MIP‑1α表达促进剂及在制备促进CIK细胞穿透血脑屏障的药物中的应用的制作方法

本发明涉及药物领域，尤其涉及mip-1α表达促进剂及在制备促进cik细胞穿透血脑屏障的药物中的应用。
背景技术：
：免疫细胞过继性治疗是一种新的肿瘤治疗技术，是对传统的手术、化疗、放疗等肿瘤治疗方法的有力补充。细胞因子诱导杀伤(cik)细胞是应用最为广泛的免疫细胞之一，其克服了以往免疫治疗细胞在体外扩增难、对肿瘤的细胞毒性不强和可能潜在致癌性等缺陷。cik细胞是体外扩增的异质淋巴细胞，具有非mhc限制的抗肿瘤活性，主要的效应细胞是表达cd3+cd56+的nk样t细胞。虽然，到目前为止，cik细胞的杀伤机制尚不完全清楚，但nkg2d及其配体的相互作用在cik抗肿瘤中发挥了重要作用。大量的临床试验证明了cik细胞治疗的可行性、有效性和安全性：cik细胞体外培养简单，扩增能力强，容易获得足够的细胞；治疗效果明显，多数患者病情得到缓解，免疫功能提高，生活质量评分提高；副作用少且轻微，如恶心、呕吐、低烧、发抖等，都可以通过简单的治疗得到缓解。cik细胞在脑癌等脑部疾病的治疗受到血脑屏障的制约。血脑屏障是指脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血浆与脑细胞之间的屏障和由脉络丛形成的血浆和脑脊液之间的屏障，这些屏障能够阻止某些物质(多半是有害的)由血液进入脑组织。血液中多种溶质从脑毛细血管进入脑组织，有难有易；有些很快通过，有些较慢，有些则完全不能通过，这种有选择性的通透现象使人们设想可能有限制溶质透过的某种结构存在，这种结构可使脑组织少受甚至不受循环血液中有害物质的损害，从而保持脑组织内环境的基本稳定，对维持中枢神经系统正常生理状态具有重要的生物学意义。研究发现，巨噬细胞炎症蛋白1(mip-1α)在肺癌脑转移患者的cik细胞中高表达，能诱导肺癌脑转移患者cik细胞在hbmec构建的血脑屏障模型中跨内皮细胞迁移(参考文献：mip-1α诱导肺癌脑转移患者cik细胞跨内皮迁移的研究，中国医科大学学报第45卷第2期2016年2月)。也就是说，mip-1α高表达的cik细胞更容易穿透血脑屏障进入脑组织发挥作用，对cik细胞的mip-1α表达具有促进作用的药物可以用于开发成cik细胞脑癌治疗药物。人参皂苷rz1是从蒸制三七中分离得到的一种稀有人参皂苷，其与同样从蒸制三七中分离得到的另外两种稀有人参皂苷rk1、rg5为同分异构体(化学结构式如下)。已有研究发现这三种稀有人参皂苷具有多种药理作用，而且这三种稀有人参皂苷虽然结构非常相似(仅仅为双键位置不同或双键两端的基团顺反式不同)，但是药理作用差异较大。目前尚未见人参皂苷rz1对cik细胞mip-1α表达影响的报道，更未见其用于促进cik细胞穿透血脑屏障的报道。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种mip-1α表达促进剂及在制备促进cik细胞穿透血脑屏障的药物中的应用。为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：人参皂苷rz1在制备促进cik细胞表达mip-1α的药物中的应用。一种用于促进cik细胞表达mip-1α的药物组合物，包含所述的人参皂苷rz1，还包含药学上可以接受的载体，制成药学上可以接受的剂型。优选地，所述药学上可以接受的载体包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。优选地，所述药学上可以接受的剂型包括注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。人参皂苷rz1在制备促进cik细胞穿透血脑屏障的药物中的应用。一种用于促进cik细胞穿透血脑屏障的药物组合物，包含所述的人参皂苷rz1，还包含药学上可以接受的载体，制成药学上可以接受的剂型。优选地，所述药学上可以接受的载体包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。优选地，所述药学上可以接受的剂型包括注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。本发明的优点：本发明发现人参皂苷rz1可以促进cik细胞高表达mip-1α，进而可以促进cik细胞穿透血脑屏障，因此，人参皂苷rz1可以用于制备促进cik细胞表达mip-1α的药物和促进cik细胞穿透血脑屏障的药物。附图说明图1是各组cik细胞中mip-1α的相对表达量。图2是各组cik细胞的跨脑血管内皮细胞穿透率(％)。具体实施方式实施例1：人参皂苷rz1促进cik细胞高表达mip-1α一、实验方法1、cik细胞的培养和分组处理采集健康志愿者外周血，淋巴细胞分离液分离、密度梯度离心获得外周血单个核细胞，于含10％小牛血清(美国gibco公司)的rpmi-1640培养液(美国invitrogen公司)中，在37℃、5％co2培养箱中培养4h，收集未贴壁细胞，调整细胞浓度至4×106/ml，加入ifn-γ(1000u/ml)，24h后加入cd3单抗(50μg/ml)、il-2(300u/ml)、il-1α(100u/ml)，以后每2d更换新鲜培养基，并补加il-2(300u/ml)，培养至14d，收获cik细胞；随机分为如下四组，使用不同的培养基继续处理24h小时：人参皂苷rz1组：含10％小牛血清的rpmi-1640培养液中添加20μm人参皂苷rz1；人参皂苷rk1组：含10％小牛血清的rpmi-1640培养液中添加20μm人参皂苷rk1；人参皂苷rg5组：含10％小牛血清的rpmi-1640培养液中添加20μm人参皂苷rg5；溶剂对照组：含10％小牛血清的rpmi-1640培养液中添加等体积溶剂。