靶向棕色脂肪组织的递药系统的制作方法

本发明涉及靶向棕色脂肪组织的递药系统，属于药物制剂技术领域。

背景技术：

随着社会经济的发展，肥胖已成为全球流行性疾病。在我国，随着生活水平的提高、生活方式的改变，肥胖患者数量也急剧上升，统计发现，目前我国居民肥胖的发生率已高达29％。而随着肥胖发生率的增高，肥胖相关疾病也相应增加，包括2型糖尿病、高血压、脂质代谢紊乱等，最终导致心脑血管疾病的显著增加。有数据显示，美国仅一年用于肥胖及其相关疾病的医疗费用就高达1170亿美元，这无疑给我们带来了沉重的社会压力和经济负担。因此，新型肥胖治疗手段的研发显得尤为重要。

肥胖主要表现为白色脂肪组织的过度生成和堆积，最初的研究表明，白色脂肪增多是机体代谢紊乱发生最关键的因素。既往观点认为，棕色脂肪作为一种非颤栗性产热器官仅存在新生儿和婴幼儿体内，随着年龄的增长棕色脂肪逐渐消退。而近年来随着PET-CT技术的应用，国内外临床研究均证实，成年人体内仍存在少量的棕色脂肪，主要散在分布在颈部、锁骨上、胸部纵膈内、胸椎管旁等区域。进一步的研究发现，棕色脂肪不仅仅是一个产热器官，其对机体能量代谢平衡起着关键作用，棕色脂肪数量的增加或其活性增强可以有效抵抗肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗等代谢紊乱状态，有效地增加棕色脂肪能够增加能量消耗，减少白色脂肪蓄积、减轻体重、改善代谢。因此，目前棕色脂肪成为治疗肥胖、机体代谢紊乱的新靶点。

然而，棕色脂肪在成年人体内的分布很少，能够明显增强和促进棕色脂肪活性的药物主要有儿茶酚类药物(如去甲肾上腺素)和甲状腺激素(T3)等。但是全身性使用这些药物增强棕色脂肪作用的同时会带来其他重要器官的严重毒副作用，其带来的弊端将远远大于增强棕色脂肪活性带来的益处。例如，去甲肾上腺素会对心血管、呼吸系统和消化系统产生非常广泛的影响，并有可能造成严重心律失常。同样，全身使用甲状腺激素会造成甲状腺激素功能亢进，从而对基本代谢功能、心血管、消化系统、骨骼肌肉系统都造成严重的不良影响。因此，增强棕色脂肪作用的最大难点在于如何将治疗药物特异靶向地运送至棕色脂肪组织，使药物作用锁定在棕色脂肪而不对其他脏器造成影响。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供靶向棕色脂肪组织的递药系统。

本发明提供了靶向棕色脂肪组织的递药系统，包含下述环肽与载体材料通过共价键连接得到的环肽-载体材料共价连接物：

Cys-Pro-Ala-Thr-Ala-Glu-Arg-Pro-Cys，其两个Cys形成二硫键。

进一步地，所述载体材料为聚乙二醇衍生物。

进一步地，所述载体材料选自聚乙二醇-磷脂(PEG-PE)、聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)、聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物(PEG-PLGA)、聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)、聚乙二醇-聚谷氨酸(PEG-PGA)、聚乙二醇-聚天冬氨酸(PEG-PAA)、聚乙二醇-聚赖氨酸(PEG-PL)、聚乙二醇-聚乙烯亚胺(PEG-PEI)中一种或两种以上的混合物。

优选地，所述聚乙二醇-磷脂为聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺。

优选地，所述聚乙二醇为甲氧基取代、羧基取代或马来酰亚胺基取代的聚乙二醇。

其中，所述甲氧基取代的聚乙二醇为CH3O(CH2CH2O)nH，所述羧基取代的聚乙二醇为HOOC(CH2CH2O)nH，所述马来酰亚胺基取代的聚乙二醇为Mal-(CH2CH2O)nH。

