鹿血浆酶解肽在制备抗衰老抗肿瘤药物或保健品中的应用的制作方法

本发明属于鹿血浆酶解肽活性提取物应用技术领域，具体涉及鹿血浆酶解肽在制备以及在抗衰老、抗肿瘤保健品中的应用。

背景技术：

梅花鹿是一种具有悠久应用历史的珍贵动物。我国是世界上最早将梅花鹿产品应用于医疗的国家，距今大约已有二千多年的历史。梅花鹿产品作为一种纯天然，绿色保健食品，可以药食两用，是一种营养价值很高，老少皆宜的滋补品。近代，通过动物实验和临床研究证明了鹿血确实具有养容颜，治疗贫血，调节免疫，延缓衰老，改善记忆，抗疲劳，改善性功能等多项治疗保健作用。

鹿血，为鹿科动物梅花鹿或马鹿的膛血或茸血,其性热,味甘咸,归肝、肾二经；具有养血益精、行血祛瘀、消肿疗伤等作用。鹿血在中医临床上有重要地位,而且在俄罗斯、韩国、日本和东南亚民间医学中也亦广泛流传。新鲜鹿血含水量为80％～81％，并含有多种氨基酸、酶类、脂类、游离脂肪酸类、固醇类、磷脂类、激素类、维生素类、嘌呤类和多糖类，具有抗氧化、抗衰老、抗疲劳、抗辐射、助强壮、美容、补血、补肾益精、增强免疫力等多种保健功能。当今由于科学技术的发达，通过先进工艺更是将鹿血的生产及应用发挥的淋漓尽致。如鹿血红花酒、东海鹿血酒、鹿血发酵酒、中华鹿血酒等酒剂制品。鹿血美肤胶囊、中国梅花鹿生鲜血粉胶囊等胶囊制剂。药膳食品中如鹿血蛋羹、鹿血豆腐、鹿血粥等。但是目前市场上的鹿血制品多为酒剂，不能满足儿童及青少年的需求，并且对酒精过敏者有局限性，而胶囊制剂不便于吞咽，鹿血药膳如果处理不当会产生鹿血的血腥味，且鹿血的有效成分不易吸收，因此有一定的局限性。并且制备工艺简单粗糙，宝贵的鹿血资源得不到充分的利用。

鹿血经抗凝处理后，利用离心分离技术得到的液体，占全血总量的55％左右即为鹿血浆，可作为民间传统的滋补佳品，具有重要保健功能。但因其粘度大，蛋白分子量高等特点不利于人体的吸收和利用。经研究表明，利用蛋白酶将鹿血浆进行酶解后，所得酶解液同样具有与鹿血浆类似的保健功能，且黏度降低，流动性及溶解性增强，可为后期生产加工提供便利，且酶解可将大分子的蛋白质变成小分子的肽，肽具有多种生物学功能如修复细胞促进细胞生长、提高消化系统功能、清除体内自由基防止血栓的形成、改善内分泌等并且更利于人体的吸收。

自由基代谢的失衡与机体许多疾病的发生发展有着密切的关系，如癌症、阿尔茨海默症、动脉粥样硬化、侧索硬化症、糖尿病等。正常机体内自由基的产生和清除处于动态平衡中。正常机体条件下产生的自由基主要是由于各种细胞器正常运作过程中产生的，比如说线粒体在产生腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)时，呼吸链产生的电子氧化产生超氧阴离子可以被利用并发挥生理作用，体外自由基主要是生活环境中的应激刺激机体产生的，如紫外线、高温、电离辐射、大气污染等，一些药物如类固醇激素等的摄入在体内也会产生自由基。当这些因素使自由基生成过多或和体内各类抗氧化物质减少，则体内自由基将不断积聚，从而引起机体的氧化应激,导致过氧化损伤增多。氧化应激使机体处于易损状态，过量的自由基会引起广泛的损伤效应自；由基过多引起的氧化应激也会对细胞信号网络系统损伤，从而导致疾病发生、蛋白质损伤和热休克反应、损伤、信号传导途径的改变、刺激转录因子活化等，而这些损伤将最终导致细胞凋亡,对机体造成损伤。

