脂肪来源间充质干细胞外泌体在制备治疗肥胖药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及脂肪来源间充质干细胞外泌体在制备治疗肥胖药物中的应用。

背景技术：

肥胖是指由于能量过剩导致脂肪在体内的过度堆积所致的慢性疾病。肥胖可分为单纯性肥胖和继发性肥胖，通常意义上的肥胖指的是单纯性肥胖，主要是由于能量摄入大于消耗，导致多余能量在体内以脂肪形式过度聚集而成。继发性肥胖是伴随某些疾病发生的，如垂体性肥胖。目前采用体重指数(body mass index,BMI)作为判定肥胖的标准，BMI≥25为超重，≥30视为肥胖。近年来，由于饮食结构和生活方式的改变，无论在发达国家还是发展中国家，肥胖的发病率急剧上升。据2014年世界卫生组织最新统计，中国的超重人群已超过34％。随着肥胖发生率的增加，肥胖引发Ⅱ型糖尿病、心血管疾病甚至癌症等慢性疾病的发病率也逐年增加。因此，肥胖是当今世界范围内一个重要的公共健康问题，针对肥胖的干预策略是防治肥胖相关疾病的重要措施。

机体内脂肪组织可分为以贮存能量为主的白色脂肪组织(肥胖主要累及部位)和以产热方式消耗能量为主的棕色脂肪组织；而白色脂肪组织中出现表达棕色脂肪特异性解偶联蛋白(UCP1)的米色脂肪组织，即白色脂肪米色化，可促进机体以产热方式消耗能量，有效抵抗肥胖的发生发展。

脂肪来源间充质干细胞(ADSC)存在于脂肪组织血管基质成分(SVF)中，具有自我更新和多向分化潜能。ADSC在体外可被诱导分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞和内皮细胞等不同的组织细胞，是目前组织修复和再生领域的研究重点和热点。脂肪来源间充质干细胞外泌体可以携带具有生物学活性的蛋白质和RNA多种物质等，并将有效成分及信息高效传递至受体细胞，在细胞间的信息交流中起重要作用。

目前对于脂肪来源间充质干细胞的研究主要涉及在肾脏、眼底疾病中的用途(CN102048756A)、在治疗勃起功能障碍的用途(CN105902568A)、在制备肝纤维化治疗制剂的用途(CN103436555A)、在制备治疗骨性关节炎制剂的用途(CN105748519A)、在制备肝癌化疗增敏制剂中的用途(CN103451152A)等，但迄今还未有关于脂肪来源间充质干细胞及其外泌体在治疗肥胖方面的报道。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的提供脂肪来源间充质干细胞外泌体在制备治疗肥胖药物中的应用。

本发明研究发现，脂肪来源间充质干细胞外泌体可以在不影响小鼠摄食量的基础上，通过诱导白色脂肪米色化抑制小鼠的体重增加，达到治疗肥胖的作用，由此提出了下述的发明内容：

