专利名称：用于检测淀粉样蛋白沉积的物质的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于特异性检测淀粉样蛋白沉积和/或其沉积位置的物质。更具体地，本发明涉及一种用于检测淀粉样蛋白沉积的物质，该物质能够精确检测由淀粉样变性引起的淀粉样蛋白的沉积和/或其沉积位置，同时不会对活体产生明显的有害影响。
淀粉样变性是一种可产生淀粉样蛋白的蛋白质或其部分碎片局部或全身地沉积在活体而产生淀粉样蛋白的一种疾病。如果症状发展下去将会危及生命。
根据报道，例如，Isobs(表1)，近年来已明确提出淀粉样变性可被分为几类(Nippon Clinical Medicine第50卷，Hemocathar-sis Therapy(两卷本的第二卷)394-399页(1992))。
表1淀粉样和变性淀粉样原纤维蛋白的分类范围 淀粉样原 临床疾病种类 原纤维蛋白 蛋白质前体纤维蛋白的生化特性全身AL 原发性淀粉样变性Ig-L-链(k·λ Ig-L-链部分骨髓瘤 -链)或片段 (k·λ-链)部分巨球蛋白MW4-25K淀粉样L-链蛋白全身 AA继发性淀粉样变性动物体内的氨 SSA，HDL2反应性淀粉样变性基酸序列与淀结核、RA、梅毒、粉样蛋白的基麻风、肺部生脓、本相同。
部分何杰金病等，MW5-9到13K不家族性地中海热病一致AA Gly33，AATrp33等淀粉样A蛋白表1(续)淀粉样和变性淀粉样原纤维蛋白的分类范围 淀粉样原临床疾病种类 原纤维蛋白蛋白质前体纤维蛋白 的生化特性全身AF 家族性多神经病、 不同的反式甲 不同的反式感觉迟纯、自主神 状腺素(tran- 甲状腺素经系统紊乱、低血 sthyretin)基压、起立性低血压 团(旧名前清蛋白)Mw8-14k淀粉样蛋白，14种变化，如Val30-Met30全身AH 延长血液透析引起 β2微球蛋白 β2微球蛋白的淀粉样蛋白复杂化，腕管综合症，骨关节病局部AE 甲状腺髓癌、胰岛 有关蛋白质的 原降钙素β-细胞瘤、垂体 前激素片段如 (procarc-瘤降钙素、胰岛 itonin)素、 催乳激素表1(续)淀粉样和变性淀粉样原纤维蛋白的分类范围 淀粉样原临床疾病种类 原纤维蛋白 蛋白质前体纤维蛋白 的生化特性局部 AHCH 遗传性大脑出血不同的C基团不同的胱硫(岛) (又名γ-迹 醚(cystat-(trace))片段， hin)C(γ-MW11至15K 迹)局部 ASb 脑血管淀粉样蛋 β-蛋白质 ？白，早老性疾呆， MW4，2K成年人唐氏综合症局部 ASC 老年(遗传性) 不同的反式甲 不同的反式(心血管)淀粉 状腺素(tran- 甲状腺素基样蛋白 sthyretin)基 团团，(旧名前清蛋白)，MW14K(Nippon Clincal Medicine 50卷清血疗法(两卷本的第二卷)394-399页(1992))长期以来，通过活体解剖来检定活体中局部或全身的淀粉样蛋白沉积。根据这种检测结果对淀粉样变性进行诊断。
不管怎样，根据淀粉样变性的种类进行适当处理可使病情延缓，终止或改善，因此对淀粉样变性的早期诊断受到了重视。
本世纪中期，已通过活组织检查来检测活体中局部或全身的淀粉样蛋白沉积。
通过活组织检查对淀粉样蛋白的检测可在病体尚存活的情况下进行，从而获得对淀粉样变性的早期诊断。然而通过活组织检查方法对淀粉样蛋白的检测存在肌体疼痛及组织损坏；因此需要一种非侵害性的检测方法。
