一种GLUT12蛋白抑制剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种蛋白抑制剂，具体是一种glut12蛋白抑制剂及其制备方法及应用，属于医药技术领域。

背景技术：

膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤。是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一，占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位。

治疗膀胱癌常用的化疗方案有m-vap(甲氨蝶呤+长春花碱+阿霉素+顺铂)和gc(吉西他滨+顺铂)及mvp(甲氨蝶呤+长春花碱+顺铂)方案，化疗的有效率为40％～65％。在常用的化疗方案中，顺铂是治疗膀胱癌的首要化疗药物，然而长期使用此药物会引起癌细胞耐药，最终导致治疗失败。而且单一使用该化合物的毒性更大。

姜黄素是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种化学成分，其中，姜黄约含3％～6％，是植物界很稀少的具有二酮的色素，为二酮类化合物。医学研究表明，姜黄素具有降血脂、抗肿瘤、抗炎、利胆、抗氧化等作用。

前期的研究结果表明，glut12蛋白在膀胱癌组织或细胞中有高度表达，姜黄素能有效抑制glut12蛋白的表达，当姜黄素和顺铂联用时能显著增加该药物的抗膀胱癌活性。但glut12在膀胱癌肿瘤组织中的表达尚不是很清楚，目前尚无可用的glut12抑制剂。姜黄素作为一种成本低廉，毒性小，获取容易的化合物，使用它和顺铂的联用是一种和新颖的组合药物制剂。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种glut12蛋白抑制剂，该glut12蛋白抑制剂中的姜黄素成分能有效抑制改蛋白的表达，与成分中的顺铂联用能显著增加该药物的抗膀胱癌活性，同时还具有成本低廉，毒性小，稳定性佳等特点。

本发明的技术方案如下：一种glut12蛋白抑制剂，其组成为：顺铂0.1-1.0％，姜黄素0.8％-8％，注射用卵磷脂1％-3％，注射用大豆油5％-35％，亚硫酸钠0.1％-0.3％，甘油15％-20％，吐温-80-5％-9％，注射用水加至100％质量配比。

优选的，所述姜黄素的含量为：1-5％。

优选的，所述顺铂的含量为：0.1-0.5％。

本发明所述的glut12蛋白抑制剂，其制备方法包括如下步骤：

(1)油相的制备：分别向注射用大豆油中加入注射用卵磷脂、吐温-80，搅拌使其溶解，作为油相；

(2)初乳的制备：将顺铂、姜黄素以及亚硫酸钠加入水中，搅拌使之溶解，再将(1)中制备的油相加入水中，高速剪切分散，形成初乳；

(3)高压匀化：调节步骤(2)制得初乳的ph为7.2-7.5，高压匀化，得精乳；

(4)无菌过滤：精乳经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，无菌灌装，再经冷冻干燥，即得。

进一步优选的，所述初乳的ph为7.2。

进一步优选的，所述高速剪切分散所采用的转速为15000/min，分散时间为30min。

本发明的glut12蛋白抑制剂主要是应用于制备治疗膀胱癌的化疗药物。本发明的发明人团队前期针对glut12在肿瘤组织的表达以及姜黄素对glut2在膀胱癌细胞中的表达以及细胞转运、姜黄素和顺铂的抗癌协同作用开展了相关的研究。结果表明：姜黄素能有效抑制glut12在膀胱癌细胞中的表达以及细胞转运，姜黄素与顺铂有抗癌协同作用。实验过程如下：

1材料

1.1细胞人膀胱癌5637,j82以及ecv-304细胞均购自于南京凯基生物有限公司。sv-huc-1正常膀胱上皮细胞购自于上海江林生物科技有限公司。所有细胞实验过程中生长状况良好，均未发现有支原体感染的迹象。

