使用小檗碱纳米颗粒的免疫疾病治疗的制作方法
本申请要求2016年10月14日提交的美国临时申请62/408,541的权益，将其全部内容引入于此以作参考。
政府支持
本发明借助美国政府支持在国立卫生研究院授予的at002647和at001495下做出。美国政府享有本发明的一定的权利。
本公开涉及例如过敏等免疫疾病的治疗，并且更具体涉及例如过敏等免疫疾病的治疗。
背景技术：
ige介导的过敏性反应对于罹患食物过敏的人通常具有严重并且有时致命的健康后果。难以获得可显著减少ige的疗法。
ige在过敏性疾病例如食物过敏、过敏性哮喘、过敏性鼻炎、和许多其他过敏性疾病的病理中起核心作用。例如终身食物过敏或过敏性哮喘等持久过敏性疾病意味着长期存在变应原特异性ige并且减少ige的特异性疗法是非常有限的。用于哮喘和其他过敏性疾病的标准治疗对于许多患者为次优有效的，并且对于ige介导的食物过敏没有fda许可的药物。
考虑到长期类固醇的不利副作用，研究过敏性疾病的非类固醇治疗的开发是非常重要的。抗ige抗体的施用，其提供通过靶向ige分子来治疗过敏性疾病的另外的选择，已并入难以控制的哮喘的治疗。然而，因为尽管该治疗中和分泌的ige，但其并不阻止b细胞的ige产生，所以需要每月持续注射来维持效果。进行中的针对使用mige(膜结合的ige)靶向抗体的研究，所述抗体据称消耗ige-b细胞，然而早期使用奎利珠单抗(quilizumab)(在临床试验中研究的第一种该类型的生物制剂)的人体研究仅显示中度的ige减少并且无任何显著的临床益处。hendele等人，anti-immunoglobulinetherapywithomalizumabforasthma.ann.pharmacother.，2007，41，1397-410；luger等人，allergyforalifetime？allergol.int.，2010，59，1-8；gauvreau等人，targetingmembrane-expressedigebcellreceptorwithanantibodytothem1primeepitopereducesigeproduction.sci.transl.med.，2014，6，243ra85；harris等人，arandomizedtrialofquilizumabinadultswithrefractorychronicspontaneousurticaria.j.allergyclin.immunol.，2016，138(6)，1730–1732；harris等人，arandomizedtrialoftheefficacyandsafetyofquilizumabinadultswithinadequatelycontrolledallergicasthma.respir.res.，2016，17，29。
抑制b细胞产生ige、特别是记忆ige应答的方法，将是重要的新的抗ige疗法。在过去几年中显示出中药(tcm)配方fahf-2和ashmi对于食物过敏和哮喘为有效的替代疗法，其提供广泛的抗过敏免疫益处，包括变应原特异性ige和过敏性炎症的减少。srivastava等人.thechineseherbalmedicineformulafahf-2completelyblocksanaphylacticreactionsinamurinemodelofpeanutallergy.j.allergyclin.immunol.2005，115，171-8；srivastava等人，anti-asthmasimplifiedherbalmedicineintervention-inducedlong-lastingtolerancetoallergenexposureinanasthmamodelisinterferon-gamma，butnottransforminggrowthfactor-betadependent.clin.exp.allergy2010，40，1678-88。然而，需要继续研究来增加产品的易用性(ease)和效力。
小檗碱(bbr)为分离自黄檗(phellodendronamurens)的异喹啉生物碱化合物，是faha-2和丁醇精炼的fahf-2(b-fahf-2)的草本成分，显著减少通过来自食物过敏患者的人b细胞和外周血单核细胞(pbmc)的ige的产生。yang等人,berberineandlimoninsuppressigeproductionbyhumanbcellsandperipheralbloodmononuclearcellsfromfood-allergicpatients.ann.allergyasthmaimmunol.，2014，113，556-64.e4。其ic50值低至0.1962μg/ml。pbmc中的抑制为非细胞毒素方式，其与作为促进ige同种型转换的关键机制的ε种系转录物(εglt)表达的抑制相关。yang等人，berberineandlimoninsuppressigeproductionbyhumanbcellsandperipheralbloodmononuclearcellsfromfood-allergicpatients.ann.allergyasthmaimmunol.，2014，113，556-64.e4。该发现表明小檗碱可具有作为抗ige疗法开发的潜力。
尽管小檗碱为东亚最常用的草药之一，并且具有包括抗炎作用的各种药理活性，但其不良的生物利用度限制其临床应用。singh等人，berberineanditsderivatives:apatentreview(2009-2012).expert.opin.ther.pat.，2013，23，215-31。小檗碱的生物利用度通常为小于1％。godugu等人，approachestoimprovetheoralbioavailabilityandeffectsofnovelanticancerdrugsberberineandbetulinicacid.plosone，2014，9，e89919。这是由于小檗碱在肠道中具有弱的溶解性和吸收性，并且其具有由p-糖蛋白介导的从肠上皮细胞的高流出率(高达95％)。wei等人，intestinalabsorptionofberberineand8-hydroxydihydroberberineandtheireffectsonsugarabsorptioninratsmallintestine.j.huazhonguniv.sci.technolog.med.sci.，2014，34，186-9；zhang等人.intestinalabsorptionmechanismsofberberine,palmatine,jateorhizine,andcoptisine:involvementofp-glycoprotein.xenobiotica，2011，41，290-6。其还在第一次通过肝脏期间大部分代谢。guo等人,cyp2dplaysamajorroleinberberinemetabolisminliverofmiceandhumans.xenobiotica，2011，41，996-1005。已发现当小檗碱作为b-fahf-2的组分给予时，以小檗碱的剂量(cmax)和曲线下面积(auc)得到的最大小檗碱水平比单独给予的b-fahf-2中的小檗碱的双倍量的cmax和auc高出许多倍。因此，b-fahf-2中的一些组分增加小檗碱的生物利用度和/或降低其清除率。
已研究纳米医学技术作为增加小檗碱生物利用度的潜在的改进的递送方法。godugu等人，approachestoimprovetheoralbioavailabilityandeffectsofnovelanticancerdrugsberberineandbetulinicacid.plosone，2014，9，e89919；gui等人，preparationandevaluationofamicroemulsionfororaldeliveryofberberine.pharmazie，2008，63，516-9。
因此，已发现小檗碱能够直接抑制细胞培养物中的ige的产生，但由于不良的生物利用度，小檗碱用于ige的医学应用是有问题的。
技术实现要素：
本公开描述纳米颗粒小檗碱的口服施用，例如，包封在肝素/壳聚糖纳米颗粒中的小檗碱导致例如花生过敏的鼠科模型中显著并且持久的ige应答的减少。通过确定在肝素/壳聚糖纳米颗粒中递送的小檗碱的体内ige减少能力来试验该概念。
