本发明涉及天然药物化学领域，尤其涉及富含呋喃香豆素的飞龙掌血提取物制备技术和该提取物在止血方面的医药应用。
背景技术：
出血一般指人体皮肤、组织受伤后，血液从局部破损部位流出的现象。一般人体内有止血机制，局部受损血管发生反射性收缩或者血管受损处血小板粘集，形成凝块，从而缓慢少量出血的情况下能够自行止血。但是对于机体止血机制发生异常的人体而言，却是会引发一系列严重出血性的疾病，如血友病。应用止血药物治疗出血性顽疾是目前临床应用主要手段。
飞龙掌血始载于《植物明实图考》，在我国主要分布于贵州、四川、广西、湖南等地，具有散瘀止血、祛风除湿、解毒消肿之效，其止血作用显著，故又名见血飞、血见愁、见血散等，但其药理研究并未完全揭示中药活性成分与止血药理作用、机制之间的关系，缺乏客观可靠的监控指标，临床疗效不确定。因此解决飞龙掌血在止血制药产业方面的严重开发不足，对飞龙掌血提取物活性成分进行分离分析鉴定工作是十分必要的。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种富含呋喃香豆素的飞龙掌血提取物的制备及止血医药用途。
为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：
富含呋喃香豆素的飞龙掌血提取物的制备工艺，步骤如下：
(1)将飞龙掌血干燥药材粉碎；
(2)冷浸提取，往经过步骤(1)处理的飞龙掌血干燥药材中加入质量分数为50％以上乙醇水溶液，飞龙掌血干燥药材与乙醇溶液的重量比为1:0.5-50，每次冷浸提取2-14天，共冷浸提取5-15次，合并冷浸提取液浓缩成浸膏1，药渣备用；
(3)回流提取，把经过步骤(1)处理的药渣用质量分数为70％以下乙醇水溶液回流提取，药渣与乙醇水溶液的重量比为1:0.5-50，每次回流提取1-5h，共提取2-6次，合并回流提取液浓缩得浸膏2；
(4)用洗脱液萃取浸膏1、浸膏2或两者合并的合并浸膏，以得到有效部位，对有效部位处理后得到富含呋喃香豆素提取物，提取物包含有以下结构通式(ⅰ)、结构通式(ⅱ)表示的化合物：
(5)进行试验动物的止血试验，以出血时间、出血量、凝血时间为评价指标，发现飞龙掌血的浸膏1、浸膏2、合并浸膏及其萃取所得的有效部位具有止血活性。
进一步地，所述步骤(4)是用正丁醇萃取浸膏1、浸膏2或合并浸膏，得到正丁醇萃取部位；
取正丁醇萃取部位，加水溶解，经d101大孔吸附树脂吸附，依次用水、质量分数为10％～80％乙醇水溶液、质量分数为80％以上乙醇水溶液洗脱；将得到质量分数为10％～80％乙醇水溶液洗脱部位再经过正相硅胶色谱柱,用甲醇-二氯甲烷梯度洗脱，甲醇与二氯甲烷的体积比为1:50-1:0，tlc检测合并,得到包括fr1组分和fr2组分的产物，
其中，从fr1组分经反复正相柱石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱和重结晶分离纯化得到茴芹内酯、佛手内酯、别欧前胡素、异茴芹内酯；
fr2组分经正相柱二氯甲烷-甲醇梯度洗脱和sephadexlh-20柱色谱分离纯化得到走马芹内脂、珊瑚菜素。
茴芹内酯(pimpinellin)的结构式如式(ⅲ)所示：
佛手内酯(bergapten)的结构式如式(ⅳ)所示：
别欧前胡素(alloimperatorin)的结构式如式(ⅴ)所示：
异茴芹内酯(isopimpinellin)的结构式如式(ⅵ)所示：
走马芹内酯(moellendorffiline)的结构式如式(ⅶ)所示：
珊瑚菜素(phellopterin)的结构式如式(ⅷ)所示：
上述各化合物结构数据如下：
茴芹内酯：淡黄色针状结晶,c13h10o5,hresi-msm/z247.0606[m+h]+。1h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ:8.09(1h,d,j＝9.5hz,h-4),7.84(1h,d,j＝2.2hz,h-2′),7.19(1h,d,j＝2.2hz,h-3′),6.38(1h,d,j＝9.5hz,h-3),4.02(3h,s,6-och3),3.92(3h,s,5-och3).13c-nmr(101mhz,dmso-d6)δ:160.15(c-2),149.63(c-9),147.59(c-2'),144.68(c-5),143.08(c-7),140.62(c-4),135.18(c-6),114.26(c-3),113.97(c-8),109.63(c-10),104.42(c-3'),62.91(6-och3),61.59(5-och3)。