1.2蛋白印记法检测glut12蛋白含量变化用含有不同浓度葡萄糖或抑制剂的培养基孵育人膀胱癌5637细胞6h后，选用提取蛋白试剂盒提取细胞总蛋白，再用bca蛋白定量试剂盒进行定量。选用合浓度的分离胶和浓缩胶进行sds-page电泳，然后选用硝酸纤维膜转移蛋白，再用5％的脱脂奶粉室温封闭4h，pbst洗3次，每次10min，一抗在4℃冰箱孵育过夜，pbst洗3次，每次10min，再加二抗稀释液室温孵育2h，pbst洗3次，每次10min。

1.3药物与试剂顺铂(cisplatin)购自于sigma试剂公司(批号：o9517)；姜黄素(curcumin)购自于上海纯优生物科技有限公司(批号：117-39-5)；mtt及二甲基亚砜(dmso)(sigma试剂公司)；胎牛血清购自于浙江d杭生物科技股份有限公司。dmem高糖配方培养基购自于sigma试剂公司；bca蛋白定量试剂盒：江苏碧云d生物技术研究。0.5％醋酸结晶紫溶液(实验室自配)；抗体glut12及β-actin购于美国abcam公司；其它抗体购自于santacruzbiotechnology(santacruz，ca，usa)；

1.4主要仪器co2培养箱(美国bio-rad公司)；nuaire生物安全柜(美国)；倒置显微镜(日本olympus)；nikoneclipse荧光显微镜(日本)；spectramaxm2多功能酶标仪(美国)；chemidocxrs凝胶成像系统(美国bio-rad公司)；mini-proteantetra转印系统(美国bio-rad公司)；t100pcr括增仪(美国bio-rad公司)；低温冰箱(美国thermoscientific)。

2方法与结果

2.1细胞培养将人膀胱癌5637，j82-ecv-304细胞接种于t25培养瓶中，种植密度为每瓶约一百万个细胞。细胞培养于含dmem的高糖培养基中(含10％fbs，青霉素-链霉素1x10⁵u·l^-1,2.0gnahco3)培养基，置于37℃，5％co2、相对饱和湿度条件的培养箱里进行培养，每隔3～5d换培养液，并仔细观察细胞的生长状况。当细胞生长密度达到80-90％时，用胰蛋白酶消化并传代。

2.2逆转录-聚合酶链反应法检测glut12基因表达按上述条件传代培养人膀胱癌细胞5637,j82及ecv-304细胞。细胞生长密度达到80-90％时，加入细胞裂解液裂解细胞，用ez-10dnaaway试剂盒提取细胞总rna。用nanodrop测量rna含量及纯度。a260/a280大于1.8被认为是合格样品。将总rna用逆转录试剂盒合成模板单链cdna。以cdna为模板，对合成的cdna进行pcr。实验室自行设计的引物及内参见表1。pcr条件设定为：95℃1min，95℃40s，55℃40s，75℃30s，循环进行35次。所得pcr产物经海藻糖凝胶电泳分离，紫外条件下可视化处理并拍照记录产物条带。

2.3免疫荧光法检测细胞glut12蛋白表达将人膀胱癌5637细胞种植于含有圆形盖玻片的24孔细胞培养板中。2-3d后，细胞密度达到60-80％时，用不含葡萄糖的dmem培养基孵育4h，然后加入含有不同浓度葡萄糖或药物的培养基。共同孵育6h后，吸掉旧培养基，加入冰冷的pbs溶液终止反应。每孔细胞用冷的4％的多聚甲醛固定15min后，用含有0.2％的tritonx-100透化。透化后，每孔细胞加入image-itfx荧光信号增强剂(美国lifetech)。用含有3％羊血清及2％牛血白蛋白的封闭剂封闭1h，细胞与一抗孵育1h，再与二抗孵育2h。清洗残余抗体后，将细胞转移到载玻片上，用含有荧光保护剂和细胞核染色剂vectashield封闭。倒置荧光显微镜下，检查细胞荧光强度并拍照。增强化学发光法(ecl)显影5min后，用geldoc2000凝胶成像系统采集图片。