简而言之，通过简单离子胶凝法来制备小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒(bbr-nano)。该方法产生具有326μm的平均直径和约-19.79mv的zeta电位的纳米颗粒。与单独给予小檗碱的小鼠相比，给予一口服剂量的小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒的小鼠具有显著更高的血液中的小檗碱水平。对于体内试验，使用明矾作为佐剂将小鼠对花生全身敏化，随后使用两个口服疗程的小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒、单独的小檗碱或肝素/壳聚糖纳米颗粒进行治疗。已发现使用小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒但不使用单独的小檗碱治疗，导致显著且持续的花生特异性ige的减少。在治疗一周后可以观察到ige减少并且在停止治疗后持续至少20周。还可观察到总ige的减少，但总iga和花生特异性igg1/igg2a不减少。此外，用小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒治疗的小鼠对治疗后口腔花生激发(challenge)完全免于过敏症状并且不显示过敏反应相关的低体温症。最后，使用小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒治疗的小鼠在再刺激的脾细胞中显示较低的il-4和高ifn-γ产生以及增加的产生ifn-γ的cdt细胞的百分比。还观察到显著降低的小鼠foxp3启动子中的cpg残基的累积甲基化，表明抗过敏的并且调节的免疫环境的促进。使用纳米颗粒小檗碱、特别是小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒的治疗，代表一种用于ige介导的食物过敏的新疗法，由于其长期阻止ige应答的能力而具有治愈该病症的潜力。
因此，本公开提供了一种在有需要的受试者中治疗免疫疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的包括纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括包封在纳米颗粒中的小檗碱或小檗碱的类似物或衍生物、或其盐。在一些实施方案中，小檗碱、或其盐包封在纳米颗粒中。
在一些实施方案中，纳米颗粒包括阴离子聚合物。
在一些实施方案中，阴离子聚合物为阴离子多糖。
在一些实施方案中，阴离子聚合物为硫酸化多糖
在一些实施方案中，阴离子聚合物为阴离子氨基聚糖聚合物。
在一些实施方案中，阴离子聚合物为硫酸化氨基聚糖聚合物。
在一些实施方案中，纳米颗粒包括以重量计在约1:5至约5:5的范围内的、例如约1:5；约2:5；约3:5；约4:5或约5:5的比例的小檗碱、或小檗碱的类似物或衍生物、或其盐，和阴离子聚合物。
在一些实施方案中，纳米颗粒包括肝素。
在一些实施方案中，纳米颗粒包括以重量计在约1:5至约5:5的范围内的、例如约1:5；约2:5；约3:5；约4:5或约5:5的比例的小檗碱、或小檗碱的类似物或衍生物、或其盐，和肝素。
在一些实施方案中，纳米颗粒包括多糖。
在一些实施方案中，纳米颗粒包括脂多糖。
在一些实施方案中，纳米颗粒包括氨基糖苷聚合物。
在一些实施方案中，纳米颗粒包括壳聚糖。
在一些实施方案中，纳米颗粒包括小檗碱、肝素和壳聚糖。
在一些实施方案中，纳米颗粒包括以重量计约5:1至约5:5的、例如约5:1至约5:2.5、例如约5:1、约5:1.5、约5:2或约5:2.5的比例的肝素和壳聚糖。
在一些实施方案中，纳米颗粒包括以重量计约2:5:1.5、约3:5:1.5或约4:5:1.5的比例的小檗碱、肝素和壳聚糖。
在一些实施方案中，纳米颗粒具有约-10至约-50mv的范围内的zeta(ζ)电位，例如，约-10mv、约-15mv、约-20mv、约-25mv、约-30mv、约-35mv、约-40mv、约-45mv、或约-50mv的zeta(ζ)电位。
在一些实施方案中，纳米颗粒具有约5nm至约1000nm的范围内的平均粒径，例如，约10nm至约1000nm、约20nm至约1000nm、约50nm至约1000nm、约100nm至约1000nm、约200nm至约1000nm；例如，约100nm、约200nm、约300nm、约400nm、约500nm、约600nm、约700nm、约800nm、约900nm、或约1000nm的平均粒径。
在一些实施方案中，组合物为口服施用。组合物还可例如通过注射或通过吸入等施用。
在一些实施方案中，组合物为重复施用。
在一些实施方案中，组合物以约每日一次的频率施用。
在一些实施方案中，组合物以约每隔一日的频率施用。
在一些实施方案中，组合物以约每周两次的频率施用。
在一些实施方案中，组合物以约每周一次的频率施用。
在一些实施方案中，组合物以约每两周一次的频率施用。
在一些实施方案中，组合物以约每月两次的频率施用。
在一些实施方案中，组合物以约每月一次的频率施用。
在一些实施方案中，组合物以约每两个月一次的频率施用。
在一些实施方案中，组合物以约每三个月一次的频率施用。
在一些实施方案中，组合物以约每四个月一次的频率施用。
在一些实施方案中，组合物以约每五个月一次的频率施用。
在一些实施方案中，组合物以约每六个月一次的频率施用。
在一些实施方案中，组合物以约每年两次的频率施用(每半年地)。
在一些实施方案中，组合物以约每年一次的频率施用(每年地)。
在一些实施方案中，组合物以约每两年一次的频率施用(每两年地)。
在一些实施方案中，单次施用有效治疗免疫疾病至少约一周、至少约一个月、至少约六个月、至少约一年、或至少约两年。
在一些实施方案中，免疫疾病为ige介导的免疫疾病。
在一些实施方案中，免疫疾病为b细胞介导的免疫疾病。
在一些实施方案中，免疫病症选自过敏、哮喘、过敏性鼻炎、类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺病、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、银屑病、1型糖尿病、系统性红斑狼疮、格林巴利综合征、特应性皮炎、移植物抗宿主病和移植排斥。
在一些实施方案中，免疫疾病为过敏。
在一些实施方案中，免疫疾病为食物过敏。
在一些实施方案中，免疫疾病为针对花生、树坚果(treenuts)(例如，杏仁、巴西坚果、腰果、澳洲坚果、或胡桃)、大豆制品、乳制品、蛋制品、鱼制品、甲壳类动物制品、麸质或小麦制品的食物过敏。
在附图和下文描述中记述了本发明的一个以上的实施方案的细节。从描述和附图、以及从权利要求中本发明的其他特征、目的和优点将显而易见。
附图说明
图1为口服施用单独的小檗碱(bbr)或小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒(bbr-nano)后血浆小檗碱水平的图。小鼠过夜禁食。在口服施用一小时后，收集血液并且通过hplc测定血浆中的bbr水平。短线(bar)表示组平均值。n＝5只小鼠每组。***p<0.001vsbbr。
图2a为显示通过elisa测定的指定时间从10只小鼠抽取的血液中的血清中的花生特异性ige水平的图。数据显示为组平均值±sem。n＝8-10只小鼠/组*p<0.05；**p<0.01vs假手术组(sham)。
图2b为显示在20周治疗后测定的持续监测的小鼠的花生特异性的ige水平的图。图2b中的符号表示个体小鼠*p<0.05；**p<0.01vs假手术组。
图2c为显示通过elisa测定的血清中蛋清(egg-white)特异性ige的图。数据显示为组平均值±sem。n＝2-3只小鼠/组。
图3a-c为显示对全身或口腔花生激发的的过敏性反应的结果的图。图3a绘制了在治疗后第2、9、14和20周时激发后30分钟记录的症状评分。第2和14周的激发为全身的并且第9和20周的那些为口腔的。使用计分键(scoringkey)分配症状评分，0-没有症状；1-口鼻部和头部周围皮肤瘙痒，腹泻但无其他全身的症状；2-眼部和口鼻部周围浮肿，口鼻部周围发红，毛发直立(pilarerecti)，活动减少，和/或活动降低并且呼吸频率增加；3-呼吸困难，腹泻并伴有体温下降，和呼吸困难伴有体温下降和持续缺乏自主运动，但刺激后活动；4-呼吸困难，体温下降，口部周围发绀并且四肢伸展同时腹部搁在笼底，刺激、震颤和抽搐后最低限度的或无活动；5-死亡。短线为组中位数。图3b绘制了在分配症状评分后即刻使用直肠探头记录体温的图。箱形图显示组平均值和范围。图3c绘制了通过elisa测定的在记录症状评分后抽取的血液样品中的血浆组胺水平的图。短线为组平均值。n＝8-10只小鼠/组。*p<0.05；***p<0.001。
