用于治疗骨质疏松症的骨靶向脂质体及其制备方法与流程

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种用于治疗骨质疏松症的骨靶向脂质体及其制备方法。

背景技术：

脂质体(liposomes)是一种类似于生物膜组织的双分子层微小囊泡，可以作为一种定向药物载体，属于靶向给药系统(targetingdrugdeliverysystem)的一种新技术。利用脂质体作为药物载体不仅可使药物制剂具有高度的靶向性，而且可以增加药物的溶解性，提高药物的生物利用度，减少药物的治疗剂量。中药脂质体系指将中药的有效成分包封于类脂质双分子层而制成的一种超微型球状药物载体制剂。作为中药的一种新型剂型，它制备简单，应用方便，可多用途给药。它作为药物载体有其独特的优势，包括可保护药物免受降解、达到靶向部位和减少毒副作用。其作用原理是脂质体和靶细胞之间可通过内吞、融合、接触释放、吸附、脂质交换等方式起作用而改变药物在体内的分布，达到靶向释药。并且脂质体有包封脂溶性药物或水溶性药物的特性，脂溶性药物被脂质体包封后，在体内呈现出与药物本身不同的特点。当药物包封于脂质体中由于脂质体的包裹作用或磷脂与药物之间的氢键等作用，使药物缓慢释放出来，从而延长了药物的作用时间，表现出一定的缓释性；因脂质体是类似于生物膜结构的囊泡，对正常细胞和组织无损害和抑制作用，可长时间吸附于靶细胞周围，使药物能充分向靶细胞靶组织渗透，表现出细胞亲和性和组织相容性。

近年来，脂质体作为药物载体的研究已成为热点之一。加之其适合体内降解、无毒性和无免疫原性，特别是它作为药物载体可提高药物治疗指数、降低药物毒性和减少药物毒副作用等优点，使它作为药物载体的研究愈来愈受到重视。如黄芩有效成分黄芩素是有效的抗菌、抗病毒药物，但他们都易氧化，受热不稳定，且不溶于水，限制了他们在实际中的应用，而脂质体制剂正好改变了这种缺点，又有其独特的优势。因此开发这类药物不仅有重要的临床意义，也具有广阔的市场前景。但是目前治疗骨质疏松症的脂质体的物理化学性质，如粒径、包封率和载药量等，并不是很理想，严重降低了脂质体药物的疗效。对于该技术问题，尚缺乏有效的解决方案。

技术实现要素：

针对现有技术，本发明的目的是提供一种用于治疗骨质疏松症的脂质体及其制备方法，制成一种含异补骨脂素的脂质体骨靶向制剂，可以改善传统中药的治疗效果，提高其有效成分的利用率和生物利用度，减少用药量，节约有限的中药资源。

为实现以上目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体，是由以下重量份的原料制成的：

卵磷脂4～6份、胆固醇4～6份、异补骨脂素0.2～0.4份、维生素e0.4～0.6份、胆固醇-聚乙二醇-双膦酸4～6份、葡萄糖0.08～0.12份。

本发明中的骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体，本发明从脂质体的粒径、包封率和载药量等因素出发，经过筛选优化实验得到了一组较佳的脂质体配方，各原料组分是一个有机整体，缺一不可。发明人在研究过程中发现，改变上述配方中的配比量，则脂质体的整体作用效果显著降低。

最优选的，从脂质体的粒径、包封率和载药量来讲，所述骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体，是由以下质量浓度原料制成的：

卵磷脂5mg·ml^-1、胆固醇5mg·ml^-1、异补骨脂素0.3mg·ml^-1、维生素e0.5mg·ml^-1、胆固醇-聚乙二醇-双膦酸5mg·ml^-1、葡萄糖0.1mg·ml^-1。

其中，卵磷脂5mg·ml^-1是指每毫升脂质体混悬液中使用5mg卵磷脂，其他原料具有与此相同的含义。

本发明的第二个目的是提供所述骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体的制备方法，包括以下步骤：