2.4mtt比色法检测细胞活力胰酶消化生长旺盛的5637和ecv-304膀胱癌细胞，稀释成5*10⁷·l^-1的细胞悬液。用排枪接种于96孔培养板中，每孔含100μl细胞悬液，每个药物处理组设置4个重复孔。细胞过夜贴壁后，用排枪吸弃旧的细胞培养液，向培养孔中添加含有不同浓度顺铂和glut12抑制剂的培养液200μl，co2培养箱中持续孵育72h后，每孔加入20μl5mg·ml^-1mtt溶液，继续孵育2h后，用排枪轻轻地吸取培养液，加入200μldmso用以溶解紫色结晶，持续震荡15min后，使用酶标仪在490nm条件下测量各孔的吸光度。对照组加入不含药物的等体积细胞培养液。实验重复三次后，按下列公式计算细胞存活率：细胞存活率％＝药物处理组吸光度/对照组吸光度x100％。

2.5肿瘤细胞集落生成实验(cfa)将膀胱癌5637细胞种植于6孔培养板中，每孔600细胞。24h后每孔细胞加入含有各种浓度药物的培养基，连续培养14d。期间单个细胞会分化成由多个细胞所组成的细胞集落。培养结束每孔细胞用2ml温热的pbs轻柔润洗后，加入2ml0.5％结晶紫溶液，轻柔震荡5min，用pbs轻轻漂洗三次后，细胞集落会被染成蓝色的颗粒状可见物。人工清点细胞组成大于50的细胞集落数目。

2.6肿瘤组织的采集，存放及前期处理采集20位膀胱癌患者的肿瘤组织，试验经由伦理委员会批准，所有患者实验前均签订知情同意书。患者年龄50～70岁，未经过放化疗，未有长期服用其它药物的历史，肝肾功能等指标也处于正常范围。采集的肿瘤组织全部经过病理技师确认。采集的肿瘤或者周围的正常组织大小为2～3cm，组织采集后立即用冰生理盐水冲洗，冷冻并存放于液氮中。免疫组化前，所有样本解冻并都经专业的病理技师进行石蜡包埋处理。

2.7免疫组化法检测肿瘤组织中glut12蛋白表达将含有膀胱癌组织的石蜡切片在二甲苯和不同浓度的乙醇水溶液中进行脱蜡和脱水处理。然后，将切片置于含有3％的h2o2的溶液中，室温孵育30min后，在高压锅中进行抗原修复。pbs水洗3次，每次10min。一抗4℃过夜孵育，pbs水洗3次，每次10min。添加辣根氧化酶标记的二抗室温孵育2h后，pbs水洗5次，每次5min。滴加二氨基联苯(dab)于组织切片上，显色反应须控制在1min之内完成。然后水洗玻片10min，苏木精复染5min，乙醇梯度脱水，透化，封片，光学显微镜下镜检。

2.8统计学方法实验数据以x±s表示，采用prism6.0software(美国graphpadsoftware)对数据进行单因素方差分析，组件两两比较采用独立样本t检验。p<0.05为差异具有统计学意义。

2.9结果

2.9.1glut12基因与蛋白在膀胱癌细胞中的表达目前，鲜有关于glut12基因在膀胱癌中表达的报道。本研究选用最有代表性的三种膀胱癌细胞株，用rt-pcr测量了该基因在此细胞中的表达。为了对比，我们也观察了该基因在正常膀胱上皮细胞sv-huc-1中的表达水平。结果显示，该基因在三种癌细胞株中均有表达，其中在5637细胞株中的表达含量最高。相比之下，正常肠上皮细胞中的glut12含量极低(p<0.05)。结果见图1。

目前glut12在膀胱癌肿瘤组织中的表达尚不是很清楚，尤其缺乏与正常组织中的对比数据。本研究采用免疫组化检测了其在20名膀胱癌患者肿瘤中的表达。实验发现，glut12在肿瘤组织和正常组织中均有不同程度的表达，量化分析数据显示其在肿瘤组织中的表达水平明显高于正常组织的表达。结果见图2。

