专利名称：：来自自身抗原的用于自身免疫疾病的免疫治疗的新的肽类的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种新的自身抗原和由其得到的肽类，它们在自身免疫疾病中关节软骨慢性损伤的治疗中的应用，包括上述肽类的药物组合物，一种用于检测样本中自身反应性T细胞的诊断方法以及用于上述方法的测试盒。免疫系统建立在识别外来抗原(非自身抗原)和自身抗原(自身抗原，来自个体自身)的原则上，这种识别通过对自身抗原的耐受性的建立而完成。免疫系统保护个体抵抗外来抗原并且通过激活特异细胞如T和B淋巴细胞并产生像白细胞间素、抗体和补体因子这样的可溶性因子来对外来抗原的暴露作出反应。免疫系统对之作出反应的抗原被抗原呈递细胞(APCs)降解并且其片断嵌在细胞表面与第二类主要组织相容性抗原复合体(MHC)的糖蛋白结合。此MHC-糖蛋白-抗原片断复合物依靠其T细胞受体识别抗原片断与第二类主要组织相容性抗原复合体蛋白的结合物并与之结合呈递给T细胞。T细胞活化，即增生和/或产生白细胞间素，导致侵袭下针对抗原的淋巴细胞的扩大(Grey等，Sci.Am.，26138-46，1989)。自身抗原也不断地被处理并做为抗原片断被MHC糖蛋白呈递给T细胞(Jardetsky等，Nature353326-329，1991)。因此自身识别成为免疫系统的本质。在正常情况下，免疫系统对自身抗原具有耐受性并且避免了这些自身抗原激活免疫反应。当对自身抗原的耐受性丧失时，免疫系统变得活化，抵抗一种或多种自身抗原，导致自身反应性T细胞的活化并产生自身抗体。这种现象称作自身免疫。由于总的说免疫反应具有破坏性，即意味消灭侵入的外来抗原，自身免疫反应能引起机体自身组织的损害。一些研究证实了T细胞对自身免疫疾病的作用。在鼠类，高度受限制的T细胞群靠髓磷鞘碱性蛋白(MBP)的特异性的单一表位与第二类主要组织相容性抗原复合体(MHC)分子结合成为引起实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)的媒介。在路易士鼠，做为对许多自身免疫疾病易感的物种，显示T细胞为引起疾病的媒介。在人类自身免疫疾病也被认为与自身侵袭的T细胞的发展有联系。许多疾病和破坏性免疫反应有牵连，例如类风湿性关节炎(RA)，由于大量活化的淋巴细胞和第二类MHC表达细胞的存在引起的慢性炎症过程导致对关节软骨的完整性的破坏。仅存的软骨显示出对维持局部炎症反应的需求已经证明软骨的降解与类风湿性关节炎(RA)情形中软骨应答的自身反应性T细胞的活化有联系(Sigall等，ClinExp.Rheumat.659，1988；Glant等Biochem.Soc.Trans.18796，1990；Burmester等，RheumatoidarthritisSmolen，Kalden，Maini(Eds)Springer-verlagBerlinHeidelberg，1992)。而且通过外科手术除去类风湿性关节炎(RA)病人的软骨证明能减弱炎症过程(G.S.Panayi等，Clin.Exp.Rheumatol.11Csuppl.8)s1-s8，1993)。因此软骨蛋白被认为是能够刺激T细胞的目标自身抗原。自身反应性T细胞的活化导致了自身免疫疾病的发展。一些药物，例如甾类药物可被用来治疗导致软骨的破坏的炎症过程。然而，这些药物常为非特异性的并且有毒副作用的免疫抑制药物。非特异性免疫抑制的缺点使得此种治疗极不适宜。抗原特异性、无毒性免疫抑制疗法为非特异性免疫抑制提供了一种很有吸引力的可供选择的方法。这种抗原特异性疗法涉及用目标自身抗原或来自自身抗原的合成的T细胞反应性肽类来治疗病人。这些合成的肽类相当于自身抗原的T细胞表位，并且可被用来诱导特异性T细胞对它们和自身抗原的耐受性。虽然看起来用使免疫系统激活的相同的抗原使免疫系统脱敏并不合理，但有控制地使用目标(自身)抗原可以很有效地使免疫系统脱敏。为了有效地采用耐受性疗法来治疗T细胞引起的软骨损伤，极需确认反应的自身抗原并且找到能降低病人对在炎症过程中激活T细胞反应的自身抗原的敏感度的T细胞反应性肽类。本发明的一个目的是提供这种自身抗原和来自上述自身抗原、能够诱导患T细胞引起的软骨损伤的病人对反应的软骨抗原的特异性T细胞耐受性的T细胞反应性肽类。本发明的另一个目的是提供一种检测与关节软骨损伤有关的自身反应性T细胞的方法和用于上述方法的测试盒。人的软骨糖蛋白39(此后称做HCgp-39)被惊奇地发现是类风湿性关节炎病人的一种目标自身抗原，它能激活特异性T细胞而引起或介导炎症。由HCgp-39得到的肽类能够最显著地被类风湿性关节炎病人的自身反应性T细胞识别而很少被健康供者的T细胞识别，因而表明HCgp-39是类风湿性关节炎的一种自身抗原。HCgp-39的关节炎基因(arthritogenic)特性进一步在Balb/c鼠被证明。