为了以一种非侵害性方式检测活体中局部或全身的淀粉样蛋白的沉积，曾尝试采用一种放射性同位素的检测方法。
采用放射性同位素的检测方法利用了产生淀粉样蛋白的蛋白质性质，该蛋白质集聚以产生淀粉样沉积位点。根据该方法将可产生淀粉样蛋白的蛋白质通过与放射性同位素结合，以便进行标记，标记的可产生淀粉样蛋白的蛋白质通过静脉给药进入活体。在活体外用闪烁照相机或类似装置对这样给药的蛋白质进行照像。在病体内存在有淀粉样蛋白沉积的情况下，则在活体中的淀粉样蛋白的沉积处，沉积有放射标记的产生淀粉样蛋白的蛋白质可以获得其成像，从而检测淀粉样蛋白的沉积部位。因而该法通过一种非侵害性的方式诊断淀粉样变性。
检测方法中所用的放射性同位素选用的是具有下列特点的放射性同位素在活体外易于检测；能获得尽可能多的诊断信息；并且所用放射性剂量尽可能小等，例如不放射α、β射线的放射性同位素(1)；具有短的物理半衰期(2)；只放射适于闪烁照相机或单光子发射计算的断层X射线照相仪的(SPECT)光拍照的100至200 kev的γ射线(3)等。迄今，碘-123，碘-131，以及锝-99m已用于淀粉样变性的诊断。对这些放射性同位素的优缺点、种类、剂量等分析如下碘-123的半衰期短到13.3小时。它是电子俘获衰变(EC)，并且具有比较小的159 kev的γ-射线能量，因此生物学的有害影响小。随着近年生产技术的进步，碘-123的应用也在增加。P.N.Hawkins等人报道了使用一种碘-123标记的血清淀粉样蛋白P组分来进行原发性和继发性淀粉样变性的诊断(Lancet，1，1413-1418(1988))。但是根据这种方法用碘标记蛋白质主要是通过直接标记酪氨酸的残基；因此，不可避免地使存在于活体内的脱碘酶引起从蛋白质中释放放射性碘。结果释放出的碘已知会聚集于甲状腺中，造成碘对活体的有害的积聚影响。此外当检测沉积部位需要几天时，则碘的需用量还要增加。
放射性同位素碘-131已非常广泛地用于标记抗体。该放射性同位素具有比较长的8.04天的半衰期，当需要几天来检测沉积位置时，该同位素比上述的碘-123及下文介绍的锝-99m更为有用。实际上J.Floege等人报道了用碘-131标记的β-2微球蛋白对有关淀粉变性的透析(dialysis)的诊断(Kidney Interational，38，1169-1176(1990))。但是，除了它具有8.04天的较长半衰期外，碘-131具有大到364 kev的γ-射线能，并放射β-射线。另外，碘-131同样具有碘-123所具有的甲状腺阻滞，因此将碘-131广泛用于临床领域仍存在某些疑义。
锝-99m在临床诊断上具有突出的放射特性。它具有6.02小时的很短的半衰期。该同位素为同质异能迁移衰变(IT)，具有小到141kev的γ-射线能。此外，锝99-m易于制得，可被设计成为几种有效的标记材料。仅以上情况就能使锝-99m得到广泛应用。然而，由于其半衰期很短，要在几天内确定淀粉样蛋白聚集沉积部位的情况下就需要大量的同位素。例如，在有关淀粉样变性的渗析中。因此，以锝-99m标记蛋白是有利的。
如上所述，放射性同位素的种类及用量需要考虑到该放射性同位素对活体的影响，用于检测所需的放射强度及其半衰期等。还存在其它一些问题，例如标记放射性同位素的释放、和其对活体的积聚以及在直接标记可产生淀粉样蛋白的蛋白质中存在的一些困难。此外用于处理这些问题的工作也十分复杂。本发明的公开本发明的发明人认真研究了能够检测淀粉样蛋白沉积和/或沉积部位的物质，该物质在获得明确结果的同时对活体的损害较少。结果他们发现通过金属螯合物质用放射性同位素标记的可产生淀粉样蛋白的蛋白质，对检测淀粉样蛋白沉积及其沉积位置是很有用的，从而完成了本发明。