2.10.2glut12蛋白在膀胱癌细胞中的表达水平的变化尽管上述试验中检测到glut12基因，并不代表该细胞中有蛋白的表达。细胞荧光免疫技术能精确地显示该蛋白在该细胞中的表达含量和定位。试验显示，在含有少量葡萄糖的培养基中，glut12在细胞中仅有少量的表达，主要集中于细胞核周围。随着培养基中葡萄糖含量的升高，glut12含量明显升高，主要集中分布于细胞膜周围。当细胞与glut12抑制剂一起培养时，高糖条件并不能提高该蛋白在细胞中的表达，也不能改变其在细胞中的定位。结果见图3。

为了更好地研究glut12蛋白在不同条件下的变化，我们也采用了免疫印迹法来量化该蛋白的变化。试验发现，细胞在含低浓度葡萄糖的培养基培养时(5mm·l-²)，glut12的表达含量很低。当升高培养基中的葡萄糖含量时(20mm·l-²、100mm·l-²)，该蛋白含量显著性地呈剂量依赖性地升高(p<0.05)。值得注意的是gut12抑制剂能阻断高糖所引起的这种变化。结果见图4。

2.10.3glut12抑制剂对顺铂杀癌的协同作用以上试验结果表明，姜黄素能有效抑制glut2在膀胱癌细胞中的表达以及细胞转运。为了研究姜黄素和顺铂之间的抗癌协同作用，我们接下来选用5637及ecv-304细胞作为体外mtt和cfa试验的研究对象。mtt试验显示，单用姜黄素处理细胞后，并不能带来明显的细胞杀伤作用，说明此药物并没有明显的细胞毒性。顺铂单独使用能显著地抑制细胞株5637和ecv-304的生存率(分别降低约10％和40％)。当细胞培养液中联合加入姜黄素时，细胞的活力降至到更低的水平(从顺铂组的91％至62.7％)。然而，对于ecv-304细胞来说，姜黄素并不能产生相似的药效协同作用。结果见图5。

在cfa试验中，姜黄素单用并没有对癌细胞群落的大小与数量产生明显地影响。顺铂处理细胞虽然不能明显地减少细胞群落的数量，却能极大地减少群落的平均粒径。更为重要的是，当姜黄素和顺铂联用时，细胞平均粒径减少的幅度更高。上述两项研究一致地表明，姜黄素和顺铂联用会起到更好的杀伤癌细胞的作用。结果见图6。

本发明的抑制剂是基于上述实验进行开发，相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明选用姜黄素作为主要成分，成本低廉，毒性小，能有效抑制glut12在膀胱癌细胞中的表达以及细胞转运；姜黄素结合顺铂，可起到协同作用，针对膀胱癌具有更好的杀伤癌细胞的效果；在抑制剂中优化了各主要成分的含量配比，剂量适中，满足患者使用和低毒的要求。

2、本发明解决了姜黄素和顺铂的化学和物理性质的兼容性问题，本发明的抑制剂由于采用了特定的组分或特定制备方法，获得的抑制剂为注射液剂型，具有良好的化学稳定性、药效佳。

附图说明

说明书附图

图1膀胱癌细胞中glut12基因表达；

图2免疫组化法glut12在肿瘤及正常组织中的表达(10×40倍)；

图3荧光显微镜下glut12蛋白在不同条件下的变化(10×40倍)；

图4蛋白印迹法检测不同条件下glut12的变化(n＝3)，其中，a为glut12蛋百条带图，b为相应条带的密度测定柱状图。与低糖组(5·mm.l-¹)相比，*p<0.05；

图5mtt法检测姜黄素与顺铂的协同作用(n＝3)，其中，c为姜黄素组；cis为顺铂组；cis+c为姜黄素与顺铂联用组；与空白组相比，*p<0.05；

图6肿瘤集落生成法检测姜黄素与顺铂的协同作用(n＝3)，其中，c为姜黄素组，cis为顺铂组，cis+c为姜黄素与顺铂联用组；a图为不同药物孵育条件下肿瘤细胞的集落生成情况，b图为相应的关于肿瘤集落大小的柱状图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1采用如下配比的组分制备本发明的glut12蛋白抑制剂：顺铂0.5％，姜黄素3％，注射用卵磷脂3％，注射用大豆油5％，亚硫酸钠0.1％，甘油20％，吐温-809％，注射用水加至100％质量配比；

