本发明涉及医疗技术领域，尤其涉及一种用于预防肝纤维化的药物及其制备方法。
背景技术：
近年来，随着社会经济的发展，人们生活水平提高，对于各种酒精饮料的消费量也日渐增多，酗酒导致的酒精性肝病(ald)的发病率随之增长。在中国，ald已经成为继hbv感染之后的第二大肝脏病因，对ald的发病机制、治疗手段和相关药物的研究也逐渐成为热点。ald具有非常典型的发病历程，初期通常表现为脂肪肝，随后是肝脏的脂肪变性，后期可发展为肝纤维化乃至肝硬化。
肝星状细胞(hsc)在肝纤维化发病过程中扮演着最关键的角色。hsc是肝脏的贮脂细胞，正常情况下表现为富含脂滴的静止状态，当乙醇进入体内后，在肝脏中由乙醇脱氢酶代谢为乙醛，后者是激活hsc并导致肝纤维化发生的关键分子。肝纤维化虽然是是肝硬化的必经阶段，但此过程是可逆的，因此，预防和抑制纤维化的发生和发展引起广大医药学工作者的重视。由于hsc在纤维化过程中的中心地位，大多数研究都将目光聚焦到了hsc上。现有技术中急需实现直接抑制纤维化组织形成的关键细胞——肝星状细胞(hsc)。
技术实现要素：
本发明提供一种用于预防肝纤维化的药物及其制备方法，解决现有技术中急需实现直接抑制纤维化组织形成的关键细胞的技术问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种用于预防肝纤维化的药物，包括：当归提取物13-20，红花提取物8-13份，干姜5-10份，皂荚果实提取物9-18份，川芎提取物7-14份。
一种用于预防肝纤维化的药物的其制备方法，包括：
称取皂荚果实500g切碎，加入2000ml蒸馏水加热回流提取两次，第一次提取时间为1.5h，第二次提取时间为1h；
提取完成后过滤，合并滤液，真空浓缩，以获得皂荚果实粗提物；
皂荚果实粗提物溶于乙醇中加入20％盐酸水溶液水解并沉淀，过滤并用蒸馏水洗至中性，以获得粗品皂荚水提物aeg粗提物约5g，粗品乙醇复溶并加活性炭纯化，以获得皂荚水提物aeg。
本发明提供一种用于预防肝纤维化的药物及其制备方法，包括：当归提取物13-20，红花提取物8-13份，干姜5-10份，皂荚果实提取物9-18份，川芎提取物7-14份。本发明可直接抑制纤维化组织形成的关键细胞——肝星状细胞，具有减轻酒精引发的肝损伤及随后发生的纤维化病变的能力，通过保护肝脏，抑制酒精引发的肝损伤、脂肪变性和炎症，从而延缓进一步的肝脏纤维化的发病过程。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例的一种用于预防肝纤维化的药物的其制备方法的流程图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
本发明实施例提供了一种用于预防肝纤维化的药物，包括：当归提取物13-20，红花提取物8-13份，干姜5-10份，皂荚果实提取物9-18份，川芎提取物7-14份。
其中，皂荚果实提取物为皂荚水提物aeg。所述皂荚水提物aeg的浓度为10μm、30μm或100μm。
下面通过实验具体说明皂荚水提物对大鼠化学性或酒精性肝纤维化的治疗作用以及对肝星状细胞增殖活化的影响，如下：
1、实验动物及分组准备
实验动物wistar雄性大鼠70只，体质量200g左右，spf级，未受孕或未经产。由四川实验动物专委会提供[scxk(川)2013-14]。饲养于西华大学清洁级动物房，环境温度22-25℃，湿度40％，12h交替人工光照。常规啮齿类动物饲料，自由饮水。动物提前5d适应性喂养，试验前将动物随机排序并标记。
