本发明涉及一种可降解血管支架材料的制备方法，属于人工血管支架制备技术领域。
背景技术：
由心血管狭窄引起的冠心病目前正危及着人类的健康，其治疗方式主要有药物治疗、心脏搭桥手术以及微创介入治疗。药物治疗是一种保守治疗方法，见效慢，容易产生副作用，使病人产生依赖性。心脏搭桥术的创口大，愈合慢，大大增加了病人的痛苦。而经皮腔内冠状动脉成形术虽然能把病人术中所受创伤减至最小，但术后6～8个月时经常会出现支架内再狭窄。如何尽量减少并避免再狭窄的发生，已成为目前支架植入术考虑的首要问题，其中，支架材料的选择又显得尤为重要。目前常用的支架材料主要包括不可降解血管支架材料和可降解血管支架材料。不可降解血管支架材料主要有不锈钢、钴、钽和镍钛合金，这些金属支架材料在人体内不可降解，需要永久保留体内，增加了引发再狭窄的风险程度。
为了克服这个问题，可降解支架材料已经被许多研究学者所关注。可降解支架，在心血管疾病介入治疗中被认为是第四次革命。可降解支架可以满足治疗血管堵塞的理想支架的要求。可以疏导血管阻塞，对狭窄的血管维持几个月的支撑，以减少收缩性重塑引起的再狭窄现象；当病变血管度过再狭窄危险期后，可降解支架可以逐渐失去机械支撑能力，然后完全降解。血管内皮增生是引起再狭窄的一个主要原因，可降解支架可以作为抗增生药物的载体，增大载药量，抑制内皮增生。支架在体内可完全降解，不会像裸支架或者药物洗脱支架一样引起血栓，因此，可降解支架发生远期血栓的概率会显著降低。使用裸金属支架或者药物洗脱支架的病人，为了降低血栓形成的概率，病人在手术后需要长期接受抗血小板治疗，并且有可能发生出血等并发症，而使用可降解支架降低了抗血小板治疗的需要。生理学上，支架降解后，可以增强血管的舒张与收缩，有利于晚期血管腔面积的增加和扩大重塑等，而刚性的支架留在病变血管处，将阻碍血管的恢复和正常功能的执行。并且，从长远角度来看，可降解支架不会阻碍病人之后其它病变血管的治疗，比如冠状动脉旁路搭桥等。同时可降解支架也可以进行ct血管造影术或者mri成像，便于手术时和后期的临床观察。最后，可降解支架可以帮助病人消除顾虑一他们身体内永远有一个植入物。
常见的可降解支架材料主要有可降解高分子材料、纯铁和镁合金材料。高分子聚合物材料尽管作为支架材料具有很多优势，但是却不能保证在血管支架植入术后与血管具有相同的径向力，限制了它的回缩反弹。另外，该类支架在植入术时，无法用球囊完全扩张开，需要借助加热的办法，给病人带来其他不可预知的伤害。并且，高分子材料密度小，无法采用x光显影技术，植入术中很难定位支架。铁基支架材料虽能克服这些问题，但它在体内的降解速率较慢，无法达到血管修复与支架降解的同步性。因此，开发新型可降解血管支架材料势在必行。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题：针对现有支架材料在植入术中定位难和体内降解速率较慢的问题，提供了一种可降解血管支架材料的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
（1）将蜘蛛丝浸泡在无水乙醚和无水乙醇中2～3天，取出沥干得预处理蜘蛛丝；
（2）将预处理蜘蛛丝加入去离子水中煮沸6～8h，再转入碳酸钠溶液中并加热至95～100℃蒸煮30～40min，过滤洗涤干燥，得粗蜘蛛丝蛋白；
（3）将粗蜘蛛丝蛋白、无水乙醇加入质量分数为10%氯化钙溶液中，混合均匀后装入透析袋中透析，冷冻干燥得蜘蛛丝蛋白；