图4为通过elisa测定的总ige的治疗前和治疗后水平的图。短线表示组平均值±sem。n＝8-10只小鼠每组。
图5为通过elisa测定的a-总iga、b-花生特异性igg1和c-花生特异性igg2a的治疗前和治疗后水平的图。短线表示组平均值±sem。n＝8-10只小鼠每组。
图6a-c为显示通过elisa测定的花生-再刺激的脾细胞培养物中的细胞因子水平的图。图6a：il-4，图6b：ifnγ和图6c-ifn-γ/il-4比例。数据显示为组平均值±sem。**p<0.01；***p<0.001vs假手术组(n＝4-5只小鼠/组)。
图7a和b为对在小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒治疗的小鼠中显示增加的cd8t细胞群的花生-再刺激的脾细胞的分析的图。图7a为流式细胞术分析的代表性数据的描述，其显示产生ifn-γ的cd8t细胞的百分比。图7b为数据组的数值分析的图。数据显示为平均值±sem。*p<0.05；**p<0.01vs.假手术组。
图8为通过elisa测定的在指定时间抽取的血液的血清中通过elisa测定的血清中花生特异性ige水平的图。数据显示为平均值±sem。n＝3-5只小鼠/组*8p<0.01；***p<0.001vs假手术组。
图9a-e为小鼠foxp3启动子中cpg残基的治疗后甲基化百分比的图。图9a-d为显示通过从血液获得的亚硫酸氢盐转换的基因组dna的焦磷酸测序来评价foxp3启动子cpg的图。图9e为显示各个实验组的全部foxp3启动子cpg的累积甲基化的图。短线表示平均值±sem。n＝4-5只小鼠每组。*p<0.05vs假手术组。
图10为一对显示对全身花生激发的过敏性反应的图。左图为激发后30分钟记录的症状评分的图。使用本文所述的计分键分配症状评分；短线显示组中位数。左图为在分配症状评分后即刻使用直肠探头测定的体温的图；短线显示组平均值。n＝3-5只小鼠/组*＝p<005；***＝p<0.001。
图11为一对显示对口服花生激发的过敏性反应的图。左图为激发后30分钟记录的症状评分的图。使用本文所述的计分键分配症状评分；短线显示组中位数。左图为在分配症状评分后即刻使用直肠探头测定的体温的图；短线显示组平均值。n＝3-5只小鼠/组*＝p<005；***＝p<0.001。
具体实施方式
定义
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
除非另外特别指出，对于术语“例如”和其语法等同物，理解为遵从短语“并且没有限制”。
除非上下文明确另外指出，如本文使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物。
如本文使用的，术语“约”意为“大约”(例如，指示值加减约10％)。
小檗碱为来自苄基异喹啉类生物碱的原小檗碱组的季铵盐并且具有以下化学结构：
小檗碱可与药学上可接受的阴离子一起用作盐。本发明还可使用小檗碱类似物代替小檗碱来进行。小檗碱的类似物包括小檗碱的取代衍生物或同系物、或其他原小檗碱或苄基异喹啉类生物碱。
本文使用的术语“纳米颗粒”是指具有约1nm至约1000nm的粒径的颗粒。术语“纳米颗粒”还可指具有在约1000nm至约1mm范围内的粒径的“微粒”。
本文使用的术语“纳米颗粒粒径”是指在纳米颗粒的分布中的中值粒径。所述中值粒径是由单个纳米颗粒的平均线性尺寸确定的，例如，球形纳米颗粒的直径。粒径可通过本领域中的许多方法来确定，包括动态光散射(dls)和透射电子显微镜(tem)技术。在一些实施方案中，纳米颗粒具有约5至约1000nm、200至约500nm、和/或约200至约400nm的粒径。
术语“盐”包括任何离子形式的聚合物和一种或多种抗衡离子类(counterionicspecies)(阳离子和/或阴离子)。盐还包括两性离子聚合物(即，包含一种或多种阳离子和阴离子类的分子，例如，两性氨基酸)。在盐中存在的抗衡离子可包括任何阳离子、阴离子、或两性离子类。示例性阴离子包括但不限于氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、高氯酸盐、氯酸盐、亚氯酸盐、次氯酸盐、高碘酸盐、碘酸盐、亚碘酸盐、次碘酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、异烟酸盐、乙酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐(glucaronate)、糖二酸盐(saccharate)、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、三氟甲基苯磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对苯磺酸盐、对三氟甲磺酸盐、氢氧化物、铝酸盐和硼酸盐。示例性阳离子包括但不限于例如锂、钠、钾和铯等一价碱金属阳离子，和例如铍、镁、钙、锶和钡等二价碱土金属。还包括例如金、银、铜和锌等过渡金属阳离子，以及例如铵盐等非金属阳离子。可用于形成碱加成盐的典型有机胺类包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、和哌嗪等。
提及本文描述和公开的聚合物，被认为包括聚合物的游离酸、游离碱、和所有加成盐和配合物。当游离羧基和碱性氨基同时存在时，聚合物还可形成内盐或两性离子。术语“药学上可接受的盐”是指具有在提供药学应用中的效用的范围内的毒性特征的盐。在stahl等人，handbookofpharmaceuticalsalts:properties,selection,anduse，wiley-vch2002中描述合适的盐形式的制备和选择。
短语“药学上可接受的”在本文中用于指在合理的医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应、或其他问题或并发症且与合理的利益/风险比相称的那些聚合物、材料、组合物和/或剂型。
应理解的是，为了清楚起见，在单独的实施方案上下文中描述的本发明的某些特征，还可在单个实施方案中组合提供。相反地，为了简明起见，在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征，还可单独地或以任何合适的子组合提供。
缩略语
本文可使用以下缩略语：acoh(乙酸)；aq.(水性的)；atm.(气氛)；da(道尔顿)；dmf(n,n-二甲基甲酰胺)；dmso(二甲基亚砜)；et(乙基)；et3n或tea(三乙胺)；etoac(乙酸乙酯)；etoh(乙醇)；fbs(胎牛血清)；h(小时)；hplc(高效液相色谱法)；m(摩尔)；me(甲基)；mecn(乙腈)；meoh(甲醇)；mg(毫克)；min.(分钟)；ml(毫升)；mmol(毫摩尔)；mv(毫伏特)；mri(磁共振成像)；mn或mw(分子量)；n(正常)；nm(纳米)；nm(纳摩尔)；np(纳米颗粒)(包括单数或复数形式)；npn(正戊基)；npr(正丙基)；pbs(磷酸盐缓冲盐水)；rpm(每分钟转数)；s(秒)；t-bu(叔丁基)；ttfa(三氟乙酸)；thf(四氢呋喃)；μg(微克)；μl(微升)；μm(微摩尔)；wt(重量)；wt％(重量百分比)。
治疗方法
在本文所述的研究中，已令人惊讶地发现小檗碱、或小檗碱的类似物或衍生物、或小檗碱的盐、其类似物或衍生物的纳米颗粒剂型对于治疗免疫疾病例如食物过敏等过敏令人惊讶地有效。特别地，已令人惊讶地发现，使用小檗碱的纳米颗粒剂型来治疗免疫疾病例如食物过敏等过敏可提供持久的治疗和保护效果。
因此，本公开提供了在有需要的受试者中治疗免疫疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的包括纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包括小檗碱或小檗碱的类似物或衍生物、或小檗碱的盐、其类似物或衍生物。
在一些实施方案中，免疫病症选自过敏、哮喘、过敏性鼻炎、类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺病、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、银屑病、1型糖尿病、系统性红斑狼疮、格林巴利综合征、特应性皮炎、移植物抗宿主病和移植排斥。
在一些实施方案中，免疫疾病为ige介导的免疫疾病，例如，过敏。
