一种绞股蓝皂苷、含有绞股蓝皂苷的健脑助眠口服液及其制备的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种绞股蓝皂苷、含有绞股蓝皂苷的健脑助眠口服液及其制备方法。

背景技术：

失眠是最常见的一种睡眠障碍，对人体机能、智力以及免疫力有巨大危害。长期失眠，不仅损害人的思维活动，而且会影响人的免疫系统，最终会缩短生命期。在临床上常用具有镇静催眠作用的化学合成药物治疗失眠。问卷结果表明，约44％的患者长期服苯二氮卓类(bdz)和巴比妥类药物催眠，但这些药物因具有副作用及成瘾性使其应用受到限制。

绞股蓝(gynostemmapentaphyliummakino)是葫芦科绞股蓝属植物的干燥根茎或者全草。绞股蓝具有降血脂、护肝、抗炎、保护心脑血管、催眠等药理活性，是一种常用中药。绞股蓝含有绞股蓝皂苷、黄酮类、糖类、蛋白质、脂肪、氨基酸、无机元素等成分，其中皂苷和糖类是主要的保健功效成分。中医药具有良好安神镇静作用，而且不良反应少，具有不成瘾，也不会产生依赖性、耐受性等显著优点，具有广阔应用前景。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种绞股蓝皂苷的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的绞股蓝皂苷。

本发明的再一目的在于提供一种含有上述绞股蓝皂苷的健脑助眠口服液。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种绞股蓝皂苷的制备方法，包含如下步骤：

(1)将干燥的绞股蓝全草粉碎过筛，得绞股蓝粗粉；

(2)采用乙醇溶液加热回流提取绞股蓝粗粉，然后将提取液离心，并将上清液浓缩，得到浓缩的绞股蓝乙醇粗提物浸膏；

(3)将绞股蓝乙醇粗提物浸膏用水溶解，加入有机溶剂进行萃取，去除含有色素的有机层，然后向水层中加入氯仿或乙酸乙酯继续进行萃取，去除有机层，得到水溶液；加入正丁醇进行萃取，收集正丁醇相；

(4)将正丁醇相浸膏用水溶解，作为上样液；将大孔树脂预处理后，将上样液加入大孔树脂中，采用水进行洗脱，再采用不同浓度的乙醇溶液梯度洗脱，收集不同浓度乙醇溶液洗脱所对应的各个组分，分别进行减压浓缩，干燥至恒重，收集50％乙醇溶液洗脱的组分即为绞股蓝皂苷。

50％乙醇洗脱的馏分总皂苷含量最高，即为绞股蓝皂苷。

步骤(1)中所述粉碎过筛为50～60目筛；

步骤(2)中所述乙醇溶液的体积分数为70～85％；优选为75％。

步骤(2)中所述乙醇溶液与绞股蓝粗粉的体积质量比为(10～20)ml:1g。

步骤(2)中所述加热回流提取的温度为90～100℃；所述加热回流提取的时间为2～4h。

步骤(2)中所述加热回流提取的次数为2～4次。

步骤(2)中所述离心的转速为3000～5000r/min；所述离心的时间为8～12min。

步骤(2)和(3)中所述浓缩为减压浓缩，浓缩的温度为40～60℃。

步骤(2)和(3)中所述减压浓缩的温度优选为50℃。

步骤(3)中所述绞股蓝乙醇粗提物浸膏用水溶解满足以下条件：绞股蓝粗粉与水质量体积比优选为200g：(1～3)l。

步骤(3)中所述有机溶剂为石油醚或乙醚中一种以上；优选为石油醚。

步骤(3)中所述加入有机溶剂进行萃取的次数为3～5次，每次萃取的时间为30～60min；所述加入氯仿或乙酸乙酯继续进行萃取的次数为3～5次，每次萃取的时间为30～60min；所述加入正丁醇进行萃取的次数为3～5次，每次萃取的时间为30～60min。

步骤(3)中萃取所用的有机溶剂、氯仿或乙酸乙酯以及正丁醇总的体积用量与溶解浸膏的水的体积比为(1～3)：(1～3)：(1～3)：(1～3)。

步骤(4)中所述大孔树脂选用d101树脂；使用d101树脂之前，需对其进行预处理：首先用95％乙醇浸泡树脂12h，待树脂充分溶胀后装入层析柱中。95％乙醇继续淋洗柱子至洗下来的乙醇澄清，再用蒸馏水洗脱至无醇味；用5％hcl洗脱4～5个柱体积，浸泡6h后用蒸馏水洗涤至洗出液为中性；最后用5％naoh洗脱4～5个柱体积，浸泡6h后用蒸馏水洗涤至洗出液为中性，待用。

