专利名称：丹参抗艾滋病病毒和抗乙型肝炎病毒的用途的制作方法
本申请是关于中草药滇丹参和丹参新医药用途的发明，属于药物用途发明领域。
丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)为唇形科植物的根，属于传统的活血化瘀药物。现代药理研究认为其具有多种药理作用(参见《中华医学杂志》1978；3180，金惠铭，丹参制剂的临床运用及其活血化瘀原理的研究)。植化研究表明，丹参中已知的成份至少有二十种之多(参见，罗厚蔚，活血化瘀药——丹参在国内研究的进展，中成药研究1978；和张德成，等，丹参水溶性有效成份的研究II.D(+)β(3，4-二羟基苯基)乳酸的结构，上海第一医学院学报1980；5384)。关于丹参用于治疗慢性肝炎已有许多报道，目前用于肝病研究的大多为水溶性部分的制剂，如丹参煎剂、丹参注射液、复方丹参注射液及丹参素等。对于丹参的临床研究表明，丹参制剂对慢性肝炎的作用主要表现为1.恢复肝功能；2.回缩肝脾、改善瘀症；3.抗肝纤维化。对于丹参治疗慢性肝炎的实验研究表现为丹参具有降酶护肝作用，可促进肝细胞再生，改善肝脏血流供应，抑制纤维增生，防止实验性肝硬变发生。而且，丹参除有抑制纤维增生作用外，还可以使已形成的纤维消散、吸收。以上实验或临床资料说明丹参制剂对于治疗慢性肝炎的确具有可靠的医疗作用，但是这些研究和应用只是依靠了丹参对于人体肝脏的保护、修复和防止病情发展的作用，至今为止没有人提出并证实丹参具有抗乙型肝炎病毒的作用。而且现有技术中指出在运用丹参治疗慢性肝炎时还需要配合抗肝炎病毒药(参见王祯苓，丹参治疗慢性肝炎的临床应用及实验研究现状，中西医结合杂志1985年第5卷第8期)。因此，治疗慢性肝炎不仅需要保肝护肝，更重要的是要消灭病原体，从根本上解决问题，寻找一种能抗乙型肝炎病毒的中药是目前医学界的迫切需求。
艾滋病是一种严重威胁人类健康而又无特效治疗药物的传染性疾病，艾滋病自1981年6月被发现以来，短短十几年，已成为有史以来，传播最迅速、最广泛、社会影响最大的病毒性传染病。迄今，世界艾滋病患者总数已超过60万，HIV感染者估计为1400万。与此同时，对艾滋病的研究愈来愈深入，有效药物也日益增多，但是尽管如此，在预防和治疗方面，都没有取得突破性进展，既无疫茵，也不能治愈。艾滋病是由艾滋病病毒(HIV)引起的一种传染性疾病，寻找一种能抗艾滋病病毒的药物是世界医学工作者为之努力的目标。尽管许多医学工作者在中药中筛选了许多对艾滋病有效的药物，但尚没有关于丹参和滇丹参能抗艾滋病病毒的报道。
本发明目的在于证实丹参具有抗艾滋病病毒和抗乙型肝炎病毒的作用。
本发明的目的还在于将滇丹参和丹参开发成为抗艾滋病和乙型肝炎病毒的药物。
本发明所说的滇丹参(Salvia Yunanensis C.H.wright)，别名紫丹参，小红丹参，小红参，为唇形科多年生植物。本品载入1974年云南药品标准P.321，云南省自产自销。根较小，呈纺锤状，表面暗紫红色，易折断，断面不平整，木质部分浅棕黄色，气微，味甘，微苦涩。生于海拔1800-2100米的山坡草地。来源于云南东部。显微特征根的横切面观察，最外为木栓层，紫红色，约10数列细胞；韧皮部宽广，约占根半径的1/3至2/3，薄壁组织内有多数石细胞及纤维群散在；木质部在中央，木质束6-7个，呈放射状排列，木质束由导管及木纤维组成。
丹参(Salvia Miltirrhiza Bunge)与滇丹参同属，分布于全国各地。
丹参的抗艾滋病和乙肝病毒的药理作用主要通过丹参中所含有效成份表现出来的，根据现有技术中常规的制剂方法，可以将丹参制成各种不同的药物剂型。
本发明为了方便实验需要，提取丹参的两种有效成分(D1，E1)，以证实丹参抗艾滋病和乙型肝炎病毒的作用。
丹参提取物的制备方法和工艺(1)丹参有效成分(D1，E1)提取流程取一定量丹参，粉碎至一定程度，上到索氏提取器中①氯仿回流提取，至无色。
②药渣再用无水乙醇提取，至无色。
③药渣凉干至无乙醇味，用3倍量无盐水提取3次，每次浸泡30分钟，过滤，滤液冻干，得成分D1。
④提取后药渣，再用3倍量无盐水沸腾提取3次，每次30分种，过滤，滤液冻干，得成分E1。
(2)冷水浸泡后，通过树脂柱，经乙醇洗脱，冷干后得D2。
(3)水煮沸后，通过树脂柱，经乙醇洗脱，冷干后得E2。
本发明进行了大量的实验，证实了丹参和滇丹参的抗艾滋病和乙型肝炎病毒的药理作用。下列的实验例更加详细地说明了丹参和滇丹参的医疗用途。