目前对于抗氧化肽的研究已有较多的报道，沈浥等人通过对乳清蛋白进行酶解，发现了具有抗氧化性能的乳清蛋白酶解肽(WHPs)；席守民等人发现蜗牛多肽混合物具有抗过氧化氢诱导神经母瘤细胞(SH-SY5Y)损伤的作用；赵江等人也发现山楂提取物具有对秀丽隐杆线虫急性氧化应激损伤的保护作用。抗氧化肽具有清除自由基、清除供氢/供电子、螯合金属离子、淬灭单线态氧、分解过氧化物、抑制脂肪氧合酶活力和抑制脂质过氧化等抗氧化功效，易消化吸收，无毒副作用，生物利用率高，营养和加工特性良好。

食品中营养成分的氧化反应会产生过氧化物。过氧化物影响食品的营养价值，严重还可导致疾病发生，寻找安全的抗氧化剂以抑制过氧化物产生一直是生化营养学的研究热点。目前广泛使用的抗氧化剂如BHA、BHT等，多为化学合成物，虽抗氧化效果良好，但对人体肝、脾、肺有蓄积性致癌作用。因此人们逐渐把目光转向天然抗氧化剂，目前很多的天然提取抗氧化产物多为有机溶剂提取或者萃取技术，成本高且工艺复杂。抗肿瘤药物的制备也同样以化学合成法或半化学合成法为主，主要是通过化学反应对药物进行合成，如目前应用较广泛的紫杉醇，利用组织培养和细胞培养生产紫杉醇进展很快,但无法达到商业要求,所以目前只是扩大药源的潜在方法。因此找到一种成本低，高效快速，操作简单，原料丰富，安全且副作用小的方法制备利于人体吸收的可以作为保健品服用的抗氧化抗肿瘤产品成为了一个值得关注的焦点。

技术实现要素：

为了克服现有技术中制备抗衰老抗肿瘤药物或保健品的不足，本发明提供一种鹿血浆酶解肽在在制备抗衰老抗肿瘤药物或保健品的应用。

本发明主要对鹿血浆的酶解肽进行研究，发现其可以降低过氧化氢(H₂O₂)损伤条件下的活性氧含量，降低对细胞的损伤程度，使细胞维持正常的生长形态；同时酶解肽可以延长秀丽隐杆线虫的生命周期，提高线虫的抗逆性；酶解肽还具有抑制肿瘤细胞生长，促进癌细胞凋亡；促进小鼠原代胚胎细胞生长并延长细胞存活周期等特性。基于这些发现，本发明的目的在于提供鹿血浆酶解肽在制备抗氧化及抗肿瘤的药物或保健品中的应用，进而提供一种新的抗衰老预防癌症发生的手段。

本发明应用了食用酶的酶解特性通过控制不同的酶解温度、氢离子浓度指数(pH)、时间等条件、通过H₂O₂刺激构建神经细胞氧化损伤模型、利用噻唑蓝(MTT)检测细胞存活率、流式细胞术检测肿瘤细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量、细胞凋亡情况、以秀丽隐杆线虫为动物模型，检测其抗氧化抗衰老性能、以小鼠原代胚胎细胞和人正常肝细胞为模型，检测酶解肽的促增长性能等生物技术手段。阐述鹿血肽具有抗衰老、抗肿瘤的生物学活性。

