肺癌细胞KI‑67表达指数的术前预测模型的建立方法与流程

本发明涉及医学领域，尤其涉及一种基于三维测量影像学参数肺癌细胞ki-67表达指数的术前预测模型的建立方法。

背景技术：

随着高分辨率ct(highresolutionct,hrct)的发展与普及，肺磨玻璃结节(ground-glassopacity,ggo)的检出率显著提高。国内外研究表明局灶性ggo多为肺腺癌的早期病变。ggo是一个非特异性病灶，可以是多种疾病在ct上的表现，是在hrct上发现的肺部局灶影，通常被学者描述为云絮状肺密度增高影，同时内部仍可显示支气管或血管结构影像。但目前国内外公认其多倾向于肺部早期肿瘤。已有多项国内外研究及临床病理资料提示，多数ggo组织病理学为早期肺腺癌。早期肺腺癌的病理类型按演进发展过程，可分为了非典型腺瘤样增生(atypicaladenomatoushyperplasia,aah)，原位腺癌(adenocarcinomainsitu,ais)，微浸润腺癌(minimallyinvasiveadenocarcinoma,mia)及浸润性腺癌(invasiveadenocarcinoma,iac)。即便是随访观察，仅靠二维ct影像学的一般征像包括传统的边缘、大小、胸膜牵拉与否、有无毛刺等很难准确鉴别其病理类型。作为一种量化指标，ct影像学参数在对ggo研究中越来越受到学者们的青睐。另外，三维ct相比于传统二维ct对肺部小结节的评价更具灵敏性和准确性。

另一方面，从病理学的角度来看，细胞增殖活性的增加是肺癌发生发展的始作俑者。而细胞核增殖抗原ki-67常被临床病理医师用来检测标本中细胞的增殖活性，多表达于增殖活跃的细胞的细胞核中，为调控分裂增殖细胞的细胞周期相关调节基因，其表达指数与细胞增殖活性呈正相关，多高表达于恶性肿瘤细胞，与肿瘤的发生发展关系密切，在多项研究中被用来探索恶性肿瘤增殖的生物学行为。国内外的研究者们预测ki-67所表达的细胞增殖活性与肺癌患者的预后具有很好的相关性。据文献记载，ki-67蛋白最初定义为标准单克隆抗体ki-67，是由霍奇金淋巴瘤细胞株l428的细胞核免疫小鼠所得。事实上ki-67蛋白出现在细胞周期的所有活跃期(g1,s,g2,有丝分裂)，但是静止细胞(g0期)中常不表达，这使其成为检测特定细胞群体增殖活性或生长分数极好标志物。高增值率是肿瘤最显著的特点，因此增殖活性在多项研究中被用来估计多发性骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌的预后。

尽管大量国内外学者的研究分析了不同病理类型ggo的ct特征，但很少研究ggo三维重建中影像学参数和量化的病理学参数如细胞增殖活性标志物ki-67li之间的关系。过往诊断方法所作分析仅限于影像学水平，未涉及评价作为诊断金标准的病理水平情况，使得诊断过于主观且准确性不高。

所以，如果能将ki-67指数与相关ct参数相关联，得到术前预测模型，是十分具有实用价值的，但是现有技术领域，这一块还尚属空白。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种基于肺结节ct三维重建影像学参数的肺癌细胞ki-67表达指数的术前预测模型。

本发明提供的肺癌细胞ki-67表达指数的术前预测模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)：对病例进行筛选，得到符合标准的患者；

