专利名称：鲍鱼人工免疫物质的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种把微生物培养物作为有效成分制成各种有用产品的方法。
目前在我国人工养殖鲍鱼的育苗过程中，鲍苗的死亡率极高，甚至可达95％，为此的们采用抗菌素来控制一般抗菌素的价格都比较高，而且每种抗菌素只对部分细菌有抑制作用，既使对某种细菌有效的抗菌素由于长期的使用也产生了抗药性，因此必须加大药量，这不仅大幅度地增加了鲍鱼成本，而且又加剧了海水的污染。陆地养鲍采用流水法，药浴时间短、用药次数少、药效就更不明显了。特别是由于水温、水质等变化每年甚至每个月鲍鱼的病因都不同这样用药治疗是很难的。
鉴于上述现有技术中的不足之处本发明的目的在于提供一种能提高鲍鱼自身免疫力使它们能抵抗各种疾病的较廉价的人工免疫物质的制备方法。
本发明的目的可通过以下措施来实现鲍鱼人工免疫物质的制备方法，其特征在于死菌苗注射液及菌饵的制备方法是将从病鲍中分离的病原菌接种于肉汤蛋白胨的培养基上，经6～10小时培养用自制的接种棒接种于胰蛋白胨琼脂培养基中，于20～35℃培养12～26小时，用0.1～1.0％的甲醛洗下菌苔，处理24～120小时，离心，用无菌生理盐水稀释成104～1011个/毫升的菌苗注射液，再将这种菌液喷洒到饵料上制成0.5～1.5亿个/克的菌饵。活菌苗注射液及菌饵的制备方法是将经过30左右次连续传代的菌种皮下、腹腔注射进兔子和鲍鱼的体内检查毒性，确认毒性很小后采用上述方法培养，用无菌生理盐水稀释成0.1×104～0.1×108个/毫升的菌苗注射液，再将这种菌液喷洒到饵料上制成0.1×106～0.1×1010个/克的菌饵。脂多糖(Lps)的制备方法是，用改良的Wetphal方法提取病原菌的LPS，其注射液用量小于1.5mg/ml，饵料用量小于1.5mg/克。
几年来经多方面的探索和研究现已基本查明引起鲍鱼大批死亡的原因绝大多数是弧菌(Vibriosp.)所致。该弧菌包括有溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌(V.parahaenolyticus)，费尼斯弧菌(V.furnissii)、鳝弧菌(V.anguillarum)、河流弧菌II(V.flavialis)。另外还有假单胞菌属(psedomonas.sp)和气单胞菌属(Aeromonas.sp)。
上述这些细菌在鲍鱼体上引起的病症从体征上来区分有两种，其一是有明显体征的，如脓胞病。患该病的鲍鱼足部肌肉上出现微隆起的白色疱，当破裂后流出白色脓汁并留下2～5mm的深孔。它导致鲍的附着力减弱，直至身体翻转死亡。镜检脓汁发现除鲍的组织细胞外只有一种单生鞭毛短杆菌，经鉴定为河流弧菌II。其二是无明显体征的，患该病的鲍鱼食欲不佳，消化功能减弱，附着力差。该病的发病率和死亡率极高。引起该病症的有弧菌、假单胞菌属和气单胞菌属。
细菌的分离首先对有明显体征的病症的鲍鱼用70％乙醇擦拭患部及周围，然后用灭菌的解剖剪切开病灶，即刻用灭菌吸管吸取脓汁进行稀释。对于无明显体征的病症，取刚死亡鲍的足和消化道消毒、灭菌后，放入灭菌的研钵中磨碎，然后放入带有玻璃珠的瓶中。同样取生长正常的无病鲍作对比试样。将所取样品接入改良肉汤(其中氯化钠为1.0～2.5％)、改良胰琼脂(其中水为海水)培养基中，于17～35℃温箱中培养2～7天后观察记录菌落形态并分离优势菌。
人工感染取分离出的并经纯化的细菌置于肉汤琼脂斜面上，于17～35℃培养24小时。用灭菌的生理盐水分别洗下菌苔，离心洗涤后分别制成2×106个/ml和4×108个/ml活菌(采用平板稀释法、血球计数法测定菌数)，然后给不同生长发育期的鲍鱼注射和制成菌饵投喂，对照组注射生理盐水。观察七天后从有病症和死亡的鲍中分离菌株，此菌作为病原菌，并作为人工免疫的抗原。
通过观察分析患脓胞病鲍的脓汁和其它病症的病鲍的血淋巴认为鲍鱼体内有吞噬功能，能进行免疫。
鲍鱼和细菌凝集性的证明(1)体外吞噬取在肉汤琼脂斜面上经17～35℃培养的病原菌，用生理盐水洗下菌苔，制成3×108个/ml菌液。取40μl正常鲍鱼的血淋巴、20μl肝素、20μl菌液混匀，置37℃湿盒内35分钟(经常摇动)，取一滴涂片，并进行吕氏染色和显微拍照见