具体的，成本低的双酶联合酶解法制备鹿血浆酶解肽，利用酶解的手段对体系中的大分子量蛋白进行水解制备小分子肽的方法已经被广泛应用，我们采用可食用且应用范围广泛的食品级酶：碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶形成不同的酶解组合得到不同的酶解产物，首先通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及小分子专用聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)分析酶解后大分子量蛋白的酶解情况及不同分子量蛋白的分布。发现胰蛋白酶(trypsin，T)、木瓜蛋白酶单酶解(papain，P)与风味蛋白酶(flavourzyme，F)、碱性蛋白酶(alkaline proteinase，A)单酶解相比效果更优，并且胰木双酶解(TP)组合效果也好于风碱双酶解(FA)组合选定L02、SH-SY5Y两种细胞系，以体积比为10％的不同酶解成分作用于两种细胞，MTT检测对两种细胞生长状态的影响，对SH-SY5Y细胞无明显作用，对L02有较明显的促增殖作用，其中TP组促增殖作用最为明显。在抗氧化实验研究中，发现TP组能够显著降低胞内ROS含量恢复至与对照组水平基本保持一致。进一步选用不同浓度的TP组产物对神经细胞进行预保护，200μg/ml检测胞内ROS含量及镜下观察细胞形态的变化确定TP组产物的最佳作用浓度，发现较损伤组相比ROS含量有所降低至与对照组相近的水平通过细胞形态观察也可以较好的维持细胞形态因此认为200μg/ml为最佳细胞保护浓度。说明酶解产物可以在一定程度上保护神经细胞免受过量的ROS的损伤并维持一定的细胞形态。TP组作用于乳腺癌细胞系MDAMB231，通过MTT检测发现作用 浓度为20％，作用时间为24h时便可以显著抑制乳腺癌细胞的增殖并且随着浓度的增加，抑制程度也不断增加。随后流式检测TP作用于MDAMB231细胞24h后细胞凋亡程度，发现随着作用浓度的增加，TP产物具有逐渐促进癌细胞凋亡的趋势，当体积比浓度达到25％时，与对照组相比，细胞凋亡率增加了22.33％，说明酶解产物具有杀伤肿瘤细胞的作用，并且有一部分是通过促进细胞凋亡途径来发生的。同样，以相同的浓度作用于小鼠原代胚胎细胞，与肿瘤细胞进行比较观察酶解产物对不同类型细胞生命活动的影响。分别作用24h、48h及10d后通过镜检细胞形态，细胞增殖数量，发现随着作用时间的增加，与对照组相比，酶解产物明显促进了细胞的增殖。在10d时进行观察，发现体积比2.5％浓度作用实验组组明显增加了原代胚胎细胞的存活状况，并且促进了细胞的增殖与分裂，而对照组很多已经不再具备完整的细胞形态。这说明了TP酶解产物具有促进原代胚胎细胞增殖延长细胞存活周期的作用。为了进一步检验TP酶解产物抗氧化抗衰老作用，用含有0.6mg/ml TP酶解产物的大肠杆菌OP50(Escherichia coli,E.coli)喂食秀丽隐杆线虫，对照组只喂食OP50，分别对线虫寿命实验，产卵率，抗热激能力进行检测，TP酶解产物喂食秀丽隐杆线虫，对其寿命无明显的影响，但显著增加了线虫的产卵率，在35℃热激条件下，TP组显著延长了线虫寿命，说明TP酶解产物喂食线虫后，表现出了其抗衰老，增强线虫抗逆性的特点。

因此，可以利用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶解得手段对鹿血浆进行了联合酶解得到鹿血肽，其具有抗衰老养生之道，抗肿瘤等生物活性，可将鹿血肽应用于肿瘤、阿尔茨海默症等的预防及治疗中，即用于制备抗衰老抗肿瘤的药物或保健品。

与现有技术相比，本发明的优点如下：

本发明中用到的酶解法生产活性肽具有产品安全性高，基本无副作用，生产条件温和，不产生消旋，水解易控制，成本低等优点，为现在生产活性肽最为推广的生产方法。本发明得到的活性肽不仅具有肽普遍具有的抗氧化活性，同时兼有抗肿瘤的活性，与传统的抗肿瘤药物相比，不仅合成手段绿色健康，可食用酶来源广泛，同时毒副作用小，减弱了目前市面上化疗药物所引起的白血球下降、免疫力减弱、精神恍惚、视力模糊等毒副作用。

附图说明

图1：不同蛋白酶酶解产物的SDS-PAGE分析图；

其中，条带Marker：14-100bp；条带T：胰蛋白酶单酶解组；条带P：木瓜蛋白酶单酶解组；条带TP：胰蛋白酶木瓜蛋白酶联合酶解组；条带A：碱性蛋 白酶单酶解组；条带F：风味蛋白酶单酶解组；条带AF：碱性蛋白酶风味蛋白酶联合酶解组。N：未经过酶解的鹿血浆原液(以下均为缩写)

图2：不同蛋白酶酶解产物的Tricine-SDS-PAGE分析图

图3：不同蛋白酶酶解产物对细胞(SH-SY5Y、L02)存活率的影响图。

图4：SH-SY5Y细胞过氧化氢氧化损伤模型的建立。

图5：不同蛋白酶酶解产物ROS清除能力的检测图(a)及定量图(b)

图6：检测不同浓度的TP对SH-SY5Y细胞的ROS清除能力图(a)及细胞形态检测不同浓度的TP对SH-SY5Y细胞的保护作用图(b)；

图7：TP对乳腺癌细胞MDAMB231增殖抑制作用图；

图8：TP诱导乳腺癌细胞MDAMB231凋亡的检测图(a)及定量图(b)