（4）取蜘蛛丝蛋白、可降解高分子聚合物、类人胶原蛋白，加入质量分数为98%甲酸溶液中搅拌20～30min，得纺丝液；
（5）将纺丝液吸入干燥的注射器中，将注射器固定在注射泵的卡槽内，高压直流电源连接注射器前端金属针头上，纺丝并干燥，得基底材料；
（6）将基底材料浸泡在肝素生理盐水中，在4℃下浸泡10～12h，再依次浸泡在壳聚糖醋酸缓冲液15～20min、磷酸缓冲盐溶液1～3min、肝素生理盐水15～20min、磷酸缓冲盐溶液1～3min，得层层自组装基材；
（7）将层层自组装基材加入脂肪干细胞悬浮液中，在37℃水浴振荡下孵育10～12h，孵育结束后用磷酸缓冲盐溶液清洗2～3次，得可降解血管支架材料。
步骤（2）所述碳酸钠溶液质量分数为0.05%，用量为预处理蜘蛛丝质量的25～100倍。
步骤（3）所述粗蜘蛛丝蛋白、无水乙醇、氯化钙溶液的重量份数为5～10份粗蜘蛛丝蛋白，10～20份无水乙醇，50～100份氯化钙溶液。
步骤（4）所述蜘蛛丝蛋白、可降解高分子聚合物、类人胶原蛋白、甲酸溶液的重量份为5～10份蜘蛛丝蛋白，85～190份可降解高分子聚合物，10～20份类人胶原蛋白，900～1800份甲酸溶液。
步骤（4）所述可降解高分子聚合物为聚乙醇酸、聚乳酸、聚乳酸羟基乙酸、聚已酸内酯、聚乙二醇、聚左旋乳酸、聚羟基丁酯、聚羟基辛酯、聚氨酯中的任意一种或多种。
步骤（5）所述纺丝参数为推进速度为0.3～1.0ml/h，纺丝电压为15～18kv，固化距离为15～18cm。
步骤（6）所述肝素生理盐水浓度为1～2mg/ml，壳聚糖醋酸缓冲液ph为5.5～6.0，磷酸缓冲盐溶液ph为7.0～7.5。
步骤（7）所述脂肪干细胞悬浮液细胞浓度为2×108/l。
本发明与其他方法相比，有益技术效果是：
（1）本发明以力学性能优异，柔韧性能和弹性远远优于人造纤维，具有良好的生物力学性能和细胞相容性的蜘蛛丝纤维为原料，提取蜘蛛丝蛋白结合能促进细胞黏附生长的类人胶原蛋白复配可降解高分子聚合物，通过静电纺丝工艺构建了血管支架基材，再采用层层自组装技术将肝素与壳聚糖构建成一种多层膜结构，有效预防血栓生成，同时负载脂肪干细胞，能够极大提高材料的生物相容性和生物力学性能；
（2）本发明制备的可降解血管支架材料负载具有多向分化潜能的多能干细胞，同时具有来源丰富、取材容易、对机体损伤小、体外增殖迅速和生物学性状稳定等优点，是理想的组织工程和再生治疗的脂肪干细胞，通过自我更新与分泌促血管生成生长因子，促进血管内皮细胞增殖，刺激提高周围组织血管生长及促进血管从周围组织长入生物材料，有利于植入体内存活与促进机体缺损部位的修复。
具体实施方式
将蜘蛛丝依次浸泡在无水乙醚和无水乙醇中2～3天，取出沥干得预处理蜘蛛丝，取10～20g预处理蜘蛛丝加入500～1000ml去离子中，加热煮沸6～8h，取出沥干后转入500～1000ml质量分数为0.05%碳酸钠溶液中，并加热至95～100℃蒸煮30～40min，过滤得滤渣并用去离子水洗涤滤渣2～3次，再置于干燥箱中，在70～80℃下干燥2～3h，得粗蜘蛛丝蛋白，取5～10g粗蜘蛛丝蛋白，加入50～100g质量分数为10%氯化钙溶液中，以300～400r/min搅拌20～30min，再加入10～20g无水乙醇，继续搅拌20～30min后装入透析袋中透析3～5天，每4～8h更换去离子水，透析结束后过滤得滤液，将滤液置于冷冻干燥箱中冷冻干燥10～20h，得