在一些实施方案中，免疫疾病为b细胞介导的免疫疾病。
在一些实施方案中，免疫疾病为过敏。在一些实施方案中，可施用提供的含有包括小檗碱的类似物或衍生物、或小檗碱的盐、其类似物或衍生物的纳米颗粒的组合物来预防和/或延迟过敏反应的开始。通常，本文所述的纳米颗粒组合物可用于治疗和/或预防任何类型的过敏。在一些实施方案中，提供的纳米颗粒组合物可用于治疗和/或预防与一种以上的蛋白质变应原相关的过敏。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物可用于治疗例如针对花粉变应原、螨变应原、动物皮屑(例如，狗、猫)或排泄/分泌物(例如，唾液、尿)中的变应原、和真菌变应原等的那些过敏。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物可用于治疗与例如食物变应原等过敏性变应原相关的过敏，所述食物变应原包括但不限于坚果变应原类(例如，来自花生、胡桃、杏仁、美国山核桃、腰果、榛子、开心果、松子、巴西坚果)、乳制品变应原类(例如，来自蛋、乳)、种子变应原类(例如，来自芝麻、罂粟、芥末)、大豆、小麦、和鱼变应原类(例如，来自虾、螃蟹、龙虾、蛤、贻贝、牡蛎、扇贝、鳌虾)；昆虫变应原类，包括但不限于蜜蜂蛰伤、黄蜂蛰伤)、和橡胶变应原类(例如，来自乳胶)。
在一些实施方案中，免疫疾病为食物过敏。在一些实施方案中，免疫疾病为针对花生、树坚果(例如，杏仁、巴西坚果、腰果、澳洲坚果、或胡桃)、大豆制品、乳制品、蛋制品、鱼制品、甲壳类动物制品、麸质或小麦制品的食物过敏。
通过ige与食物中所含的特定蛋白质的相互作用来介导食物过敏。常见食物变应原的实例包括来自坚果类(例如，来自花生、胡桃、杏仁、美国山核桃、腰果、榛子、开心果、松子、巴西坚果)、乳制品类(例如，来自蛋、乳)、种子类(例如，来自芝麻、罂粟、芥末)、大豆、小麦、和鱼(例如，虾、螃蟹、龙虾、蛤、贻贝、牡蛎、扇贝、鳌虾)的蛋白质。常见昆虫变应原的实例包括但不限于来自例如跳蚤、蜱、蚁、蟑螂、和蜂等昆虫的蛋白质。
小檗碱、或小檗碱的类似物或衍生物、或小檗碱的盐、其类似物或衍生物的纳米颗粒制剂可用于通过向需要治疗的受试者施用有效量的包括纳米颗粒的组合物来减少对待治疗的过敏/变应原特异性的ige水平的治疗方法中，所述纳米颗粒包括小檗碱或小檗碱的类似物或衍生物、或小檗碱的盐、其类似物或衍生物。
小檗碱纳米颗粒
用于本文所述方法中的小檗碱纳米颗粒可包含包封在其中的小檗碱或小檗碱的类似物或衍生物、或小檗碱的盐、其类似物或衍生物。
小檗碱的类似物包括小檗碱的取代衍生物或同系物、或其他原小檗碱或苄基异喹啉类生物碱，例如，如grycova等人，quaternaryprotoberberinealkaloids，phytochemistry，2007，68，150-175中所公开的。盐可包括具有阴离子的盐，例如氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、高氯酸盐、氯酸盐、亚氯酸盐、次氯酸盐、高碘酸盐、碘酸盐、亚碘酸盐、次碘酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、异烟酸盐、乙酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖二酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、三氟甲基苯磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对苯磺酸盐、对三氟甲磺酸盐、氢氧化物、铝酸盐和硼酸盐。
在一些实施方案中，纳米颗粒包括例如阴离子聚合物、磷脂等表面活性剂。
在一些实施方案中，纳米颗粒包括阴离子聚合物。
在一些实施方案中，阴离子聚合物为阴离子多糖。
在一些实施方案中，阴离子聚合物为硫酸化多糖。
在一些实施方案中，阴离子聚合物为阴离子氨基聚糖聚合物。
在一些实施方案中，阴离子聚合物为硫酸化氨基聚糖聚合物。
在一些实施方案中，纳米颗粒包括以重量计在约1:5至约5:5的范围内的、例如约1:5；约2:5；约3:5；约4:5或约5:5的比例的小檗碱和阴离子聚合物。
合适的阴离子聚合物的实例包括肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、岩藻依聚糖、和透明质酸。
在一些实施方案中，纳米颗粒包括肝素。
在一些实施方案中，纳米颗粒包括以重量计在约1:5至约5:5的范围内的、例如约1:5；约2:5；约3:5；约4:5或约5:5的比例的小檗碱和肝素。
在一些实施方案中，纳米颗粒包括多糖。
在一些实施方案中，纳米颗粒包括脂多糖。
在一些实施方案中，纳米颗粒包括氨基糖苷聚合物。
在一些实施方案中，纳米颗粒包括壳聚糖。
在一些实施方案中，纳米颗粒包括小檗碱、肝素和壳聚糖。
在一些实施方案中，纳米颗粒包括以重量计约5:1至约5:5的、例如约5:1至约5:2.5、例如约5:1、约5:1.5、约5:2或约5:2.5的比例的肝素和壳聚糖。
在一些实施方案中，纳米颗粒包括以重量计约2:5:1.5、约3:5:1.5或约4:5:1.5的比例的小檗碱、肝素和壳聚糖。
在一些实施方案中，纳米颗粒可为使用壳聚糖和岩藻依聚糖-牛磺酸的缀合物的小檗碱纳米颗粒，例如，如wu等人，deliveryofberberineusingchitosan/fucoidan-taurineconjugatenanoparticlesfortreatmentofdefectiveintestinalepithelialtightjunctionbarrier，mar.drugs，2014，12，5677-5697中所描述的。在一些实施方案中，纳米颗粒可为纳米级的plga中的小檗碱纳米颗粒，例如，如khemani等人，encapsulationofberberineinnano-sizedplgasynthesizedbyemulsificationmethod,isrnnanotechnology,2012,articleid187354中所描述的。在一些实施方案中，纳米颗粒可为使用磷脂制备的纳米脂质体，例如，使用卵磷脂、胆固醇和磷酸双十六烷基酯制备的脂质。脂质体可以使用例如壳聚糖包衣。nguyen等人，chitosan-coatednano-liposomesfortheoraldeliveryofberberinehydrochloride.j.mater.chem.b，2014，2，7149-7159。
在一些实施方案中，纳米颗粒具有在约-10至约-50mv的范围内的zeta(ζ)电位，例如，约-10mv、约-15mv、约-20mv、约-25mv、约-30mv、约-35mv、约-40mv、约-45mv、或约-50mv的zeta(ζ)电位。
在一些实施方案中，纳米颗粒具有约5nm至约500nm的范围内的平均粒径。在一些实施方案中，纳米颗粒具有约5nm至约200nm的范围内的平均粒径。在一些实施方案中，纳米颗粒具有约10nm至约100nm的范围内的平均粒径。在一些实施方案中，纳米颗粒具有约20nm至约100nm的范围内的平均粒径。
在一些实施方案中，纳米颗粒具有约5nm至约1000nm的范围内的平均粒径，例如，约10nm至约1000nm、约20nm至约1000nm、约50nm至约1000nm、约100nm至约1000nm、约200nm至约1000nm；例如，约100nm、约200nm、约300nm、约400nm、约500nm、约600nm、约700nm、约800nm、约900nm、或约1000nm的平均粒径。
本文所述的纳米颗粒的平均粒径可为约1nm至约1000nm。在一些实施方案中，粒径在约5nm至约1000nm、约5nm至约500nm、约5nm至约400nm、约5nm至约300nm、约5nm至约200nm、约5nm至约100nm、约20nm至约200nm、约40nm至约200nm、约60nm至约200nm、约20nm至约180nm、约40nm至约180nm、约60nm至约180nm、约20nm至约160nm、约40nm至约160nm、约60nm至约160nm、和/或约75nm至约150nm的范围内。
在一些实施方案中，例如在组合物中，在群体中存在的纳米颗粒可具有实质上相同的形状和/或粒径(即，其为“单分散的”)。例如，颗粒可具有如下的分布，使得不超过约5％或约10％的纳米颗粒的直径比颗粒的平均直径大高于约10％，并且在一些情况下，使得不超过约8％、约5％、约3％、约1％、约0.3％、约0.1％、约0.03％、或约0.01％的颗粒的直径比纳米颗粒的平均直径大高于约10％。