图9：不同浓度TP促进小鼠原代胚胎细胞生长不同时间点的拍照观察检测图，其中(a)24h，TP体积比为2.5％、5％、10％、15％、20％(b)48h，TP体积比为2.5％、5％、10％、15％、20％(c)10d，TP体积比为2.5％

图10：TP对线虫生命周期的影响图；

图11：TP对线虫产卵率的影响图；

图12：TP对线虫抗热激能力的影响图(a)和统计图(b)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

实施例1：鹿血浆酶解肽的制备

选取胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶分别进行单酶解和不同的双酶解组合制备具有不同活性成分的酶解组分。具体步骤如下：取20ml鹿血浆原液，检测其蛋白质浓度并计算所含的蛋白质总量。充分混匀后90℃预处理5min。

组A：胰蛋白酶(反应温度37℃)、木瓜蛋白酶(反应温度55℃)

胰蛋白酶单酶解：降温至37℃并在酶反应器中保温10min,调pH至中性后加胰蛋白酶,酶底物比为4％(w/w),酶解过程中不断调节反应体系的pH值在7±0.05之间,水解90min后，沸水浴灭酶10min,迅速冷却，调至中性,8000rpm冷冻离心30min后弃去沉淀，上清液即为胰酶单酶解产物，4℃冷藏备用。

木瓜蛋白酶单酶解：降温至55℃并在酶反应器中保温10min,调pH至中性后加入木瓜蛋白酶，酶底物比2％(w/w),酶解过程中不断调节反应体系的pH值在 7士0.05之间,水解90min后,沸水浴灭酶10min,迅速冷却,调至中性,8000rpm冷冻离心30min后弃去沉淀,上清液即为木瓜蛋白酶单酶解产物，4℃冷藏备用。

双酶解：降温至37℃并在酶反应器中保温10min，调pH至中性后加胰蛋白酶,酶底物比为4％(w/w),酶解过程中不断调节反应体系的pH值在7±0.05之间,水解90min后,沸水浴灭酶10min,迅速冷却,调至中性,8000rpm冷冻离心30min后弃去沉淀。上清液转入预先调至55℃的酶反应器保温,调pH至中性后重新检测上清液中的蛋白质浓度，加入木瓜蛋白酶,酶底物比2％(w/w),酶解过程中不断调节反应体系的pH值在7±0.05之间,水解90min后,沸水浴灭酶10min,迅速冷却,调至中性,8000rpm冷冻离心30min后弃去沉淀,上清液4℃冷藏备用。

组B：风味蛋白酶(反应温度55℃)、碱性蛋白酶(反应温度60℃)

风味蛋白酶单酶解：降温至55℃并在酶反应器中保温10min,调pH至中性后加入木瓜蛋白酶,酶底物比2％(w/w),酶解过程中不断调节反应体系的pH值在7±0.05之间,水解90min后,沸水浴灭酶10min,迅速冷却,调至中性,8000rpm冷冻离心30min后弃去沉淀,上清液即为风味蛋白酶单酶解产物，4℃冷藏备用。

碱性蛋白酶单酶解：降温至60℃并在酶反应器中保温10min,调pH至中性后加入木瓜蛋白酶,酶底物比2％(w/w),酶解过程中不断调节反应体系的pH值在8±0.05之间,水解90min后,沸水浴灭酶10min,迅速冷却,调至中性,8000rpm冷冻离心30min后弃去沉淀,上清液即为碱性蛋白酶单酶解产物，4℃冷藏备用。

双酶解：降温至55℃并在酶反应器中保温10min,调pH至中性后加风味蛋白酶底物比为2％(w/w),酶解过程中不断调节反应体系的pH值在7±0.05之间,水解90min后,沸水浴灭酶10min,迅速冷却,调至中性,8000rpm冷冻离心30min后弃去沉淀。上清液转入预先调至60℃的酶反应器保温,调pH至中性后重新检测上清液中的蛋白质浓度，将pH调节至8±0.05加入碱性蛋白酶,酶底物比2％(w/w),酶解过程中不断调节反应体系的pH值在8±0.05之间,水解90min后,沸水浴灭酶10min,迅速冷却,调至中性,8000rpm冷冻离心30min后弃去沉淀,上清液4℃冷藏备用。