(1)油相的制备：分别向注射用大豆油中加入注射用卵磷脂、吐温-80，搅拌使其溶解，作为油相；

(2)初乳的制备：将顺铂、姜黄素以及亚硫酸钠加入水中，搅拌使之溶解，再将(1)中制备的油相加入水中，高速剪切分散(转速：15000/min、分散时间:30min)，形成初乳；

(3)高压匀化：调节步骤(2)制得初乳的ph7.2，高压匀化，得精乳；

(4)无菌过滤：精乳经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，无菌灌装，再经冷冻干燥，即得。

实施例2采用如下配比的组分制备本发明的glut12蛋白抑制剂：顺铂0.1％，姜黄素1％，注射用卵磷脂1％，注射用大豆油35％，亚硫酸钠0.2％，甘油15％，吐温-805％，注射用水加至100％质量配比；

(1)油相的制备：分别向注射用大豆油中加入注射用卵磷脂、吐温-80，搅拌使其溶解，作为油相；

(2)初乳的制备：将顺铂、姜黄素以及亚硫酸钠加入水中，搅拌使之溶解，再将(1)中制备的油相加入水中，高速剪切分散(转速：15000/min、分散时间:30min)，形成初乳；

(3)高压匀化：调节步骤(2)制得初乳的ph为7.2，高压匀化，得精乳；

(4)无菌过滤：精乳经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，无菌灌装，再经冷冻干燥，即得。

实施例3采用如下配比的组分制备本发明的glut12蛋白抑制剂：顺铂0.2％，姜黄素2％，注射用卵磷脂2％，注射用大豆油25％，亚硫酸钠0.3％，甘油18％，吐温-806％，注射用水加至100％质量配比；

(1)油相的制备：分别向注射用大豆油中加入注射用卵磷脂、吐温-80，搅拌使其溶解，作为油相；

(2)初乳的制备：将顺铂、姜黄素以及亚硫酸钠加入水中，搅拌使之溶解，再将(1)中制备的油相加入水中，高速剪切分散(转速：15000/min、分散时间:30min)，形成初乳；

(3)高压匀化：调节步骤(2)制得初乳的ph为7.0，高压匀化，得精乳；

(4)无菌过滤：精乳经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，无菌灌装，再经冷冻干燥，即得。

实施例4采用如下配比的组分制备本发明的glut12蛋白抑制剂：顺铂0.4％，姜黄素5％，注射用卵磷脂2.5％，注射用大豆油15％，亚硫酸钠0.3％，甘油20％，吐温-808％，注射用水加至100％质量配比；

(1)油相的制备：分别向注射用大豆油中加入注射用卵磷脂、吐温-80，搅拌使其溶解，作为油相；

(2)初乳的制备：将顺铂、姜黄素以及亚硫酸钠加入水中，搅拌使之溶解，再将(1)中制备的油相加入水中，高速剪切分散(转速：15000/min、分散时间:30min)，形成初乳；

(3)高压匀化：调节步骤(2)制得初乳的ph为7.3，高压匀化，得精乳；

(4)无菌过滤：精乳经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，无菌灌装，再经冷冻干燥，即得。

实施例5采用如下配比的组分制备本发明的glut12蛋白抑制剂：顺铂0.3％，姜黄素6％，注射用卵磷脂3％，注射用大豆油20％，亚硫酸钠0.1％，甘油15％，吐温-807％，注射用水加至100％质量配比；

(1)油相的制备：分别向注射用大豆油中加入注射用卵磷脂、吐温-80，搅拌使其溶解，作为油相；

(2)初乳的制备：将顺铂、姜黄素以及亚硫酸钠加入水中，搅拌使之溶解，再将(1)中制备的油相加入水中，高速剪切分散(转速：15000/min、分散时间:30min)，形成初乳；

(3)高压匀化：调节步骤(2)制得初乳的ph为7.5，高压匀化，得精乳；

(4)无菌过滤：精乳经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，无菌灌装，再经冷冻干燥，即得。