(1)按照设定比例称取卵磷脂、胆固醇、异补骨脂素和维生素e溶于氯仿溶液中，然后采用薄膜分散法得到均匀的薄膜；

(2)再向薄膜中加入pbs缓冲液和胆固醇-聚乙二醇-双膦酸，在20～30℃超声混匀，过滤膜，即得到脂质体混悬液，再加入葡萄糖调节所述脂质体混悬液的渗透压，得到骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体。

本发明尝试了多种制备方法，如高压均乳法、薄膜分散法和反相蒸发法，从得到的脂质体的粒径、包封率和载药量考虑，本发明筛选优化得到采用薄膜-超声分散法，其制备骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体的粒径符合要求，包封率和载药量均较高。

步骤(1)中，为使得卵磷脂、胆固醇、异补骨脂素和维生素e能够良好溶解以便能够更好地形成均匀的薄膜，经过试验验证，本发明选择氯仿溶液。

所述薄膜分散法的旋转温度为30～45℃，本发明考虑得到药物的热敏性和卵磷脂相转变温度，优选温度为30℃。低于30℃时，脂质体包封的异补骨脂素容易泄露；高于30℃时，脂质体的物理稳定性不好，不容易形成球形的脂质体。

步骤(2)中，从提高影响脂质体的均一稳定性的效果来讲，经过试验验证，本发明的超声温度选择在20～30℃。

本发明的pbs缓冲液的用量与最终形成的脂质体的稳定性有关，经过试验验证，本发明选择用量比例为pbs缓冲液与卵磷脂＝5ml：4～6mg，优选的为1ml：1mg。

本发明的超声功率和时间对形成的脂质体的形态、粒径和包封率均有重要的影响，经过试验验证，本发明的超声功率为100～200w(优选150w)，超声时间选择在15-20min，以使得脂质体的粒径均匀，满足粒径大小为200～300nm，并且使其包封率较高。若是超声功率过大，超声时间过长，会引起脂质体的氧化受损，包封的异补骨脂素渗漏。超声功率小，超声时间长，脂质体的稳定性欠佳，形成的脂质体的粒径不符合要求，粒径较小，在体内容易被淋巴系统清除掉，失去疗效。

本发明中所述胆固醇-聚乙二醇-双膦酸(bp-peg-chol)为现有技术中可以常规制备得到的物质，例如：首先合成中间体胆固醇甲基磺酸酯，合成中间体胆固醇-聚乙二醇(chol-peg)，合成聚乙二醇末端氨基化的衍生物(chol-peg-nh2)，最终合成胆固醇-聚乙二醇-双膦酸(chol-peg-bp)。具体的，本发明采用以下方法制备得到，胆固醇溶解在二氯甲烷中，加三乙胺做缚酸剂，冷却到-10℃，缓慢滴加甲基磺酰氯搅拌反应，反应完毕后处理用水洗过滤得白色粉末状固体。将peg2000充分干燥并抽真空之后，氩气保护下，加入干燥的二甲基亚砜(dmso)和四氢呋喃(thf)，随后迅速加入氢化钠，室温活化后，将溶解于thf的胆固醇甲基磺酸酯滴加入上述溶液中反应，将反应液倾人到冰水中，二氯甲烷提取，旋干，经快速柱层析分离得chol-peg。将上述产物与甲基磺酰氯反应制备甲基磺酸酯的中间体，溶于二甲基甲酰胺(dmf)中，加入的叠氮钠于50-80℃反应还原生成伯胺。将双磷酸衍生物溶于无水thf中，搅拌下加入chol-peg-nh2，加入二环己基碳二亚胺(dcc)，室温反应后过滤到thf混悬液中，过滤、洗涤、无水硫酸钠干燥、浓缩物经硅胶快速柱层析，以二氯甲烷/甲醇梯度洗脱得骨靶向接合物bp-peg-chol。

步骤(2)中，过滤膜的具体过程为：依次过0.8和0.45um的滤膜。

本发明的第三个目的是提供上述骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。

上述技术方案具有如下有益效果：

(1)本发明选用合适的原料制备成为骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体，由于采用了合适的原料以及配制量和制备方法，制备得到的脂质体多为类似球形的粒子，粒径约为200～300nm，平均粒径为224.3nm，该粒径范围在体内的稳定性较高；包封率和载药量较高，体外释放度比较稳定。