具体地说，本发明解决了上文提到的传统难题，并提供了一种用于检测淀粉样蛋白沉积的物质，该物质中含有与金属螯合物质结合的可产生淀粉样蛋白的蛋白质。
本发明提供一种上文提到的物质，该物质通过金属螯合物质使用放射性同位素检测标记的淀粉样蛋白沉积。
另外，本发明提供了一种用于检测淀粉样蛋白沉积的物质的制备方法，包括以下步骤使金属螯合物质与可形成淀粉样蛋白的蛋白质结合；接着在其中加入一放射性同位素。
此外，本发明还提供了一种用于检测淀粉样蛋白沉积或其沉积位置的方法，其步骤包括将与放射性同位素结合(标记)的、用于检测淀粉样蛋白沉积的物质，通过静脉给药进入活体；并通过闪烁照相机检测该物质以检测淀粉样蛋白的沉积。
再者，本发明提供了一种用于检测活体内淀粉样蛋白沉积和淀粉样蛋白沉积位置的、含有与金属螯合物质结合的可产生淀粉样蛋白的蛋白质的物质的用途。
而且，本发明包括使用可产生淀粉样蛋白的蛋白质与金属螯合物质以制备用于检测淀粉样蛋白沉积的物质。
因此，按照本发明达到了易于制备一种用于检测淀粉样蛋白沉积的物质的目的，该物质适用于检测淀粉样蛋白沉积和/或其沉积部位。另外，达到了通过使用闪烁照相机检测用于测定淀粉样蛋白沉积的标记的物质，从而达到安全准确地检测淀粉样蛋白沉积或其沉积部位的目的。附图的简要说明
图1表明淀粉样蛋白沉积和其沉积部位的成像，它是通过将用铟-111标记的用于检测淀粉样蛋白沉积的物质经静脉给药进入活体，然后通过闪烁照相机拍摄而获得的。
图2表明淀粉样蛋白沉积和其沉积部位的成像，它是通过将用铟-131标记的用于检测淀粉样蛋白沉积的物质经静脉给药进入活体，然后通过用闪烁照相机拍摄获得的，以和铟-111作对比。本发明的最佳实施方式本发明用于检测淀粉样蛋白沉积的含有与金属螯合物质结合的产生淀粉样蛋白的蛋白质的物质是通过在氨基与金属螯合物质可以进行反应的条件下，将从可产生淀粉样蛋白的蛋白质中释放出的氨基与金属螯合物质反应而进行的。
作为本发明中可以使用的可产生淀粉样蛋白的蛋白质，是任何β-2微球蛋白，血清淀粉样蛋白P成分和免疫球蛋白L链，只要它可以成为具有淀粉样变性特征的沉积蛋白都可采用，这些蛋白可通过一般的纯化蛋白的方法制得。这些方法的实例包括诸如凝胶色谱法和离子交换色谱法的纯化方法，透析以及冷冻干燥。纯化可通过这些方式的结合或重复而进行。
本发明可以使用的金属螯合物质应具有能与放射性同位素结合的金属螯合位点。能与放射性同位素结合的金属螯合位点的实例包括例如乙二胺四乙酸(EDTA)螯合点和二亚乙基三氨基五乙酸(DTPA)螯合点。另外，本发明所用的金属螯合物质具有至少一个可与蛋白质反应而与其结合的官能团。
满足上述条件的金属螯合物质的具体实例包括EDTA的衍生物，如异硫氰基苄基-EDTA，氨苄基-EDTA，溴乙酰氨基苄基-EDTA，马来酰亚胺其丙基酰氨苄基-EDTA和马来酰亚胺戊基酰氨苄基-EDTA；以及DTPA的衍生物，如DTPA酸酐，异硫氰基苄基-DTPA，氨苄基-DTPA，溴乙酰氨基苄基-DTPA，马来酰亚胺丙基酰氨苄基-DTPA，和马来酰亚胺戊基酰氨苄基-DTPA。值得注意的是，金属螯合物质并不限于以上列举的实例。