实验例1细胞培养内抗艾滋病病毒活性(1).在艾滋病毒1型AZT敏感或耐药株感染人的细胞培养中对P24抗原的抑制作用细 胞 病 毒 D1冷水浸E1煮沸IC50 TC50 TI IC50 TC50 TIμg/ml μg/ml μg/ml μg/mlPBMC018a，AZT(S) 12.7 964.3 77.5 2.24 61.3 27.37人外周血018c，AZT(R) 7.3 ＞1333182.6 2.6 ＞1333512.7单核细胞IIIB 11.3 ＞1333117.96 4.4 ＞1333303.0H9 IIIB 28.7 2000 ＞84.649.07 500 ＞55.45人T淋巴细胞 ±14.1 ±47.49±0.83 ±4.91H9 MN7 44.2C8166 IIIB 0° 14.5 ＞1000＞68.972.2 ＞250 ＞113.64细胞病 毒DR1冷水浸 DR2煮沸IC50 TC50 TI IC50 TC50 TIμg/ml μg/ml μg/ml μg/mlDR6冷水 DR3沸水C8166 IIIB 6.4 250 39.061.5250 166.67DR8 DR218.9 ＞1000 ＞52.91 12.3 250 108.7DR10 DR420.4 ＞1000 49.022.0250 125.0(2).样品抗艾滋病病毒活性的稳定性1994年5--9月，提取D19批，E13批，室温放置半年后，1994年11月测定活性，除D1-8效果不佳外，其余11种都有效。D1-3，4，5效果较好。见图2。
1994年12月采用柱层析方法提取的DR不同样品与D1-3和E1-2于1995年1月同时测定，效价相似。
(3).D1、E1与AZT在人外周血细胞培养中对AZT耐药株的协同作用
D1和E1与AZT有协同作用，见下表药物细胞病毒 D1IC50(μg/ml)AZTE1D1 PBMC018c，42.28AZT耐药AZT0.12D1+AZT3.3 0.053FIC 0.52 ↑12.81倍↑2.26有协同作用E1 ＞20AZT0.033E1+AZT 0.017 0.27FIC 0.54 ↑17.94倍 ↑74.35倍有协同作用实验例2D1在小鼠体内对鼠白血病病毒感染的效果Balb/c小鼠50只，10只正常鼠对照，其余40只腹腔注射鼠白血病病毒RVB株感染鼠脾10％悬液0.3ml/只，分4组，每组10只，称体重，2小时后分别口服D1 0.5、1和2g/kg，对照组口服生理盐水，每天2次20天，称体重，杀鼠取脾称重，计算脾指数，取抗凝血，测白细胞(WBC)、红细胞(RBC)数和血色素％(Hb％)。与对照比较，计算抑制％和统计学t值和p值。 结果D1在小鼠体内对鼠白血病病毒RVB感染的作用组别观 察 指标鼠数体重脾重脾指数 WBC RBCHb％RVB病毒 10 20.71.420.069 26830 407.9 9.78±1.34 ±0.34 ±0.017 ±9926.07 ±62.08±1.09D1 10 21.20.85** 0.04** 14070** 586.7**12.72**2g/kg ±1.23 ±0.18 ±0.008 ±4455.2±76.36±0.93Bid×20 变化％ 2.42％ -41.86％** -47.56％** 43.83％** 30.06％**D1 10 20.70.88** 0.043** 13830** 547.8**12.16**1g/kg ±1.42 ±0.13 ±0.0075±4258.3±92.63±1.17Bid×20 变化％ 0 -37.50％** -48.45％** 34.30％** 24.34％**D1 10 20.71.480.071 21960 387.8 9.930.5g/kg ±1.42 ±0.31 ±0.014 ±7861.33 ±44.91±8.15Bid×20 变化％ 0 3.20％ -18.15％-4.93％ 1.53％
感染后2小时，口服0.5、1.0和2.0g/kg，1天2次20天。1.0和2.0g/kg组抑制RVB病毒感染鼠的脾指数和白血球数，增加红血球数和血色素％，与RVB病毒感染对照组比较，有非常显著的意义。0.5g/kg组无效。重复实验，结果一致。见图3。
E1因药量不足，未进行小鼠体内对鼠白血病病毒RVB感染作用的实验。