大鼠适应性饲养1周后按随机数字表法分为正常对照组、酒精+吡唑模型组、皂荚水提物(aeg)低剂组(5mg/kg/day，aeg-5)、中剂组(10mg/kg/day，aeg-10)、高剂量(20mg/kg/day，aeg-20)和阳性药(多烯磷脂胆碱,120mg/kg/day)对照组，共6组，每组10只以上。除正常对照组外，其他各组大鼠每日早晚2次予以62°二锅头酒10ml/kg/day、玉米油2ml/kg/day、吡唑25mg/kg/day混合物灌胃，正常对照组则每日早晚予以相应剂量的生理盐水灌胃。aeg低、中、高剂量组和阳性药对照组提前7d每天于中午灌胃给予相应剂量的药物，正常对照组和模型组给予相应剂量生理盐水灌胃。造模过程持续12周。
2、生物样本获取
造模12周后，乙醚麻醉动物，打开腹腔并在腹主动脉取血2ml左右，放血处死大鼠迅速取出肝脏。血液样本37℃温育20min后3000rpm离心5min，取上层血清于-20℃冻存。每份肝组织取右叶中间相同部分组织以4％甲醛溶液固定，其余肝组织加入10倍质量的生理盐水制成肝组织匀浆液。
3、指标监测
血清丙氨酸转氨酶(alt)和天冬氨酸转氨酶(ast)的活性使用自动生化分析仪按赖氏法测定；肝组织羟脯氨酸(hyp)含量使用羟脯氨酸测定试剂盒测定；用苏木素-伊红(he)染色和天狼星红(sr)染色观察各组大鼠肝损伤及纤维化的情况，应用imaeg-proplus6.0专业图像分析软件进行分析计算纤维所占面积的百分比；采用免疫组化法进行染色，测定大鼠肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)的表达，于光镜高倍视野下进行结果判定：阳性部位应定位于胞浆，每张切片随机选取5个互不重叠视野，同样应用imaeg-proplus6.0分析计算每个视野的阳性细胞面积，取其平均值。
4、细胞培养与mtt试验
永生的大鼠肝星状细胞hsc-t6购自atcc，培养条件为：dmem(加10％灭活胎牛血清、100iu/ml青霉素和100mg/ml链霉素)培养基，5％co2。aeg溶于dmso，用培养基稀释，终浓度分别为10μm、30μm和100μm的aeg与hsc-t6细胞共培养48h，并设置溶剂组。mtt法评估细胞活力，以酶标仪所测od值计算细胞活力。
5、实验结果如下：
(1)动物状态
正常对照组动物实验全程情况良好，毛色健康，精神无异常，无任何死亡。模型组动物体质量增长缓慢，皮毛蓬乱，精神状态差，极度嗜睡，至12周结束前共3只死于慢性乙醇中毒或严重肝损伤。aeg低剂组死亡3只，中剂和高剂组各死亡1只，阳性组死亡2只，整体状态明显好于模型组(见表1)。动物死亡率数据表明，较高剂量的aeg(中高剂)能有效的降低由慢性酒精中毒和酒精与佐剂诱发的肝损伤造成的死亡，相对于常用的保肝药物(多烯磷脂胆碱)，效果可能更好。
表1试验期间动物死亡情况
(2)肝功能及羟脯氨酸含量
各实验组的血清转氨酶活性和肝组织hyp含量如表2所示，结果显示模型组alt和ast的活性明显升高，肝组织匀浆中的hyp含量也明显升高，提示该组动物存在严重的肝损伤并且有较多的纤维化组织，证明造模成功。aeg治疗组血清转氨酶和肝脏hyp含量都相应降低，尤其是中高剂量组的数据与模型组比较具有显著性差异，其中高剂组的转氨酶活力值甚至低于阳性对照。结果表明，aeg能改善酒精加佐剂导致的转氨酶升高的情况，且具有剂量依赖性，可能具有保护肝脏的作用；aeg还可以降低酒精性肝纤维化模型中肝脏hyp含量，提示aeg能够减轻肝纤维化的程度或延缓发病过程。