步骤(4)中所述不同浓度乙醇溶液依次为30％乙醇溶液、50％乙醇溶液、70％乙醇溶液和95％乙醇溶液，即依次用30％乙醇溶液、50％乙醇溶液、70％乙醇溶液和95％乙醇溶液进行洗脱。30％乙醇溶液、50％乙醇溶液、70％乙醇溶液和95％乙醇溶液中百分数为乙醇的体积百分数。

一种绞股蓝皂苷，通过上述制备方法制备得到；

所述绞股蓝皂苷中，皂苷类物质的含量为67～68％(此皂苷含量为50％乙醇溶液洗脱得到的馏分中皂苷的含量)。

一种含有绞股蓝皂苷的健脑助眠口服液，包含如下按质量百分比计的组分：

上述绞股蓝皂苷80％～85％；

蜂蜜8％～10％；

水余量。

所述含有绞股蓝皂苷的健脑助眠口服液的制备方法，包含如下步骤：

将上述含有绞股蓝皂苷的健脑助眠口服液的各组分勾调，灭菌，得到含有绞股蓝皂苷的健脑助眠口服液；

所述的灭菌的条件优先为78～80℃下灭菌25min；

本发明对绞股蓝中具有安神催眠作用的有效物质进行分离和纯化，获得绞股蓝皂苷，将绞股蓝皂苷配制成健脑助眠口服液，并通过体内小鼠实验测试绞股蓝皂苷的活性和毒理作用，证明绞股蓝皂苷无毒副作用，疗效确切。该健脑助眠口服液可以用于因用脑过度、精神紧张、工作压力大造成的失眠、焦虑等症状，具有安神、健脑、催眠、益智等功效。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供的绞股蓝皂苷的制备方法简单易操作：通过将绞股蓝粉碎、加热回流、萃取、浓缩、大孔树脂分离纯化，即得到绞股蓝皂苷；有效成分保留的多；整个提取过程所涉及有机溶剂少，安全可控，具有对人体无毒害的优点。

(2)本发明提供的绞股蓝皂苷的制备方法制得的产物的收率有明显提高。

(3)本发明提供的含有绞股蓝皂苷的健脑助眠口服液含有绞股蓝助眠安神有效成分，无毒副作用，镇静安神疗效确切，可以用于因用脑过度、精神紧张、工作压力大造成的失眠、焦虑等症状。

附图说明

图1为本发明制备得到的含有绞股蓝皂苷的健脑助眠口服液对失眠模型小鼠不动时间的影响；

图2为本发明制备得到的含有绞股蓝皂苷的健脑助眠口服液对失眠模型小鼠睡眠时间的影响；图2a为睡眠潜伏期，图2b为睡眠时间；

图3为本发明制备得到的含有绞股蓝皂苷的健脑助眠口服液对失眠模型小鼠脑组织病理学的影响；

图4为本发明制备得到的含有绞股蓝皂苷的健脑助眠口服液对失眠模型小鼠下丘脑和海马5-ht1a，5-ht2a，gabaarα2，gabaarα3，gad65/67，il-6，tnf-α和il-1β基因和蛋白表达的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1从绞股蓝中制备得到绞股蓝皂苷

(1)将绞股蓝用粉碎机粉碎后，过60目筛，得绞股蓝粗粉备用；

(2)称取绞股蓝粗粉200g，于5000ml圆底烧瓶中，加入2000ml的体积分数为75％乙醇溶液，充分摇匀后，100℃保持微沸提取3h，停止加热，过滤，加热回流提取3次，合并滤液，采用离心机4000rpm，离心10min，将所得上清液用旋转蒸发仪在50℃的条件下减压浓缩，得到乙醇粗提物浸膏；