实验例3D1在猴体内对猴艾滋病病毒(SIV)感染的效果恒河猴5-7kg，8只，雄性，实验前体检无淋巴结肿大，猴艾滋病病毒抗体阴性。D1，1-6批样品棕色粉末，1994年5-7月制备，细胞培养检测对HIV-1 IIIB P24抗原有抑制作用，用0.5％甲基纤维素配制溶液。8只猴用美国SIVmac病毒液20-200MID50/ml静脉注射，4只猴给D1灌胃喂服100，300mg/kg，各2只，在感染前一天及当天给药，每天一次8周，病毒对照组口服0.5％甲基纤维素，一天一次，灌胃8周，给药前，给药第10、14、17、21及30天，及停药后6天(治疗第62天)和36天(治疗第44天)，取血，分离血浆，在HuT78细胞培养中测定病毒。结果1.血浆病毒动态治疗组和对照组猴血浆病毒阳性数血清平均病毒滴度(TCID50/ml)组别 感染 血浆病毒阳性数/血清平均病毒滴度猴数 10天 14天 17天 21天 30天 62天 90天D1 1/4 1/6.21/31.20/0 0/0 1/12.50/0 0/0感染对照 3/4 0/0 2/12.53/192.5 1/43.71/12.51/12.5 0/04只SIV感染猴口服D18周病毒感染率和血浆病毒滴度与4只感染对照猴比较，感染率减少，血浆病毒滴度低，持续时间短。
2.淋巴结病变D1治疗组比感染对照组减轻E1因药量不足，未进行猴体内对STV感染作用的实验。
实验例4D1和E1对乙型肝炎病毒的作用1.D1和E1在2215细胞中的毒性D1对2215细胞培养的半数中毒浓度(TC50)为3962.78μg/ml，E1为672μg/ml。药物药物浓度和细胞毒性TC50(μg/ml)50002500 1250625 312.5 156.25D1细胞2 1 - - -- -- 3962.78病变3(58.33％)1(25％) - -2 1 - -20001000 500 250 12562.5E1细胞4 3 2 - - -病变4 (100％) 3(75％) 1(33.33％) - 0 - 0- 06724 3 1 - - -
2.D1和E1在2215细胞培养中对HBeAg表达有抑制作用半数有效浓度1148、1154μg/ml；治疗指数分别为3.45和3.44。
对HBsAg表达D1 2000μg/ml，E1 500μg/ml最大耐受浓度无抑制作用。
D1和E1在2215细胞培养内对HBV的作用
3.在鸭乙型肝炎病毒感染鸭体内的治疗效果1日龄北京鸭静脉感染鸭乙型肝炎病毒(DHBV)阳性鸭血清0.2ml/只，7天后口服D1，E1各2g/kg，1天2次10天，病毒对照口服生理盐水，每组5只鸭，给药前、给药后5、10天及停药后3天取血测定血清DHBV-DNA，结果可见给口服D1或E1 2g/kg，Bid×20与病毒对照组比较，可非常显著抑制鸭血清病毒DNA。见图D1及E1治疗组与病毒对照组在鸭体内对DHBV-DNA抑制率的比较实验 组 别 鸭数抑制率(％)批次 (只) T5 T10 P3I 病毒对照组6 -54.19 -6.77-53.94D1 po，Bid×102g/kg 6 64.15** 32.3871.69*E1 po，Bid×102g/kg 6 53.04** 74.71** 62.61II 病毒对照 5 -5.72 0.80 -2.23D1 po，Bid×102g/kg 5 19.23 43.78** 13.24*D1 po，Bid×104g/kg 5 52.47** 62.61** 66.55给药治疗组不同时间DHBV-DNA抑制率分别与病毒对照组相同时间DHBV-DNA抑制率比较(成组t检验)，*P＜0.05，**P＜0.01。
实验例5D1及E1在小鼠体内诱生干扰素的作用。
昆明种小鼠体重20g，♂，每剂量组20只，D1口服37.5，75和150mg/kg一次。E1口服75，150和300mg/kg一次。芸芝多糖(PSK)口服250，500和2000mg/kg一次。2，6，18和24小时分别取5只杀剖取血，分离血清，用培养液稀释1∶10后2倍稀释，处理用小鼠纤维母细胞L929传代细胞培养24小时后，倾去培养液，加入水泡性口炎病毒48小时，设病毒感染，和正常细胞对照，当病毒对照完全时，观察样品细胞病变程度，按Reed-Muench法，计算样本半数抑制稀释度即为干扰素相对效价。结果见下表血清干扰素效价u/ml药物 剂量 给药途径 2 6 18 24小时D13150mg/kg 口服300- - -75234.4 - - -37.5 141.25 - - -E11300 口服- - - -150 - - - -75- - - -PSK1000 口服200- - -500 100- - -250 100- - -150 - - - -* - 0.1ml 1∶10无效。