按照本发明将可产生淀粉样蛋白的蛋白质与金属螯合物质结合，例如，将上述金属螯合物质加入到在pH7-10，优选pH8-9缓冲液中的蛋白质溶液中，并在生理条件下例如25℃-37℃时搅拌混合过夜。该反应是在许多金属螯合物质分子结合到一个蛋白分子上的情况下进行。例如当一分子可产生淀粉样蛋白的蛋白质仅与0.1或更少的金属螯合物分子结合，则会因放射性不足于在活体外检测而引起困难；结果会引起另外的麻烦，即为获得足够的放射性必需加入过量的蛋白质。当金属螯合物质可以与可改性的可产生淀粉样蛋白的蛋白质的所有位点结合时，因其体视构型的变化而引起可产生淀粉样蛋白的蛋白质特性的消失，而且因蛋白质过量改性使得产生免疫应答的可能性提高。因此，需要测定结合到一分子蛋白质的金属螯合物质的分子数。
再者，按照本发明，通过金属合螯物，用放射性同位素标记，用于检测淀粉样蛋白沉积的含有与金属螯合物结合的可产生淀粉样蛋白的蛋白质的物质。
在本发明中可用作放射性同位素的是选用那些能够与金属螯合物质形成配合物的金属元素。例如，包括铟-111和锝-99m的金属元素。这些元素具有显著的优点，它们能够在生理条件下与金属螯合物质牢固地结合而无须对特殊部位(如甲状腺阻滞)进行保护的步骤。
铟-111具有二较大的γ-射线能，即172 kev和247 kev；但其半衰期为2.81天。甚至在对上文中提到的有关淀粉样变性渗析的情况下，需要几天以后才能确定淀粉样蛋白的聚集到沉积位置，其半衰期是适宜的。而且，铟-111还具有以下优点，该元素为EC衰变，仅放射γ-射线，在活体内的放射剂量很小，与碘-131相比对活体的有害较小。
与可产生淀粉样蛋白的蛋白质结合的金属螯合物质，同放射性同位素的结合是通过将该放射性同位素加到用于检测淀粉样蛋白沉积的物质的溶液中，并搅拌混合物一段适宜时间。例如向与金属螯合物结合的可产生淀粉样蛋白的蛋白质中加入含有上述放射性同位素的溶液，并通过凝胶色谱法进行纯化。将如此得到的混合物搅拌数小时，并通过凝胶色谱法从混合液中除去游离态的放射性同位素。此过程可在无菌条件下进行，所得物质可用作静脉注射的样品。
本发明中用于检测淀粉样蛋白沉积的物质是适于临床应用，主要由于以下原因预先与金属螯合物结合的可产生淀粉样蛋白的蛋白质可在该状态下保存很长时间。因为该预先与金属螯合物质结合的可产生淀粉样蛋白的蛋白质并未与放射性同位素结合，所以便于保存。当与可产生淀粉样蛋白的蛋白质结合的金属螯合物要进行标记时，可以在正好要用于检测淀粉样蛋白沉积和其沉积位置前，通过上文提到的方法容易地进行标记。
另外，用于检测淀粉样蛋白沉积的标记物质可按上述的方法制备，以进行静脉注射。通过将标记物质静脉给药，并用闪烁照相机检测聚集于产生淀粉样蛋白的蛋白质的沉积部位而检测淀粉样蛋白沉积和/或其沉积部位。
本发明中的用于检测淀粉样蛋白沉积的物质易于制备，并且能在比传统方法更短的时间内获得检测结果。因此该物质缩短了病体的时间负担，具有显著的安全性。另外，通过与用碘-131成像所得的成像比较可知，本发明中所用的放射性同位素的放射性可以使淀粉样蛋白沉积部位获得鲜明成像。因此，可准确测出其分布和损伤范围。