本发明中，连接基团的种类对载药系统的性质并没有影响，只要能将所述环肽和载体材料通过共价键连接的基团都可以应用于本发明。

进一步地，所述环肽与载体材料的马来酰亚胺基、巯基、氨基、羧基、生物素和/或亲和素基团形成共价键。

优选地，所述环肽与载体材料的马来酰亚胺基形成共价键。

本发明中，在靶向多肽的末端接一个游离的Cys，通过Cys的巯基直接与带Mal基团的载体材料连接，直接室温搅拌反应即可得到环肽-载体材料共价连接物。

进一步地，所述的递药系统还含有未经所述环肽修饰的载体材料，其与环肽-载体材料共价连接物的摩尔比为(0.001～1000)：1。

优选地，未经所述环肽修饰的载体材料：环肽-载体材料共价连接物的摩尔比为(1～99)：1。

所述摩尔比进一步优选为9：1。

进一步地，所述递药系统为聚合物纳米粒、脂质体或聚合物胶束。

本发明中，聚合物纳米粒是指天然或合成的高分子材料制成的、粒度在纳米级别的、具有核-壳结构的实心颗粒；聚合物胶束是合成的两亲性载体材料自发形成的空心颗粒。

进一步地，所述聚合物纳米粒的载体材料为聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物。

进一步地，所述脂质体的膜材料由下述摩尔百分比的组分组成：磷脂30％～70％，胆固醇10％～35％，未经环肽修饰的载体材料2％～10％，环肽-载体材料共价连接物0.1％～5％。

优选地，所述组分的摩尔比为：磷脂：胆固醇：未经环肽修饰的载体材料：环肽-载体材料共价连接物＝59：36：3：2。

进一步地，所述磷脂选自大豆磷脂、卵磷脂、合成磷脂中一种或两种以上的混合物。

优选地，所述合成磷脂选自磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油中一种或两种以上的混合物。

优选地，所述磷脂为大豆磷脂。

进一步地，所述载体材料为聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺。

进一步地，所述聚合物胶束由下述摩尔比的组分组成：未经环肽修饰的载体材料：环肽-载体材料共价连接物＝(1000:1)～(1000:10)。

优选地，所述聚合物胶束由下述摩尔比的组分组成：未经环肽修饰的载体材料：环肽-载体材料共价连接物＝9：1。

进一步地，所述载体材料为聚乙二醇-聚己内酯。

进一步地，所述递药系统的平均粒径为20～200nm。

进一步地，所述的递药系统还含有药品、保健品、日化用品或示踪剂中可接受的辅料。

进一步地，所述递药系统制备为口服剂型、注射剂型或外用剂型。

本发明提供了所述递药系统的制备方法，包括如下步骤：将所述环肽通过共价键连接于载体材料，得到环肽-载体材料共价连接物，再加入未经环肽修饰的载体材料，加入或不加入药品、保健品、日化用品或示踪剂中可接受的辅料，即得。

进一步地，采用乳化/挥发法制备聚合物纳米粒；或，采用薄膜水化法制备脂质体；或，采用薄膜水化法制备聚合物胶束。

本发明提供了所述递药系统在制备靶向棕色脂肪组织的药品、保健品、日化用品或示踪剂中的用途。

本发明提供了靶向棕色脂肪组织的制剂，是将活性成分和/或示踪成分包载于所述的递药系统制备而成的。

本发明中，所述活性成分和/或示踪成分以包裹或共价连接的方式包载于所述递药系统。

进一步地，所述活性成分选自儿茶酚胺类药物、糖皮质激素、甲状腺激素、SGLT-2抑制剂、PPAR-γ激动剂、黄连素或基因药物。

本发明所述基因药物主要是指具有治疗作用的重组多肽/蛋白、microRNA和siRNA。

进一步地，所述儿茶酚胺类药物为肾上腺素；所述糖皮质激素为地塞米松；所述甲状腺激素为三碘甲状腺原氨酸；所述SGLT-2抑制剂为坎格列净；所述PPAR-γ激动剂为罗格列酮。