本发明的第一方面，提供脂肪来源间充质干细胞外泌体在制备治疗肥胖药物中的应用。

本发明中，所述脂肪来源间充质干细胞外泌体由如下方法制备而成：

(1)将剥离的脂肪组织分散于消化液中，以产生细胞悬浮液；

(2)离心细胞悬浮液，以形成细胞沉淀，分离沉淀，洗涤，得到含有脂肪来源间充质干细胞(ADSC)的血管基质成分(SVF)；

(3)在体外培养体系中对ADSC进行扩增培养，收集扩增培养后的上清液，浓缩，向浓缩后的上清液中加入外泌体提取试剂，即提取得到脂肪来源间充质干细胞外泌体。

优选的，步骤(1)中，所述消化液是由KRB缓冲液和Ⅰ型胶原酶组成；更优选的，KRB缓冲液和Ⅰ型胶原酶的组成比例为1ml：2mg。

优选的，步骤(2)中，离心转速为2000rpm，离心时间为5分钟。

优选的，步骤(3)中，扩增培养的条件为：用不含外泌体的10％胎牛血清的DMEM培养基(含有bFGF)培养ADSC。

优选的，步骤(3)中，所述外泌体提取试剂为Exoquick-TCTM外泌体提取试剂。

本发明中，所述脂肪来源间充质干细胞外泌体具有TSG101、CD9、CD63和HSP90标志。

优选的，本发明中，所述脂肪来源间充质干细胞外泌体来源于小鼠附睾处脂肪组织。

本发明的第二方面，提供包含上述脂肪来源间充质干细胞外泌体的组合物在制备治疗肥胖药物中的应用。

本发明的第三方面，提供脂肪来源间充质干细胞外泌体在制备促进白色脂肪米色化的生物制剂中的应用。

本发明的有益效果：

本发明首次提出了脂肪来源间充质干细胞外泌体在制备治疗肥胖药物中的新用途。本发明研究发现，ADSC来源外泌体可以促进白色脂肪米色化，以实现产热驱动的能量消耗，从而抵抗肥胖的发生发展，本发明的ADSC来源外泌体可以在不影响能量摄入的基础上抑制体重增加，达到治疗肥胖的作用，从而可作为用于肥胖治疗的新的生物制剂。此外，本发明还提供了上述脂肪来源间充质干细胞外泌体的制备方法，操作简单可行。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1：脂肪来源间充质干细胞外泌体的透射电镜图；图中，白色标尺为150nm。

图2：外泌体标志western-blot的鉴定结果。

图3：体重曲线的变化。

图4：外泌体干预治疗结束后体重的统计图。

图5：外泌体干预治疗时摄食量的统计图。

图6：外泌体干预治疗结束后各个部位脂肪的照片。

图7：脂肪重量的统计图。

图8：白色脂肪米色化中UCP1的表达；图中A：小鼠附睾处脂肪组织中UCP1的表达；图中B：下肢皮下脂肪组织中UCP1的表达。

图9：肝脏重量的统计图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

术语说明：

肥胖：由于能量过剩导致脂肪在体内的过度堆积所致的慢性疾病。

ADSC(adipose-derived mesenchymal stem cell)：脂肪来源间充质干细胞，存在于脂肪组织的血管基质成分中，是脂肪组织中的脂肪细胞前体，具有自我更新和多向分化潜能。

外泌体(exosome)：是细胞分泌外排的一类囊泡结构，直径约为30-120nm，内含多种蛋白和RNA物质，可通过旁分泌或者内分泌方式作用于相应的组织或细胞，是介导细胞间信息传递的一个重要介质。

正如背景技术所介绍的，现有技术中还未有关于脂肪来源间充质干细胞及其外泌体在治疗肥胖的报道。基于此，本发明提出了一种脂肪来源间充质干细胞外泌体在制备治疗肥胖药物中的应用。

在本申请的一种实施方案中，通过建立饮食诱导高脂肥胖模型，进行ADSC来源外泌体干预，分别检测外泌体干预后小鼠的体重、摄食量、不同部位脂肪组织的重量变化、小鼠附睾处脂肪组织以及下肢皮下脂肪组织中UCP1的表达以及小鼠肝脏的重量。

综上，通过上述研究发现：ADSC来源外泌体能减轻饮食诱导肥胖小鼠的体重，以及各个部位的脂肪重量，起到治疗肥胖的作用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：ADSC的提取与分离

⑴脂肪组织的分离：选取10～12周龄C57BL/6雄性小鼠，脱颈处死小鼠后，打开腹腔，剥离其附睾处脂肪，尽量去除血管，称取脂肪重量后，浸于PBS中冰上放置。

⑵配制消化液：根据脂肪重量，按照每克脂肪需3ml KRB缓冲液，6mgⅠ型胶原酶的比例配制使用。

⑶脂肪组织消化：将剥离好的脂肪组织机械剪碎后，加入配制好的消化液中，混匀后置于37℃摇床中消化45分钟，2000rpm，离心5分钟，小心取出底部的细胞置于不加酶的KRB中，冰上放置。