实验结果表明小鼠口服D1 37.5，75和150mg/kg一次2小时后分别诱生血清干扰素。141.25，234.4和300相对效价u/ml，6.18和24小时后均＜100u/ml。小鼠口服E1 25，150和300mg/kg一次，2，6，18，24小时均＜100u/ml。小鼠口服芸芝多糖150，250，500和1000mg/kg一次，2小时后分别测出血清干扰素相对效价200，100，100u/ml，说明小鼠口服D1诱生血清干扰素，优于芸芝多糖37.5mg/kg约相当于芸芝多糖250，500mg/kg。小鼠口服E1 300mg/kg，未能诱生干扰素。
实验例6D1和E1体内毒性D1口服毒性小，小鼠静脉急性毒性，口服急性、亚急性毒性和雏鸭口服亚急性毒性和猴口服慢性毒性，及E1鸭口服亚急性毒性见表。
药物毒性 动物 实验 动物数给药方案 观察时间 死亡D1 急毒 昆明种小鼠 1 5 40g/kg po×1 7天 0/51 5 2g/kg iv×1 7天 0/52 5 40g/kg po×1 7天 0/52 5 2g/kg iv×1 7天 0/5亚急毒 1 5 4g/kg po，Bid×20 20天 0/52 5 4g/kg po，Bid×20 20天 0/5亚急毒 北京鸭 1 5 2g/kg po，Bid×10 13天 0/52 5 4g/kg po，Bid×10 13天 0/5慢毒 恒河猴 1 2 100mg/kg pd×56 3月 0/2300mg/kg qd×56 3月 0/2E1 亚急毒 北京鸭 1 5 2g/kg po，Bid×1013天 0/5急毒 昆明种小鼠 1 5 30g/kg po×1 7天 0/51 5 2g/kg iv×1 7天 5/51 5 1g/kg iv×1 7天 2/51 5 0.5g/kg iv×17天 1/5D1在小鼠、雏鸭和猴体内毒性小。E1因药量不足，仅进行了鸭体内毒性实验口服2g/kg，1天2次10天，未见毒性。
实验例7丹参提取物Do和丹参酮11-A及丹参素在人T-淋巴细胞培养内对艾滋病病毒的抑制作用。样品1.丹参提取物Do制备方法水煎酒沉，冷干。
2.丹参酮IIA(Tanshinone IIA)。
3.丹参素(b-(3，4-二羟基苯基)乳酸钠，Danshensu)。病毒艾滋病病毒(HTLV-IIIB)细胞人T-淋巴细胞(C8166，H9)病毒指标细胞病变巨细胞形成(CPE)；P24抗原(P24ng/ml)毒性指标细胞病变(CPE)，3HTdR掺入(cpm)表丹参和丹参素及丹参酮II-A在人T-淋巴细胞培养内对艾滋病病毒的抑制作用药品 细胞 病毒 指标IC50 TC50 TIug/ml ug/mlD0C8166HTLV-IIIB巨细胞形成(CPE) 176.77 1000.0 5.663HTdR掺入(cpm) 343.21.94丹参酮C8166HTLV-IIIB巨细胞形成(CPE) 26.90 176.86.573HTdR掺入(cpm) 108.24.02丹参素H9 HTLV-IIIBP24(ng/ml) 30.43HTdR掺入(cpm) 348.011.4权利要求
1.丹参用于制备抗病毒药物的应用。
2.丹参用于制备抗艾滋病药物的应用。
3.丹参用于制备抗艾滋病病毒药物的应用。
4.丹参用于制备抗乙型肝炎病毒药物的应用。
5.丹参用于制备抗白血病病毒药物的应用。
6.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的丹参的应用，其中的丹参包括滇丹参。
全文摘要
本发明证实了丹参和滇丹参具有抗艾滋病和乙型肝炎病毒的作用及其抗白血病病毒的作用，并公开了丹参和滇丹参在制备抗病毒药物中的应用。
文档编号A61P31/12GK1136928SQ9510590
公开日1996年12月4日 申请日期1995年5月29日 优先权日1995年5月29日
发明者陈鸿珊, 阎旭光, 张兴权, 滕立, 李壮, 卢耀增, 吴小娴 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所