐(碳酸氢钠、碳酸钠等)、柠檬酸或其盐(柠檬酸钠、柠檬酸钾等)等。
在本说明书中，水性悬浮液剂及药物组合物的粘度可以为1～5mpa·s，例如可以为1～3mpa·s。
在本说明书中，除了特别明示的情况下，组成或含量中的“％”表示重量％(w/w)。
发明的效果
本发明的含有糖皮质激素化合物的纳米微粒的水性悬浮液剂，其澄清性、分散性、保存稳定性、结膜转移性、及房水转移性优异，刺激性低，灭菌容易，经时稳定性和分散稳定性优异，因此可以作为非口服给药用药物组合物、特别是滴眼剂使用。
附图说明
[图1]示出了实施例5(1)～(3)中制作的纳米化滴眼悬浮液在滴眼后的眼房水中的氯倍他索丙酸酯浓度的经时变化的坐标图。纵轴表示眼房水中的氯倍他索丙酸酯浓度(ng/ml)，横轴表示滴眼后的经过时间(分钟)。黑色圆表示0.05％纳米化滴眼悬浮液(平均粒径100nm)，黑色方块表示0.05％纳米化滴眼悬浮液(平均粒径300nm)，黑色三角表示0.05％纳米化滴眼悬浮液(平均粒径600nm)。值表示平均值，误差棒表示标准偏差。
[图2]示出了实施例5(1)～(3)中制作的纳米化滴眼悬浮液在滴眼后的结膜中的氯倍他索丙酸酯浓度的经时变化的坐标图。纵轴表示结膜中的氯倍他索丙酸酯浓度(ng/ml)，横轴表示滴眼后的经过时间(分钟)。黑色圆表示0.05％纳米化滴眼悬浮液(平均粒径100nm)，黑色方块表示0.05％纳米化滴眼悬浮液(平均粒径300nm)，黑色三角表示0.05％纳米化滴眼悬浮液(平均粒径600nm)。值表示平均值，误差棒表示标准偏差。
[图3]示出了实施例7(1)～(4)中制作的纳米化滴眼悬浮液在滴眼后的眼房水中的氯倍他索丙酸酯浓度的经时变化的坐标图。纵轴表示眼房水中的氯倍他索丙酸酯浓度(ng/ml)，横轴表示滴眼后的经过时间(分钟)。白色圆表示0.05％纳米化滴眼悬浮液p(hpmc(60sh-50)3mg/ml)，黑色圆表示0.05％纳米化滴眼悬浮液q(hpmc(60sh-4000)1.5mg/ml)，白色三角表示0.05％纳米化滴眼悬浮液r(mc(sm-100)2mg/ml)，黑色三角表示0.05％纳米化滴眼悬浮液s(mc(sm-4000)1.5mg/ml)。值表示平均值，误差棒表示标准偏差。
[图4]示出了实施例7(1)～(4)中制作的纳米化滴眼悬浮液在滴眼后的结膜中的氯倍他索丙酸酯浓度的经时变化的坐标图。纵轴表示结膜中的氯倍他索丙酸酯浓度(ng/ml)，横轴表示滴眼后的经过时间(分钟)。白色圆表示0.05％纳米化滴眼悬浮液p(hpmc(60sh-50)3mg/ml)，黑色圆表示0.05％纳米化滴眼悬浮液q(hpmc(60sh-4000)1.5mg/ml)，白色三角表示0.05％纳米化滴眼悬浮液r(mc(sm-100)2mg/ml)，黑色三角表示0.05％纳米化滴眼悬浮液s(mc(sm-4000)1.5mg/ml)。值表示平均值，误差棒表示标准偏差。
[图5]示出了兔子bsa诱导葡萄膜炎模型中的外眼部的炎症得分的坐标图。纵轴表示炎症得分，横轴表示自第一次bsa给药后的经过天数(15天后到18天后)。白色框表示对照组(生理盐水)，深灰色表示0.05％纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液给药组，浅灰色表示阳性对象组(0.1％氟米龙滴眼液给药组)。值表示平均值，误差棒表示标准偏差。
[图6]示出了兔子bsa诱导葡萄膜炎模型中的内眼部的炎症得分的坐标图。纵轴表示炎症得分，横轴表示自第一次bsa给药后的经过天数(15天后到18天后)。白色框表示对照组(生理盐水)，深灰色表示0.05％纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液给药组，浅灰色表示阳性对象组(0.1％氟米龙滴眼液给药组)。值表示平均值，误差棒表示标准偏差。
[图7]示出了兔子bsa诱导葡萄膜炎模型中的自第一次bsa给药29天后的外眼部(a)及内眼部(b)的炎症得分的坐标图。纵轴表示炎症得分。白色框表示对照组(生理盐水)，深灰色表示0.05％纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液给药组，浅灰色表示阳性对象组(0.1％氟米龙滴眼液给药组)。值表示平均值，误差棒表示标准偏差。
[图8]示出了大鼠的巴豆诱导结膜炎模型中的结膜重量的坐标图。纵轴表示结膜重量(g)。值表示平均值，误差棒表示标准偏差。
[图9]示出了大鼠的卡拉胶诱导结膜浮肿模型中的眼睑结膜重量的坐标图。纵轴表示眼睑结膜重量(g)。值表示平均值，误差棒表示标准偏差。
[图10]示出了兔子的lps诱导葡萄膜炎模型中的房水中pge2浓度的坐标图。纵轴表示房水中pge2浓度(pg/ml)。值表示平均值，误差棒表示标准偏差。
[图11]示出了兔子的lps诱导葡萄膜炎模型中的玻璃体中pge2浓度的坐标图。纵轴表示玻璃体中pge2浓度(pg/ml)。值表示平均值，误差棒表示标准偏差。
[图12]示出了兔子前房穿刺炎症模型中的房水中的蛋白质浓度的坐标图。纵轴表示前房水中的蛋白质浓度(mg/ml)。值表示平均值，误差棒表示标准偏差。
[图13]示出了兔子lps诱导葡萄膜炎模型中的玻璃体中pge2浓度的坐标图。纵轴表示玻璃体中pge2浓度(pg/ml)。值表示平均值。“b.i.d”表示1天滴眼2次，“q.i.d”表示1天滴眼4次。
具体实施方式
1.含有糖皮质激素化合物的微粒的水性悬浮液剂
糖皮质激素化合物的纳米微粒可以通过将糖皮质激素化合物与生理学上可接受的盐及生理学上可接受的多元醇进行混合，并对上述有机化合物进行湿式粉碎而制造。这样的制造方法详细记载在国际公开wo2008/126797号中。混合只要是使糖皮质激素化合物、生理学上可接受的盐、及生理学上可接受的多元醇最终混合即可，这些成分的添加顺序没有特别地限定。例如，该混合可以通过向糖皮质激素化合物中添加生理学上可接受的盐及生理学上可接受的多元醇来进行，或者向生理学上可接受的盐及生理学上可接受的多元醇中添加糖皮质激素化合物来进行。特别地，本发明的粉体中包含的糖皮质激素化合物微粒可以通过向熔点为80℃以上的有机化合物中添加生理学上可接受的盐及生理学上可接受的多元醇，并对上述有机化合物进行湿式粉碎来制造。在本制造方法中，可以不除去上述盐及上述多元醇而制备水性悬浮液。由此，由于不必须除去上述盐及上述多元醇，因此可以通过非常简单的工序而实现制造。湿式粉碎可以通过将有机化合物、盐及多元醇进行混合并混炼该混合物来进行。优选的是，本发明的糖皮质激素化合物的微粒可以通过在进行粉碎的工序中或该工序后添加卵磷脂来制造。
糖皮质激素化合物纳米微粒优选不使用硬质的固体粉碎助剂而通过湿式粉碎来制造，更优选不使用玻璃制、不锈钢等金属制、氧化锆及氧化铝等陶瓷制或硬质聚乙烯等高分子制的固体粉碎助剂而通过湿式粉碎来制造，最优选本发明的糖皮质激素化合物微粒通过不使用除上述生理学上可接受的盐及粘度调节剂之外的固体粉碎助剂而进行湿式粉碎来制造。
在本说明书中，“生理学上可接受的”是指，被认为能够以生理学上不产生特别问题的方式摄取，某一物质是否为生理学上可接受的物质，可根据作为摄取对象的生物种类、摄取的形式等来适当地确定。作为生理学上可接受的溶剂，可列举例如作为药物、食品等的添加剂、溶剂等被认可的物质等。
本说明书中的“生理学上可接受的盐”只要是能够以生理学上不产生特别问题的方式进行摄取的盐即可，没有特别地限定。作为生理学上可接受的盐，优选为相对于多元醇的溶解性低的盐、相对于水的溶解性高的盐和/或吸湿性少且具有适于有机化合物的微粉碎化的硬度的盐。作为能够用于糖皮质激素化合物的纳米微粒的制造方法中的生理学上可接受的盐，更优选为具备这些性质中的2种以上的盐。生理学上可接受的盐在多元醇中的溶解度优选为10(质量/容量)％以下。另外，欲使粉碎后的除去简便的情况下，作为生理学上可接受的盐，优选为相对于水的溶解性高的盐。具体可以列举上述的盐。
本说明书中的”生理学上可接受的盐”优选在与糖皮质激素化合物进行混合之前进行粉碎等而预先调整其粒径。另外，根据需要，出于防止由含有水分导致的粒子粘合及粒子生长的目的，也可以在例如30～200℃的温度下进行减压干燥，从而使水分含量降低。在预先调整生理学上可接受的盐的粒径的情况下，作为粒子的体积平均粒径，可以例如为5～300μm、10～200μm，优选为0.01～300μm，更优选为0.1～100μm，进一步优选为0.5～50μm，最优选为1～5μm。另外，该盐的使用量相对于糖皮质激素化合物，优选为1～100倍质量，更优选为5～30倍质量，进一步优选为10～20倍。进一步，该盐可以使用1种盐，也可以将2种以上盐混合使用。