在一些实施方案中，25％以下的纳米颗粒的直径与平均纳米颗粒直径相差为平均纳米直径的大于150％、100％、75％、50％、25％、20％、10％、或5％。通常希望产生在大小、形状和/或组成方面相对均一的纳米颗粒群，使得大部分纳米颗粒具有相似特性。例如，使用本文所述方法生产的至少80％、至少90％、或至少95％的纳米颗粒的直径或最大尺寸可落在平均直径或最大尺寸的5％、10％、或20％内。在一些实施方案中，纳米颗粒群的大小、形状、和/或组成可为不均一的。在这方面，参见，例如，wo2007/150030，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，纳米颗粒的形状为球形或实质上球形。
在一些实施方案中，纳米颗粒包括小檗碱、其类似物或衍生物、或小檗碱的盐、其类似物或衍生物以及例如肝素等的阴离子多糖和例如壳聚糖等的脂多糖。为了增加小檗碱的治疗效力并且无副作用，设计一些研究来增加其生物利用度。这些研究之一是产生用于药物运输的可负载的纳米颗粒。肝素是可用作抗凝药物的高度硫酸化的糖胺聚糖。除了其抗凝作用外，肝素还具有消炎和免疫调节作用。mousavi等人，anti-inflammatoryeffectsofheparinanditsderivatives:asystematicreview.adv.pharmacol.sci.，2015，2015，507151。许多研究已证明肝素的抗哮喘作用。avadi等人，preparationandcharacterizationofinsulinnanoparticlesusingchitosanandarabicgumwithionicgelationmethod.nanomedicine，2010，6，58-63。肝素具有可与阳性小檗碱相互作用形成纳米颗粒的阴性标记。但这些纳米颗粒似乎具有不均一的粒径分布以及椭圆环形。为了使小檗碱-肝素纳米颗粒更加适合，并入壳聚糖来形成小檗碱肝素壳聚糖杂交的纳米颗粒，其为球形并且具有相对均一的粒径分布。avadi等人exvivoevaluationofinsulinnanoparticlesusingchitosanandarabicgum.isrnpharm，2011；2011，860109。壳聚糖通过用碱氢氧化钠处理甲壳类动物的壳来产生，已显示用于组合药物的递送，并且已证实粘附并且打开上皮细胞之间的紧密连接，因此可潜在地增加包封的药物的生物利用度。chen等人recentadvancesinchitosan-basednanoparticlesfororaldeliveryofmacromolecules.adv.drugdeliv.rev.，2013，65，865-79；bowman等人differentialbiologicalandadjuvantactivitiesofcholeratoxinandescherichiacoliheat-labileenterotoxinhybrids.infect.immun.，2001，69，1528-35。
在一些实施方案中，可通过常规方法制备纳米颗粒。用于纳米颗粒制剂的方法的实例包括乳化，例如，通过离心、高速混合、或超声处理、或通过纳米沉淀技术。例如，可通过乳化包含小檗碱、肝素和壳聚糖的水溶液来制备包含小檗碱、肝素和壳聚糖的纳米颗粒。
其他配方成分
除包括本文所述的颗粒的成分外，组合物还可包含佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂、和分散剂。通过包含各种抗细菌和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、和苯酚山梨酸等可以确保预防微生物的活动。还可需要在组合物中包含例如糖等张力调节剂。另外，可通过包含例如单硬脂酸铝和明胶等延迟吸收的试剂来延长可注射药物剂型的吸收。
包含本文所述纳米颗粒的组合物可以各种形式施用，取决于待治疗的疾病或病症以及受试者的年龄、状况、和体重。例如，当组合物为口服施用时，其可配制为片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、或糖浆剂；或用于肠胃外施用时，其可配制为注射剂(静脉内、肌内、或皮下)、滴注制剂、或栓剂。对于通过眼粘膜途径施用，其可配置为滴眼剂或眼用软膏剂。这些剂型可通过常规方法结合本文所述方法来制备，并且，必要时可将活性成分与任何常规添加剂或赋形剂混合，例如，粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、增溶剂、悬浮助剂、乳化剂、或包衣剂。
片剂可通过压制或成形制成，任选地含有一种以上的辅助成分。压制的片剂还可使用惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，羟乙酸淀粉钠或交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备。成形的片剂可通过将惰性液体稀释剂湿润的粉末化合物的混合物在合适的机器中成形来制备。
用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆剂、和酏剂。除纳米颗粒外，液体剂型可包含例如水或其他溶剂等惰性稀释剂，增溶剂，和乳化剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油类(特别是棉籽、落花生、玉米、胚芽、橄榄、蓖麻、和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇、和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯、及其混合物。
除纳米颗粒外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄芪胶、及其混合物。
组合物在制造和贮存条件下应为稳定的并且必须防止例如细菌和真菌等微生物的污染。可通过在组合物中包含例如单硬脂酸铝和明胶等延迟吸收的试剂来延长可注射组合物的吸收。
剂量和给药
可改变本文提供的组合物中小檗碱的实际剂量水平，以便获得有效实现对特定受试者、组合物、和给药方式的期望的治疗反应且对受试者无毒的小檗碱、或小檗碱的类似物或衍生物、或其盐的量。小檗碱的含量应在组合物总体的0.1至90重量％的范围内，优选0.1至50重量％，即，足以实现下述特定剂量范围的量。
所述的包含小檗碱的剂型或组合物通常可包含推荐用于成人受试者的0.01至2000mg化合物的日剂量，并且其可以单剂量或以分剂量施用。可与载体材料组合来产生单剂型的小檗碱、或小檗碱的类似物或衍生物、或其盐的量通常将为产生治疗效果的小檗碱、小檗碱的类似物或衍生物、或其盐的量。在一些实施方案中，本文所述的纳米颗粒组合物可包含约0.01mg至约5000mg小檗碱、或小檗碱的类似物或衍生物、或其盐。本领域普通技术人员将理解的是，这体现了组合物包含的小檗碱、或小檗碱的类似物或衍生物、或其盐为约0.01mg至0.1mg、约0.1mg至约1mg、约1mg至约5mg、约5mg至约10mg、约10mg至约15mg、约15mg至约20mg、约20mg至约25mg、约25mg至约30mg、约30mg至约35mg、约35mg至约40mg、约40mg至约45mg、或约45mg至约50mg、约50mg至约100mg、约100mg至约200mg、约200mg至约300mg、约300mg至约400mg、约400mg至约500mg、约500mg至约1000mg、约1000mg至约2000mg、约2000mg至约3000mg、约3000mg至约4000mg或约4000mg至约5000mg。
组合物可以单次施用，或可分为许多小剂量每隔一段时间施用。应理解，精确剂量和治疗持续时间是待治疗疾病的函数，并且可使用公知的试验方案或通过体内或体外试验数据的外推来凭经验确定。应注意，浓度和剂量值还可随病症严重程度的减轻而改变。应进一步理解，对于任何特定受试者，应根据个体需求和施用或指导组合物施用的人员的专业判断随时间调整具体的剂量方案，并且本文提出的浓度范围仅为示例性的，并非旨在限制所要求保护的组合物的范围或实施。
在给定受试者的治疗效果方面将产生最有效结果的组合物的精确施用时间和/或量将取决于特定药物分子的活性、药物代谢动力学、和生物利用度、受试者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体状况、对给定剂量的响应能力、和药物种类)、给药途径等。然而，上述指南可用作微调治疗的基础，例如，确定施用的最佳时间和/或量，其仅需要由监测受试者和调节剂量和/或时间组成的常规实验。