(3)将绞股蓝乙醇粗提物浸膏用1.5l蒸馏水溶解，加入0.5l的石油醚溶剂，充分震荡混匀，静置40min，待两相溶剂完全分层后，吸出上层的石油醚相，重复萃取四次(0.5l×3次)，弃去石油醚层，除去一些色素；在石油醚萃取后的溶液中即去除石油醚层的溶液中加入0.5l的乙酸乙酯溶剂，充分震荡混匀，静置40min，待两相溶剂完全分层后，吸出上层的乙酸乙酯相，重复萃取四次(0.5l×3次)，弃去乙酸乙酯层，除去黄酮、香豆素等中等极性的物质；在乙酸乙酯萃取后的溶液中加入0.5l的正丁醇溶剂，充分震荡混匀，静置40min，待两相溶剂完全分层后，吸出上层的正丁醇相，重复萃取四次(0.5l×3次)，合并所得正丁醇相萃取液，50℃减压浓缩蒸干，得到绞股蓝正丁醇相浸膏，回收正丁醇溶液；

(4)取适量正丁醇浸膏，用蒸馏水充分溶解(其中正丁醇浸膏与蒸馏水质量体积比为200g：1l)，离心，取上清作为上样液；将上样液用胶头滴管缓慢加入到d101树脂(d101树脂在使用前进行预处理，d101树脂的极性和孔径大小更利于分离纯化得到皂苷)上，用蒸馏水洗脱至样品层上方液无色，加棉花保护层；待样品吸附4h后，先用蒸馏水洗脱5个柱体积，除去糖和色素等水溶性杂质，再用30％的乙醇洗脱5个柱体积，除去一些酚类物质，最后用50％、70％和90％乙醇洗脱5个柱体积，减压浓缩回收乙醇；将50％乙醇洗脱馏分真空干燥，即为绞股蓝皂苷。所得产物(50％乙醇洗脱馏分)产率为25.6％。

实施例2从绞股蓝中制备得到绞股蓝皂苷

(1)将绞股蓝用粉碎机粉碎后，过60目筛，得绞股蓝粗粉备用；

(2)称取绞股蓝粗粉200g，于5000ml圆底烧瓶中，加入2000ml的体积分数为70％乙醇溶液，充分摇匀后，100℃保持微沸提取2h，停止加热，过滤，加热回流提取3次，合并滤液，采用离心机3000rpm，离心8min，将所得上清液用旋转蒸发仪在55℃的条件下减压浓缩，得到乙醇粗提物浸膏；

(3)将绞股蓝乙醇粗提物浸膏用1.8l蒸馏水溶解，加入0.6l的石油醚溶剂，充分震荡混匀，静置30min，待两相溶剂完全分层后，吸出上层的石油醚相，重复萃取三次(0.6l×3次)，弃去石油醚层，除去一些色素；在石油醚萃取后的溶液中加入0.6l的乙酸乙酯溶剂，充分震荡混匀，静置30min，待两相溶剂完全分层后，吸出上层的乙酸乙酯相，重复萃取三次(0.6l×3次)，弃去乙酸乙酯层，除去黄酮、香豆素等中等极性的物质；在乙酸乙酯萃取后的溶液中加入0.6l的正丁醇溶剂，充分震荡混匀，静置30min，待两相溶剂完全分层后，吸出上层的正丁醇相，重复萃取三次(0.6l×3次)，合并所得正丁醇相萃取液，55℃减压浓缩蒸干，得到绞股蓝正丁醇相浸膏，回收正丁醇溶液；

(4)取适量正丁醇浸膏，用蒸馏水充分溶解(其中正丁醇浸膏与蒸馏水质量体积比为200g：2l)，离心，取上清作为上样液。将上样液用胶头滴管缓慢加入到d101树脂上，用蒸馏水洗脱至样品层上方液无色，加棉花保护层；待样品吸附3h后，先用蒸馏水洗脱5个柱体积，除去糖和色素等水溶性杂质，再用30％的乙醇洗脱5个柱体积，除去一些酚类物质，最后用50％、70％和90％乙醇洗脱5个柱体积，减压浓缩回收乙醇；将50％乙醇洗脱馏分真空干燥，即为绞股蓝皂苷，所得产物(50％乙醇洗脱馏分)产率为27.4％。

实施例3从绞股蓝中制备得到绞股蓝皂苷

(1)将绞股蓝用粉碎机粉碎后，过60目筛，得绞股蓝粗粉备用；

(2)称取绞股蓝粗粉200g，于5000ml圆底烧瓶中，加入3000ml的体积分数为80％乙醇溶液，充分摇匀后，95℃保持微沸提取4h，停止加热，过滤，加热回流提取2次，合并滤液，采用离心机5000rpm，离心10min，将所得上清液用旋转蒸发仪在60℃的条件下减压浓缩，得到乙醇粗提物浸膏；