糖皮质激素化合物的纳米微粒的制造方法中使用的“生理学上可接受的多元醇”只要是能够以生理学上不产生特别问题的方式进行摄取的多元醇即可，没有特别地限定。作为生理学上可接受的多元醇，优选盐的溶解性低的物质、在水中的溶解性高的物质、凝固点低的物质、和/或燃点高的物质。另外，欲简便地进行粉碎后的除去的情况下，生理学上可接受的多元醇优选在水中的溶解性高的物质。
糖皮质激素化合物的纳米微粒的制造方法中使用的多元醇优选为粘度高的多元醇。作为这样的多元醇的20℃下的粘度，例如为40mpa·s以上，优选为50mpa·s以上，更优选为80mpa·s以上。作为糖皮质激素化合物的纳米微粒的制造方法中使用的多元醇的20℃下的粘度，其上限没有特别地限定，例如可以从40mpa·s以上且5000mpa·s以下的范围中选择，优选为50mpa·s以上且3000mpa·s以下，更优选为80mpa·s以上且2000mpa·s以下。具体可列举上述的多元醇。
糖皮质激素化合物的纳米微粒的制造方法中的生理学上可接受的多元醇的使用量相对于作为微粉碎化的对象的有机化合物，优选为0.5～100倍质量，更优选为1～10倍质量。另外，使用的多元醇的种类可以考虑作为微粉碎化的对象的有机化合物的溶解性而适当地确定。进一步，该多元醇可以使用1种多元醇，也可以混合2种以上的多元醇使用。
在糖皮质激素化合物的纳米微粒的制造方法中，糖皮质激素化合物、多元醇及盐的混炼物优选粘度高。作为提高混炼物的粘度的方法，优选使用向多元醇中添加粘度调节剂而成的混合物的方法、或独立于多元醇而单独添加粘度调节剂的方法，可以有效地提高粉碎效率。作为向多元醇中添加的粘度调节剂，可以使用上述物质。作为添加了这样的粘度调节剂的多元醇的20℃下的粘度，优选为1000mpa·s以上，更优选为2000mpa·s以上，更优选为5000mpa·s以上，最优选为10000mpa·s以上。作为本发明的添加了粘度调节剂的多元醇的20℃下的粘度，其上限没有特别地限定，但例如可以从1000mpa·s以上且5000000mpa·s以下的范围中选择，优选为1000mpa·s以上且1000000mpa·s以下，更优选为2000mpa·s以上且500000mpa·s以下，更优选为5000mpa·s以上且300000mpa·s以下，最优选为10000mpa·s以上且100000mpa·s以下。
在糖皮质激素化合物的纳米微粒的制造方法中，就用于对糖皮质激素化合物进行湿式粉碎的粉碎装置而言，只要是具有能够通过机械方式进行糖皮质激素化合物、盐、多元醇、和/或分散稳定剂的混炼/分散的能力的装置即可，没有特别地限制。作为该粉碎装置，可列举例如：捏合机、双辊磨机、三辊磨机、轮碾机、胡佛研磨机(hoovermuller)、圆盘叶片混炼分散机等通常使用的粉碎装置。
粉碎温度可以考虑经微粉碎化的糖皮质激素化合物、粉碎装置等来适当地确定。作为粉碎温度，没有特别地限制，但优选为-50～50℃，更优选为-20～30℃，最优选为-10～25℃。另外，粉碎时间可以考虑经微粉碎化的有机化合物、粉碎装置等来适当地确定。粉碎时间可以为例如1～50小时，2～30小时，3～20小时，4～18小时，5～10小时。
糖皮质激素化合物的粉碎结束后，可以不除去用于粉碎的盐及多元醇而获得目标的微粉碎化糖皮质激素化合物微粒。由此，由于不需要清洗工序，可以更简单且廉价地制造纳米粒子制剂。由此，可以通过在溶剂中利用均化器等使糖皮质激素化合物、盐、多元醇和/或粘度调节剂的混合物均匀化来制造。作为使该混合物均匀化时使用的溶剂，只要是能够容易地溶解多元醇、盐及粘度调节剂，且难以溶解经微粉碎的糖皮质激素化合物，且为生理学上可接受的溶剂即可，没有特别地限定。该溶剂优选为水，但也可以使用水之外的溶剂。作为该水之外的溶剂，包括例如乙酸、甲醇、乙醇等有机溶剂与水的混合液。另外，根据需要，可以对经过均匀化后的混合物进行过滤。过滤方法没有特别地限定，可以利用通常用于过滤有机化合物的含有物的公知的方法来进行。作为该过滤方法，包括例如减压过滤法、加压过滤法、超滤膜法等。
微粉碎化粒子由于通常具有高表面能，因此容易凝聚。因此，在除去了盐等之后，为了防止二次凝聚，可以添加上述抗凝聚剂。抗凝聚剂可以使用1种，也可以混合使用2种以上。
在将盐及多元醇除去之后，通过进行干燥处理，可以从得到的微粉碎化糖皮质激素化合物微粒中除去用于盐等的除去的溶剂。该干燥方法没有特殊限定，可以利用通常用于干燥有机化合物的方法来进行。作为该干燥方法，包括例如减压干燥法、冷冻干燥法、喷雾干燥法、冷冻喷雾干燥法等。该干燥中的干燥温度、干燥时间等并无特殊限制，但为了保持医疗用有机化合物粒子的化学稳定性以及防止粒子的二次凝聚，优选在低温下进行该干燥，优选利用冷冻干燥法、喷雾干燥法、冷冻喷雾干燥法进行。
作为通过糖皮质激素化合物的制造方法得到的微粉碎化糖皮质激素化合物微粒的平均粒径的范围，可以为与上述本发明的水性悬浮液剂或水性药物组合物所含有的糖皮质激素化合物纳米粒子的平均粒径相同的范围。另外，通过糖皮质激素化合物的制造方法得到的微粉碎化糖皮质激素化合物微粒的90％粒径(d90)及50％粒径(d50)的范围也与上述本发明的水性悬浮液剂或水性药物组合物所含有的糖皮质激素化合物纳米粒子各自的90％粒径(d90)及50％粒径(d50)相同。
本说明书中的“平均粒径”或“dv”是指，利用动态光散射光子相关法而测定的粒度分布中的算术平均直径。50％粒径(也称为中值粒径、d50)是指，在利用上述测定法测定的粒度分布中，在将粉体自某一粒径起分为2部分时，大粒径一侧与小粒径一侧达到等量的粒径。“90％粒径”是指，在利用上述测定法测定的粒度分布中，自粒径小的一侧起依次从0(最小)到100％(最大)进行计数时，位于90％的位置处的粒径(d90)。“10％粒径”是指，在利用上述测定法测定的粒度分布中，自粒径小的一侧起依次从0(最小)到100％(最大)进行计数时，位于10％的位置处的粒径(d10)。关于基于动态光散射光子相关法的测定方法、以及粒度分布的计算方法，在本技术领域中是被广泛公知的。
2.药物组合物
另外，本发明涉及以含有糖皮质激素化合物的纳米微粒为特征的药物组合物。优选本发明的药物组合物为非口服给药用药物组合物，例如，可以使本发明的药物组合物为注射剂或局部适用制剂。在本说明书中，对于药物组合物的种类没有特别地限制，作为剂型，可列举：眼用局部适用制剂(例如，滴眼剂)、耳用局部适用制剂(例如，滴耳剂)、鼻用局部适用制剂(例如，滴鼻剂)、悬浮液剂、软膏、乳霜剂、凝胶剂、吸入剂、注射剂(例如，静脉注射用注射剂、皮下给药用注射剂、肌肉注射用注射剂、点滴)等。这些制剂可以按照常规方法制备。优选本发明的药物组合物含有分散稳定剂。对于注射剂的情况而言，可以使本发明的大环内酯类抗菌剂的纳米微粒悬浮于水中来制备，但也可以根据需要而使其悬浮于生理盐水或葡萄糖溶液中，另外，还可以添加分散剂、缓冲剂、保存剂。本发明的药物组合物例如可以制备成静脉内给药用、肌肉内给药用、或皮下给药用等的注射剂、点滴剂、经皮吸收剂、经粘膜吸收剂、滴眼剂、滴耳剂、滴鼻剂、吸入剂等形态的非口服给药用药物组合物。
本发明的药物组合物也可以含有药理学可接受的载体(制剂用添加物)。对于用于药物组合物的制造的制剂用添加物的种类、相对于有效成分的制剂用添加物的比例、或药物组合物的制造方法，本领域技术人员可根据组合物的形态而适当选择。作为制剂用添加物，可使用无机或有机物质、或固体或液体的物质，一般而言，可以以相对于有效成分重量为1重量％～90重量％的范围配合。具体而言，作为这样的物质的例子，可列举：乳糖、葡萄糖、甘露糖醇、糊精、环糊精、淀粉、蔗糖、硅酸铝镁、合成硅酸铝、羧甲基纤维素钠、羟丙基淀粉、羧甲基纤维素钙、离子交换树脂、甲基纤维素、明胶、阿拉伯树胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、pva、轻质无水硅酸、硬脂酸镁、滑石、黄蓍树胶、膨润土、硅酸镁铝、氧化钛、山梨糖醇酐脂肪酸酯、月桂基硫酸钠、甘油、脂肪酸甘油酯、精制羊毛脂、甘油明胶、聚山梨酯、聚乙二醇、植物油、蜡、液体石蜡、白色凡士林、碳氟化合物、非离子型表面活性剂、丙二醇、水、苯扎氯铵、盐酸、氯化钠、氢氧化钠、乳酸、钠、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、柠檬酸钠、乙二胺四乙酸二钠、poloxamer407、聚卡波菲等。例如，本发明的药物组合物含有选自poe-pop二醇、pva、羟丙基甲基纤维素及甲基纤维素中的1种以上制剂用添加物。