步骤(2)：检测所述的患者ki-67表达指数；

步骤(3)：对所述的患者肺部进行ct影像扫描及三维重建，得到各ct参数数据及三维图像；

步骤(4)：对所述的ct参数数据及ki-67表达指数进行统计学处理分析及交叉验证，并建立ki-67的预测模型。

较佳地，所述的患者为符合下列标准：

术前行ct检查且首次诊断为ggo患者；

术后有明确病理诊断结果；

直径小于3cm的单纯性ggo和混合性ggo。

较佳地，ki-67表达指数的检测采用免疫组化二步法。

较佳地，所述的ct参数数据为平均直径、总体积、最大ct值、平均ct值和ct值分布标准差。

较佳地，所述步骤(5)还包括以下步骤：

步骤(5.1)：采用levene检验检测ct参数数据及ki-67表达指数方差齐性；

步骤(5.2)：对于方差不齐的ct参数数据运用kruskal-wallis检验来计算各组间参数数据是否具有显著性差异；

步骤(5.3)：对于方差齐性的ki-67表达指数则用单因素方差来分析组间差异，并运用lsd检验来进行ki-67的组间两两配对检验；

步骤(5.4)：用tamhane’st2来对ct参数数据及ki-67表达指数预测值进行两两间配对检验；

步骤(5.5)：用受试者工作特征曲线分析来检测各ct参数数据及ki-67表达指数对于鉴别不同病理类型的ggo病灶的灵敏性和特异性；

步骤(5.6)：采用spearman相关性分析和多元回归分析并十折交叉验证来建立ki-67表达指数的预测模型。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明开创性的将具有较好客观性和准确性的ggo三维重建模型中所测量的相关ct参数与病理标本中肺癌细胞ki-67表达指数(labelingindex,li)相联系，通过研究二者的量化相关性来建立以三维重建参数预测ki-67li的多元回归模型，从而对术前ggo的病理性质的鉴别诊断提供更准确可量化的评估，为医生判断提供了一个较好的中间值。将比以往单纯的通过影像学特征来主观判断更加精确。

附图说明：

图1a和图1b为本发明实施例中的ki-67表达指数的免疫组化定量测量图。

图2a、图2b及图2c为本发明实施例中肺磨玻璃结节的三维重建处理和参数测量图；

图3为本发明实施例中非浸润腺癌(pia)、微浸润性腺癌(mia)及浸润性腺癌(iac)之间各参数的比较图；

图4为本发明实施例中表示肺部磨玻璃结节(ggo)直径、体积(tv)、最大ct值(max)、平均ct值(avg)和ct值分布标准差(std)的受试者工作特征曲线(roc)分析的曲线图。

图5为本发明实施例中肺磨玻璃结节(ggo)的直径、体积(tv)、最大ct值(max)、平均ct值(avg)和ct值分布标准差(std)与ki-67li之间spearman相关性分析的散点图。

图6为本发明实施例中ki-67表达指数(li)实际值和预测值在不同病理类型肺磨玻璃结节(ggo)包括非浸润腺癌(pia)、微浸润腺癌(mia)及浸润性腺癌(iac)之间的箱线比较图。

图7为本发明实施例中不同病理类型肺磨玻璃结节的ki-67的roc曲线图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步地说明，以更好地理解本发明。

一、方法

1、临床资料采集

收集2012年10月至2014年10月来院就诊的手术切除后有明确病理结果的并且术前有完整hrct和三维重建的160例ggo患者的临床病史、病理报告、手术记录及ct影像资料，对患者的年龄、性别、病理分型、ggo形状、边缘、直径(diameter)、体积(totalvolume,tv)、最大ct值(themaximumctattenuationvalue,max)、平均ct值(averagectattenuation,avg)及ggo整体ct值分布的标准差(standarddeviationofthedistributionofctattenuationwithinthewholeggo,std)进行统计整理。所有病例在首次被检出为ggo后均接受抗炎治疗2周，3个月随访后复查ct。只有随访后对比ggo病灶稳定或直径减小的病例方可纳入研究，对于抗炎后病灶消失的病例应予以排除，多为炎性病灶。

病例被纳入研究的标准：

①术前于本院行ct检查且首次诊断为ggo患者；

②术后有明确的病理诊断结果；

③直径小于3cm的单纯性ggo和混合性ggo。

henschke等人研究报道ggo比全实性肺部小结节(full-solidnodules)恶性程度更高，fengli等人研究发现137例全实性肺部小结节中，仅有15例为恶性病灶,其余122例皆为良性病灶，且全实性结节中多角形、边缘光滑或稍光滑的病例恶性者比良性者明显少(多角形：恶性7％-良性38％，p＝0.02；边缘光滑或稍光滑：恶性0％-良性63％，p＝0.001)；98％的多角形实性结节(46/47)和100％的边缘光滑的实性结节(77/77)均为良性病变。故本研究排除了全实性结节的病例。

排除病例的标准：

①ct影像上直径大于3cm的ggo或病灶为全实性小结节者或随访抗炎治疗后消退者；

②病理结果为转移性肺癌者、病理结果为鳞癌或小细胞癌者及病理虽为腺癌，但分期超过t1n0m0者；

③无术后病理结果或无本院的术前ct扫描数据者(部分患者为当地医院ct诊断后转至本院)；

④术前接受过肺部放化疗及活检穿刺者，会导致影像学参数测量不准确；

⑤过去有肺癌肺外癌症病史者。

最终160例ggo病例纳入研究，其中男性54例，女性106例，平均年龄为56.59±9.9岁。所有病例进行三维重建参数测量的ct扫描至手术获得病理标本的时间间隔平均为11±4天(1-23天)。所有纳入研究的病例病理诊断结果包括非典型腺瘤样增生(atypicaladenomatoushyperplasia，aah)26例、原位腺癌(adenocarcinomainsitu,ais)11例、微浸润腺癌(minimallyinvasiveadenocarcinoma，mia)106例及浸润性腺癌(invasiveadenocarcinoma,iac)17例。表1总结了所纳入研究病例的临床资料、影像学资料及病理学资料。