如上所述，本发明提供一种用于检测淀粉样蛋白沉积的物质，该物质对于检测淀粉样蛋白沉积和/或其沉积部位具有显著有效性和安全性。实施例下面，本发明将对有关的β-2微球蛋白进行描述；该β-2微球蛋白是一种在淀粉样变性、特别是与淀粉样变性有关的透析中可产生淀粉样蛋白的蛋白质。本专利不限于有关淀粉样变性的透析，亦适用于因其它特殊的淀粉变性引起的沉积蛋白质，如血清淀粉样蛋白P成分和免疫球蛋白L链。(1、β-2微球蛋白的纯化)将对人体免疫缺陷病毒(HIV)和肝炎病毒呈阴性的肾功能不健全患者的尿液超滤以浓缩富含β-微球蛋白成分的溶液。该浓缩液经凝胶色谱法进行分馏(Sephadex G-75，Pharmacia生产)，然后经离子交换色谱法(DEAE-Sephacel，Pharmacia生产)纯化。将该富含β2-微球蛋白的馏份于4℃时在蒸馏水中透析，然后冷冻干燥。采用凝胶过滤柱(TSK Gel 2000 SW，Tosoh公司生产)对所得富含β2-微球蛋白的馏分进行高效液相色谱(HPLC)以收集富含更多β-2微球蛋白的馏分。将这样收集的馏分经离子交换色谱法然后经HPLC法进一步纯化，从而得到进一步纯化的β2-微球蛋白。(2、β2-微球蛋白与异硫氰基苄基-EDTA(SCN-Bz-EDTA的结合)将饱和的磷酸三钠溶液加入到含5mg β2-微球蛋白的磷酸盐缓冲溶液(0.15M，pH8.0)中，以调节缓冲液的pH到8.5。然后将27.5μl含0.55mg SCN-Bz-EDTA的磷酸盐缓冲溶液(0.15M，pH8.0)加入混合液中，于30℃搅拌过夜。将该反应混合物进行凝胶色谱(Sephadex G-25，Pharmacia生产)以除去任何未反应的金属螯合物质。所得溶液在4℃下保存。经凝胶色谱法纯化的最终产物的洗脱量与未变性的β2-微球蛋白的洗脱量几乎相同。
通过对蛋白质表面氨基基团的减少进行测定而确定与一分子蛋白质结合的螯合物质的分子数。首先，对反应前的β2-微球蛋白溶液和经凝胶色谱法纯化前的反应混合物进行取样。通过采用三硝基苯磺酸的方法测定每分子蛋白质的氨基减少数来计算与一分子蛋白质结合的金属螯合物质的分子数。结果见表2。
表2当量的SCN-BZ-EDTA与β2-微球蛋白反应时的氨基减少数No.当量(eg.) 每分子蛋白质的氨基基团减少数1 1 0.62 3 0.93 10 2.2(3、铟-111的引入)首先，将0.004M111InCl3(铟111，185M Bq.Amersham公司生产)的盐酸溶液加入到5mg经凝胶色谱法纯化的与金属螯合物结合的β2-微球蛋白中。搅拌混合数小时。然后，在无菌条件下将该混合物用Sephadex G-25进行凝胶色谱，以除去游离态铟，从而获得了放射性标记的、用于静脉注射的样品，其放射性为74MBq。(4、应用实施例)在检测淀粉样蛋白之前，在表2的No.2条件下，向与金属螯合剂结合的β2-微球蛋白中加入铟-111，从而得到标记的、用于静脉注射的样品，其放射性为约74MBq，将该样品静脉注射给一患有有关淀粉样变性的透析患者K.N.。如图1所示，注射后1小时，通过使用闪烁照相机而获得淀粉样蛋白沉积和沉积位置的成像。
作为比较例，同一患者K.N.通过采用以碘-131标记的淀粉样蛋白进行成像。将结果(见图2)与图1中所示结果作比较。结果，对铟-111得到以下的观察(1)获得清晰的成像；(2)与使用碘-131的方法相比，可在更短的时间内检测淀粉样蛋白沉积和其沉积位置；(3)铟-111几乎不聚集到肝脏，以及(4)在甲状腺没有铟-111的积聚。
由上述结果可知，本实施例中所用的放射性同位素铟-111，只放射γ-射线，因此能获得淀粉样沉积部位的清晰成像。另一方面，碘-131除放射γ-射线之外还放射β-射线，因其不规则反射造成成像背景模糊；因此，必须经过至少两天时间才由检测到产生淀粉样蛋白的蛋白质蓄积而得到成像。所以由碘-131得到的成像比由铟-111得到的成像模糊。