(2)将异补骨脂素制备成为骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体，对骨质疏松症具有显著的治疗效果，对老年性骨代谢疾病具有显著的治疗前景，为难治性骨代谢疾病患者带来福音。

(3)本发明的脂质体作为药物载体，能够有效保护异补骨脂素，提高异补骨脂素的生物利用度，使异补骨脂素具有靶向性，从而加强了骨质疏松症的治疗效果。

附图说明

图1是骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体结构示意图。

图2是骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体透射电镜(x20000)。

图3是骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体粒径分布图。

图4是骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体包封率和载药量测定标准曲线图。

图5：骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体对去卵巢c57/bl6小鼠股骨下段runx2和ppar-γ表达影响。

图6：骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体对去卵巢c57/bl6小鼠股骨下段骨量的影响。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

本发明中所用试剂和材料均是本领域技术人员可以常规得到的。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

一种骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体的制备方法，包括以下步骤：

分别称取卵磷脂、胆固醇、异补骨脂素、维生素e、氯仿溶液，过滤后备用。按实施例2中正交试验表的安排，依次精密吸取上述滤液适量置于25ml的圆底烧瓶中，在适宜的温度水浴条件下旋转蒸发至瓶壁上形成均匀薄膜，继续抽吸至氯仿充分挥发，再加入适量pbs缓冲液(是一种常规的磷酸缓冲盐溶液)和胆固醇-聚乙二醇-双膦酸，在20-30℃水浴条件下超声，形成近透明略显乳光的脂质体混悬液；依次过0.8和0.45um的滤膜，再加入葡萄糖调节所述脂质体混悬液的渗透压，得到骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体。

得到骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体，是由以下重量份的各原料制成的：卵磷脂5mg·ml^-1、胆固醇5mg·ml^-1、异补骨脂素0.3mg·ml^-1、维生素e0.5mg·ml^-1、胆固醇-聚乙二醇-双膦酸5mg·ml^-1、葡萄糖0.1mg·ml^-1。

使得异补骨脂素脂质体效果最优的条件为：旋转蒸发温度为30℃，缓冲液用量5ml，超声功率150w及超声时间15分钟。

对比例1

骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体是由以下重量份的各原料制成的：卵磷脂10mg·ml^-1、胆固醇10mg·ml^-1、异补骨脂素0.3mg·ml^-1、维生素e0.8mg·ml^-1、胆固醇-聚乙二醇-双膦酸5mg·ml^-1、葡萄糖0.1mg·ml^-1。实验步骤与实施例1相同，条件为：旋转蒸发温度为30℃，缓冲液用量5ml(pbs缓冲液与卵磷脂的添加比例为1ml：1mg)，超声功率150w及超声时间15分钟，区别在于形成的脂质体混悬液中，各原料的含量不同，脂质体的整体作用效果显著降低。

实施例2

一种骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体的制备工艺的研究，包括以下步骤：

根据薄膜-超声分散法的制备过程着重考察了旋转蒸发温度(a)、缓冲液的用量(b)、超声功率(c)、超声时间(d)四因素对脂质体包封率的影响，拟订了l9(3⁴)试验因素水平表(见表1)。

表1制备工艺正交试验表

结果显示最佳制备条件为a1b3c2d3，即旋转蒸发温度为30℃，缓冲液用量5ml，超声功率150w及超声时间15分钟。

实施例3

实施例1中效果最优的骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体的质量考察，包括以下步骤：

脂质体粒径的大小直接影响其在体内的稳定性，脂质体在体内时由于与高密度脂蛋白胆固醇(hdl)结合会导致粒径的改变。粒径大于300nm的脂质体缺乏血管通透性，易被网状内皮系统吞噬，难以离开循环系统，而小于等于l00nm的脂质体易被淋巴系统清除掉。小单室脂质体(20nm-50nm)增加了体内靶部位的聚集和延长在血液中的半衰期，但多室的脂质体药物渗透困难。本实验制备脂质体的透射电镜结果(见图2、图3)，本发明通过控制各原料的配比量，所制备的脂质体多为类似球形的粒子，粒径约为200～300nm，平均粒径为224.3nm，该粒径范围的骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体在体内的稳定性较高。