佛手内酯：淡黄色针状结晶,c12h8o4,hresi-msm/z217.0498[m+h]+。1h-nmr(400mhz,chloroform-d)δ:8.14(1h,d,j＝9.7hz,h-4),7.58(1h,d,j＝2.4hz,h-2'),7.12(1h,s,h-8),7.01(1h,d,j＝2.4hz,h-3'),6.26(1h,d,j＝9.7hz,h-3),4.25(3h,s,5-och3).13c-nmr(101mhz,chloroform-d)δ:161.35(c-2),158.46(c-7),152.78(c-9),149.65(c-5),144.87(c-2’),139.37(c-4),112.74(c-6),112.62(c-3),106.48(c-10),105.13(c-3’),93.92(c-8),60.17(c-5-och3)。
别欧前胡素：淡黄色针状结晶,c16h14o4,hresi-msm/z271.0961[m+h]+。1h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ:10.37(1h,s,c8-oh),8.15(1h,d,j＝9.9hz,h-4),7.97(1h,d,j＝2.5hz,h-2'),6.95(1h,d,j＝2.5hz,h-3'),6.36(1h,d,j＝9.8hz,h-3),5.04(1h,t,j＝6.8hz,h-2”),3.69(2h,d,j＝6.8hz,h-1”),1.76(3h,s,c-5”),1.59(3h,s,c-4”).13c-nmr(101mhz,dmso-d6)δ:160.40(c-2),147.46(c-2'),145.53(c-7),142.80(c-4),141.03(c-9),131.96(c-3”),128.91(c-8),125.37(c-6),123.62(c-2”),122.56(c-5),114.16(c-10),113.79(c-3),106.64(c-3'),27.66(c-1”),25.92(c-5”),18.47(c-4”)。
异茴芹内酯：淡黄色针状结晶,c13h10o5,hresi-msm/z247.0604[m+h]+。1h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ:8.12(1h,d,j＝9.8hz,h-4),8.05(1h,d,j＝2.3hz,h-2'),7.35(1h,d,j＝2.3hz,h-3'),6.29(1h,d,j＝9.8hz,h-3),4.12(3h,s,8-och3),3.98(3h,s,5-och3).13c-nmr(101mhz,dmso-d6)δ:160.10(c-2),149.93(c-7),146.85(c-2'),144.80(c-5),143.59(c-9),140.24(c-4),127.65(c-8),114.82(c-6),113.03(c-3),107.26(c-10),106.24(c-3'),61.79(8-och3),61.27(5-och3)。
走马芹内酯：淡黄色结晶,c26h20o10,hresi-msm/z493.1128[m+h]+。1hnmr(400mhz,chloroform-d)δ:7.46(d,j＝2.2hz,2h,h-2',2”'),6.74(d,j＝2.8hz,2h,h-3',3”'),4.40(m,2h,h-4,4”),4.04(m,2h,h-3,3”),3.84(s,6h,5-och3,5”-och3),3.68(s,6h,6-och3,6”-och3)。13cnmr(101mhz,chloroform-d)δ:164.90(2c,c-2,2”),148.32(2c,c-7,7”),147.70(2c,c-9,9”),144.76(2c,c-2',2”'),139.66(2c,c-5,5”),134.71(2c,c-6,6”),113.96(2c,c-8,8”),106.59(2c,c-10,10”),104.13(2c,c-3',3”'),60.96(5-och3,5”-och3,6-och3,6”-och3),39.95(2c,c-3,3”),38.37(2c,c-4,4”)。