组合物可与施用说明书一起包含在容器、包装、或分配器中。
在一些实施方案中，组合物为口服施用。组合物还可例如肠胃外地，通过注射或通过吸入施用。
在一些实施方案中，组合物为重复施用。
在一些实施方案中，组合物以约每日四次的频率施用。
在一些实施方案中，组合物以约每日三次的频率施用。
在一些实施方案中，组合物以约每日两次的频率施用。
在一些实施方案中，组合物以约每日一次的频率施用。
使用包括本文所述的小檗碱或小檗碱的类似物或衍生物、或小檗碱的盐、其类似物或衍生物的纳米颗粒的一个特别的优点为可通过使用纳米颗粒制剂来获得持久的治疗效果。这可允许通过以每日一次或更低的频率施用组合物来进行治疗。
在一些实施方案中，组合物以约每隔一日的频率施用。
在一些实施方案中，组合物以约每周两次的频率施用。
在一些实施方案中，组合物以约每周一次的频率施用。
在一些实施方案中，组合物以约每两周一次的频率施用。
在一些实施方案中，组合物以约每个月两次的频率施用。
在一些实施方案中，组合物以约每个月一次的频率施用。
在一些实施方案中，组合物以约每两个月一次的频率施用。
在一些实施方案中，组合物以约每三个月一次的频率施用。
在一些实施方案中，组合物以约每四个月一次的频率施用。
在一些实施方案中，组合物以约每五个月一次的频率施用。
在一些实施方案中，组合物以约每六个月一次的频率施用。
在一些实施方案中，组合物以约每年两次的频率施用(每半年地)。
在一些实施方案中，组合物以约每年一次的频率施用(每年地)。
在一些实施方案中，组合物以约每两年一次的频率施用(每两年地)。
在一些实施方案中，单次施用有效治疗免疫疾病至少约一周、至少约一个月、至少约六个月、至少约一年、或至少约两年。
将通过具体实施例更详细地描述本发明。提供以下实施例是为了说明的目的，并非旨在以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易地认识到改变或修改各种非关键参数可产生实质上相同的结果。
实施例
材料和方法
纳米颗粒的制备
小檗碱氯化物、肝素(范围从17,000kda至19,000kda)和壳聚糖(低分子量，75-85％脱乙酰基化)购自sigmaaldrich(st.louis，mo，usa)，乙酸(冰的)和naoh(1n)购自fisherchemicals(robinsontownship，pa，usa)。全部其他化学品和试剂为分析级。通过在室温下磁力搅拌的简单离子胶凝法制备纳米颗粒(小檗碱/肝素/壳聚糖)的两种组合物。表1列出了纳米颗粒制备条件以及各个试验样品的测定的粒径分布和zeta电位值。首先，通过使用移液管尖端冲洗混合将不同重量比(小檗碱/肝素以重量计2:5、3:5、4:5)的水性小檗碱(2mgml-1)与水性肝素组合来制备小檗碱/肝素纳米颗粒(表1)。然后，通过添加小檗碱/肝素水溶液(0.5ml)至壳聚糖水溶液(0.5ml，ph6.0)以不同的重量比(小檗碱/肝素/壳聚糖以重量计2:5:1、3:5:1、4:5:1、2:5:1.5、3:5:1.5、4:5:1.5、2:5:2、3:5:2和4:5:2)来制备小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒。
负载小檗碱的纳米颗粒的特征
使用动态光散射分析仪(zetasizerzs90，malverninstruments，malvern，uk)测定所制备的纳米颗粒在di水中的粒径分布和zeta电位值。使用傅里叶变换红外光谱仪(shimadzuscientificinstruments，columbia，md)记录制备的纳米颗粒的ftir光谱。使用tem来检测纳米颗粒(小檗碱/肝素或小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒)的不同组合物的形态。将纳米颗粒悬浮液置于涂有碳的400目铜网上。在沉积后约2分钟，使用滤纸轻拍网格来去除表面水并用磷钨酸溶液负染色。
小檗碱的药物负载效率的确定
为了测定制备的纳米颗粒的小檗碱负载效率，所得的包含小檗碱负载的纳米颗粒的溶液在4℃下以16,000r.p.m离心1小时。通过高效液相色谱法(hplc)用uv检测器(juscoco.875-uv，东京，日本)和反相c18柱并且用乙腈-0.04mh3po4(42:58体积％)以1.0mlmin-1的流速洗脱，来分析上清液中游离小檗碱的量。使用下式计算纳米颗粒的小檗碱负载效率(le％)：le(％)＝(总小檗碱–游离小檗碱)/总小檗碱x100％
小鼠敏化、处理和激发方案
根据nrc生命科学委员会实验动物来源学会(instituteoflaboratoryanimalresourcescommissionoflifesciencesnrc)的动物护理及使用标准指南(standardguidelinesforthecareanduseofanimals)，将购自jacksonlaboratory(barharbor，me)的六周龄雌性c3h/hej小鼠在西奈山动物饲养所的无病原体设施中以无花生的饲料维持。guideforthecareanduseoflaboratoryanimals:nationalacademicpress,1996。如图1所示，使用混合有2mgalum(明矾)(thermofisher，nj)的0.5mg粗花生提取物(cpe)将小鼠全身敏化，一周一次持续三周。使用类似方案将一些小鼠对蛋清(eggwhite,ew)敏化。其后，以4周或2周阶段以指定时间中2周的间隔，施用bbr-纳米颗粒，每日口服治疗。如所示的，以约6周间隔使用全身或口腔激发周期性地激发小鼠。在一些实施方案中，在一天前然后在治疗期间每周两次给予小鼠100μg腹腔注射的抗cd8或抗ifnγ抗体。
超敏反应的评价
在30分钟内观察过敏性症状然后使用0-5级来评分反应：0-没有症状；1-口鼻部和头部周围皮肤瘙痒，腹泻但无其他全身的症状；2-眼部和口鼻部周围浮肿，口鼻部周围发红，毛发直立，活动减少，和/或活动降低并且呼吸频率增加；3-呼吸困难，腹泻并伴有体温下降，和呼吸困难伴有体温下降和持续缺乏自主运动，但刺激后活动；4-呼吸困难，体温下降，口部周围发绀并且四肢伸展同时腹部搁在笼底，刺激、震颤和抽搐后最低限度的或无活动；5-死亡。评分1的反应定义为温和，评分2为中等至严重，评分3-4为严重，评分5为非常严重。
花生和蛋清特异性免疫球蛋白的测定
用花生或蛋清(样品孔)的脱脂蛋白提取物和大鼠抗小鼠ige(参照孔)包被微量滴定板，并且在4℃下保持过夜。在清洗三次后，使用2％bsa-pbs在室温下封闭板2小时。在清洗三次后，使用稀释的血清样品在4℃下过夜培养板。添加生物素化的抗ige至板中，接着添加抗生物素蛋白-过氧化物酶和abts底物。使用抗原捕获法来检测wn特异性ige。简而言之，使用抗ige抗体包被微量滴定板并且在4℃下保持过夜。在清洗三次后，如上所述封闭板。然后清洗板，并添加稀释的血清或小鼠ige并且在4℃下过夜培养。清洗后，添加生物素化的wn提取物至样品孔，并且添加生物素化的抗ige至参照孔。最后，通过添加抗生物素蛋白-hrp接着abts底物来显色所有的孔。如在先的出版物中所述测定总iga、花生特异性igg1和igg2a水平。srivastava等人efficacy,safetyandimmunologicalactionsofbutanol-extractedfoodallergyherbalformula-2onpeanutanaphylaxis.clin.exp.allergy，2011，41，582-91；lee等人，oraladministrationofil-12suppressesanaphylacticreactionsinamurinemodelofpeanuthypersensitivity.clin.immunol.，2001，101，220-8。脾细胞培养和细胞因子测定
在实验结束时，将小鼠安乐死并在组织培养条件下用200μg/mlcpe或单独的培养基来培养脾细胞的单细胞悬浮液72小时。收集上清液并且在-80℃下贮存至使用。根据制造商的说明书，通过市售的elisa(bdbiosciences)来测定il-4和ifnγ。
流式细胞术
清洗培养的脾细胞并处理来用于流式细胞术分析。在fc-block存在的情况下，将细胞对细胞表面标志物(cd3、cd8、cd4)进行荧光染色。清洗后，固定细胞并透化并且对ifnγ进行细胞内染色。使用facsdiva在lsrii流式细胞仪上获得数据并且通过flowjo分析。
cpg甲基化分析