(3)将绞股蓝乙醇粗提物浸膏用3l蒸馏水溶解，加入1l的石油醚溶剂，充分震荡混匀，静置60min，待两相溶剂完全分层后，吸出上层的石油醚相，重复萃取三次(1l×3次)，弃去石油醚层，除去一些色素。在石油醚萃取后的溶液中加入1l的乙酸乙酯溶剂，充分震荡混匀，静置60min，待两相溶剂完全分层后，吸出上层的乙酸乙酯相，重复萃取三次(1l×3次)，弃去乙酸乙酯层，除去黄酮、香豆素等中等极性的物质；在乙酸乙酯萃取后的溶液中加入1l的正丁醇溶剂，充分震荡混匀，静置60min，待两相溶剂完全分层后，吸出上层的正丁醇相，重复萃取三次(1l×3次)，合并所得正丁醇相萃取液，60℃减压浓缩蒸干，得到绞股蓝正丁醇相浸膏，回收正丁醇溶液；

(4)取适量正丁醇浸膏，用蒸馏水充分溶解(其中正丁醇浸膏与蒸馏水质量体积比为为200g：3l)，离心，取上清作为上样液；将上样液用胶头滴管缓慢加入到d101树脂上，用蒸馏水洗脱至样品层上方液无色，加棉花保护层；待样品吸附4h后，先用蒸馏水洗脱5个柱体积，除去糖和色素等水溶性杂质，再用30％的乙醇洗脱5个柱体积，除去一些酚类物质，最后用50％、70％和90％乙醇洗脱5个柱体积，减压浓缩回收乙醇；将50％乙醇洗脱馏分真空干燥，即为绞股蓝皂苷，所得产物(50％乙醇洗脱馏分)产率为28.6％。

实施例4绞股蓝皂苷中皂苷类物质的定量实验：

标准曲线的制备：精密称取干燥恒重的人参皂苷rb1对照品(购自中国药品生物制品检定所)6.0mg，移至10ml容量瓶，以无水乙醇定容，配制成0.6mg/ml的对照品溶液。精密吸取人参皂普rb1对照品溶液(c＝0.6mg/ml)0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml于10ml具塞磨口试管中，在烘箱中挥干试剂，加入5％(质量百分比)香草醛-冰醋酸溶液0.2ml和高氯酸0.8ml，摇匀，60℃水浴加热20min，冰水浴中冷却3min，加入冰醋酸5ml，摇匀，随行试剂作空白，用分光光度计在540nm处测定吸光度值，以人参皂苷rb1浓度为横坐标，吸收度值为纵坐标，绘制标准曲线，结果发现人参皂苷rb1在0.01-0.06mg/ml范围内呈良好线性关系，得回归方程y＝8.11071x+0.00182，r²＝0.99945。

精密吸取实施例1、2和3制备得到的绞股蓝皂苷各0.5ml，置于10ml具塞磨口试管中，按照“标准曲线的制备”操作，通过上述标准曲线，求得皂苷类物质的含量：实施例1、2和3制备得到绞股蓝中皂苷类物质的含量分别为67.5％、67.1％、67.9％。

实施例5含有绞股蓝皂苷的健脑助眠口服液的制备

(1)勾调：将实施例1制备得到的绞股蓝皂苷、蜂蜜和水勾调混合；其中，绞股蓝皂苷、蜂蜜和水的质量百分比分别为80％、8％、12％；

(3)分装和灭菌：将步骤(1)勾调后的混合液进行管装，每支小瓶装10毫升。用巴斯德灭菌器进行消毒，80℃下消毒25min，再进行一次细菌数量卫生指标检验(参照标准是食品卫生质量标准)，合格贴标。每10支装一盒，每50盒装一箱。

成品贮存在低温、通风、干燥处，或贮存在4℃冰箱中，保质期长达6个月以上。

实施例6含有绞股蓝皂苷的健脑助眠口服液的制备

(1)勾调：将实施例1制备得到的绞股蓝皂苷、蜂蜜和水勾调混合；其中，绞股蓝皂苷、蜂蜜和水的质量百分比分别为82％、9％、9％；

(3)分装和灭菌：将步骤(1)勾调后的混合液进行管装，每支小瓶装10毫升。用巴斯德灭菌器进行消毒，78℃下消毒24min，再进行一次细菌数量卫生指标检验(参照标准是食品卫生质量标准)，合格贴标。每10支装一盒，每50盒装一箱。