进一步地，罗格列酮与脂质体膜材料总量的质量比为1：10。

进一步地，所述示踪成分为荧光染料。

优选地，所述示踪成分为DiD。

进一步地，DiD与脂质体膜材料总量的质量比为(0.02～2)：10。

优选地，DiD与脂质体膜材料总量的质量比为0.02：10。

本发明提供了下述环肽在制备靶向棕色脂肪组织的药品、保健品、日化用品或示踪剂中的用途：Cys-Pro-Ala-Thr-Ala-Glu-Arg-Pro-Cys，其两个Cys形成二硫键，其中，所述环肽通过共价键与载体材料连接。

本发明以环状短肽为靶向功能分子，提供了一种针对棕色脂肪组织的靶向递药系统，能够特异性地将治疗药物运送至棕色脂肪组织，提高疗效并降低毒副作用，为肥胖及其他代谢相关疾病的靶向治疗提供了新的方法，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例4中载罗格列酮的PEP3脂质体的电镜及粒径分布图；

图2为试验例1中PEP3脂质体与未经PEP3修饰的脂质体在正常小鼠棕色脂肪组织的分布情况图；

图3为试验例2中各组小鼠体重随时间的变化情况图；

图4为试验例2中棕色脂肪功能基因UCP1、Prdm16、Cidea、Dio2、PGC-1α的变化情况图。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

以下所述PEP3即本发明环肽：Cys-Pro-Ala-Thr-Ala-Glu-Arg-Pro-Cys，其两个Cys形成二硫键。

以下所述DiD即1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚二碳菁高氯酸盐(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindodi carbocyanine perchlorate)。

实施例1本发明聚合物纳米粒的制备

采用乳化/挥发法制备，准确称取18mg mPEG-PLGA，2mgCOOH-PEG-PLGA(分子量25000～30000)，溶解于1mL二氯甲烷中，加入5mL0.6％的胆酸钠，冰水浴下超声(5s，5s，10次)，37℃旋蒸除去有机溶剂，12000rpm离心30min后收集沉淀并将其分散于双蒸水中得到聚合物纳米粒。

PEP3-PEG-PLGA纳米粒的制备：上述纳米粒分别按100mmol/L和200mmol/L加入NHS和EDC，避光反应2h活化-COOH，加入0.5mg/mL的PEP3多肽溶液继续搅拌反应24h，过葡聚糖凝胶柱纯化并收集PEP3-PEG-PLGA纳米粒。采用激光粒度仪测定纳米粒的平均粒径和Zeta电位，透射电镜观察其形态，测得纳米粒的平均粒径为185.3±2.4nm，Zeta电位为-18mV。

实施例2本发明脂质体的制备

脂质体膜材料处方为：大豆磷脂(S100)/胆固醇(Chol)/甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-DSPE)/马来酰亚胺基聚乙二醇2000-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(Mal-PEG2000-DSPE)＝59：36：3：2，mol/mol。称取上述脂质材料溶解于适量氯仿中，减压旋蒸除去有机溶剂，真空干燥过夜，加入生理盐水水化脱膜，高压均质使其粒径变小、均匀。加入PEP3-Cys多肽溶液与脂质体室温搅拌反应2h，过葡聚糖凝胶柱除去未连接上的PEP3肽，即得PEP3-PEG脂质体。

实施例3本发明聚合物胶束的制备

称取10mg马来酰亚胺基聚乙二醇-聚己内酯(Mal-PEG-PCL，分子量8000～12000)和0.5mg PEP3-Cys肽，室温搅拌反应4h，以MCO＝10kDa的透析袋透析48h得到PEP3-PEG-PCL。采用薄膜法制备，称取9mg mPEG-PCL，1mgPEP3-PEG-PCL溶解于2mL乙腈，40℃减压旋蒸成膜，5％葡萄糖溶液水化脱膜即得PEP3-PEG-PCL聚合物胶束。