经过测定，对比例1脂质体的粒径范围在300nm以上，这会影响脂质体在体内的稳定性。这说明改变脂质体各组分的用量对脂质体的粒径大小影响较大，不合适的配比关系的各原料得到的脂质体形态不满足要求。

实施例4实施例1中效果最优的骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体的包封率和载药量的测定，包括以下步骤：精密吸取上述所制得的脂质体液1.0ml低温超速离心(4℃、16000r.rain^-1)30min，取上清液用pbs稀释至l0ml，用微孔滤膜过滤，取滤液10ul，进样测定峰面积，代入标准曲线求出异补骨脂素生物浓度，从而求出脂质体中游离异补骨脂素衍生物的含量，按下列公式计算包封率(entrapmentefficiency，ee)和载药量(drugloading，dl)。计算公式：ee＝(w总-w游)/w总x100％，dl＝(w总-w游)/w类脂xl00％，其中w总为投药量，w游为未包入脂质体的游离的药量，w类脂为处方中类脂总量(见图4)。

经过测定可得，实施例1中的脂质体的包封率ee为91.2％，载药量dl为38.3％。对比例1脂质体的包封率ee为80.3％，载药量dl为29.7％，与实施例1中的效果相比具有显著的差别，这说明改变脂质体各组分的用量对脂质体的包封率和载药量影响较大，不合适的配比关系的各原料得到的脂质体的包封率和载药量较低，两者的效果具有显著的差异。

实施例5实验效果

1.1候选药物

异补骨脂素(纯度＞99％，分子量186.1635，sigma，usa)；

实施例1中效果最优的骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体。

1.2动物分组与模型建立

24只c57/bl6雌鼠随机平均分为假手术组(shame)、去卵巢组(ovx)和去卵巢加异补骨脂素组(ovx+iso1)、去卵巢加骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体.(ovx+iso2)，各组数量6只。ovx组、ovx+iso1和ovx+iso2组分离背部近髂脊处肌肉，取出双侧卵巢，结扎上部输卵管，剪去双侧输卵管。shame组相同入路后剪去包裹卵巢周围的部分脂肪组织。ovx+iso1和ovx+iso2组在去卵巢前5天开始分别灌胃异补骨脂素和骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体，灌胃剂量为20mg/(kg·d)，灌胃持续时间2个月，shame组组以等剂量生理盐水灌胃。

1.3观察指标及方法

1.3.1骨标本收集：术后喂养3个月，断颈处死小鼠，取两侧股骨、胫骨，仔细剔除周围附着的肌肉等软组织，同时将左侧股骨放入含有0.1％叠氮钠的生理盐水中，备骨组织微结构测定；右侧股骨用于免疫组织化学、免疫荧光检测runx2和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(ppar-γ)蛋白表达以及组织形态学分析。

1.3.2股骨下段he染色及脂肪细胞定量分析：取实验鼠股骨4％中性多聚甲醛常温固定，漂洗后进行脱钙，4℃脱钙21天，每3天更换1次脱钙液，每隔3天观察脱钙过程，股骨弯曲至90°认为脱钙完全即可终止。将已经完成脱钙的标本漂洗、组织脱水、石蜡包埋、切片、烤片，进行he染色。普通光学显微镜对股骨下段干骺端进行拍照，定量脂肪细胞，分析参数为:脂肪细胞数量(ad#，permm²)，总脂肪细胞面积占骨髓腔比例(av/tv)。所有切片均由3个不同人统一拍摄同一区域，拍摄顺序由图片左下角干骺端向右将图片平均分割呈3个区域进行拍摄，然后从图片左上角皮质骨内向右将图片分割成3个区域进行拍摄，进行脂肪细胞计数时不包括已被破坏的脂肪细胞。分析时为避免对最终结果产生偏倚，所有图均未知标本的各自分组(sham，ovx、ovx+iso1组和ovx+iso2)。