成品贮存在低温、通风、干燥处，或贮存在4℃冰箱中，保质期长达6个月以上。

实施例7含有绞股蓝皂苷的健脑助眠口服液的制备

(1)勾调：将实施例1制备得到的绞股蓝皂苷、蜂蜜和水勾调混合；其中，绞股蓝皂苷、蜂蜜和水的质量百分比分别为85％、10％、5％；

(3)分装和灭菌：将步骤(1)勾调后的混合液进行管装，每支小瓶装10毫升。用巴斯德灭菌器进行消毒，79℃下消毒20min，再进行一次细菌数量卫生指标检验(参照标准是食品卫生质量标准)，合格贴标。每10支装一盒，每50盒装一箱。

成品贮存在低温、通风、干燥处，或贮存在4℃冰箱中，保质期长达6个月以上。

实施例8悬尾实验测定含有绞股蓝皂苷的健脑助眠口服液对小鼠不动时间的影响

雄性icr小鼠(购自济南朋悦实验动物繁育有限公司)48只，随机分为6组，每组8只。6组分别为正常空白对照组、失眠模型组、地西泮阳性对照组(2.5ml/kg)、健脑助眠口服液低剂量组(25ml/kg)、健脑助眠口服液中剂量组(50ml/kg)、健脑助眠口服液高剂量组(100ml/kg)。健脑助眠口服液由实施例5制备得到。失眠大鼠用化学试剂方法诱导，对除正常空白对照组以外的另外5组大鼠腹腔注射对氯苯丙氨酸(pcpa)混悬液(pcpa悬浮在0.5％的阿拉伯胶或弱碱性的生理盐水ph＝7-8中)，每日一次，连续注射2天。连续2天腹腔注射pcpa后，大鼠昼夜节律消失，白天活动增多，进食及饮水增多，表明失眠大鼠造模成功。

连续灌胃口服液8天后，进行小鼠悬尾实验，记录小鼠不动时间。不动时间记录为6分钟，检测最后4分钟内不动的持续时间。当小鼠停止四肢和身体活动时，它被认为是不动的，只做呼吸所需的动作。结果如图1所示。图1为本发明制备得到的含有绞股蓝皂苷的健脑助眠口服液对失眠模型小鼠不动时间的影响；control：正常空白对照组，model：失眠模型组，地西泮：地西泮阳性对照组(2.5ml/kg)，口服液低：健脑助眠口服液低剂量组(25ml/kg)，口服液中：健脑助眠口服液中剂量组(50ml/kg)，口服液高：健脑助眠口服液高剂量组(100ml/kg)。

结果表明各剂量健脑助眠口服液均可显著降低小鼠不动时间(图1)

实施例9测定含有绞股蓝皂苷的健脑助眠口服液对小鼠睡眠时间的影响

雄性icr小鼠(购自济南朋悦实验动物繁育有限公司)48只，随机分为6组，每组8只。6组分别为正常空白对照组、失眠模型组、地西泮阳性对照组(2.5ml/kg)、健脑助眠口服液低剂量组(25ml/kg)、健脑助眠口服液中剂量组(50ml/kg)、健脑助眠口服液高剂量组(100ml/kg)。健脑助眠口服液由实施例5制备得到。失眠大鼠用化学试剂方法诱导，对除正常空白对照组以外的另外5组大鼠腹腔注射对氯苯丙氨酸(pcpa)混悬液(pcpa悬浮在0.5％的阿拉伯胶或弱碱性的生理盐水ph＝7-8中)，每日一次，连续注射2天。连续2天腹腔注射pcpa后，大鼠昼夜节律消失，白天活动增多，进食及饮水增多，表明失眠大鼠造模成功。

连续灌胃口服液10天后，各组均腹腔注射预实验所得戊巴比妥钠阈上剂量，记录小鼠睡眠潜伏期及睡眠持续时间。将小鼠腹部向上身体保持垂直放在平板上，保持60s以上为翻正反射消失，从腹腔注射时间至翻正反射消失时间记为睡眠潜伏时间；小鼠60s内翻转过来2次以上视为翻正反射恢复，翻正反射消失至翻正反射恢复时间为睡眠持续时间。结果如图2所示。图2为本发明制备得到的含有绞股蓝皂苷的健脑助眠口服液对失眠模型小鼠睡眠时间的影响；图2a为睡眠潜伏期，图2b为睡眠时间。control：正常空白对照组，model：失眠模型组，地西泮：地西泮阳性对照组(2.5ml/kg)，口服液低：健脑助眠口服液低剂量组(25ml/kg)，口服液中：健脑助眠口服液中剂量组(50ml/kg)，口服液高：健脑助眠口服液高剂量组(100ml/kg)。