本发明的水性悬浮液剂或药物组合物可以以试剂盒的形态与外罩、容器、稀释剂、浊液剂、和/或关于制备方法/给药方法的说明书共同包含。在本发明的水性悬浮液剂或药物组合物制成试剂盒的形式供给的情况下，可以使该水性悬浮液剂或药物组合物中的不同构成成分分别包装在不同的容器中并使它们包含在一个试剂盒中，或者，也可以仅使该水性悬浮液剂或药物组合物中的一种以上的部分构成成分(至少包含糖皮质激素化合物的纳米微粒)包含在试剂盒中、而将其它构成成分与试剂盒相区别地提供。另外，在本发明的水性悬浮液剂或药物组合物制成试剂盒的形式供给的情况下，由于会得到本发明的水性悬浮液剂或药物组合物，因此优选在即将使用之前混合必要的构成成分。
例如，可以使本发明的试剂盒为以下的试剂盒：
(a)一种用于制备药物组合物的试剂盒，所述药物组合物具备含有糖皮质激素化合物的纳米微粒的水性悬浮液剂；
(b)(a)所述的试剂盒，其还含有分散稳定剂；
(c)(b)所述的试剂盒，其中，上述分散稳定剂为选自poe-pop二醇、pva、羟丙基甲基纤维素及甲基纤维素中的一种以上物质；
(d)(a)～(c)中任一项所述的试剂盒，其为用于制备非口服给药用药物组合物的试剂盒；
(e)(a)～(d)中任一项所述的试剂盒，其为用于制备注射剂或局部适用制剂的试剂盒。
(f)(e)所述的试剂盒，其为用于制备眼用局部适用制剂、耳用局部适用制剂、鼻用局部适用制剂或肺用局部适用制剂，或者滴眼剂、滴耳剂、滴鼻剂、或吸入剂的试剂盒。
(g)(a)～(f)中任一项所述的试剂盒，其中，药物组合物为眼、耳、鼻或肺的炎症性疾病或感染性疾病的治疗药或预防药。
在一实施方式中，本发明也可以是含有糖皮质激素化合物的纳米微粒的水性药物组合物的制备方法，其包括：将含有糖皮质激素化合物的纳米微粒的水性悬浮液剂和稀释剂进行混合。
在制备本发明的药物组合物(例如，注射剂、眼用局部适用制剂(优选为滴眼剂)、耳用局部适用制剂(优选为滴耳剂)、鼻用局部适用制剂(优选为滴鼻剂)或肺用局部适用制剂(优选为吸入剂))的情况下，关于其ph及浸透压，以作为局部适用制剂可接受为限度，没有特殊限制，但优选为ph5～9.5、更优选为ph6～9、进一步优选为ph7～9。作为该制剂(软膏剂以外的情况)的相对于生理盐水的浸透压比，例如为0.3～4.3、优选为0.3～2.2、特别优选为0.5～1.5左右。ph、浸透压的调节可使用ph调整剂、等渗剂、盐类等，利用在本技术领域中公知的方法进行。
本发明的药物组合物的制备可以适当地利用公知的方法来进行，例如可以如下地制造：在蒸馏水或纯净水等适当的稀释剂中，将含有糖皮质激素化合物的纳米微粒的水性悬浮液剂与任意的配合成分混合，调整至上上述的浸透压及ph，并在无菌环境中进行高压蒸汽灭菌或过滤灭菌处理，从而将其无菌填充至经过洗涤灭菌后的容器中。
本发明的药物组合物可以制成炎症性疾病或感染性疾病的治疗药或预防药。例如，可以使本发明的药物组合物用于由感染引起的炎症性疾病或感染性疾病的治疗或预防。由此，本发明包含用于作为药物(炎症性疾病或感染性疾病的治疗药或预防药)使用的含有糖皮质激素化合物的纳米微粒和分散稳定剂的水性悬浮液剂。
在本说明书中，炎症性疾病或感染性疾病包括全身性的炎症性疾病及感染性疾病、以及局部性的炎症性疾病或感染性疾病。炎症性疾病中，除了由感染引起的炎症性疾病以外，还包括过敏性的炎症性疾病(例如，过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、过敏性皮肤炎、过敏性湿疹、过敏性哮喘、过敏性肺炎)。作为全身性的炎症性疾病，可列举：浅层/深层皮肤感染症、淋巴管/淋巴节炎、乳腺炎、骨髓炎、扁桃体炎、肺炎、肾盂肾炎、尿道炎、淋菌感染症、梅毒、子宫内感染、猩红热、白喉、百日咳、外伤/灼伤及手术等的二次感染、咽/喉炎、支气管炎、慢性呼吸道病变的二次感染、冠周炎、牙周组织炎、破伤风、膀胱炎、前列腺炎、感染性肠炎、颌骨炎、感染性关节炎、胃炎等全身的炎症性疾病或感染性疾病。
具体而言，可以将本发明的药物组合物用于治疗或预防眼的炎症性疾病及感染性疾病以及这些疾病所附带的多种症状。作为眼的炎症性疾病及感染性疾病，可列举例如：包含眼睑炎、眼睑结膜炎、睑板腺炎、急性或慢性麦粒肿、霰粒肿、泪囊炎、泪腺炎及酒渣性痤疮的眼睑的症状；包含结膜炎、新生儿眼炎及沙眼的结膜的症状；包含角膜溃疡、浅层角膜炎及间质性角膜炎、角膜结膜炎、异物及术后感染症的角膜的症状；以及包含眼内炎、感染性葡萄膜炎及术后感染症的眼前房及葡萄膜的症状。作为感染症的预防，包括在手术等外科处置前、在与表现出感染性症状者接触前进行给药。在用于预防的情况下，例如可以在下述处置或手术之前给药：眼睑成形术、霰粒肿的摘除、睑板缝合术、用于泪小管或泪管排液系统的手术、以及与眼睑和泪器相关的其它外科处置这样的外科处置；包含翼状胬肉、睑裂斑及肿瘤的摘除、结膜移植、割伤、灼伤及擦伤这样的外伤性的伤、及结膜遮盖术的结膜的手术；包含异物的除去、角膜切开术及角膜移植的角膜的手术；包含光折射率处置的折射率手术；包含滤泡的过滤的青光眼手术；眼前房的穿刺；虹膜切除术；白内障手术；视网膜手术；以及与眼外肌相关的手术。另外，新生儿眼炎的预防也包括在本说明书的预防中。
例如，可以将本发明的药物组合物用于耳的炎症性疾病或感染性疾病所附带的多种症状的治疗或预防。作为耳的炎症性疾病或感染性疾病，可列举例如中耳炎或外耳炎。所述感染症的预防，包括手术前的处置、以及存在感染可能性的状态(例如，与疑似感染的人或已经感染的人接触)之前的处置。作为预防性情况的例子，可列举伴随耳的外伤或损伤的外科性处置及其它手术或处置之前的治疗。
另外，可以将本发明的药物组合物用于治疗或预防鼻的炎症性疾病或感染性疾病所附带的多种症状。需要说明的是，在整个本说明书中，“鼻的炎症性疾病或感染性疾病”、及“鼻用局部适用制剂”的用语中的“鼻”表示的是包含整个上呼吸道的含义，例如包含鼻腔、鼻咽、咽及喉。作为鼻的炎症性疾病或感染性疾病，可列举例如鼻窦炎、过敏性鼻炎、及鼻炎。
另外，可以将本发明的药物组合物用于肺的炎症性疾病或感染性疾病所附带的多种症状的治疗或预防。需要说明的是，在整个本说明书中，“肺的炎症性疾病或感染性疾病”及“肺用局部适用制剂”的用语中的“肺”表示的是包含整个下呼吸道的含义，例如包含气管、支气管、细支气管及肺。作为肺的炎症性疾病或感染性疾病，可列举例如肺炎、支气管炎、过敏性肺炎、及哮喘等。
本发明的药物组合物更优选用于由多种细菌或寄生虫引起的感染性疾病(例如，眼、耳、鼻或肺的感染性疾病)的治疗或预防。作为这样的微生物，可列举例如：包含金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌的葡萄球菌属；包含肺炎链球菌及酿脓链球菌以及c、f及g组的链球菌及草绿色链球菌的链球菌属；包含生物型iii的流感杆菌；软下疳菌；卡他莫拉菌(moraxellacatarrhalis)；包含淋菌及脑膜炎菌的奈瑟菌属；包含沙眼披衣菌(chlamydiatrachomatis)、鹦鹉披衣菌(chlamydiapsittaci)及肺炎披衣菌(chlamydiapneumoniae)的披衣菌属；包含人结核杆菌及鸟结核杆菌细胞内复合体以及包含海洋分枝杆菌(mycobacteriummarinamu)、两栖分枝杆菌(mycobacteriumforutsuitsumu)及龟结核杆菌的非典型分枝杆菌的分枝杆菌属；百日咳菌；空肠弯曲菌(campylobacterjejuni)；嗜肺军团菌(legionellapneumophila)；双道类杆菌(bacteroidesbivius)；产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)；消化链球菌(peptostreptococcus)属；伯氏疏螺旋体(borreliaburgdorferi)；肺炎支原体；梅毒螺旋体；尿浆菌(ureaplasmaurealyticum)；弓形体属；疟疾；以及孢子虫(nosema)。
3.治疗方法/预防方法
本发明的药物组合物通过向需要其的患者进行有效量的给药，可以用于炎症性疾病或感染性疾病的治疗或预防。因此，本发明涉及炎症性疾病或感染性疾病的治疗方法或预防方法，其包括：将包含含有糖皮质激素化合物的纳米微粒(及分散稳定剂)的水性悬浮液剂的药物组合物向需要该医药组合物的患者进行有效量的给药。这里，成为对象的患者是指被分类为哺乳类的任意动物，但并不限定于此。作为例子，包括人；狗、猫、兔等宠物；牛、猪、羊、马等家畜动物，优选为人