蜘蛛丝蛋白，取5～10g蜘蛛丝蛋白，85～190g可降解高分子聚合物，10～20g类人胶原蛋白，加入900～1800g质量分数为98%甲酸溶液中，以300～400r/min搅拌20～30min，得纺丝液，将纺丝液吸入干燥的注射器中，将注射器固定在注射泵的卡槽内，高压直流电源连接注射器前端金属针头上，控制推进速度为0.3～1.0ml/h，纺丝电压为15～18kv，固化距离为15～18cm，纺丝结束后置于真空干燥箱中干燥，得基底材料，将基底材料依次浸泡在1～2mg/ml的肝素生理盐水中，在4℃下浸泡10～12h，再依次浸泡在1～2mg/ml的ph为5.5～6.0的壳聚糖醋酸缓冲液中15～20min、ph为7.0～7.5磷酸缓冲盐溶液中1～3min、1～2mg/ml的肝素生理盐水中15～20min、ph为7.0～7.5磷酸缓冲盐溶液中1～3min，得层层自组装基材，将层层自组装基材加入浓度为2×108/l脂肪干细胞悬浮液中，在37℃水浴振荡下孵育10～12h，孵育结束后用ph为7.0～7.5磷酸缓冲盐溶液清洗2～3次，得可降解血管支架材料。
实例1
将蜘蛛丝依次浸泡在无水乙醚和无水乙醇中2天，取出沥干得预处理蜘蛛丝，取10g预处理蜘蛛丝加入500ml去离子中，加热煮沸6h，取出沥干后转入500ml质量分数为0.05%碳酸钠溶液中，并加热至95℃蒸煮30min，过滤得滤渣并用去离子水洗涤滤渣2次，再置于干燥箱中，在70℃下干燥2h，得粗蜘蛛丝蛋白，取5g粗蜘蛛丝蛋白，加入50g质量分数为10%氯化钙溶液中，以300r/min搅拌20min，再加入10g无水乙醇，继续搅拌20min后装入透析袋中透析3天，每4h更换去离子水，透析结束后过滤得滤液，将滤液置于冷冻干燥箱中冷冻干燥10h，得蜘蛛丝蛋白，取5g蜘蛛丝蛋白，85g可降解高分子聚合物，10g类人胶原蛋白，加入900g质量分数为98%甲酸溶液中，以300r/min搅拌20min，得纺丝液，将纺丝液吸入干燥的注射器中，将注射器固定在注射泵的卡槽内，高压直流电源连接注射器前端金属针头上，控制推进速度为0.3ml/h，纺丝电压为15kv，固化距离为15cm，纺丝结束后置于真空干燥箱中干燥，得基底材料，将基底材料浸泡在1mg/ml的肝素生理盐水中，在4℃下浸泡10h，再依次浸泡在1mg/ml的ph为5.5的壳聚糖醋酸缓冲液中15min、ph为7.0磷酸缓冲盐溶液中1min、1mg/ml的肝素生理盐水中15min、ph为7.0磷酸缓冲盐溶液中1min，得层层自组装基材，将层层自组装基材加入浓度为2×108/l脂肪干细胞悬浮液中，在37℃水浴振荡下孵育10h，孵育结束后用ph为7.0磷酸缓冲盐溶液清洗2次，得可降解血管支架材料。
实例2
将蜘蛛丝依次浸泡在无水乙醚和无水乙醇中2天，取出沥干得预处理蜘蛛丝，取15g预处理蜘蛛丝加入750ml去离子中，加热煮沸7h，取出沥干后转入750ml质量分数为0.05%碳酸钠溶液中，并加热至98℃蒸煮35min，过滤得滤渣并用去离子水洗涤滤渣2次，再置于干燥箱中，在75℃下干燥2h，得粗蜘蛛丝蛋白，取8g粗蜘蛛丝蛋白，加入80g质量分数为10%氯化钙溶液中，以350r/min搅拌25min，再加入15g无水乙醇，继续搅拌25min后装入透析袋中透析4天，每6h更换去离子水，透析结束后过滤得滤液，将滤液置于冷冻干燥箱中冷冻干燥15h，得蜘蛛丝蛋白，取8g蜘蛛丝蛋白，135g可降解高分子聚合物，15g类