结果表明，各剂量健脑助眠口服液均可显著降低小鼠睡眠潜伏期(图2a)，增加小鼠睡眠时间(图2b)。

实施例10测定含有绞股蓝皂苷的健脑助眠口服液对小鼠脑组织病理学的影响

雄性icr小鼠(购自济南朋悦实验动物繁育有限公司)48只，随机分为6组，每组8只。6组分别为正常空白对照组、失眠模型组、地西泮阳性对照组(2.5ml/kg)、健脑助眠口服液低剂量组(25ml/kg)、健脑助眠口服液中剂量组(50ml/kg)、健脑助眠口服液高剂量组(100ml/kg)。健脑助眠口服液由实施例5制备得到。失眠大鼠用化学试剂方法诱导，对除正常空白对照组以外的另外5组大鼠腹腔注射对氯苯丙氨酸(pcpa)混悬液(pcpa悬浮在0.5％的阿拉伯胶或弱碱性的生理盐水ph＝7-8中)，每日一次，连续注射2天。连续2天腹腔注射pcpa后，大鼠昼夜节律消失，白天活动增多，进食及饮水增多，表明失眠大鼠造模成功。

连续灌胃口服液12天后，麻醉小鼠，快速取出小鼠全脑。将脑组织固定于10％中性福尔马林48h后，进行石蜡包埋，切片，he染色，最后采用光学显微镜观察。结果如图3所示。图3为本发明制备得到的含有绞股蓝皂苷的健脑助眠口服液对失眠模型小鼠脑组织病理学的影响。control：正常空白对照组，pcpa：失眠模型组，地西泮：地西泮阳性对照组(2.5ml/kg)，口服液低：健脑助眠口服液低剂量组(25ml/kg)，口服液中：健脑助眠口服液中剂量组(50ml/kg)，口服液高：健脑助眠口服液高剂量组(100ml/kg)。

结果表明，各剂量健脑助眠口服液均可显著改善睡眠剥夺小鼠的脑组织形态，对脑组织具有一定的保护作用。

实施例11测定含有绞股蓝皂苷的健脑助眠口服液对小鼠血浆神经递质、细胞因子、激素含量的影响

雄性icr小鼠(购自济南朋悦实验动物繁育有限公司)48只，随机分为6组，每组8只。6组分别为正常空白对照组、失眠模型组、地西泮阳性对照组(2.5ml/kg)、健脑助眠口服液低剂量组(25ml/kg)、健脑助眠口服液中剂量组(50ml/kg)、健脑助眠口服液高剂量组(100ml/kg)。健脑助眠口服液由实施例5制备得到。失眠大鼠用化学试剂方法诱导，对除正常空白对照组以外的另外5组大鼠腹腔注射对氯苯丙氨酸(pcpa)混悬液(pcpa悬浮在0.5％的阿拉伯胶或弱碱性的生理盐水ph＝7-8中)，每日一次，连续注射2天。连续2天腹腔注射pcpa后，大鼠昼夜节律消失，白天活动增多，进食及饮水增多，表明失眠大鼠造模成功。

连续灌胃口服液12天后，麻醉小鼠，摘眼球取血并分离血浆。按照说明书指定的操作方法检测血浆内血清素(5-ht)、多巴胺(da)、去甲肾上腺素(ne)、谷氨酸(glu)、白介素6(il-6)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白细胞介素1β(il-1β)、前列腺素d2(pgd2)含量。结果如表1所示。

空白对照组：正常空白对照组，模型组：失眠模型组，口服液低：健脑助眠口服液低剂量组(25ml/kg)，口服液中：健脑助眠口服液中剂量组(50ml/kg)，口服液高：健脑助眠口服液高剂量组(100ml/kg)。