本发明的药物组合物的给药量及给药次数没有特殊限制，可根据治疗对象疾病的恶化/进展的防止和/或治疗的目的、疾病的种类、患者的体重、年龄等条件、基于医生的判断而适当选择。一般而言，成人每日的给药量为0.01～1000mg(有效成分重量)左右，一天可给药1次或数次。给药路径为注射或局部给药，可列举例如静脉注射、肌肉内注射、或皮下注射、点滴、滴眼、滴耳、滴鼻、经皮、经粘膜、吸入等。另外，例如本发明的药物组合物中的有效成分的含量可以为0.001％～10％、0.01％～1％或0.05％～0.1％。
本发明的医药组合物为注射剂的情况下，对于成人，可以按照一天量0.001～100mg(有效成分重量)进行连续给药或间歇给药。
在本发明的水性药物组合物为局部给药用的情况下，可对患部、患部的周边部或包含患部的脏器等的局部直接给药。例如，可以将本发明的药物组合物制成眼用局部适用制剂、耳用局部适用制剂、鼻用局部适用制剂、或肺用局部适用制剂。在本发明的药物组合物为局部给药用制剂的情况下，可以日常地适用，也可以在局部的炎症性疾病或感染性疾病发病之后适用任意的次数。另外，适用量可根据症状等适当设定，通常每天滴眼1～6次左右，例如，每天滴眼1次、2次、3次、4次、5次或6次，一次使用1～3滴左右。另外，给药期间可以为直到症状充分消除为止的任意期间，可以为例如2周～1年。
以下，结合实施例对本发明进行更为详细的说明，但其并不限定本发明的范围。需要说明的是，本申请说明书整体中引用的文献通过参照而将其整体援引至本申请说明书中。
(实施例1)氯倍他索丙酸酯的粉碎方法的研究
为了研究在氯倍他索丙酸酯的粉碎中添加柠檬酸酐及氢化大豆卵磷脂的影响，进行以下(1)～(9)的粉碎，并对得到的粒子的平均粒径(dv)、中心粒径(d50)及90％粒径(d90)使用粒度分布测定装置(delsananos，beckmancoulter公司制造)进行了测定。
(1)柠檬酸酐及氢化大豆卵磷脂无添加条件下的粉碎
向水冷式1.0l立式捏合机(井上制作所)中进料平均粒径38390nm的氯倍他索丙酸酯(熔点：193～200℃，东京化成制造)10g及氯化钠(tomitasaltk-30，富田制药制造)110g，混合至均匀后，投入甘油(sigma-aldrich公司制造)17g而使内容物保持为捏合粉(こね粉)状，于5℃进行了6小时粉碎。然后，将得到的粉碎混炼物(面团)0.1g、作为分散剂的0.1％poe-pop二醇(unirube70dp-950b，日本油脂制)5g称取到50ml螺纹管中，使用超声波装置(modelvs-100iii，asone公司制造)分散至均匀，添加纯净水45g而得到悬浮液50g。使用粒度分布测定装置(delsananos，beckmancoulter公司制造)测定得到的悬浮液的粒度分布的结果，氯倍他索丙酸酯的粒度分布为：平均粒径(dv)285nm、中心粒径(d50)231nm、90％粒径(d90)433nm。
(2)柠檬酸酐添加条件下的粉碎
除了追加柠檬酸酐(纯正化学公司制造)0.8g之外，在与实施例1(1)同样的条件下，在5℃进行了7小时粉碎。然后，与实施例1同样地进行粉碎混炼物(面团)的分散处理并测定了氯倍他索丙酸酯的粒度分布的结果为：平均粒径(dv)260nm、中心粒径(d50)222nm、90％粒径(d90)363nm。
(3)氢化大豆卵磷脂添加条件下的粉碎
除了追加氢化大豆卵磷脂(phospholipon90h，lipoid公司制造)10g之外，在与实施例1(1)同样的条件下，进行了粉碎和其后的分散处理。其结果，氯倍他索丙酸酯的粒度分布为：平均粒径(dv)147nm、中心粒径(d50)124nm、90％粒径(d90)210nm。
(4)柠檬酸酐及氢化大豆卵磷脂添加条件下的粉碎1
除了追加柠檬酸酐(纯正化学公司制造)0.8g和氢化大豆卵磷脂(phospholipon90h，lipoid公司制造)5g之外，在与实施例1(1)同样的条件下，进行了粉碎和其后的分散处理。其结果，氯倍他索丙酸酯的粒度分布为：平均粒径(dv)166nm、中心粒径(d50)138nm、90％粒径(d90)241nm。
(5)柠檬酸酐及氢化大豆卵磷脂添加条件下的粉碎2
除了追加柠檬酸酐(纯正化学制造)0.8g和氢化大豆卵磷脂(phospholipon90h，lipoid公司制造)10g之外，在与实施例1(1)同样的条件下，在5℃进行了7小时粉碎。然后，与实施例1同样地进行粉碎混炼物(面团)的分散处理并测定了氯倍他索丙酸酯的粒度分布的结果为：平均粒径(dv)101nm、中心粒径(d50)87nm、90％粒径(d90)141nm。
(6)柠檬酸酐及氢化大豆卵磷脂添加条件下的粉碎3
除了追加柠檬酸酐(纯正化学公司制造)0.8g和氢化大豆卵磷脂(phospholipon90h，lipoid公司制造制)20g之外，在与实施例1(1)同样的条件下，在5℃进行了7小时粉碎。然后，与实施例1同样地进行粉碎混炼物(面团)的分散处理并测定了氯倍他索丙酸酯的粒度分布的结果为：平均粒径(dv)144nm、中心粒径(d50)121nm、90％粒径(d90)214nm。
(7)柠檬酸酐及氢化大豆卵磷脂添加条件下的粉碎4
除了追加柠檬酸酐(纯正化学公司制造)2g和氢化大豆卵磷脂(phospholipon90h，lipoid公司制造制)5g之外，在与实施例1(1)同样的条件下，在5℃进行了7小时粉碎。然后，将得到的粉碎混炼物(面团)0.1g、作为分散剂的0.01％poe-pop二醇(unirube70dp-950b，日本油脂制)5g称取到50ml螺纹管中，使用超声波装置(modelvs-100iii，asone公司制造)分散至均匀，添加纯净水15g而得到悬浮液20g。使用粒度分布测定装置(delsananos，beckmancoulter公司制造)测定得到的悬浮液的粒度分布的结果，氯倍他索丙酸酯的粒度分布为：平均粒径(dv)137nm、中心粒径(d50)112nm、90％粒径(d90)209nm。
(8)柠檬酸酐及氢化大豆卵磷脂添加条件下的粉碎5
除了追加柠檬酸酐(纯正化学公司制造)2g和氢化大豆卵磷脂(phospholipon90h，lipoid公司制造制)10g之外，在与实施例1(1)同样的条件下，在5℃进行了6小时粉碎。然后，将得到的粉碎混炼物(面团)0.1g进行与实施例1(1)同样的分散处理并测定得到的悬浮液的粒度分布的结果，氯倍他索丙酸酯的粒度分布为：平均粒径(dv)129nm、中心粒径(d50)112nm、90％粒径(d90)179nm。
(9)柠檬酸酐及氢化大豆卵磷脂添加条件下的粉碎6
除了追加柠檬酸酐(纯正化学公司制造)2g和氢化大豆卵磷脂(phospholipon90h，lipoid公司制造制)20g之外，在与实施例1(1)同样的条件下，在5℃进行了7小时粉碎。然后，将得到的粉碎混炼物(面团)0.1g进行与实施例1(1)同样的分散处理并测定得到的悬浮液的粒度分布的结果，氯倍他索丙酸酯的粒度分布为：平均粒径(dv)147nm、中心粒径(d50)121nm、90％粒径(d90)228nm。
(1)～(9)的粉碎条件及粉碎的结果得到的粒径如表1所示。从本实验的结果可知，(5)的粉碎配方显示出最良好的粉碎性能。
[表1]
(实施例2)氯倍他索丙酸酯的制剂化研究
(1)分散剂的研究
称量实施例1(4)中得到的粉碎混炼物(面团)0.1g和表2所记载的各分散剂的水溶液5g到50ml螺纹管中，使用超声波装置(modelvs-100iii，asone公司制造)分散至均匀，添加纯净水45g而得到悬浮液50g。将得到的各分散液在室温(约25℃)保存1天，通过目测观察刚刚分散后与经过1天后的各分散液的澄清性和有无沉淀，对分散液的稳定性进行了评价。
结果如表2所示。在表2中，保存稳定性的评价中记载的符号表示以下含义。○：稳定性良好；△：刚刚分散后稳定，但随着时间的经过而生成沉淀；×：刚刚制备后具有混浊感，不稳定。如表2所示，从本实验的结果可知，在作为分散剂使用了poe-pop二醇(pronon407p、pluronicf68、unirube70dp-950b)及pva(kuraraypoval217c)的情况下，不仅刚刚分散后，在经过1天后也没有观察到沉淀的生成，保持澄清性，稳定性良好。
[表2]
(2)增粘剂的研究
称量实施例1(4)中得到的粉碎混炼物(面团)0.1g和0.1％pluronicf68/0.01％tween80(1:1)混合水溶液7.3g到50ml螺纹管，使用超声波均化器(sonicators-4000，chip418号，输出30，astrason公司制造)，3分钟，分散至均匀后，添加如表3所示的各增粘剂的水溶液1.5g，进一步添加纯净水13.5g而得到分散液22.4g。需要说明的是，各增粘剂的最终浓度如表3所示。将得到的各分散液在室温(约25℃)保存4天，通过目测观察各分散液的澄清性和有无沉淀，对稳定性进行了评价。