在allprotect(qiagen，md)中保存的来自肠组织的基因组dna是使用allprepminidna试剂盒(qiagen，md)分离的。然后，将分离的dna使用epitectplusdnabisulfite试剂盒(qiagen，md)依照制造商的说明书进行亚硫酸氢盐转化。亚硫酸氢盐转化的dna用于通过pcr扩增启动子区域foxp3基因，其后使用pyromarkq24焦磷酸测序系统和pyromark软件(qiagen，md)对其进行焦磷酸测序来确定在相对于转录起始位点的-71、-62、-53、-50、-35处的cpg残基的甲基化百分比。使用以下的在先描述的pcr和测序引物。foxp3fwd：5’-tatatttttagatgatttgtaaagggtaaa(seqidno:1)，foxp3rev：5’-biotin-tcaccttaataaaataaactacta(seqidno:2)，测序引物：5’-aaaaaattggattattagaa(seqidno:3)。song等人，maternalallergyincreasessusceptibilitytooffspringallergyinassociationwithth2-biasedepigeneticalterationsinamousemodelofpeanutallergy.j.allergyclin.immunol.，2014，134，1339-45.e7；liu等人，theligasepias1restrictsnaturalregulatorytcelldifferentiationbyepigeneticrepression.science，2010，330，521-5；liu等人，combinedinhaleddieselexhaustparticlesandallergenexposurealtermethylationofthelpergenesandigeproductioninvivo.toxicol.sci.，2008，102，76-81。
统计学分析
使用graphpadprism分析数据。使用onewayanova来确定处理组之间的显著差异。使用学生t检验来分析选定组之间的差异。对于不正态分布的数据，使用mann-whitney检验和dunn后检验。pearson相关性用于回归分析。p值小于p≤0.05视为显著。
结果
实施例1.小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒制剂显著增强体内bbr摄取。
为了解决小檗碱的不良摄取和生物利用度，开发一种纳米颗粒递送方法。通过在肝素/壳聚糖的水性混合物中溶解小檗碱来制备2:4:1.5的比例的小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒。(表1)。这些纳米颗粒中小檗碱的载药量接近70％并且发现颗粒的物理特性在用于胃肠摄取的理想参数内。给予单一剂量的小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒的小鼠的血清小檗碱水平与单独给予小檗碱的小鼠相比显著增加(图1)。
实施例2.使用小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒治疗花生过敏小鼠显著并且持久地减少花生特异性ige水平。
全身花生敏化的小鼠接受2个疗程的口服小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒治疗并且定期测定ige水平。小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒治疗将花生特异性ige减少至可忽略或接近可忽略水平，其持续减少至治疗后9周并且接近0(图2a)。该效果延长至治疗后20周(图2b)。还发现，通过小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒治疗的ige减少不特异于花生过敏。蛋清过敏小鼠的小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒治疗导致ige的显著减少(图2c)。这些结果一起表明小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒的使用是适用于多种变应原的有效的减少ige的治疗。
实施例3.小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒提供针对全身或口腔花生激发诱导的过敏反应的保护。
使用小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒处理全身对花生敏化的小鼠，并且在治疗后2和14周时全身激发、和在治疗后9和20周时口腔激发(图3-c)。在各激发时评价症状评分(图3a)、体温(图3b)和血浆组胺(图3c)。在小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒处理组的小鼠在口腔花生激发后受到显著保护，并且仅一只小鼠在治疗后2周时具有过敏反应或相关低体温症的视觉迹象。在该组随后的激发中未观察到过敏反应的迹象(p<0.01-0.001vs.假手术组)。同样，小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒处理小鼠显著免于过敏反应相关低体温症(p<0.001vs.假手术组)，并且该组在所有激发中的血浆组胺水平显著低于假手术组小鼠(p<0.001vs.假手术组)。
实施例4.小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒治疗减少总ige水平，但不影响总iga或特异性igg1/igg2a水平
为了确定小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒治疗是否影响特异性ige以外的免疫球蛋白，评价血清总ige和iga。小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒处理的花生过敏小鼠表现减少的总ige(图4)但总iga不减少(图5a)。进一步地，对于花生特异性igg1/igg2a水平未观察到治疗效果(图5b、c)。这些数据显示小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒治疗选择性地靶向ige。
实施例5.小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒治疗给予有利的细胞因子谱
il-4为决定性的th2细胞因子，其在ige产生中起主要作用。th1细胞因子ifn-γ与过敏的自然发展相关。在花生再刺激的脾细胞培养物中评价细胞因子。在用小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒处理的小鼠中，il-4显著减少(图6a，p<0.01vs假手术组)，然而，ifn-γ观察到显著增加(图6b，p<0.01vs.假手术组)。ifn-γ/il-4比在小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒处理组中同样显著增加(图6c，p<0.01vs.假手术组)。
实施例6.cd8t细胞为小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒处理的小鼠中提高的ifn-γ的主要来源，并且对于小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒诱导的ige减少为功能上重要的。
观察到来自体内处理的小鼠的花生-再刺激的脾细胞培养物中增加的ifn-γ，调查了细胞来源。对花生-再刺激的脾细胞中的ifn-γ的染色的细胞内细胞因子的分析显示出cd8t细胞群在小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒处理的小鼠中增加(图7a和7b；p<0.01vs.假手术组；p<0.05vs.单独小檗碱)。还评价了cd8t细胞和ifn-γ对小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒治疗效果的功能贡献。使用在治疗前和治疗期间给予的消耗抗体，发现在给予cd8t细胞消耗抗体的小鼠中小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒的ige减少显著受损，并且用ifn-γ消耗抗体的在较少程度上受损(图8)。同种型对照抗体无效果。