实施例2：SDS-PAGE检测不同酶解产物蛋白分子量的分布

包括以下步骤：

配制SDS-PAGE电泳缓冲液(最好不要过夜，现用现配)，灌满里侧电泳槽，外侧电泳槽的缓冲液可以重复利用2-3次。取相同蛋白含量的蛋白样品，加入5×SDS上样缓冲液，100℃金属浴10min，12000rpm离心5min，取上清液及5μL蛋白质预染Marker进行电泳，电压设定80V进行浓缩胶，使蛋白样品迁移到浓缩胶与分离胶的界限并浓缩成一条细线；将电压设定为120V，待溴酚蓝迁 移到凝胶底部，停止电泳；取出蛋白凝胶后考马斯亮蓝R-250染色1h，弃去染色液，脱色液脱色两小时左右至蛋白胶背景透亮，条带清晰，拍照分析。

表1：SDS-PAGE配方：

如图1和图2中所示，从图中可以看出，与未经过任何酶解的鹿血浆原液(N)相比，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶单酶解能够充分分解白蛋白等大蛋白,与碱性蛋白酶、风味蛋白酶单酶解相比效果更优，并且胰木双酶解组效果也好于风碱双酶解组合，主要表现在大分子蛋白(主要为55kD处的白蛋白)降解更彻底以及14kD以下多肽聚集更明显。

实施例3：不同酶解产物对两种细胞的增殖影响

L02细胞(人正常肝细胞系)、SH-SY5Y细胞(人神经母细胞瘤细胞系)采用含有体积分数为10％的胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM细胞培养液，在37℃，体积分数为5％的CO₂条件下进行培养及传代。称取MTT 0.25g溶于500ml PBS配成浓度为5mg/ml的使用液，过滤除菌分装，-20℃保存备用。分别取对数生长期的两种细胞，1×10⁴个细胞/孔，接种于96孔培养板中，每孔培养基200μL，37℃、5％CO₂培养24h。弃去原培养基，以体积比为10％的不同酶解成分作用于两种细胞，同时以相同体积比的磷酸缓冲液作用于细胞作为空白对照组。每组设3个复孔，将培养板置于培养箱中培养24h。弃去培养液，每孔加入20μL 5mg/mL噻唑蓝(MTT)溶液至终浓度为0.5mg/mL，继续培养4h。4h后小心吸弃上清，加入150μl二甲亚砜溶解生成的沉淀物，振荡5min后，在492nm下通过酶标仪检测吸光度。取各平行孔吸光度值的平均值，依据下列公式计算细胞相对存活率：

Cell viability(％)＝(A_sample-A_blank)/(A_control-A_blank)×100％

其中，A_sample为加入不同的酶解产物后的吸光度值，A_control为以加入相同体积比的磷酸缓冲液细胞培养液正常培养细胞后的吸光度值，A_blank为无培养细胞仅加入DMEM细胞培养液后的吸光度值。

从图3可以看出，当以体积比为10％的不同酶解成分作用于两种细胞，MTT检测对两种细胞生长状态的影响，对SH-SY5Y细胞无明显作用，对L02有较明显的促增殖作用，其中TP组促增殖作用最为明显。

实施例4：鹿血肽抗氧化功能的探究

(1)H₂O₂对SH-SY5Y神经细胞损伤模型的构建

取生长对数期的SH-SY5Y细胞,消化后接种,以2×10⁵个细胞/孔细胞密度接种于6孔板中，培养24h后,弃去原培养基，加入无血清培养基并在培养基中加入H₂O₂,终浓度分别为50、100、200、300、400、500、600、700、800μmol/L。细胞分别在孵箱中继续培养24h后,吸出上清液,以MTT法检测细胞活力,选取致死率接近50％的浓度作为氧化损伤模型建立的浓度。

(2)流式细胞术检测不同酶解产物的抗氧化功能

取生长对数期的SH-SY5Y细胞,消化后接种6孔板,细胞密度为2×10⁵个细胞/孔,每孔培养基2ml，培养24h后分组如下：

①正常组：正常细胞

②模型组：细胞+H₂O₂(H₂O₂浓度为最佳损伤浓度：500μmol/L)

③样品保护组：A：细胞+胰蛋白酶单酶解+H₂O₂；B：细胞+木瓜蛋白酶单酶解+H₂O₂；C：细胞+碱性蛋白酶单酶解+H₂O₂；D：细胞+胰木双酶解+H₂O₂细胞培养24后，样品保护组提前加入200μg/ml的各组样品预孵2h，取出去除上清后再在培养基中加入H₂O₂使其终浓度为最佳损伤浓度500μmol/L刺激细胞12h。根据活性氧(ROS)检测试剂盒(上海碧云天公司)的使用说明书进行相关检测：使用质量体积分数为0.25％的胰酶消化贴壁细胞，2000g离心5min收集细胞，用预冷的PBS洗涤细胞两次。装载检测ROS的探针DCFH-DA：按照体积比1:1000用无血清培养液稀释探针DCFH-DA，使终浓度为10μmol/L。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为10⁶～2×10⁸/ml，37℃细胞培养箱内孵育20min。每隔3-5min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清培养基洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。使用流式细胞仪检测细胞内的ROS含量。