人胶原蛋白，加入1350g质量分数为98%甲酸溶液中，以350r/min搅拌25min，得纺丝液，将纺丝液吸入干燥的注射器中，将注射器固定在注射泵的卡槽内，高压直流电源连接注射器前端金属针头上，控制推进速度为0.6ml/h，纺丝电压为16kv，固化距离为16cm，纺丝结束后置于真空干燥箱中干燥，得基底材料，将基底材料浸泡在1mg/ml的肝素生理盐水中，在4℃下浸泡11h，再依次浸泡在1mg/ml的ph为5.8的壳聚糖醋酸缓冲液18min、ph为7.2磷酸缓冲盐溶液2min、1mg/ml的肝素生理盐水18min、ph为7.2磷酸缓冲盐溶液中2min，得层层自组装基材，将层层自组装基材加入浓度为2×108/l脂肪干细胞悬浮液中，在37℃水浴振荡下孵育11h，孵育结束后用ph为7.2磷酸缓冲盐溶液清洗2次，得可降解血管支架材料。
实例3
将蜘蛛丝依次浸泡在无水乙醚和无水乙醇中3天，取出沥干得预处理蜘蛛丝，取20g预处理蜘蛛丝加入1000ml去离子中，加热煮沸8h，取出沥干后转入1000ml质量分数为0.05%碳酸钠溶液中，并加热至100℃蒸煮40min，过滤得滤渣并用去离子水洗涤滤渣3次，再置于干燥箱中，在80℃下干燥3h，得粗蜘蛛丝蛋白，取10g粗蜘蛛丝蛋白，加入100g质量分数为10%氯化钙溶液中，以400r/min搅拌30min，再加入20g无水乙醇，继续搅拌30min后装入透析袋中透析5天，每8h更换去离子水，透析结束后过滤得滤液，将滤液置于冷冻干燥箱中冷冻干燥20h，得蜘蛛丝蛋白，取10g蜘蛛丝蛋白，190g可降解高分子聚合物，20g类人胶原蛋白，加入1800g质量分数为98%甲酸溶液中，以400r/min搅拌30min，得纺丝液，将纺丝液吸入干燥的注射器中，将注射器固定在注射泵的卡槽内，高压直流电源连接注射器前端金属针头上，控制推进速度为1.0ml/h，纺丝电压为18kv，固化距离为18cm，纺丝结束后置于真空干燥箱中干燥，得基底材料，将基底材料浸泡在2mg/ml的肝素生理盐水中，在4℃下浸泡12h，再依次浸泡在2mg/ml的ph为6.0的壳聚糖醋酸缓冲液20min、ph为7.5磷酸缓冲盐溶液3min、2mg/ml的肝素生理盐水20min、ph为7.5磷酸缓冲盐溶液中3min，得层层自组装基材，将层层自组装基材加入浓度为2×108/l脂肪干细胞悬浮液中，在37℃水浴振荡下孵育12h，孵育结束后用ph为7.5磷酸缓冲盐溶液清洗3次，得可降解血管支架材料。
对照例：浙江某公司生产的可降解血管支架材料。
将实例及对照例的可降解血管支架材料进行检测，具体检测如下：
生物相容性皮下包埋试验：用于切片观察的样品为10mmxl0mm的膜材料。将膜与周围组织一同取出，置入福尔马林溶液中固定，进行石蜡切片、苏木精-伊红染色，分别于40倍及100倍光学显微镜下观察材料周围炎症反应。3次随机计数视野内切片材料周围组织单位面积内的炎性细胞数量，取平均值为该切片炎性细胞数量。
体内降解拉伸测试：拉伸测试采用英国instron公司的instron5565型静力材料试验机，感应器载荷量500n。设置拉伸速度为5mm/min，在25℃，相对湿度50%的环境下对样品进行测试。
具体检测结果如表1。
表1性能表征对比表
由表1可知，本发明制备的可降解血管支架材料随着包埋时间的延长，材料周围炎症细胞数量下降，降到最低，具有良好的组织相容性，并在降解后仍具有良好的拉伸强度，符合可降解支架材料的要求。