结果如表3所示。在表3中，保存稳定性的评价中记载的符号表示以下含义。○：稳定性良好；δ：观察到若干沉淀、稳定性低；×：观察到完全沉淀、不稳定。如表3所示，从本实验的结果可知，在作为增粘剂使用了羟丙基甲基纤维素和甲基纤维素的情况下，不仅刚刚分散后，在经过4天后也没有观察到沉淀的生成，保持澄清性，稳定性良好。
[表3]
(3)防腐剂的研究1
称量实施例1(4)中得到的粉碎混炼物(面团)0.1g和0.1％pluronicf68/0.01％tween80(1:1)混合水溶液7.3g以及1％kuraraypoval217c水溶液1.43g至50ml螺纹管，使用超声波均化器(sonicators-4000，chip418号，输出30，astrason公司制造)，7分钟，分散至均匀后，添加0.01％苯扎氯铵水溶液1.43g和3％tc-5(r)水溶液1.43g，边搅拌边缓慢添加100mm柠檬酸钠水溶液而调整至ph7.0，进一步添加纯净水而制成了滴眼剂14.6g。将得到的滴眼剂在5℃-25℃的循环及40℃下保持7天，通过目测观察该滴眼剂的澄清性，评价了稳定性。
实施例2(3)的结果如表4所示。表4中的保存温度的“循环(5℃-25℃)”是指，将在5℃保存6小时后在25℃保存6小时的操作重复进行。如表4所示，根据本实验的结果可知，使用苯扎氯铵作为防腐剂制备的滴眼剂不仅在刚刚制备后，在经过7天后也可以保持澄清性，稳定性良好。
[表4]
(实施例3)过滤灭菌的研究
(1)滴眼剂的制备1
向1l的烧杯中添加实施例1(5)中得到的粉碎混炼物(面团)6.0g、0.01％unirube70dp-950b水溶液408g及1.0％kuraraypoval217c水溶液81.6g，使用超声波装置(modelvs-100iii，asone公司制造)进行粗分散后，利用高压均化器(l01-yh1，90mpa×5path，sanwaengineeringcompany公司制造)分散至均匀。进一步添加0.1％苯扎氯铵水溶液7.48g和3％tc-5(r)水溶液7.48g，进行了5分钟搅拌后，添加100mm柠檬酸钠水溶液使ph达到7.0，然后，边搅拌边添加纯净水使总量为748g。使用粒度分布测定装置(delsananos，beckmancoulter公司制造)测定得到的滴眼剂的粒度分布的结果：平均粒径(dv)173nm、中心粒径(d50)151nm、90％粒径(d90)233nm。
(2)滴眼剂的制备2
向1l的烧杯中添加实施例1(7)中得到的粉碎混炼物(面团)6.0g、0.01％unirube70dp-950b水溶液414g和1.0％kuraraypoval217c水溶液82.8g，使用超声波装置(modelvs-100iii，asone公司制造)进行粗分散后，利用高压均化器(l01-yh1，90mpa×5path，sanwaengineeringcompany公司制造)分散至均匀。进一步添加0.1％苯扎氯铵水溶液7.5g和3％tc-5(r)水溶液7.5g，进行了5分钟搅拌后，添加100mm柠檬酸钠水溶液使ph达到7.0，然后，边搅拌边添加纯净水使总量为750g。使用粒度分布测定装置(delsananos，beckmancoulter公司制造)测定得到的滴眼剂的粒度分布的结果：平均粒径(dv)201nm、中心粒径(d50)177nm、90％粒径(d90)260nm。
(3)滴眼剂的制备3
向1l的烧杯中添加实施例1(8)中得到的粉碎混炼物(面团)6.29g、0.01％unirube70dp-950b水溶液415g和1.0％kuraraypoval217c水溶液83.0g，使用超声波装置(modelvs-100iii，asone公司制造)进行粗分散后，利用高压均化器(l01-yh1，90mpa×5path，sanwaengineeringcompany公司制造)分散至均匀。进一步添加0.1％苯扎氯铵水溶液7.84g和3％tc-5(r)水溶液7.84g，进行了5分钟搅拌后，添加100mm柠檬酸钠水溶液使ph达到7.0，然后，边搅拌边添加纯净水使总量为784g。使用粒度分布测定装置(delsananos，beckmancoulter公司制造)测定得到的滴眼剂的粒度分布的结果：平均粒径(dv)204nm、中心粒径(d50)166nm、90％粒径(d90)306nm。
(4)过滤器过滤透过性的研究
针对实施例3(1)～(3)制备的各滴眼剂，使用millipore公司制造的两种过滤器过滤膜(optiscale25和optiscale25capsule)进行了过滤器过滤透过性的研究。过滤条件如下所示。
过滤器名称：
optiscale25(预过滤器0.5μm/主过滤器0.22μm)
optiscale25capsule(预过滤器0.2μm/主过滤器0.22μm)
过滤器材质：聚偏氟乙烯(pvdf)
有效过滤面积：3.5cm2
试验压力：0.18mpa
就试验的方法而言，测定经时的滴眼剂的透过流量，在过滤器完全堵塞为止不进行过滤，利用能够预测过滤器的最大处理量的vmax法实施了试验。
结果如表5所示。表5中的透过量示出的是将各滴眼剂通过了过滤器的量换算成l/m2而得到的值。另外，就透过率而言，利用hplc测定过滤器过滤前后的氯倍他索丙酸酯的浓度，将过滤后的浓度相对于过滤前的浓度以百分率表示。根据表5所示的结果可知，对于任意粒径均能够实现过滤器过滤灭菌。粉碎后的倍他索丙酸酯的粒径最小的实施例3(1)中制备的滴眼剂，其透过量和透过率两者均显示出较高的值。
[表5]
(实施例4)氯倍他索丙酸酯的粉碎
(1)平均粒径100～150nm的纳米粒子的制作
向水冷式1.0l立式捏合机(井上制作所)中进料平均粒径38390nm的氯倍他索丙酸酯(熔点：193～200℃，东京化成制造)10g、氯化钠(tomitasaltk-30，富田制药制造)110g、氢化大豆卵磷脂(phospholipon90h，lipoid公司制造制)10g及柠檬酸酐(纯正化学公司制造)0.8g，混合至均匀后，投入甘油(sigma-aldrich公司制造)17g而使内容物保持为捏合粉状，于5℃进行了7小时粉碎。然后，将得到的粉碎混炼物(面团)0.1g、作为分散剂的0.1％poe-pop二醇(unirube70dp-950b，日本油脂制)5g称取到50ml螺纹管中，使用超声波装置(modelvs-100iii，asone公司制造)分散至均匀，添加纯净水45g而得到悬浮液50g。使用粒度分布测定装置(delsananos，beckmancoulter公司制造)测定得到的悬浮液的粒度分布的结果，氯倍他索丙酸酯的粒度分布为：平均粒径(dv)101nm，10％粒径(d10)56nm、中心粒径(d50)87nm、90％粒径(d90)141nm。
(2)平均粒径100～150nm的纳米粒子的制作
与(1)同样地进行了氯倍他索丙酸酯的粉碎和粒度分布测定。其结果，氯倍他索丙酸酯的粒度分布为：平均粒径(dv)108nm，10％粒径(d10)57nm、中心粒径(d50)89nm、90％粒径(d90)151nm。
(3)平均粒径250～300nm的纳米粒子的制作
除了未添加氢化大豆卵磷脂(phospholipon90h，lipoid公司制造制)10g之外，与(1)同样地进行了氯倍他索丙酸酯的粉碎和粒度分布测定。其结果，氯倍他索丙酸酯的粒度分布为：平均粒径(dv)260nm，10％粒径(d10)143nm、中心粒径(d50)222nm、90％粒径(d90)363nm。
(4)平均粒径500～700nm的纳米粒子的制作
将平均粒径38390nm的氯倍他索丙酸酯1g、氯化钠及甘油的混合物(氯化钠11g，甘油2g)2g投入到mortargrinderrm200(lecce公司制造)，在室温下重复9次每次1分钟的运转而进行了粉碎。然后，称量得到的粉碎混炼物(面团)0.04g、作为分散剂的0.01％poe-pop二醇(unirube70dp-950b)5g到50ml螺纹管，使用超声波装置分散至均匀，添加纯净水45g而得到悬浮液50g。使用粒度分布测定装置测定得到的悬浮液的粒度分布的结果，氯倍他索丙酸酯粒度分布为：平均粒径(dv)637nm，10％粒径(d10)233nm、中心粒径(d50)475nm、90％粒径(d90)1129nm。
(实施例5)纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液的制作
(1)0.05％纳米化滴眼悬浮液(平均粒径约100nm)的制作