图1，从图片上可见细菌附着在细胞膜上，有的进入细胞，可计算吞噬率和消化指数。
(2)鲍鱼抗原性的证明采用上述方法制成1×109个/ml菌液，用0.2％的甲醛灭活48～72小时，给成龄鲍按下述方法进行足肌肉、外套膜注射。第一天0.01ml、第二天0.02ml、第三天0.04ml、第四天0.08ml、第六天0.16ml、第十四天0.4ml、第十六天取鲍鱼的血淋也作为凝集素、细菌作为凝集原作环状沉淀，可见明显的沉淀环。取同样的菌液方法给2公斤的兔子皮下、腹腔注射，取兔子的血清为凝集素，细菌为凝集原环状沉淀证明细菌也有抗原性。
鲍鱼人工免疫物质的制备(1)死菌苗注射液及菌饵的制备将从病鲍中分离的弧菌属(Vibro sp)、假单胞菌属(psedomonas.sp)和气单胞菌属(Aeromonas.sp)的病原菌接种于肉汤蛋白胨的培养基上，经6～10小时培养用自制的接种棒接种于胰蛋白胨、琼脂培养基中，于20～35℃培养12～26小时。用0.1～1.0％的甲醛洗下菌苔，处理24～120小时，离心，用无菌生理盐水稀释成104～1011个/ml的菌苗注射液，再将这种菌液喷洒到饵料上制成0.5～1.5亿个/克的菌饵。菌的计数用血球计数法、平皿计数法和改良的Mc Farland比浊法。
(2)活菌苗注射液及菌饵的制备将经过30次连续传代的菌种，皮下、腹腔注射进兔子和鲍鱼的体内检查毒性。确认毒性很小后采用上述方法培养。用无菌生理盐水稀释成0.1×104～108个/ml的菌苗注射液，再将这种菌液喷洒到饵料上，制成0.1×106～1010个/克的菌饵。
(3)脂多糖(Lps)的制备用改良的Wetphal方法提取病原菌的Lps，它在鲍鱼体内具有良好的免疫效果，其注射液用量小于1.5mg/ml饵料用量小于1.5mg/g，还必须按个体的差异进行试验。
本发明的工艺方法不复杂，生产成本低。制备出的各种有用的产品能提高鲍鱼的免疫力提高成活率减少死亡率，作用持久。除此之外还能使鲍鱼更加健康体重增加二成。它与使用抗菌素相比不仅费用低、不存在耐药性的问题，而且消除了对海水的污染。也消除了鲍鱼体内残留的抗菌素对人类的毒害。
图面说明如下图1是镜检鲍鱼淋巴细胞的吞噬情况。
图2是9301菌株的电镜照片(×30,000)。
图3是用9301菌株人工感染鲍鱼后分离的菌株的红外光谱图。
图4是9301菌株的红外光谱图。
例1先用70％洒精擦拭患脓疱病的鲍足肌肉表面(特别是脓疱部)，然后用灭菌的解剖剪刀剪破病灶，即刻用灭菌吸管吸出脓汁进行稀释，然后培养在改良牛肉浸汤培养基(其中氯化钠为2.5％)、改良胰琼脂培养基(其中水改用海水)置17～19℃温箱中培养2天后观察；发现两种培养基平板上均有一种优势菌落，挑取纯化为9301号。经对菌体的光镜、电镜观察和革兰氏染色结果证明其结构为革兰氏阴性、极生单鞭毛的短杆形细菌，(如图2所示)。该菌株经中国科学院微生物所鉴定为河流弧菌II(Vibr of luvialis)。取该菌株用灭菌的生理盐水洗下菌苔，并经离心洗涤后制成2×106个/ml和4×108个/ml菌液(平板、血球计数法)、然后给体重10～13克的健康鲍足的肌肉注射2×106个/ml的菌液0.01ml，口服菌液4×108个/ml和创伤感染，对照组用生理盐水。观察七天，结果肌肉注射和创伤感染都产生脓疱，而口服由于量不够仅有少部分感染产生脓疱。从脓胞中按上述方法分离菌株，其形态构造、性质同9301基本相似，其红外光谱图(图3)与9301号的红外光谱图(图4)基本相同，所以可确认鲍鱼产生脓疱病是该种细菌所致。将从病鲍分离出的河流弧菌II接种于牛肉汤培养基中，培养6小时，用自制的接种棒接种于琼脂蛋白胨培养基上，于20～35℃培养12小时。用0.1％的甲醛洗下菌苔处理120小时，离心，用生理盐水稀释成1.0×104个/ml菌苗注射液。将这种菌液喷到饵料上制成0.5×109个/克的菌饵。
例2