⑷过滤：用100μm孔径铜网过滤细胞悬液，滤过后的混悬液2000rpm，离心5分钟，弃上清。

⑸洗涤：沉淀物加入双倍体积的无酶KRB缓冲液，混匀后2000rpm，离心5分钟，弃上清，沉淀物即为含有ADSC的脂肪组织基质细胞(SVF)。

⑹种板：按照一只小鼠所提细胞接种至六孔板中一个孔的原则进行种板。加入含有bFGF的DMEM条件培养基重悬。每孔加入2ml培养基，37℃，5％CO2条件下培养，24-30小时后换液。

⑺传代：细胞融合度达90％时可进行传代。用PBS清洗细胞表面，加入适当胰酶消化细胞，按照每孔细胞传至一个10cm平皿的原则进行传代培养。第四代的细胞进行后续实验。

实施例2：ADSC来源的外泌体的提取与鉴定

用不含外泌体的10％胎牛血清的DMEM培养基(含有bFGF)培养ADSC。取第四代ADSC细胞培养上清，0.22μm无菌过滤器过滤后，5000g，100K浓缩离心管4℃离心30分钟，取上室浓缩液于新的无菌15ml离心管中，加入Exoquick-TCTM外泌体提取试剂，置于4℃过夜后，5000g,4℃离心30分钟，弃上清，用无菌PBS重悬沉淀并分装，冻于-80℃保存。

将提取到的外泌体用透射电镜的方法对其直接大小以及形态进行检测，结果如图1所示；用western-blot的方法检测外泌体标志TSG101，CD9，CD63，HSP90，进一步对其进行鉴定，结果如图2所示。

实施例3：ADSC来源外泌体对饮食诱导高脂肥胖模型的影响

(1)建立饮食诱导高脂肥胖模型与外泌体干预

7周龄C57BL/6雄性小鼠用于建立肥胖模型。在一周的预高脂饮食适应后，给予高脂饮食(HFD)(含有60％cal)喂养，以普通饮食(NCD)喂养作为对照组。高脂12-20周后，腹腔注射实施例2制备的外泌体(30μg/mouse，每3天注射一次，连续注射6-8周)，即为HFD-exosome组；腹腔注射生理盐水组为对照组，即HFD-NS。普通饮食喂养小鼠腹腔注射生理盐水组为NCD-NS。

(2)检测小鼠的体重变化

高脂喂养以及外泌体干预期间，每周检测小鼠体重并绘制成曲线进行分析，结果如图3和图4所示。由图3和图4可以看出，ADSC来源的外泌体干预治疗一段时间后，HFD-exosome组小鼠的体重增加明显减缓。

(3)检测小鼠的摄食量

外泌体干预治疗后，每天检测干预组与生理盐水对照组小鼠的摄食量，结果如图5所示。由图5结果可以看出，外泌体干预治疗过程中并不影响小鼠的摄食量。

(4)检测小鼠不同部位的脂肪组织重量变化

外泌体干预治疗后，取小鼠不同部位的脂肪组织，拍照并称重。结果如图6和图7所示，外泌体干预治疗后小鼠附睾处脂肪组织(EpiWAT)，下肢皮下脂肪组织(IngWAT)，以及上肢皮下脂肪组织(AsWAT)重量均有不同程度减少，棕色脂肪组织(BAT)重量变化不大。

(5)检测小鼠附睾处脂肪组织以及下肢皮下脂肪组织中UCP1的表达

外泌体干预治疗后，检测小鼠附睾处脂肪组织以及下肢皮下脂肪组织中UCP1的表达，由图8可知，外泌体干预治疗后，小鼠附睾处脂肪组织(图8A)以及下肢皮下脂肪组织(图8B)中UCP1的表达量有所升高。

结果表明：ADSC来源外泌体能够促进白色脂肪米色化，从而驱动消耗脂肪。

(6)小鼠肝脏重量变化情况

外泌体干预治疗后，取小鼠的肝脏并称重。如图9结果显示，外泌体干预治疗后小鼠的肝脏重量有所降低。

以上结果显示，ADSC来源外泌体能抑制饮食诱导肥胖小鼠的体重增加，以及各个部位的脂肪重量，起到治疗肥胖的作用。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。