如上所述，通过描述铟-111举例说明了本发明。锝-99m亦可通过与铟-111同样的方式进行标记。虽然锝-99m并不适用于上述需经几天时间以检测沉积部位，该放射性同位素适用于本发明，与传统方法相比，它能够在更短的时间内获得检测结果。
权利要求
1.用于检测淀粉样蛋白沉积的物质，该物质含有与金属螯合物质结合的、产生淀粉样蛋白的蛋白质。
2.按照权利要求1的用于检测淀粉样蛋白沉积的物质，通过金属螯合物质，用放射性同位素标记。
3.按照权利要求2的用于检测淀粉样蛋白沉积的物质，其中放射性同位素是铟-111。
4.按照权利要求2的用于检测淀粉样蛋白沉积的物质，其中放射性同位素是锝-99m。
5.按照权利要求1的用于检测淀粉样蛋白沉积的物质，其中产生淀粉样蛋白的蛋白质是β2-微球蛋白或其二聚物。
6.按照权利要求1的用于检测淀粉样蛋白沉积的物质，其中产生淀粉样蛋白的蛋白质是β2-微球蛋白的部分肽。
7.按照权利要求1的用于检测淀粉样蛋白沉积的物质，其中金属螯合物具有乙二胺四乙酸位点。
8.按照权利要求1的用于检测淀粉样蛋白沉积的物质，其中金属螯合物具有二亚乙基三胺五乙酸位点。
9.按照权利要求1的用于检测淀粉样蛋白沉积的物质，其中金属螯合物的加入量要不会引起破坏产生淀粉样蛋白的蛋白质的体视结构。
10.权利要求2的用于检测淀粉样蛋白沉积的物质的制备方法，包括下列步骤使金属螯合物质与产生淀粉样蛋白的蛋白质结合，接着向其中加入放射性同位素。
11.用于检测淀粉样蛋白沉积或淀粉样蛋白沉积部位的方法，包括下列步骤经静脉注射将权利要求2的用于检测淀粉样蛋白沉积的物质对活体给药；和通过闪烁照相机检测用于检测淀粉样蛋白沉积的物质。
12.含有与金属螯合物质结合的、产生淀粉样蛋白的蛋白质的、用于检测淀粉样蛋白沉积的物质在检测活体中淀粉样蛋白沉积或淀粉样蛋白沉积部位中的用途。
13.按照权利要求12的用途，其中通过金属螯合物质、用放射性同位素标记用于检测淀粉样蛋白沉积的物质。
14.按照权利要求13的用途，其中放射性同位素是铟-111。
15.按照权利要求13的用途，其中放射性同位素是锝-99m。
16.按照权利要求12的用途，其中产生淀粉样蛋白的蛋白质是β2-微球蛋白或其二聚物。
17.按照权利要求12的用途，其中产生淀粉样蛋白的蛋白质是β2-微球蛋白的部分肽。
18.按照权利要求12的作用，其中金属螯合物质具有乙二胺四乙酸位点。
19.按照权利要求12的用途，其中金属螯合物质具有二亚乙基三胺五乙酸位点。
20.按照权利要求12的用途，其中金属螯合物的加入量要不会引起破坏产生淀粉样蛋白的蛋白质的体视结构。
21.产生淀粉样蛋白的蛋白质和金属螯合物质在制备用于检测淀粉样蛋白沉积的物质中的用途。
全文摘要
具有良好的实用性和安全性、用于检测淀粉样蛋白沉积和/或沉积部位的物质，通过将形成淀粉样蛋白的蛋白质与金属螯合物结合而制备。借助金属螯合物质，通过用放射性同位素标记本发明的物质，可以在短时间内安全地获得淀粉样蛋白质沉积和/或沉积部位的清楚成像。
文档编号A61K51/08GK1119415SQ94191529
公开日1996年3月27日 申请日期1994年11月29日 优先权日1993年11月30日
发明者下条文武, 中谷胜, 古吉重雄, 高田觉 申请人:钟渊化学工业株式会社