表2.aeg对血清alt、ast活性和肝脏hyp含量的影响
注：与正常对照组比较，#p＜0.05；与模型组比较，*p＜0.05。
(3)组织病理学结果
he染色观察各组大鼠肝组织一般形态，正常组he染色可见正常肝细胞组成肝索以中央静脉为中心呈放射状排列。模型组大鼠肝脏肝索紊乱，主要病理改变为脂肪变性和炎性细胞浸润(主要为嗜中性粒细胞)，形态上可见水样变性、气球样变性和点状坏死。其他各给药组情况好于模型组，尤其在aeg-12组可以看到各病理现象相比模型组明显改善，主要表现在肝细胞脂肪变性显著减轻、炎性细胞大量减少等。
sr染色结果显示正常组仅在汇管区和血管壁可见少量血管纤维；而模型组可见大量纤维存在于汇管区间和中央静脉间，纤维化组织面积较大；而aeg治疗组明显减少了胶原纤维的沉积，且具有剂量依赖性。
酒精及佐剂对大鼠肝脏造成损伤，从而激活肝星状细胞(hsc)分泌α-sma并形成胶原。免疫组化结果显示，模型组α-sma蛋白分泌量显著高于正常组，而治疗组α-sma蛋白分泌相对于模型组分别减少约0％(aeg-5)、25％(aeg-10)、37％(aeg-20)。
组织病理学检查结果表明，酒精、玉米油以及吡唑的持续摄入确实造成了大鼠肝脏的严重脂肪变性和炎性病变，大量肝细胞的损伤激活了肝内修复损伤的机制，其中hsc激活分泌α-sma形成纤维化组织是一种快速修复机制，但纤维化组织并无正常肝脏细胞的生理功能，大量的组织纤维化最终将发展成为肝硬化。在模型组中可以看到明显的纤维化形成，aeg的治疗对于在酒精加佐剂的情况下肝脏的脂肪变性、炎细胞浸润等损伤肝细胞的因素都有改善作用，肝损伤的减轻抑制了hsc的激活，减少了纤维化的形成，这种作用具有一定的剂量依赖性，进一步验证了aeg对于酒精诱导的肝纤维化的保护作用。
(4)mtt测试结果
不同浓度aeg对hsc-t6细胞的活力抑制作用见表3。由结果可知，aeg对hsc细胞活力有明显影响，且具有剂量依赖性。由于hsc为肝星状细胞，是形成纤维化组织的重要细胞，抑制其活力可以延缓肝纤维化进程，从而改善肝纤维化病情及预后。对hsc的抑制可能是aeg治疗酒精性肝纤维化的机制之一。
表3aeg对hsc活力的影响
注：*与溶剂组比较*p＜0.05
实验结果证明了aeg具有减轻酒精引发的肝损伤及随后发生的纤维化病变的能力，具有剂量依赖性。aeg减轻肝纤维化的机制通过保护肝脏，抑制酒精引发的肝损伤、脂肪变性和炎症，从而延缓进一步的肝脏纤维化的发病过程；另外，体外hsc活力试验也证明aeg也有直接抑制纤维化组织形成的关键细胞——肝星状细胞的功能。
本发明实施例还提供了一种用于预防肝纤维化的药物的其制备方法，如图1所示，包括：
步骤101、称取皂荚果实500g切碎，加入2000ml蒸馏水加热回流提取两次，第一次提取时间为1.5h，第二次提取时间为1h；
步骤102、提取完成后过滤，合并滤液，真空浓缩，以获得皂荚果实粗提物；
步骤103、皂荚果实粗提物溶于乙醇中加入20％盐酸水溶液水解并沉淀，过滤并用蒸馏水洗至中性，以获得粗品皂荚水提物aeg粗提物约5g，粗品乙醇复溶并加活性炭纯化，以获得皂荚水提物aeg。
以上对本发明进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。