从图4中可以看出，当H₂O₂浓度为500μM，作用时间为12h时，细胞死亡率可以达到50％，可以以此作为半数致死浓度，氧化损伤建立成功。图5的(a)为流式检测ROS含量的结果，图(b)为图(a)的数值量化可以看出，从(a)和(b)中 同时可以看出当以200μg/ml浓度的不同酶解产物作用于SH-SY5Y细胞时，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶单酶解产物组与H₂O₂组相比均可以降低10％-12％的ROS含量，但ROS水平仍然高于对照组，胰蛋白酶木瓜蛋白酶联合酶解组与H₂O₂组相比ROS水平可以降低到达30％，基本与对照组持平。说明联合酶解组清除ROS的能力更强，对细胞的保护作用更好。

(3)流式细胞术及细胞形态观察检测不同浓度胰木联合酶解组产物的抗氧化

功能。

取生长对数期的SH-SY5Y细胞,消化后接种于两个6孔板中,细胞密度为2×10⁵个细胞/孔,培养24h后分别进行流式细胞仪检测和荧光显微镜拍照观察分组如下：

①正常组：正常细胞

②模型组：细胞+H₂O₂(H₂O₂浓度为最佳损伤浓度：500μmol/L)

③样品保护组：A：细胞+50μg/ml样品+H₂O₂；B：细胞+100μg/ml样品+H₂O₂；C：细胞+200μg/ml样品+H₂O₂；D：细胞+1000μg/ml样品+H₂O₂

细胞培养24后，样品保护组提前加入不同浓度的胰木联合酶解产物预孵2h，取出去除上清后再在培养基中加入H₂O₂使其终浓度为最佳损伤浓度500μmol/L刺激细胞12h。收集细胞后装载探针检测ROS。样品的制备与检测方法与实施例4(2)中的第③步相同。同时使用荧光显微镜对另一个6孔板进行观察及拍照记录。

图6中(a)图为流式检测不同浓度TP对细胞内ROS含量的影响，可以看出，200μg/ml浓度较损伤组相比ROS含量有所降低至与对照组相近的水平，而50μg/ml和100μg/ml组虽然也降低了ROS含量，但与对照组相比，降低程度过大，ROS含量过高与过低均不利于细胞的生存及生长。图(b)为荧光显微镜拍摄观察细胞形态，通过细胞形态观察也可以发现200μg/ml可以较好的维持细胞形态，因此认为200μg/ml为最佳细胞保护浓度。说明酶解产物可以在一定程度上保护神经细胞免受过量的ROS的损伤并维持一定的细胞形态。

实施例5：胰木联合酶解产物抗肿瘤作用的研究

(1)MTT检测酶解产物对肿瘤细胞增殖的抑制率

以1×10⁴细胞/孔的密度分别将MCF7、MDAMB231细胞接种于96孔板中，每孔培养基200μL，预培养24h。吸弃培养基，在1.5ml EP管中将联合酶解产物与DMEM细胞培养液以一定的比例混合将其分别稀释至体积比10％、20％、30％、40％、50％，每组设置3个复孔，每孔200μL加入至细胞培养体系中，将培养板置于培养箱中继续培养细胞24h。弃去培养液，每孔加入20μL 5mg/mL 噻唑蓝(MTT)溶液至终浓度为0.5mg/mL，继续培养4h。4h后小心吸弃上清，加入150μl二甲亚砜溶解生成的沉淀物，振荡5min后，在492nm下通过酶标仪检测吸光度。取各平行孔吸光度值的平均值，依据下列公式计算细胞相对存活率：

Cell viability(％)＝(A_sample-A_blank)/(A_control-A_blank)×100％

其中，A_sample为加入不同的酶解产物后的吸光度值，A_control为以加入相同体积比的磷酸缓冲液细胞培养液正常培养细胞后的吸光度值，A_blank为无培养细胞仅加入DMEM细胞培养液后的吸光度值。