称量实施例4(1)中制作的粉碎混炼物(面团)2.4g、0.01％unirube水溶液150g及1.0％pva(merck公司制造)水溶液30g到烧杯中，使用超声波装置(modelvs-100iii，asone公司制造)均匀分散约5分钟而形成粗分散液，使用高压均化器(三和工业公司制造，l01-yh1)处理该粗分散液，得到分散液。进一步，添加0.1％苯扎氯铵(bac)水溶液2.5g和3.0％羟丙基甲基纤维素(hpmc)水溶液2.5g，然后，缓慢地添加500mm柠檬酸钠而调节至ph7.0。然后，添加注射用水而使总量为417.6g，制作了0.05％纳米化滴眼悬浮液(平均粒径约100nm)。该滴眼悬浮液的浸透压比为0.8。
(2)0.05％纳米化滴眼悬浮液(平均粒径约300nm)的制作
称量实施例4(3)中制作的粉碎混炼物(面团)2.1g、0.01％unirube水溶液150g及1.0％pva(merck公司制造)水溶液30g到烧杯中，使用超声波装置(modelvs-100iii，asone公司制造)均匀分散约5分钟而形成粗分散液，使用高压均化器(三和工业公司制造，l01-yh1)处理该粗分散液，得到分散液。进一步，添加0.1％bac水溶液2.5g和3.0％hpmc水溶液2.5g，然后，缓慢地添加500mm柠檬酸钠而调节至ph7.0。然后，添加注射用水而使总量为405.4g，制作了0.05％纳米化滴眼悬浮液(平均粒径约300nm)。该滴眼悬浮液的浸透压比为0.8。
(3)0.05％纳米化滴眼悬浮液(平均粒径约600nm)的制作
称量实施例4(4)中制作的粉碎混炼物(面团)0.52g、注射用水150g及1.0％pva(merck公司制造)水溶液30g到烧杯中，使用超声波装置(modelvs-100iii，asone公司制造)均匀分散约5分钟而形成粗分散液，使用高压均化器(三和工业公司制造，l01-yh1)处理该粗分散液，得到分散液。进一步，添加0.1％bac水溶液2.5g和3.0％hpmc水溶液2.5g，然后，缓慢地添加500mm柠檬酸钠而调节至ph7.0。然后，添加注射用水而使总量为245g，制作了0.05％纳米化滴眼悬浮液(平均粒径约600nm)。该滴眼悬浮液的浸透压比为0.9。
实施例5(1)～(3)中制作的各0.05％纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液的组成如下述表6所示。
[表6]
(实施例6)眼内药物动态试验
将实施例5(1)～(3)中制作的各纳米化滴眼悬浮液滴加至兔子(kbl:jw，雄)的眼部进行眼内药物动态试验(n＝3)。缓慢拨开兔子的下眼睑，使用移液器向左眼的结膜囊内滴眼(单次滴眼给药，50μl/眼)被检物质，滴眼后，慢慢地闭合上下眼睑并保持约2秒钟。在滴眼15分钟、30分钟、60分钟及90分钟后，利用戊巴比妥钠(东京化成工业株式会社)水溶液的耳静脉内给药进行麻醉，放血使其安乐死，利用注射用水充分清洗眼睛，然后采集眼房水(左眼)。然后采集结膜(左眼)。分别利用电子天平对采集的眼房水及结膜的重量进行测定，然后，利用液氮进行冷冻，在直到测定为止保存在超低温冰箱(允许范围：-70℃以下)。眼房水和结膜中的氯倍他索丙酸酯浓度利用lc-ms/ms法进行了测定。
(眼房水的前处理)
向采集的眼房水25μl中添加甲醇20μl和内标准(泼尼松龙)溶液20μl并充分地进行搅拌。进一步添加乙腈100μl并充分地进行搅拌，在离心(13100×g，4℃，5分钟)后，将上清10μl注入到lc-ms/ms中。
(结膜的前处理)
向采集的结膜中加入相对于其湿重量为9倍容量的超纯水进行了匀浆。向该匀浆液25μl中添加甲醇25μl和内标准(泼尼松龙)溶液20μl并充分地进行搅拌。进一步添加乙腈100μl并充分地进行搅拌，在离心(13100×g，4℃，5分钟)后，将上清20μl注入到lc-ms/ms中。
(lc-ms/ms的测定条件)
(hplc的测定条件)
色谱柱：capcellpakc18mgiii(5μm，2mm×150mm，资生堂)
流动相a：0.2％甲酸水溶液
流动相b：乙腈
梯度的时间程序：按照以下的容量比进行
流速：0.3ml/min
柱温：40℃
自动进样器温度：4℃
分析时间：7分钟
(ms/ms的测定条件)
ionsource(离子源):electrosprayionization(esi,电喷雾电离)
scantype(扫描类型):multiplereactionmonitoring(mrm,多反应监测)
polarity(极性):positive(正极性)
sourcetemperature(源温度):400℃
监测离子：
允许范围：±0.5以内
作为实施例5(1)～(3)中制作的纳米化滴眼悬浮液的眼内药物动态试验的结果，眼房水中的药物浓度的经时变化如图1及表7所示，结膜中的药物浓度的经时变化如图2及表8所示。观察到眼房水中的药物浓度的粒径依赖性。即随着粒径变小，眼房水中的药物浓度显示出升高的倾向。由此表明，粒径小的情况对于滴眼后的纳米化氯倍他索丙酸酯向眼房水中的转移性是适宜的。另外，结膜中的药物浓度也同样可观察到粒径依赖性的倾向，这表明粒径小的情况对于滴眼后的纳米化氯倍他索丙酸酯向结膜中的转移性是适宜的。
[表7]
[表8]
(实施例7)纳米化滴眼悬浮液中增粘剂的影响的研究
根据实施例6表明，纳米化氯倍他索丙酸酯的平均粒径为约100nm是适宜的，因此，接下来针对含有平均粒径约100nm的纳米化氯倍他索丙酸酯的滴眼悬浮液、通过采用各种增粘剂而改变纳米化滴眼悬浮液的粘度进行了眼内药物动态试验。
(1)纳米化滴眼悬浮液p的制作
称量实施例4(2)中制作的粉碎混炼物(面团)5g、0.01％unirube水溶液335g及1.0％pva水溶液67g到烧杯中，使用超声波装置(modelvs-100iii，asone公司制造)，均匀分散约5分钟而得到粗分散液，利用高压均化器(三和工业公司制造，l01-yh1)对该粗分散液进行处理得到分散液。进一步添加0.1％bac水溶液6.7g和1.0％hpmc(60sh-50)水溶液201g，然后缓慢地添加500mm柠檬酸钠调节至ph7.0。然后，添加注射用水而使总量达到670g，制作了0.05％纳米化滴眼悬浮液p。该滴眼悬浮液的粘度约为2mpa·s。
(2)纳米化滴眼悬浮液q的制作
除了将“1.0％hpmc(60sh-50)水溶液201g”变更为“1.0％hpmc(60sh-4000)水溶液100.5g”之外，与实施例7(1)同样地制作了0.05％纳米化滴眼悬浮液q。该滴眼悬浮液的粘度约为3mpa·s。
(3)纳米化滴眼悬浮液r的制作
除了将“1.0％hpmc(60sh-50)水溶液201g”变更为“1.0％mc(sm-100)水溶液134g”之外，与实施例7(1)同样地制作了0.05％纳米化滴眼悬浮液r。该滴眼悬浮液的粘度约为2mpa·s。
(4)纳米化滴眼悬浮液s的制作
除了将“1.0％hpmc(60sh-50)水溶液201g”变更为“1.0％mc(sm-4000)水溶液100.5g”之外，与实施例7(1)同样地制作了0.05％纳米化滴眼悬浮液s。该滴眼悬浮液的粘度约为3mpa·s。
实施例7(1)～(4)所制作的各0.05％纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液的组成如下表9所示。
[表9]
(5)眼内药物动态试验
利用实施例7(1)～(4)中制作的纳米化滴眼悬浮液通过实施例6记载的方法进行了眼内药物动态试验。
(6)结果
眼房水中的药物浓度的经时变化如图3及表10所示，结膜中的药物浓度的经时变化如图4及表11所示。根据图3所示的结果可以明确，滴眼悬浮液的粘度高者，具有向眼房水中的转移性高的倾向。另外，根据图4所示的结果可以明确，滴眼悬浮液的粘度高者，具有初期(15分钟后)向结膜的转移性高的倾向。
[表10]
[表11]
(实施例8)纳米化氯倍他索滴眼悬浮液在兔子的bsa诱导葡萄膜炎模型中的药效试验
(1)氯倍他索丙酸酯的粉碎
与实施例4(1)同样地进行氯倍他索丙酸酯的粉碎，制作了氯倍他索丙酸酯的粒度分布为平均粒径(dv)132nm、10％粒径(d10)65nm、中心粒径(d50)109nm、90％粒径(d90)186nm的粉碎混炼物(面团)。
(2)0.05％纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液的制作
称量上述(1)中制作的粉碎混炼物(面团)2.4g、0.01％poe-pop二醇水溶液167.5g及1.0％pva水溶液33.5g到烧杯中，使用超声波装置(modelvs-100iii，asone公司制造)分散面团而得到了粗分散液，利用高压均化器(三和工业公司制造，l01-yh1)对该粗分散液进行5次处理而得到面团分散液。进一步，添加0.1％苯扎氯铵水溶液2.8g和1.0％甲基纤维素水溶液56.4g，然后，缓慢添加500mm柠檬酸钠水溶液调节至ph7.0。然后，添加甘油1.5g将浸透压比调节为1.0，添加注射用水而使总量达到282.1g，制作了0.05％纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液。该滴眼悬浮液的组成和物性如下表所示。