结果表明，各剂量健脑助眠口服液均可不同程度调节失眠模型小鼠血清5-ht、da、ne、glu、il-6、tnf-α、il-1β和pgd2的含量。

表1健脑助眠口服液对神经递质、细胞因子、激素含量的影响

实施例12测定含有绞股蓝皂苷的健脑助眠口服液改善失眠模型小鼠睡眠作用机理的研究

雄性icr小鼠(购自济南朋悦实验动物繁育有限公司)48只，随机分为6组，每组8只。6组分别为正常空白对照组、失眠模型组、地西泮阳性对照组(2.5ml/kg)、健脑助眠口服液低剂量组(25ml/kg)、健脑助眠口服液中剂量组(50ml/kg)、健脑助眠口服液高剂量组(100ml/kg)。健脑助眠口服液由实施例5制备得到。失眠大鼠用化学试剂方法诱导，对除正常空白对照组以外的另外5组大鼠腹腔注射对氯苯丙氨酸(pcpa)混悬液(pcpa悬浮在0.5％的阿拉伯胶或弱碱性的生理盐水ph＝7-8中)，每日一次，连续注射2天。连续2天腹腔注射pcpa后，大鼠昼夜节律消失，白天活动增多，进食及饮水增多，表明失眠大鼠造模成功。

连续灌胃口服液12天后，麻醉小鼠，快速剥离小鼠下丘脑和海马组织，并对组织进行匀浆处理。采用rt-qpcr和westernblot检测健脑助眠口服液对小鼠下丘脑和海马5-ht1a，5-ht2a，gabaarα2，gabaarα3，gad65/67，il-6，tnf-α和il-1β表达的影响。如图4所示。图4为本发明制备得到的含有绞股蓝皂苷的健脑助眠口服液对失眠模型小鼠下丘脑和海马5-ht1a，

5-ht2a，gabaarα2，gabaarα3，gad65/67，il-6，tnf-α和il-1β基因和蛋白表达的影响。control：正常空白对照组，model：失眠模型组，地西泮：地西泮阳性对照组(2.5ml/kg)，口服液低：健脑助眠口服液低剂量组(25ml/kg)，口服液中：健脑助眠口服液中剂量组(50ml/kg)，口服液高：健脑助眠口服液高剂量组(100ml/kg)。

本实施例中小鼠相关基因mrna引物序列如表2所示。本发明中小鼠相关基因引物为常规因子(如：gapdh，5-ht1a，5-ht2a，gabaarα2，gabaarα3，il-6，tnf-α和il-1β)。

表2小鼠相关基因mrna引物序列

结果表明，各剂量健脑助眠口服液均可不同程度调节失眠模型小鼠下丘脑和海马5-ht1a(见图4中a-1,a-2,b-1和b-2),5-ht2a(见图4中c-1,c-2,d-1和d-2)，gabaarα2(见图4中e-1,e-2,f-和f-2)，gabaarα3(见图4中g-1,g-2,h-1和h-2)，il-6(见图4中i-1,i-2,j-1和j-2)，tnf-α(见图4中k-1,k-2,l-1和l-2)，il-1β(见图4中m-1,m-2,n-1和n-2)和gad65/67(见图4中o和p)的基因和蛋白表达水平。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华南理工大学

<120>一种绞股蓝皂苷、含有绞股蓝皂苷的健脑助眠口服液及其制备

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>gapdh上游引物

<400>1

tttgtcaagctcatttcctggtatg25

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>gapdh下游引物

<400>2

tgggatagggcctctcttgc20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>5-ht1a上游引物

<400>3

tactccactttcggcgcttt20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>5-ht1a下游引物

<400>4

ggctgaccattcaggctctt20

<210>5

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>5-ht2a上游引物

<400>5

gcaaccaggaggggcttat19

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>5-ht2a下游引物

<400>6

aagagccgcagggaaagtag20

<210>7

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>gabaarα2上游引物

<400>7

agattcaaagccactggaggaa22

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>gabaarα2下游引物

<400>8

gatgttagccagcaccaacc20

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>gabaarα3上游引物

<400>9

atgcctgcccactgaagttt20

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>gabaarα3下游引物

<400>10

gccatcctgtgctacttcca20

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>il-6上游引物

<400>11

tactcggcaaacctagtgcg20

<210>12

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>il-6下游引物

<400>12

gtgtcccaacattcatattgtcagt25

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>tnf-ɑ上游引物

<400>13

ggggattatggctcagggtc20

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>tnf-ɑ下游引物

<400>14

cgaggctccagtgaattcgg20

<210>15

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>il-1ß上游引物

<400>15

tgaagggctgcttccaaacctttgacc27

<210>16

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>il-1ß下游引物

<400>16

tgtccattgaggtggagagctttcagc27