取刚刚死亡的鲍鱼足和消化道放入灭菌的研钵中磨碎，然后放入带有玻璃珠的瓶中，培养在改良牛肉浸汤培养基(其中氯化钠为1.5％)，改良胰琼脂培养基(其中水改为海水)置17～1 9℃温箱中培养7天后观察发现两种培养基平板上均有一种优势菌落，挑取纯化，经鉴定为假单孢菌属(Psedomonas.sp)重复例1的人工感染操作。再将从病鲍中分离出的假单孢菌接种于牛肉汤培养基中培养10小时，用自制接种棒接种于胰蛋白胨培养基上，于20～35℃培养26小时，用1％甲醛洗下菌苔处理24小时。离心用生理盐水稀释成1.0×1011个/ml菌苗注射液，将这种菌液喷到饵料上制成1.5×109个/克的菌饵。
例3将从鲍鱼体内分离的病原菌经过29次连续传代的菌种，给兔子皮下腹腔注射，鲍鱼肌肉注射，确认毒性较小时接种于改良的肉汤培养基中，经6小时培养用自制接种棒接种于改良的蛋白胨培养基中于20～35℃培养12小时，用无菌生理盐水稀释成0.1×104个/ml的注射菌液和0.1×106个/克的菌饵。
例4取经过26次连续传代的病原菌菌种，皮下、腹腔、静脉注射给兔子和肌肉注射给鲍鱼，确认毒性较小时接种于牛肉汤培养基中，经10小时培养用自制接种棒接种于胰蛋白胨培养基中于20～35℃培养26小时，用无菌生理盐水稀释成0.1×108个/ml注射菌液和0.1×1010个/克菌饵。
例5用改良的Wetphal方法提取从鲍鱼体内分离的病原菌的Lps，然后制成1.2mg/g饵料给鲍鱼投喂，或制成1。1ml/ml，注射液给鲍鱼肌肉注射。
鲍鱼人工免疫及其结果分析(1)成鲍免疫取36只成鲍(♂♀各半)分成三组，第一组为对照组。注射无菌的生理盐水，第二组为菌苗组，注射死菌苗的量为19。44亿/只，分五次注射共21天，第三组为弱毒活菌苗组，注射量为0.3亿/只，同样分五次注射。第25天进行人工感染，注射活菌0.3×108个/只，免疫结果如下 同时将免疫的成鲍♀♂交配，其仔鲍作为母体免疫。
(2)一龄鲍的免疫取一龄鲍(壳长2～4厘米)90只，分成三组，第一组为对照组，注射同体积的生理盐水，第二组为菌苗组分五次注射6.4亿/只死菌苗。第三组为弱毒菌苗组，用21天分五次注射0.2亿/只活菌苗。从第25天开始注射活菌进行人工感染菌量为0.2×104个/只，其免疫结果如下 (3)鲍苗的免疫取刚剥离正常饵料死亡情况属正常的18块板鲍苗分三组，第一组为对照组，投喂空白饵料，第二组为菌苗组，第三组为母体免疫组。向第二、三组的鲍苗投喂0.3～6亿/克的菌饵30天，海水温度23～28℃，观察结果如下 根据对鲍鱼养殖的实际考察，病原菌最多的是夏季，其在水中的浓度为102～104个/ml，而本实验细菌感染数量为2×108个/只，相当于5×109个/ml，这个数字远远大于鲍鱼病原菌数几万到十几万倍，在这样多的病原菌鲍鱼都有良好的免疫力，在生产实际中免疫效果会更好。
权利要求
1.鲍鱼人工免疫物质的制备方法，其特征在于死菌苗注射液及菌按的制备方法是将从病鲍中分离的病原菌接种于肉汤蛋白胨的培养基上，经6～10小时培养用自制的接种棒接种于胰蛋白胨琼脂培养基中，于20～35℃培养12～26小时，用0.1～1.0％的甲醛洗下菌苔，处理24～120小时，离心，用无菌生理盐水稀释成104～1011个/毫升的菌苗注射液，再将这种菌液喷洒到饵料上制成0.5～1.5亿个/克的菌饵。
2.鲍鱼人工免疫物质的制备方法，其特征在于活菌苗注射液及菌饵的制备方法是将经过30左右次连续传代的菌种皮下，腹腔注射进兔子和鲍鱼的体内检查毒性，确认毒性很小后采用上述方法培养，用无菌生理盐水稀释成0.1×104～0.1×108个/毫升的菌苗注射液，再将这种菌液喷洒到饵料上制成0.1×106～0.1×1010个/克的菌饵。
3.鲍鱼人工免疫物质的制备方法，其特征在于脂多糖(Lps)和制备方法是，用改良的Wetphal方法提取病原菌的LPS，其注射液用量小于1.5mg/ml，饵料用量小于1.5mg/克。
全文摘要
鲍鱼人工免疫物质的制备方法，其死菌苗注射液及菌饵的制备方法是，将从病鲍中分离的病原菌接种于培养基上，然后用甲醛处理，稀释成10
文档编号A61K39/106GK1123182SQ94112648
公开日1996年5月29日 申请日期1994年11月24日 优先权日1994年11月24日
发明者李太武, 丁明进, 苏秀榕, 刘金屏, 聂丽萍 申请人:辽宁师范大学