表1不同病理类型的ggo病例的临床、影像学及病理学资料统计(160例)

注：

按照最新的美国iaslc/ats/ers国际多学科肺腺癌分类系统进行分类；

所有数据均以平均值±标准差(sd)进行记录，*表示p<0.05；

性别、吸烟史及ggo类别均通过卡方检验进行分析；

平均年龄、直径、总体积(tv)、最大ct值(max)、平均ct值(avg)、ct值分布标准差(std)及ki-67表达指数预测值均通过kruskal-wallis和tambane’st2检验进行分析；

ki-67表达指数通过单因素方差分析(one-wayanova)最小显著性差异检验(lsdtest)进行分析；

p表示所有ggo病例方差分析结果的p值；

p1表示非浸润肺腺癌(pia)和微浸润肺腺癌(mia)组间显著性差异的p值；

p2表示微浸润肺腺癌(mia)和浸润肺腺癌(iac)组间显著性差异的p值；

2、免疫组化法检测ki-67表达指数

ki-67的检测采用国际标准的免疫组化二步法进行检验，具体操作如下：

1.玻片的准备：首先把准备的载玻片和盖玻片置于酸性溶液中24h，取出后流水冲洗，再用ddh20冲洗3-4遍，然后浸入95％酒精2h，待玻片干后还需作防脱片处理，将洗净的载玻片放入新鲜配制的3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(apes)工作液中30s，取出后再用纯丙酮溶液或ddh20洗去未结合的apes，晾干后装入盒中备用。

2.切片：用10％的中性福尔马林对所有手术切除的标本进行固定，再石蜡包埋后连续切片，切片厚度为4μm，每例连续切片三张进行常规he染色观察病理形态，免疫组织化学染色观察ki-67、egfr、p53、cea表达情况；可用电热干燥箱恒温60℃条件下烤片6-8h。

3.脱蜡：首先用二甲苯于60℃下脱蜡3次，每次15min；再用梯度酒精脱水，依次为无水酒精2次、95％酒精2次、80％酒精1次、70％酒精1次，每次均为5min；再用自来水冲洗片刻后ddh20冲洗5min；0.01mpbs冲洗3次，每次3min。

4.配置3％过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，室温下维持10min，再用pbs冲洗3次，每次3-5min。

5.抗原修复：先把经过上述步骤处理的切片放在盛有ph为6.0的柠檬酸缓冲液的烧杯中，再把烧杯放入高压蒸汽锅内，煮沸至高压锅喷气并维持10min；然后取出切片后使其自然冷却至室温，先用蒸馏水冲洗2次，再用pbs冲洗3次，每次3min。

6.封闭：擦净表面多余水分，滴加4％羊血清封闭后室温孵育2h，减少非特异性染色。

7.一抗：甩去羊血清，滴加准备好的第一抗体，各抗体稀释后室温孵育1h后于4℃下过夜；滴加0.01mpbs作为阴性对照；0.01mpbs冲洗3次，每次3min。

8.去除表面水分,滴加试剂盒中的试剂l，37℃孵育20min，0.01mpbs冲洗3次，每次3min；滴加试剂盒中的试剂2，37℃孵育30min；0.01mpbs冲洗3次，每次3min。

9.甩去pbs液，将经上述处理后的切片浸入新鲜配制的dab显色液中5min，同时在显微镜下观察显色程度，染色阳性常表现为棕黄色或棕褐色,阳性反应显色明显后则将切片于流水下冲洗，及时终止反应，一般显色时间为5分钟左右。

11.苏木素复染30s-2min后流水冲洗，再用l％盐酸-酒精分化，氨水返蓝或自来水返蓝，自来水冲洗。

12.梯度酒精脱水：依次使用70％酒精、80％酒精、95％酒精、无水酒精脱水，每次均为5min；二甲苯浸泡2次，每次8min。

13.用中性树胶脂封片，然后显微镜下阅片，记录染色结果。

目前尚无有关ki-67表达强弱分级的统一标准。研究文献和临床病理工作中通常采用粗略的百分比来表示ki-67标记指数，即在40×10倍镜下，每张玻片中随机选择10个视野，计算10个视野中阳性细胞平均所占视野的比例来粗略估算ki-67li,细胞核染为棕黄色或棕褐色的细胞则为阳性细胞。如图1所示，本实施例中使用图像测量软件imageproplus6.0来对ki-67免疫组化检测后的图片进行定量测量。图1a表示增殖细胞的胞核中灰黑色颗粒即为ki-67的阳性表达；图1b表示定量检测时根据灰度值不同，软件自动识别灰色区域的灰度值并进行测量。