滴眼悬浮液的组成
滴眼悬浮液的物性
(3)使用兔子的bsa诱导葡萄膜炎模型的药效试验
在氯胺酮盐酸盐(氯胺酮肌肉注射用500mg)和甲苯噻嗪(celactal2％注射液)的组合麻醉下，对兔子(std:jw/csk)的右眼球中滴眼0.4％奥布卡因盐酸盐(过氧化苯甲酰滴眼液0.4％)进行麻醉而使角膜反射消失后，向右眼的玻璃体中央部注入10％bsa生理食盐液0.1ml，进行了葡萄膜炎的诱发(第一次)。在其第二天，使用微移液器采取对照(生理食盐液)、被检物质(上述(2)中制作的0.05％纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液)及阳性对照物质(0.1％氟米龙滴眼液，市售品)50μl，每天两次(原则上为9:00和17:00)，连续29天向右眼球滴眼给药。左眼为无处置，以各组n＝5进行了药效试验。
从第一次的bsa给药15天后到18天后的4天中，按照山内等人的眼炎症采集基准(山内秀泰等(1973)，日本眼科纪要，24，969-979)对外眼部(角膜的外侧)和内眼部(角膜的内侧)的炎症症状进行得分化，由此进行了抗炎症效果的评价。另外，在27天后，以2ml/kg的用量通过耳静脉注入1.25％bsa生理食盐液，进行了葡萄膜炎的诱发(第二次)，在29天后，与上述同样地对外眼部和内眼部的炎症症状进行得分化，评价了抗炎症效果。
(4)结果
结果如图5～7所示。由本结果可知，0.05％纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液相对于外眼部和内眼部的炎症模型，具有与0.1％氟米龙滴眼液相同程度的抗炎症效果。
(实施例9)在大鼠的巴豆诱导结膜炎模型中的药效试验
(1)0.1％纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液的制作
称量上述实施例8(1)中制作的粉碎混炼物(面团)4.2g、0.01％聚氧亚乙基聚氧亚丙基二醇水溶液150g及1.0％pva水溶液30g到烧杯中，使用超声波装置(modelvs-100iii，asone公司制造)分散面团而得到粗分散液，利用高压均化器(三和工业公司制造，l01-yh1)对该粗分散液进行5次处理得到分散液。进一步添加0.1％苯扎氯铵水溶液2.4g和1.0％甲基纤维素水溶液48.3g，然后，缓慢地添加500mm柠檬酸钠水溶液调节至ph7.0。然后，添加注射用水而使总量达到241.4g，制作了0.1％纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液。该滴眼悬浮液的组成和物性如下表所示。
滴眼悬浮液的组成
滴眼悬浮液的物性
(2)使用大鼠的巴豆诱导结膜炎模型的药效试验
向大鼠(wistar，雌)的双眼中，在-41分钟和0分钟两次，以2.5μl/site滴眼乙醇(起炎剂)，共计引起炎症2次。在第一次的起炎剂给药1分钟前(-42分钟)和第二次的起炎剂给药1分钟前(-1分钟)这两次，使用微移液器向双眼中以5μl/site滴眼给药了利用被检物质((1)中制作的0.1％纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液)和阳性对照物质(0.1％地塞米松，市售品)。需要说明的是，以正常对照组(没有引起炎症，无药物给药)和引起炎症对照组(引起炎症，没有药物给药)作为对照组，以各组n＝10进行了试验。
在第二次的起炎剂给药40分钟后、100分钟后和160分钟后的共计3次，以5μl/site向双眼滴眼10％巴豆油乙醇溶液(炎症诱导剂)诱导炎症。在10％巴豆油乙醇溶液的最终滴眼的2小时后，在异氟醚麻醉下，通过颈椎脱臼使大鼠安乐死，然后，采集了双眼的结膜测定了重量。通过与引起炎症对照组的结膜重量相比较，评价了被检物质的抗炎症效果。
得到的结果如图8所示。由本结果可知，引起炎症对照组的结膜重量与正常对照组相比，显示出高值，由此可以确认，本模型诱导了炎症。另外，滴眼了被检物质(0.1％纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液)和阳性对照物质(0.1％地塞米松)的组的结膜重量与引起炎症对照组相比，均显示出低值。因此可以明确，通过向大鼠的巴豆诱导结膜炎模型滴眼本申请的0.1％纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液，能够抑制结膜的浮肿。
(实施例10)在大鼠的卡拉胶诱导结膜浮肿模型中的药效试验
(1)0.1％纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液的制作
称量上述实施例8(1)中制作的粉碎混炼物(面团)4.3g、0.01％聚氧亚乙基聚氧亚丙基二醇水溶液150g及1.0％pva水溶液30g到烧杯中，使用超声波装置(modelvs-100iii，asone公司制造)分散面团而得到粗分散液，利用高压均化器(三和工业公司制造，l01-yh1)对该粗分散液进行5次处理得到分散液。进一步添加0.1％苯扎氯铵水溶液2.4g和1.0％甲基纤维素水溶液47.9g，然后，缓慢地添加500mm柠檬酸钠水溶液调节至ph7.0。然后，添加注射用水而使总量达到239.5g，制作了0.1％纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液。该滴眼悬浮液的组成和物性如下表所示。
滴眼悬浮液的组成
滴眼悬浮液的物性
(2)使用大鼠的卡拉胶诱导结膜浮肿模型的药效试验
向大鼠(wistar，雄)的右眼中，使用微移液器，滴眼给药了对照(生理食盐液)、被检物质(实施例8(2)中制备的0.05％纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液及实施例10(1)中制备的0.1％纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液)以及阳性对照物质(0.1％氟米龙滴眼液，市售品)(各组n＝8)。在滴眼给药15分钟后，在异氟醚麻醉下，向右上眼睑结膜进行1％卡拉胶生理食盐液溶液(起炎物质)50μl的皮下给药，制作了结膜浮肿模型。起炎物质给药4小时后，在异氟醚麻醉下，从腹大动脉中放血使大鼠安乐死，摘出了包含右眼球和副泪腺(哈德氏腺)的浮肿部位，然后分离右眼睑结膜并测定了其重量。通过比较得到的眼睑结膜重量，进行了抗炎症效果的评价。
图9示出了眼睑结膜重量的结果。由本结果，确认了纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液的依赖于浓度的抗炎症效果，明确了0.1％纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液显示出与阳性对照的0.1％氟米龙滴眼液基本同样的抗炎症作用。
(实施例11)纳米化氯倍他索滴眼悬浮液在兔子lps诱导葡萄膜炎模型中的药效试验
(1)氯倍他索丙酸酯的粉碎
向水冷式1.0l立式捏合机(井上制作所)中进料氯倍他索丙酸酯(farmabiosspa公司制造)50g、氯化钠(tomitasaltk-30，富田制药制造)550g，柠檬酸酐(sigma-aldrich公司制造)4g及氢化大豆卵磷脂(phospholipon90h，lipoid公司制造)50g，混合至均匀后，投入甘油(sigma-aldrich公司制造)70g而使内容物保持为捏合粉状，于5℃进行了5小时粉碎。将得到的粉碎混炼物(面团)与实施例1(1)同样地利用分散剂进行分散而形成悬浮液并测定氯倍他索丙酸酯的粒度分布的结果：平均粒径(dv)132nm、10％粒径(d10)67nm、中心粒径(d50)110nm、90％粒径(d90)184nm。
(2)0.002％纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液的制作