实施例4本发明载罗格列酮(Rosi)脂质体的制备

脂质体膜材料处方同实施例2，以脂质/药物质量比为10:1的比例加入模型药物Rosi，溶解于氯仿中，减压旋蒸除去有机溶剂，真空干燥过夜，加入生理盐水水化脱膜，高压均质使其粒径变小、均匀。加入PEP3-Cys多肽溶液与脂质体室温搅拌反应2h，过葡聚糖凝胶柱除去未连接上的PEP3肽，即得包载罗格列酮的PEP3-PEG脂质体。

超滤法测定罗格列酮胶束的包封率和载药量，测得其包封率为98.65％，载药量为2.4％；激光粒度仪测定其粒径分布，透射电镜观察其形态，结果见图1。

实施例5本发明载荧光染料DiD脂质体的制备

脂质体膜材料处方同实施例2，取10mg脂质体膜材料，加入20μg DiD，溶解于氯仿，减压旋蒸除去有机溶剂，真空干燥过夜，加入生理盐水水化脱膜，高压均质使其粒径变小、均匀。加入PEP3-Cys多肽溶液与脂质体室温搅拌反应2h，过葡聚糖凝胶柱除去未连接上的PEP3肽，即得包载DiD的PEP3-PEG脂质体。激光粒度仪测得DiD脂质体的粒径为75±2nm，Zeta电位为-20±2mV。超滤法测得DiD的包封率为99.48％。

以下通过试验例证明本发明的有益效果。

试验例1本发明递药系统对棕色脂肪组织的体内靶向性评价

正常小鼠分别静脉给予PEP3-PEG-DSPE脂质体/DiD和PEG-DSPE脂质体/DiD，其中，PEP3-PEG-DSPE脂质体/DiD根据实施例5制备，PEG-DSPE脂质体/DiD的膜材料处方组成为S100/Chol/mPEG2000-DSPE(59：36：5，mol/mol)，制备方法为：称取10mg上述脂质材料，加入20μg DiD，溶解于适量氯仿中，减压旋蒸除去有机溶剂，真空干燥过夜，加入生理盐水水化脱膜，高压均质使其粒径变小、均匀。

取8周龄的C57BL/6J雄性小鼠，尾静脉注射0.2mL/只(DiD的用量为200ug/kg小鼠体重)，给药后2h断颈处死小鼠，取新鲜组织(白色脂肪组织、皮下脂肪组织、棕色脂肪组织、心、肝、脾、肺、肾)，于活体成像仪上直接观察荧光强度，结果见图2。

结果显示，与未经PEP3修饰的PEG-脂质体相比，本发明PEP3-PEG-DSPE脂质体在棕色脂肪组织的荧光分布显著增强，证明该靶向脂质体可以靶向分布到棕色脂肪组织。

试验例2本发明递药系统对高脂饮食诱导肥胖小鼠的治疗效果

将50只6周龄的雄性C57BL/6J小鼠平均分为5组，标记为对照饮食组(CD组)，高脂饮食组(HFD)，游离Rosi组，载Rosi的PEG-DSPE脂质体组(PEG-DSPE脂质体/Rosi，制备方法：膜材料同实施例4，以脂质/药物比为10:1的比例加入模型药物Rosi，溶解于氯仿中，减压旋蒸除去有机溶剂，真空干燥过夜，加入生理盐水水化脱膜，高压均质使其粒径变小、均匀)，载Rosi的PEP3-PEG-DSPE脂质体组(根据实施例4制备)，CD组给予正常饮食，后4组均给予高脂饮食，并按Rosi 10mg/kg尾静脉给药，隔3天给药一次，共12周，记录模型小鼠的体重，结果见图3。在第10周采用口服葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验分析模型小鼠的胰岛素敏感性。上述小鼠处死后，取棕色脂肪组织进行RT-PCR检测棕色脂肪功能基因UCP1、Prdm16、Cidea、Dio2、PGC-1α的变化，结果见图4。

结果显示，载治疗药物罗格列酮的本发明纳米递药系统能够更有效地控制高脂饮食诱导的小鼠肥胖，并显著降低胰岛素抵抗。

序列表

<110> 四川大学华西医院

<120> 靶向棕色脂肪组织的递药系统

<130> A180029K

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Cys Pro Ala Thr Ala Glu Arg Pro Cys

1 5