3、ct影像扫描及三维重建后处理

对肺部先行常规普通平扫，再对病灶进行薄层容积螺旋扫描。嘱病人深吸气后屏住，由胸廓入口扫描至肺底部。

扫描条件：

电压120～140kv

电流200～400ma

重建层厚0.625mm

矩阵512×512

算法：骨算法轴向重建、滤波反投影(filteredbackprojection,fbp)及双肺最小视野法。

所有病例的ct诊断和后处理均由两位分别有8年和12年的影像医师读片，当结节超过一个层面方可诊断为ggo。hrct图像保存于医院dicm(digitalimagingandcommunicationsinmedicine)计算机系统内以供查询和研究。

本实施例中选取了5项ggo三维重建模型相关的参数作为变量：平均直径、总体积(totalvolume,tv)、最大ct值(max)、平均ct值(avg)和ct值分布标准差(std)。

三维重建处理：应用adw3.1工作站(advantageworkstation4.3；gehealthcare)，利用重建软件(lungvcar；gehealthcare)进行三维重建，主要方法采用容积显示重建(volumerendering，vr)。在vr图像重建中，点击结节后软件根据ct值差别自动检测并划定兴趣区域(regionofinterest,roi)，即ggo结节及周围相邻结构，包括结节内部的血管和细支气管；再通过切割技术对结节周围不属于结节的结构按照各部分ct值差异辨别后进行自动切割；三维容积图像显示后，适当调节对比度、亮度，使图像达到最佳视觉效果；然后可使用旋转技术从720°全角度观察结节三维形态、内部血管或细支气管结构、及与边缘胸膜的关系等情况；最后自动对ggo三维直径、tv、max、avg和std进行准确测量并列出。图2显示肺磨玻璃结节(ground-glassopacity，ggo)的三维重建处理与参数测量，图2a表示高分辨率ct(hrct)上典型的ggo(箭头)；图2b表示软件自动生成的重建后的ggo模型以及自动测量相关参数；图2c表示2b中的参数列表放大，包括三维直径、体积(tv)、最大ct值(max)、平均ct值(avg)和ct值分布标准差(std)。

4、统计分析

所有数据均记录为平均值±标准差。采用levene检验检测变量方差齐性，结果除了ki-67li以外所有变量均为方差不齐，如表2所示。故对于方差不齐的变量运用kruskal-wallis检验来计算各组间变量是否具有显著性差异，方差齐性的ki-67li则用单因素方差分析(anova)来分析组间差异。另外，运用lsd检验来进行ki-67li的组间两两配对检验，用tamhane’st2来对结节直径、tv、max、avg、std及ki-67li预测值进行两两间配对检验。用受试者工作特征曲线(receiveroperatingcurve,roc)分析来检测各变量对于鉴别不同病理类型的ggo病灶的灵敏性和特异性。spearman相关性分析和多元回归分析并十折交叉验证来建立ki-67li的预测模型。统计分析所用软件为spss22.0，p＜0.05为差异有统计学意义。

表2以levene检验进行变量方差齐性检验结果

注：

变量包括ggo结节直径、总体积、最大ct值、平均ct值、ct值分布标准差、ki-67表达指数及ki-67表达指数预测值；

p(sig.)<0.05表示变量方差不齐，需用tamhane’st2检验，p(sig.)>0.05则表示方差齐性，需用最小显著差异检验(lsd)；

二.结果

1、影像学特征及病理组织学诊断

ggo的三维重建ct参数由后处理软件自动测量，各病理的参数比较如图3所示，图3表示非浸润腺癌(pia)、微浸润性腺癌(mia)及浸润性腺癌(iac)之间各参数的比较。ki-67表达阳性细胞表现为位于过度增殖细胞的细胞核内棕褐色颗粒，相关统计数据见仍见表1。