称量(1)中制作的粉碎混炼物(面团)0.076g、0.01％poloxamer407水溶液31.3g、1.0％pva水溶液25.0g、氯化钠0.217g、注射用水93.3g到烧杯中，使用超声波装置分散面团而得到粗分散液，使用高压均化器(三和工业公司制造，l01-yh1)处理该粗分散液4次而得到了面团分散液。称量该面团分散液110.67g到烧杯中，添加了0.1％苯扎氯铵水溶液1.85g和1.0％甲基纤维素水溶液36.91g，然后缓慢添加1m柠檬酸钠水溶液调制成ph7.0。然后，添加甘油而调节浸透压比至1.0，添加注射用水而使总量达到184.6g，制作了0.002％纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液。该滴眼悬浮液的组成和物性如下表所示。
滴眼悬浮液的组成
滴眼悬浮液的物性
(3)0.01％纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液的制作
称量(1)中制作的粉碎混炼物(面团)0.38g、0.01％poloxamer407水溶液62.5g、1.0％pva水溶液25.0g、注射用水62.5g到烧杯中，使用超声波装置分散面团而得到粗分散液，使用高压均化器(三和工业公司制造，l01-yh1)处理该粗分散液4次而得到了面团分散液。称量该面团分散液119.44g到烧杯中，添加了0.1％苯扎氯铵水溶液1.98g和1.0％甲基纤维素水溶液39.70g，然后缓慢添加1m柠檬酸钠水溶液调制成ph7.0。然后，添加甘油而调节浸透压比为1.0，添加注射用水而使总量达到198.5g，制作了0.01％纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液。该滴眼悬浮液的组成和物性如下表所示。
滴眼悬浮液的组成
滴眼悬浮液的物性
(4)0.05％纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液的制作
称量(1)中制作的粉碎混炼物(面团)1.84g、0.01％poloxamer407水溶液125.0g、1.0％pva水溶液25.0g到烧杯中，使用超声波装置分散面团而得到粗分散液，使用高压均化器(三和工业公司制造，l01-yh1)处理该粗分散液4次得到了面团分散液。称量该面团分散液116.79g到烧杯中，添加了0.1％苯扎氯铵水溶液1.92g和1.0％甲基纤维素水溶液38.45g，然后缓慢添加1m柠檬酸钠水溶液调制成ph7.0。然后，添加甘油而调节浸透压比为1.0，添加注射用水而使总量达到192.3g，制作了0.05％纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液。该滴眼悬浮液的组成和物性如下表所示。
滴眼悬浮液的组成
滴眼悬浮液的物性
(5)在兔子的lps诱导葡萄膜炎模型中的药效试验
通过耳静脉向兔子(kbs：jw)给药戊巴比妥钠(somnopentyl)来实施麻醉，进一步向双眼中滴眼0.4％奥布卡因盐酸盐(过氧化苯甲酰滴眼液)，在角膜反射消失后，给兔子安装开睑器，使用带30g注射针的针管，将制备成2μg/ml的lps(lipopolysaccharide，frome.colio55:sigma)0.02ml给药到玻璃体内，诱导了炎症。滴眼为利用微移液器，向双眼各给药50μl的对照(saline)、阳性对照物质(durezol(注册商标)：0.05％difluprednateophthalmicemulsion，alconlaboratories公司制造)及上述(4)中制作的被检物质(0.05％滴眼悬浮液)，在lps给药的4小时前、15分钟后、6小时及8小时后实施。需要说明的是，各组6只分别使用双眼，各组为n＝12。在lps给药24小时后，向兔子过量给药戊巴比妥钠(somnopentyl)而使其安乐死，利用带26g注射针的针管，采集全部量的前房水。进一步，摘出眼球并切开巩膜-角膜转移部附近，利用1ml针筒采集了玻璃体。通过elisa法(prostaglandine2expresselisakit:cayman)测定了所采集的两样品中的pge2浓度。
(6)结果
图10示出了房水中pge2浓度(前眼部评价)、图11示出了玻璃体中pge2浓度(后眼部评价)的结果。可以明确，通过向兔子的lps诱导葡萄膜炎模型中滴眼本发明的纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液，针对葡萄膜炎(前眼部)显示出与阳性对照durezol(注册商标)同样的抗炎症作用。另外，与durezol(注册商标)给药组相比较，玻璃体内的pge2浓度在本发明的纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液给药组中变得更低，由此可知，对于葡萄膜炎(后眼部)，显示出高于durezol(注册商标)的抗炎症作用。
(实施例12)纳米化氯倍他索滴眼悬浮液在兔子的前房穿刺炎症模型中的药效试验
(1)在兔子的前房穿刺炎症模型中的药效试验
利用微移液器，向兔子(kbs：jw)的双眼中每一次分别滴眼给药50μl的对照(saline)、阳性对照物质(durezol(注册商标))及实施例11(2)(3)(4)中制作的被检物质(0.002％、0.01％和0.05％滴眼悬浮液)。需要说明的是，各组6只分别使用双眼，各组为n＝12。在其4小时后，向双眼中滴眼0.4％奥布卡因盐酸盐(过氧化苯甲酰滴眼液)，在角膜反射消失后，给兔子安装开睑器，使用带26g注射针的针管刺入到前房内，采集全部量的前房水，由此引起前眼部炎症。进一步，在其3小时后，再次利用带26g注射针的针管采集全部量的前房水，前房水中蛋白质浓度利用bca法(piercetmbcaproteinassaykit:thermofisherscientificinc.)进行了测定。另外，未因前房穿刺而诱导出前眼部炎症的组(normal)的前房水中蛋白质浓度也使用bca法进行了测定。
(2)结果
图12示出了前房水中的蛋白质浓度的结果。由本结果可知，通过向兔子的前房穿刺炎症模型中滴眼本发明的纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液(0.002％、0.01％和0.05％)，显示出与阳性对照的durezol(注册商标)(0.05％difluprednate)同样的抗炎症作用。
(实施例13)纳米化氯倍他索滴眼悬浮液在兔子lps诱导葡萄膜炎模型中的药效试验
(1)在兔子的lps诱导葡萄膜炎模型中的药效试验
通过耳静脉向兔子(kbs：jw)给药戊巴比妥钠(somnopentyl)来实施麻醉，进一步向双眼中滴眼0.4％奥布卡因盐酸盐(过氧化苯甲酰滴眼液)，在角膜反射消失后，给兔子安装开睑器，使用带30g注射针的针管，将制备成2μg/ml的lps(lipopolysaccharide，frome.colio55:sigma)0.02ml给药到玻璃体内，诱导了炎症。滴眼为利用微移液器，向双眼各给药50μl的对照(saline)、阳性对照物质(durezol(注册商标)：0.05％difluprednateophthalmicemulsion，alconlaboratories公司制造)及实施例11(4)中制作的被检物质(0.05％滴眼悬浮液)，在lps给药的第二天，就b.i.d(1天2次滴眼)而言，在9:00和17:00，就q.i.d(1天4次滴眼)而言，在9:00、12:00、15:00和18:00连续实施了6天。需要说明的是，各组4只或5只分别使用双眼，使各组为n＝8或10。在lps给药的24小时后，向兔子过量给药戊巴比妥钠(somnopentyl)而使其安乐死，摘出眼球并切开巩膜-角膜转移部附近，利用1ml针筒采集了玻璃体。通过elisa法(prostaglandine2expresselisakit:cayman)测定了所采集的样品中的pge2浓度。
(2)结果
图13示出了玻璃体中pge2浓度(后眼部评价)的结果。对照的玻璃体中pge2浓度为345.6pg/ml。阳性对照的durezol的1天2次滴眼及1天4次滴眼各自的玻璃体中pge2浓度分别为256.35pg/ml及179.4pg/ml，显示出了改善倾向。本发明的纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液的1天2次滴眼及1天4次滴眼各自的玻璃体中pge2浓度分别为219.2pg/ml及167.6，显示出了比durezol更为优异的抗炎症作用。由此表明，本发明的纳米化氯倍他索丙酸酯滴眼悬浮液通过滴眼到兔子的lps诱导葡萄膜炎模型中，与阳性对照durezol相比，在b.i.d(1天2次滴眼)和q.i.d(1天4次滴眼)的两者中均显示出高抗炎症作用。