1.3.3股骨下段micro-ct扫描：股骨远端进行显微ct(scancomedical，μct80)分析:小鼠co2麻醉，股骨下端骨小梁较为明显和集中的区域通过显微ct(μct)分析和三维重建，设置参数为扫描电压70kv，功率30w，扫描电流429μa，每次扫描厚度5μm。分析数据包括:骨小梁厚度(tb.th)、骨小梁体积(tb.sp)、骨体积(bv)/总体积(tv)和骨小梁数量(tb.n)。

1.3.4股骨下段runx2、ppar-γ免疫荧光表达:取去卵巢并灌胃异补骨脂素c57/bl6小鼠股骨，保留膝关节和股骨中下段，4％中性多聚甲醛室温固定，进行漂洗、脱钙、再漂洗、组织脱水、石蜡包埋、切片烤片、烤蜡、脱蜡、抗原修复、孵育抗体等，后用含dipi封片剂封片，避光保存3分钟后荧光共聚焦显微镜观察拍照，从上下左右中5个方位随机取5个非重叠视野，使用image-proplus(ipp)软件计算平均光密度值。

1.4结果分析

1.4.1候选药物对去卵巢c57/bl6小鼠股骨下段runx2和ppar-γ表达结果：

核心结合蛋白因子2(runx2)是成骨细胞分化的关键调控因子，用来衡量细胞成骨或成脂的能力。ppar-γ是脂肪细胞成熟过程中必需的细胞转录因子，它的表达强弱和活性高低会决定小鼠bmscs向成骨细胞或是脂肪细胞分化。

结果：对去卵巢c57/bl6小鼠股骨下段进行runx2和ppar-γ免疫荧光提示，骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体治疗能增加股骨下段由于去卵巢引起的runx2表达降低，同时能抑制ppar-γ表达增加，即ovx+iso2组股骨下段runx2、ppar-γ免疫荧光表达强度高于ovx+iso1组，差异具有统计学意义(p<0.05)，见表2，图5。

表2骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体对去卵巢c57/bl6小鼠股骨下段runx2和ppar-γ表达影响(均值±标准差，n＝6)

*为ovx+iso2与ovx+iso1组相比较，p<0.05；+为sham组与ovx组相比较，p<0.05。

1.4.2候选药物对骨质疏松动物模型的试验结果：

脂肪细胞对成骨细胞具有脂毒性，脂肪细胞成脂分化的状态会影响成骨细胞的成骨能力和分化能力。

骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体能显著抑制去卵巢小鼠骨髓腔中脂肪细胞的增加，即ovx+iso2组脂肪细胞数量低于ovx+iso1组，差异具有统计学意义(p<0.05)。(表3)

表3骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体对c57/bl6小鼠股骨下段脂肪细胞量的影响(均值±标准差，n＝6)

*为ovx+iso与ovx组相比较，p<0.05；+为sham组与ovx组相比较，p<0.05。

通过对各组c57/bl6小鼠股骨下段的显微ct(micro-ct)扫描提示，骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体治疗能明显改善由于去卵巢引起的股骨下段骨量丢失，即ovx+iso2组骨小梁厚度(tb.th)、骨体积/总体积(bv/tv)、骨小梁数量(tb.n)大于ovx+iso1组，差异具有统计学意义(p<0.05)；而ovx+iso2组骨小梁体积(tb.sp)小于ovx+iso1组，差异具有统计学意义(p<0.05)，见表3、4，图6。

表4骨靶向修饰的异补骨脂素脂质体对c57/bl6小鼠股骨下段骨量的影响(均值±标准差，n＝6)

*为ovx+iso2与ovx+iso1组相比较，p<0.05；+为sham组与ovx组相比较，p<0.05。

综上，本发明的脂质体作为药物载体，能够有效保护异补骨脂素，提高异补骨脂素的生物利用度，相比于单纯的异补骨脂素，对骨质疏松症具有更加优异的治疗效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。