2、不同病理类型的各参数roc曲线鉴别分析

通过roc曲线分析得到结节直径、tv、max、avg、std和ki-67li对于pia和mia组间鉴别的曲线下面积(auc)分别分0.801、0.822、0.890、0.857、0.901和0.907，对于mia和iac组间鉴别的auc分别为0.812、0.793、0.749、0.731、0.684、0.901；在各自变量曲线上的点同时选取最大真阳性率(即灵敏性)和最小假阳性率(即1-特异性)就可得到各个变量对于组间的鉴别阈值，通常是最靠近曲线左上角的那点[37]。故所得直径、tv、max、avg、std和ki-67li对于pia和mia组间最佳鉴别阈值分别为10.55mm,217mm³,-126.5hu,-615.5hu,135.5和4.38％，而对于mia和iac组间最佳鉴别阈值分别为21.8mm,1708.5mm³,189hu,-464hu,169.4和9.88％，如图4所示，图4表示肺部磨玻璃结节(ggo)直径、体积(tv)、最大ct值(max)、平均ct值(avg)和ct值分布标准差(std)的受试者工作特征曲线(roc)分析。根据曲线下面积(auc)可以看出ki-67li有着比其他各项三维ct参数更好的灵敏性和特异性。各项参数对于鉴别pia和mia组间差别比mia和iac组间差别效率更高。

3、三维ct参数与ki-67li之间的相关性

通过spearman相关性分析，ggo直径(p<0.001)、tv(p<0.001)、max(p<0.001),avg(p<0.001)和std(p<0.001)与ki-67li之间均有显著性相关，各自相关系数分别为0.575,0.559,0.605,0.585and0.639，如图5所示，图5为肺磨玻璃结节(ggo)的直径、体积(tv)、最大ct值(max)、平均ct值(avg)和ct值分布标准差(std)与ki-67li之间spearman相关性分析的散点图(r为相关系数)；各参数均与ki-67li成显著性正相关；图5(s)证明了ggo具有异质性，随着实性成分的增多，当超过50％时并不会出现std的抛物线式下降。

另外，通过多元线性回归分析来进一步定量探索三维ct参数与ki-67li之间的相关性，并进行十折交叉验证(10-foldcross-validation)即将160例ggo病例均分为10组，依次定义1组为测试组(testingsets)，另外9组为训练组(trainingsets)来进行回归模型构建，然后用测试组代入检测验证。最后得到10个关于ki-67li的多元回归方程，并计算每个方程的平均绝对误差(meanabsoluteerror,mae)，平均相对误差(meanrelativeerror,mre)和均方根误差(rootmeansquareerror,rmse)来评价各自方程的回归效率。

上述公式中n表示测试组病例数即10，表示ki-67li的预测值，y1表示ki-67li的实际值。

表3160例ggo病例三维ct参数对ki-67表达指数(li)多元线性回归模型的十折交叉验证

注：r表示多元相关系数，r²表示决定系数，mae表示平均绝对误差，mre表示平均相对误差，rmse表示根均方误差；

r和r²表示回归模型的契合度；

mae、mre及rmse表示回归模型的预测精准度，三者越低则回归模型预测越准确。

最终10个回归方程中，通过交叉验证比较得出第5组方程具有相对较高的预测准确率，回归方程如下：

ki-67li＝0.022*std+0.001*tv+2.137(4)

将纳入研究的160病例三维ct参数全部代入得到整体的ki-67li预测值，pia、mia和iac的ki-67li预测值均值分别为4.27±0.76(range,2.67～6.05％),6.50±1.69(range,3.00～11.74％)和8.81±3.73(range,3.75～16.65％)，且两两组间均有显著性差异(anovap<0.001,lsdpiavs.miap<0.001,miavs.iacp＝0.014,piavs.iacp<0.001)其如图6所示，图6图6为ki-67表达指数(li)实际值和预测值在不同病理类型肺磨玻璃结节(ggo)包括非浸润腺癌(pia)、微浸润腺癌(mia)及浸润性腺癌(iac)之间的箱线图比较。结果显示ki-67li实际值和与预测值组间均有显著性差异。另外通过roc曲线分析，我们比较了ki-67li预测值和实际值的auc，尽管ki-67li预测值的auc(pia/mia：0.893；mia/iac：0.841)没有真实值的auc(pia/mia：0.907；mia/iac：0.901)高，但也比影像学参数对于不同病理类型ggo组间鉴别的准确度高，其如图7所示，图7roc曲线分析比较ki-67li的实际值和预测值对于鉴别判断不同病理类型肺磨玻璃结节(ggo)的灵敏性和特异性。

本发明开创性的将具有较好客观性和准确性的ggo三维重建模型中所测量的相关ct参数与病理标本中肺癌细胞ki-67表达指数(labelingindex,li)相联系，通过研究二者的量化相关性来建立以三维重建参数预测ki-67li的多元回归模型，从而对术前ggo的病理性质的鉴别诊断提供更准确可量化的评估，为医生判断提供了一个较好的中间值。将比以往单纯的通过影像学特征来主观判断更加精确。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。