2、rt-pcr法测定各组cik细胞的mip-1α表达水平收集各组cik细胞约500万个细胞，提取细胞总rna，测定rna含量和纯度，然后进行反转录(反转录试剂盒购于美国promega公司)。20μl的反转录体系为：1μgrna添加1μloligodt，配相应体积的无rna酶水，70℃变性5min后置于4℃，然后加入5×primebuffer4μl，mgcl22.4μl，dntp(2.5mmol·l-1)4μl，rnasin(20u)0.5μl，rtase1μl，3.1μl无rna酶水。反转录条件：37℃反应15min，85℃加热5min灭活反转录酶，然后置于4℃。反转录的cdna产物进行pcr反应，反应条件为：94℃变性5min；然后经94℃变性30s，55℃退火30秒，72℃延伸1min，进行30个循环，再72℃延伸5min。1％琼脂糖电泳检测pcr产物。引物序列购于美国invitrogen公司，具体如下：mip-1α上游引物序列：5'-tcacctgctcaacatcatg-3'mip-1α下游引物序列：5'-tcaggcattcagttccagct-3'β-actin上游引物序列：5'-tctacaatgagctgcgtgtg-3'β-actin下游引物序列：5'-ggtcaggatcttcatgaggt-3'各组cik细胞的mip-1α表达水平用相对表达量表示：mip-1α相对表达量＝mip-1αmrna/β-actinmrna。二、实验结果如表1和图1所示，与溶剂对照组相比，人参皂苷rz1组cik细胞的mip-1α表达水平显著上调，具有显著性差异(p＜0.05)；而人参皂苷rk1组、人参皂苷rg5组cik细胞的mip-1α表达水平与溶剂对照组相比无显著性差异(p＞0.05)。该实验结果证明，人参皂苷rz1可以显著促进mip-1α在cik细胞中的表达，而其两个结构非常相似的同分异构体rk1、rg5不具有这种作用，人参皂苷rz1为cik细胞中mip-1α的表达促进剂。表1各组cik细胞中mip-1α的相对表达量组别mip-1αmrna/β-actinmrna溶剂对照组0.76人参皂苷rz1组2.98人参皂苷rk1组0.81人参皂苷rg5组0.83实施例2：人参皂苷rz1促进cik细胞穿透人脑微血管内皮细胞(hbmec)模型一、实验方法1、cik细胞的培养和分组处理同实施例1。2、hbmec的培养hbmec由中国医科大学细胞生物学实验室提供，按照常规方法培养即可，具体为：将hbmec加入含10％小牛血清的rpmi-1640营养液，10％nuserum，2mmol/l谷氨酰胺，1mmol/l丙酮酸钠，非必需氨基酸，mem维生素，在37℃，5％co2，95％湿度的细胞培养箱中培养。每2d更换新鲜培养液，待细胞在培养瓶底面生长至90％左右，用含0.25％胰蛋白酶细胞消化液消化细胞，再加入培养液，吹打成单细胞悬液后，1:4传代于新的培养瓶中。3、体外血脑屏障模型的建立在24孔3μm孔径的transwell小室上建立血脑屏障模型，transwell上室以2×105密度接种hbmec，将24孔板放于37℃，5％co2的细胞培养箱中培养4～5d，millicellers系统(购自美国worldprecisioninstruments公司)检测跨内皮电阻，当跨膜电阻teer值>200ω·cm-2时，将小室以无血清rpmi-1640培养液洗2次，在上室加入0.5μmol/l被rpmi-1640培养液溶解的辣根过氧化物酶(hrp)，2h后收集下室培养液，用分光光度计在吸收光为492nm波长处检测hrp浓度，当下室没有hrp时，此模型可以进行跨内皮迁移实验。4、各组cik细胞跨内皮迁移试验将各组cik细胞(2×105)加入transwell上室作用20h，后收集transwell下室细胞，用细胞计数仪计数细胞穿过率。二、实验结果如表2和图2所示，与溶剂对照组相比，人参皂苷rz1组cik细胞的跨内皮细胞穿透率显著升高，具有显著性差异(p＜0.05)；而人参皂苷rk1组、人参皂苷rg5组cik细胞的跨内皮细胞穿透率与溶剂对照组相比无显著性差异(p＞0.05)。该实验结果证明，人参皂苷rz1可以显著促进cik细胞穿透血脑屏障，而其两个结构非常相似的同分异构体rk1、rg5不具有这种作用，人参皂苷rz1可以用于制备促进cik细胞穿透血脑屏障的药物。表2各组cik细胞的跨内皮细胞穿透率(％)组别跨内皮细胞穿透率(％)溶剂对照组3.7人参皂苷rz1组26.1人参皂苷rk1组3.2人参皂苷rg5组3.8上述实施例证明，人参皂苷rz1可以促进cik细胞高表达mip-1α，进而可以促进cik细胞穿透血脑屏障，因此，人参皂苷rz1可以用于制备促进cik细胞表达mip-1α的药物和促进cik细胞穿透血脑屏障的药物。本领域技术人员应当知道，上述具体实施方式仅用于解释本发明，本发明的保护范围并不局限于上述具体实施方式。当前第1页12