实施例7.使用小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒处理的过敏小鼠显示出在foxp3启动子中cpg残基的去甲基化。
增强的treg谱(profile)与抗过敏治疗的有益且持久的结果相关。为了确定过敏小鼠的小檗碱处理是否建立正向treg谱，使用从小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒处理完成后2周时收集的外周血中分离的基因组dna来研究foxp3启动子中cpg残基的甲基化。发现来自小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒处理小鼠的样品中的几个foxp3启动子cpg残基的甲基化的百分比，当与假手术组小鼠或给予单独的小檗碱的小鼠相比时为减少的，以及在foxp3启动子中其他cpg处降低甲基化的趋势(图9a-d)。当累计评价时，小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒处理小鼠中甲基化水平显著低于假手术组小鼠中的(图9e)，表明治疗诱导的foxp3表达的提高，并且因此有利地改变调节性t细胞谱。
结论
目前的研究报告使用肝素/壳聚糖纳米颗粒中递送的小檗碱来减少ige的新方法。由于小于5％的小檗碱通过胃肠道摄入，需要增加小檗碱的gi保持的策略。上文已描述使用例如壳聚糖和肝素等粘膜粘着剂成分的小檗碱纳米颗粒。作为药物载体的纳米颗粒已显示出增强药物的口服摄取、延长其半衰期并且将药物靶向至淋巴器官。壳聚糖为天然存在的多糖并且为安全、生物相容且生物可降解的粘膜粘着剂聚合物。尽管肝素因其抗凝剂特性而闻名，其还为聚合物多糖，由于高负电荷目前被认为是用于药物载体开发的理想生物聚合物。另外，已报道肝素具有抗哮喘作用并且壳聚糖已被研究作为抗过敏治疗。使用通过肝素/壳聚糖纳米颗粒递送小檗碱表明小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒在鼠科花生过敏模型中显著抑制ige产生，甚至在一些小鼠中达到完全减少花生(pn)特异性ige产生的程度。血清花生特异性ige的有效消除不通过任何预先的干预来实现。治疗后持续的减少是独特并且令人惊叹的。此外，已发现，由于也在蛋清过敏小鼠中观察到益处，通过小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒治疗的ige减少不限制于花生过敏。这些现有数据是建立在先前出版的研究上的，该研究表明对培养的u266细胞(永生化人类ige+pc细胞系)和人类pbmc的小檗碱处理导致ige的显著减少。yang等人，berberineandlimoninsuppressigeproductionbyhumanbcellsandperipheralbloodmononuclearcellsfromfood-allergicpatients.ann.allergyasthma.immunol.，2014，113，556-64.e4。进一步发现，小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒还与未经处理的小鼠(
为了提供对小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒治疗减少ige的机理的理解，研究主要负责小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒处理的小鼠中的ifn-γ提高的ifn-γ-产生cd8t细胞的功能贡献。使用抗体消耗，已发现消耗cd8t细胞逆转小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒的ige减少，然而针对ifn-γ的抗体仅具有轻微效果。需要进一步的研究来阐明cd8t细胞如何调节ige产生。
先前的报道已提出，小鼠和人类中持久的ige水平可通过直接开发长寿命ige+pc和/或通过将igg1+b细胞连续转换至ige+b细胞然后继而转为短寿命ige+浆细胞来补充ige+pc池来维持。he等人，biologyofigeproduction:igecelldifferentiationandthememoryofigeresponses.curr.top.microbiol.immunol.，2015，388，1-19；erazo等人，uniquematurationprogramoftheigeresponseinvivo.immunity，2007，26，191-203；he等人，thedistinctivegerminalcenterphaseofige+blymphocyteslimitstheircontributiontotheclassicalmemoryresponse.j.exp.med.，2013，210，2755-71。无论其开发途径如何，ige+pc都表现出ige的高产量并且主要负责ige水平的维持。jackson等人，factorsregulatingimmunoglobulinproductionbynormalanddisease-associatedplasmacells.biomolecules，2015，5，20-40；wu等人，targetingigeproductioninmiceandhumans.curr.opin.immunol.，2014，31，8-15。因此，使用小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒的体内治疗可通过防止定向型ige+pc的产生或残存来减少ige+pc的数量和/或活性来负调节ige水平。可选地，小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒可通过诱导无反应性状态来起到封闭ige+pc中的ige合成的作用。关于我们在u266细胞中通过小檗碱来减少ige的数据表明小檗碱具有对ige-浆细胞功能的直接作用。我们正积极研究该效果背后的确定性信号传导机制。有趣的是，已发现体内小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒治疗导致小鼠foxp3启动子的cpg残基低甲基化，表明小檗碱可促进增强的treg应答。目前treg已显示出通过直接接触来负调节pc数量并且影响pc对fcγriib/免疫复合物介导的死亡的敏感性。jang等人foxp3+regulatorytcellscontrolhumoralautoimmunitybysuppressingthedevelopmentoflong-livedplasmacells.j.immunol.，2011，186，1546-53。重要的是，如在一项研究中所表明的，ige+pc似乎对treg抑制更敏感，该研究显示出人类b细胞/treg共培养导致ige减少但igg4水平提高。meiler等人distinctregulationofige,igg4andigabytregulatorycellsandtoll-likereceptors.allergy，2008，63，1455-63。因此，小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒治疗可具有对ige-产生浆细胞的直接或间接作用机制，还需要进一步研究。
总之，我们首次在全身和口腔激发后产生显著并且持久的ige应答降低和花生过敏的保护。还减少总ige至正常范围。重要的是，不影响iga和igg水平。其还诱导foxp3基因启动子的脱甲基化，表明在该模型中有利的表观基因组修饰。小檗碱/肝素/壳聚糖纳米颗粒治疗策略可具有实质上改变过敏治疗格局的潜力。
表1：小檗碱:肝素:壳聚糖纳米颗粒的各种组成的物理特征。
纳米颗粒形成的最佳比例和相关特征为红色。x-观察到聚集体形成。nd：未做。
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已描述本发明的许多实施方案。然而，应理解的是，在不背离本发明的精神和范围的情况下可作出各种修改。因此，其他实施方案在所附权利要求的范围内。本申请中引用的各参考文献，包括全部专利、专利申请、和出版物，以其全部内容通过引用并入本文。
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