珊瑚菜素：淡黄色粉末,c16h20o6,hresi-msm/z301.1075[m+h]+。1h-nmr(400mhz,chloroform-d)δ:8.11(1h，d，j＝10.2hz，h-4),7.61(1h,d,j＝2.3hz,h-2'),6.98(1h,d,j＝2.3hz,h-3'),6.26(1h,d,j＝10.2hz,h-3),5.59(1h,t,j＝7.2hz,h-2”),4.83(2h,d,j＝7.2hz,h-1”),4.16(3h，s，5-och3),1.72(3h，s，4”-ch3),1.68(3h，s，5”-ch3).13c-nmr(101mhz,chloroform-d)δ:160.6(c-2),150.83(c-7),145.11(c-2'),144.35(c-5),144.38(c-9),139.75(c-3”),139.45(c-4),126.86(c-8),119.82(c-2”),114.51(c-6),112.79(c-3),107.54(c-10),105.10(c-3'),70.39(c-1”),60.78(5-och3),25.86(c4”-ch3),18.11(c5”-ch3)。
进一步地，所述步骤(4)是用乙酸乙酯萃取浸膏1、浸膏2或合并浸膏，得到乙酸乙酯萃取部位，
取乙酸乙酯萃取部位，以80-100目粗硅胶拌样，乙酸乙酯萃取部位与粗硅胶的体积比是1:1，300-400目硅胶装柱，乙酸乙酯-石油醚梯度洗脱，乙酸乙酯与石油醚的体积比为1:50-1:0，得到包括fr3组分的产物，从fr3组分经正相柱石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱和重结晶分离纯化得到茴芹内酯、异茴芹内酯。
飞龙掌血提取物在制备止血药物中的应用。
进一步地，所述飞龙掌血提取物包括茴芹内酯、佛手内酯、别欧前胡素、异茴芹内酯、走马芹内脂、珊瑚菜素中一种或两种以上。
进一步地，所述止血药物的剂型为外用散剂、口服颗粒剂、胶囊剂、片剂或注射剂。
本发明的优点在于：分离效果好，操作简单，能够从飞龙掌血中分离鉴定出具有较好止血活性的呋喃香豆素类成分，包括茴芹内酯、佛手内酯、别欧前胡素、异茴芹内酯、走马芹内脂、珊瑚菜素等，冷浸和回流提取法均适合提取制备飞龙掌血止血活性提取物。乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位是该提取物止血活性的主要活性部位。为飞龙掌血药效物质基础提供科学依据，为揭示飞龙掌血的止血机制奠定基础，促进止血药物制备行业的发展。
具体实施方式
下面将结合具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例一
富含呋喃香豆素的飞龙掌血提取物的制备工艺，步骤如下：
(1)将飞龙掌血干燥药材粉碎，得到粗粉；
(2)冷浸提取，往经过步骤(1)处理的飞龙掌血干燥药材中加入质量分数为70％乙醇水溶液，飞龙掌血干燥药材与乙醇的重量比为1:6，每次冷浸提取3天，共冷浸提取6次，合并冷浸提取液浓缩成浸膏1，药渣备用；
(3)回流提取，把经过步骤(1)处理的药渣用质量分数为30％乙醇水溶液回流提取，药渣与乙醇水溶液的重量比为1:3，每次回流提取1.5h，共提取2次，合并回流提取液浓缩得浸膏2；
(4)用洗脱液萃取浸膏1、浸膏2合并的合并浸膏，以得到有效部位，对有效部位处理后得到富含呋喃香豆素的提取物；
所述步骤(4)是用正丁醇萃取合并后的浸膏，得到正丁醇萃取部位；
取正丁醇萃取部位，加水溶解，经d101大孔吸附树脂吸附，依次用水、质量分数为50％乙醇、无水乙醇洗脱。将得到质量分数50％乙醇洗脱部位浸膏后，再经正相硅胶色谱柱,用甲醇-二氯甲烷梯度洗脱，甲醇与二氯甲烷的体积比为1:50-1:0，tlc检测合并，得到包括fr1组分和fr2组分的产物。
其中，从fr1组分经反复正相柱石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱和重结晶分离纯化得到茴芹内酯、佛手内酯、别欧前胡素、异茴芹内酯；fr2组分经正相柱二氯甲烷-甲醇梯度洗脱和sephadexlh-20柱色谱分离纯化得到走马芹内脂、珊瑚菜素。
实施例二
富含呋喃香豆素的飞龙掌血提取物的制备工艺，步骤如下：
(1)将飞龙掌血干燥药材粉碎，过筛，得到细粉；
(2)冷浸提取，往经过步骤(1)处理的飞龙掌血干燥药材中加入质量分数为80％乙醇水溶液，飞龙掌血干燥药材与乙醇的重量比为1:10，每次冷浸提取5天，共冷浸提取8次，合并冷浸提取液浓缩成浸膏1，药渣备用；
(3)回流提取，把经过步骤(1)处理的药渣用质量分数为50％乙醇水溶液回流提取，药渣与乙醇水溶液的重量比为1:5，每次回流提取2h，共提取3次，合并回流提取液浓缩得浸膏2；
(4)合并浸膏1和浸膏2，用洗脱液萃取合并后的浸膏以得到有效部位，对有效部位处理后得到提取物。