研究中，对胰木联合酶解产物进行不同体积比的稀释，作用于肿瘤细胞24h后检测，结果如图7所示，当体积比为10％时，对肿瘤细胞的增殖无明显影响，当体积比为20％时，细胞死亡比例即可以达到40％，并且随着加入酶解肽体积比的不断增加，细胞死亡百分比不断升高，说明酶解肽可以促进肿瘤细胞的死亡。

(2)流式细胞仪检测酶解产物对肿瘤细胞凋亡的影响

以2×10⁵细胞/孔的密度分别将MCF7、MDAMB231细胞接种于6孔板中，每孔培养基2mL，预培养24h。吸弃培养基，在1.5ml EP管中将联合酶解产物与DMEM细胞培养液以一定的比例混合将其分别稀释至体积比5％、10％、15％、20％、25％，总体积为1ml。分别将其加入细胞培养板的各孔中，并向各孔中补加1ml DMEM完全培养基，置于培养箱中继续培养细胞24h。根据Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(上海贝博公司)的使用说明书进行相关检测：使用质量体积分数为0.25％的胰酶消化贴壁细胞，2000g离心5min收集细胞，用预冷的PBS洗涤细胞两次；以50μL染色体系对细胞进行染色，其中包括2μL Annexin V-FITC和2μL PI，混匀后于4℃避光条件下孵育30min；以Annexin V结合缓冲液将体系稀释至400μL，通过流式细胞仪检测乳腺癌细胞凋亡情况。

图8中(a)图为流式细胞术对TP诱导癌细胞凋亡情况的检测图，(b)图为对(a)图的定量，从两个图中同时可以看出，联合酶解产物对MDAMB231细胞具有良好的凋亡诱导效果，发现随着肽浓度的增加，晚期凋亡比例高于对照组但基本保持在8％左右，早期凋亡的比例不断增加，当体积比为25％时，早期凋亡即可达到23.4％。

实施例6：联合酶解产物TP对小鼠原代胚胎细胞增殖的影响

选取孕期8-10d的母鼠在超净台内进行解剖，在无菌条件下采取动物的组织或器官研磨成单个细胞，采用含有体积分数为10％的胎牛血清、1％的L-谷氨酰胺的DMEM-F12细胞培养液，在37℃，体积分数为5％的CO₂条件下进行培养及传代。以2×10⁵细胞/孔的密度将胚胎细胞接种于6孔板中，每孔培养基2mL， 预培养24h。吸弃培养基，在1.5ml EP管中将联合酶解产物与DMEM-F12完全培养基以一定的比例混合将其分别稀释至体积比5％、10％、15％、20％、25％，总体积为1ml。分别将其加入细胞培养板的各孔中，并向各孔中补加1ml DMEM-F12完全培养基，同时设置只加入完全培养基的组为对照组。置于培养箱中继续培养细胞，为了观察酶解产物是否具有延长胚胎细胞生命周期的作用，每隔48h给对照组和加入不同浓度TP的实验组换一次相应的细胞培养基，每隔一定时间对细胞形态及细胞数量进行检测及拍照记录，最后记录培养了24h、48h及10d时的细胞状态。

从图9中可以看出，培养24h时，在体积比为2.5％时，即能够促进胚胎细胞的增殖，细胞数量整体增多。在48h时，与24h相比，各组细胞数量均有增加，但对照组变化较小，与对照组相比，酶解产物处理的组别中细胞均明显增多。随着时间的延长，原代胚胎细胞在体外培养的条件下不具有无限增殖的能力，因此会逐渐死亡，我们发现在10d时，酶解肽处理组的细胞形态要明显优于对照组，并且细胞数量明显多于对照组，说明我们给予原代胚胎细胞不同浓度的酶解产物处理之后，可以显著促进细胞的增殖，延长细胞的生命周期。