所述步骤(4)是用乙酸乙酯萃取合并后的浸膏，得到乙酸乙酯萃取部位，
取乙酸乙酯萃取部位，以80-100目粗硅胶拌样，乙酸乙酯萃取部位与粗硅胶的体积比是1:1，300-400目硅胶装柱，乙酸乙酯-石油醚(乙酸乙酯与石油醚的体积比为1:40-1:0)梯度洗脱，得到包括fr3组分的产物，从fr3组分经正相柱石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱和重结晶分离纯化得到茴芹内酯、异茴芹内酯。
实施例三不同提取方法对飞龙掌血止血活性的影响
1.1实验对象：昆明小鼠
1.2考察指标：出血时间、出血量、小鼠凝血时间的测定
1.3临用前，将浸渍浸膏溶于0.5％cmc-na配成0.2g/ml、0.1g/ml、0.05g/ml高中低三个浓度溶液，回流浸膏配成0.1g/ml、0.05g/ml、0.025g/ml高中低三个浓度溶液，灌胃给药体积均为10ml/kg。
1.4取km小鼠随机分组，即空白组(0.5g.kg-1生理盐水)，云南白药组(0.5g·kg-1)，飞龙掌血待测浸膏的高、中、低剂量组，每组6只。灌胃给药，每天1次，连续7d。末次给药60min后，沿小鼠尾尖5mm处横向剪断，当血液自动流出时开始计时，每隔10s用滤纸吸去血滴1次，直到血液不再流出为止(滤纸吸时无血)。以人工形成创面到出血停止所经时间作为出血时间；将人工形成创面到出血停止后的滤纸称重，计算出血量。
1.5取km小鼠，随机分组，按1.3项下方法分组和给药，末次给药60min后用毛细管插入小鼠眼球内眦后静脉丛取血，以5cm的血柱为宜。计时，每隔20s折断两端毛细玻璃管(5mm)并缓慢向左右拉开，观察折断处有无血凝丝出现，以血凝丝出现时的时间计算凝血时间。
1.6结果发现与云南白药组比较(见表1、2)，95％乙醇冷浸浸膏和50％乙醇回流浸膏的各剂量组止血活性无统计学差异。说明飞龙掌血的95％乙醇冷浸浸膏和50％乙醇回流浸膏均具有良好的抑制生物机体创面出血的功效，彼此之间止血活性无统计学差异。但飞龙掌血95％乙醇冷浸浸膏主要富集中、低极性有效成分，包括香豆素类、生物碱类。
表1飞龙掌血冷浸提取法对止血活性的影响(n＝6)
tab.1theimpregnationextractionmethodforhemostaticactivityoftherootbarkoftoddaliaasiatica(n＝6)
与空白对照组比较：*p<0.05,**p<0.01
与云南白药组比较：ap>0.05
表2飞龙掌血回流提取方法对止血活性的影响(n＝6)
tab.2therefluxextractionmethodforhemostaticactivityoftherootbarkoftoddaliaasiatica(n＝6)
与空白对照组比较：*p<0.05,**p<0.01
实施例五不同极性部位对飞龙掌血止血活性的影响
2.1临用前将石油醚、乙酸乙酯和正丁醇三个部位浸膏溶0.5％cmc-na分别配成0.1g/ml、0.05g/ml、0.025g/ml高、中、低三个浓度溶液，灌胃给药体积均为10ml/kg。
2.2按上述1.4、1.5开展飞龙掌血95％乙醇冷浸浸膏的不同极性部位，即石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位对小鼠体内止血活性指标影响的研究。取km小鼠110只，随机等分为11组，即空白组(0.5g·kg-1生理盐水)，云南白药组(0.5g·kg-1)，飞龙掌血95％乙醇冷浸浸膏的石油醚部位高、中、低剂量组，乙酸乙酯部位高、中、低剂量组和正丁醇部位高、中、低剂量组，灌胃给药。
2.3结果发现(见下表3)云南白药组、飞龙掌血95％乙醇冷浸浸膏的乙酸乙酯部位各剂量组均能显著缩短小鼠出血时间、凝血时间，减少出血量，与空白组之间存在显著性差异。石油醚部位、正丁醇部位的高、中剂量组也能显著改善小鼠止血效果，这2个部位的低剂量组的止血作用与空白组之间却大多无统计学差异。综合分析，95％乙醇冷浸浸膏的乙酸乙酯部位止血活性最强，活性随给药剂量增加而提高，且药物毒副作用小。
表3飞龙掌血冷浸浸膏的不同极性部位对止血活性的影响(n＝10)
tab3thedifferentpolarityfrctionsofimpregnationextractsoftherootbarkoftoddaliaasiatica(n＝10)
与空白对照组比较：*p<0.05,**p<0.01
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。