实施例7：联合酶解肽TP对秀丽隐杆线虫生命周期影响的研究

(1)线虫生命周期实验

选用雌雄同体的野生型秀丽隐杆线虫N2，采用涂有大肠杆菌E.coli OP50的线虫培养专用的板，于20℃条件下进行培养和繁殖。在实验过程中，我们需要将线虫进行同期化处理，以便对相同发育阶段线虫的表型进行对比实验。采用转移母虫线虫进行同期化：一般一条产卵期线虫一小时可以产卵8个左右。把平板置于20℃恒温箱中孵育。为了得到同步生长的线虫，挑取进入产卵期的线虫若干条在一个平板中，具体数量视所需要的线虫数量而定，孵育约0.5h后，将平板中线虫挑出，平板中的卵孵化后即处于同一发育时期。野生型在20℃以OP50为食生命周期实验方法如下：转移50颗卵至两个新鲜接种OP50的线虫专用培养基NGM培养基上，操作中避免转入幼体和成虫。将卵置于20℃，48h等待卵孵化发育至L4期。第0d：将线虫转移至实验组和对照组记为第0d，观察线虫并记录生长状况，继续培养线虫至L4期。实验分TP组和对照组。设置两组样品，第一组为联合酶解肽组，酶解肽初始浓度为6mg/ml，将OP50与一定量酶解产物混匀加入培养基，涂布棒涂匀，酶解肽终浓度为0.6mg/ml；第二组为对照组，涂布与实验组相同体积的OP50。转移12条健康L4期线虫至新鲜接种皿，共6个皿并标记，转移至培养箱培养。记录：建立表格，记录存活、死亡、删除的线虫数目。被删除的线虫指的是丢失、钻到琼脂里的、爬到皿壁上而干死 的，有一些会生殖道外翻，或者变成虫袋。第2d：将开始产卵的母代线虫转移至新鲜培养基。第4、6、8d：两天后，隔一天观察并转移线虫，直到产卵期结束，期间做好数据记录。比较并制作开普勒米耶生存曲线。

死亡判断方法：线虫随着年龄的增长行动变慢，尤其在他们生命的最后时刻几乎是静止的，偶尔摆动一下头或尾巴。现在普遍被接受的判断线虫死亡的方法包括物理法和化学法。我们采用物理法：用挑虫针刺激它一下，然后观察它的反应。刺激两次以上均无反应说明线虫已经死亡。另外，为了避免反复机械刺激对线虫的损伤，可以把铂丝烧红，靠近线虫头部而不接触线虫，观察它的反应，活的线虫会摆动一下脑袋，死亡的则不会。

从图10中可以看出，在19d之前喂食酶解肽组的线虫平均存活率要高于对照组，19d之后，虽然存活率出现了低于对照组的趋势，但最终平均存活时间对照组与喂食酶解肽的实验组是相同的，均为20d，说明酶解肽对线虫生命周期无明显影响。

(2)线虫产卵率的测定

同期化秀丽隐杆线虫，方法同(1)中所述。挑取L2期秀丽线虫至含0.6mg/ml联合酶解产物的涂有OP50溶液的90mm平皿中给药，空白对照组为只涂有OP50的平皿。分别从酶解肽组和对照组挑取30条L4期的线虫至相应酶解肽和对照平板中，每板5条线虫并编号记录，于20℃恒温培养箱培养。进入产卵期开始产卵的当天记为第一天，每天将线虫转至新的相应培养板中，直到线虫产卵期结束，约4d。将所有平板于20℃孵化，统计每条线虫在4个平板中孵化线虫总数即该线虫产卵数量。

从图11中可以看出，第一天喂食酶解产物的线虫产卵量与对照组基本持平，第二天及第三天实验组产卵量显著高于对照组，产卵总数可以达到对照组的两倍，第四天实验组产卵量有所降低，可能是因为喂食了酶解产物促进了线虫的早期排卵，卵的数量是一定的，那么后期产卵量就会呈现降低的趋势。用0.6mg/ml的酶解产物处理过的线虫产卵量提高了35％。

(3)耐热实验

所有的实验工具置于35℃，新鲜接种的培养基在35℃预热2-3h。将同期化线虫挑取至含0.6mg/ml联合酶解产物的涂有OP50溶液的直径90mm平皿中，空白对照组为只涂有OP50的平皿。(约3d)，转移线虫至预热好的TP组NGM培养基和对照组培养基，每个培养基放置30条线虫，准备10皿线虫，将观察后的培养皿废弃，防止温度涨落对实验结果造成影响。分组放置于培养箱中，尽量减 少培养箱开门的时间。转至35℃生化培养箱，此时设为0h，以后每隔4h记录线虫死亡数目。

从图12中可以看出，在35℃高温条件下，喂食酶解肽组线虫平均存活24h左右，存活时间最长者存活44h；对照组线虫平均存活20h左右，存活时间最长者存活40h，TP组线虫比对照组线虫存活时间延长高达20％。实验结果说明酶解肽能显著提高线虫急性热应激能力。