在Balb/c鼠单剂量皮下注射上述蛋白质能够引发动物的关节炎迹象。HCgp-39诱导的疾病过程其特征为前脚爪和/或后脚爪的周期性复发并且从轻关节炎逐渐发展为更严重的类型。同样地特别是类风湿性关节炎，观察到的对称分布的关节痛和周期性复发及小瘤的形成，暗示着关节炎疾病的发展。更令人惊奇的是发现使用HCgp-39获得了免疫学的耐受性，更重要的是延缓和/或抑制了关节炎的发展。HCgp-39存在于病人和健康成人血清中，不过病人的这种蛋白的血清浓度是健康成人的2倍。而且在滑液标本和类风湿性关节炎病人的软骨中可以得到编码HCgp-39的mRNA，而通过外科手术得到的健康成人的软骨中并不含有大量的上述mRNA。当培养关节软骨细胞和滑液细胞时，它们主要的分泌产物即为HCgp-39(Hakala等，J.Biol.Chem.，Vol268，3425803，1993)。在Hakala等人的文献及其它任何文献中，对HCgp-39的关节炎基因本质既无描述也无提示。本发明更进一步的目的通过包含自身抗原HCgp-39的一个亚序列的肽类得以实现，其特征在于上述肽类包含氨基酸序列FGRSFTLAS(SEQIDNo.1)，FTLASSETG(SEQIDNo.2)，YDDQESVKS(SEQIDNo.3)和FSKIASNTQ(SEQIDNo.4)中的一种或多种。更特别地，根据本发明的肽包含氨基酸序列PTFGRSFTLASSE(SEQIDNo.5)，RSFTLASSETGVG(SEQIDNo.6)，VGYDDQESVKSKV(SEQIDNo.7)和SQRFSKIASNTQSR(SEQIDNo.8)中的一种或多种。“亚序列”被理解定义为“一部分”而不能错误地理解为包括整个蛋白质。根据本发明的肽最好是具有9-55个氨基酸残基的氨基酸序列。更优选本发明的肽具有的氨基酸序列为9-35个氨基酸残基，特别是9-25个氨基酸残基。更为优选的肽具有的氨基酸序列为9-15个氨基酸残基。极优选的肽具有的氨基酸序列为13或14个氨基酸残基，例如正如具有SEQIDNo.5-8给出的氨基酸序列的肽。本发明的肽的多聚体也在本发明的范围内，例如单体序列可选择地被间隔残基隔开的二聚体或三聚体。这些多聚体提供了大量的SEQIDNo.’s1-8中给出的T细胞表位。在本发明的肽类SEQIDNo.1-8中给出的氨基酸序列能够受到侧翼区的翼侧攻击，侧翼区相当于HCgp-39蛋白质或其它存在上述氨基酸序列的蛋白质的氨基酸序列上相应氨基酸的自身侧面部位。上述侧翼区也可替代地是由无规则的氨基酸残基构成的非天然氨基酸序列。这些非天然侧翼部位可用来稳定肽类，从而提高其生物有效性。为提高本发明肽类的生物有效性，优选非天然侧翼部位。SEQIDNo.’s1-4给出的氨基酸序列，更特别的是SEQIDNo.’s5-8给出的氨基酸序列类似于第二类主要组织相容性抗原复合体限制的T细胞表位，其存在于HCgp-39上。HCgp-39上的第二类主要组织相容性抗原复合体限制的T细胞表位显示在HCgp-39氨基酸序列的103-116，259-271，263-275和326-338区域(从信号序列中的蛋氨酸开始，见HaKala等，1993)。因此，根据本发明这些肽类也可被理解为包括含有一种或多种上述确定的第二类主要组织相容性抗原复合体限制的T细胞表位的自身抗原HCgp-39的片段而且它们也在本发明的范围内。根据本发明的肽类为T细胞反应性的肽，能够被自身反应性T细胞识别并能刺激T细胞的活化。这些自身反应性T细胞可在类风温性关节炎病人的血中发现但极少存在于健康供者。因此，根据本发明HCgp-39蛋白质或上述类似于目标自身抗原HCgp-39上的第二类主要组织相容性抗原复合体限制的T细胞表位的合成肽类，极适合于对患有T细胞介导的关节损伤例如关节炎、尤其是类风湿性关节炎的病人的治疗来诱导特异的T细胞对HCgp-39的耐受性。WO95/01995和WO95/02188描述了HCgp-39做为类风湿性关节炎的标记在诊断上的用途，HCgp-39的关节炎基因本质从未揭示或提示过。对于HCgp-39，其片断或根据本发明的T细胞反应性肽类在软骨遭到侵袭时诱导T细胞对HCgp-39的特异耐受性的抗原或肽特异性疗法中的应用也未在任何地方暗示过。本发明的肽的制备是通过已知的肽合成的有机化学方法之一得以实现的。HCgp-39和肽类也可借助重组DNA技术制备。肽合成的有机化学方法被认为包括在均相中或依靠所谓的固相用缩合反应偶联所需的氨基酸。缩合反应可如下进行a)在缩合剂存在下，将具有自由羧基且其它反应基团被保护的化合物(氨基酸、肽)与具有自由氨基且其它反应基团被保护的化合物(氨基酸、肽)进行缩合。b)将具有活化的羧基并且其它反应基团为自由的或保护的化合物(氨基酸、肽)与具有活化的氨基并且其它反应基团为自由的或保护的化合物(氨基酸、肽)进行缩合。羧基的活化可以发生，特别是将羧基转化为酸性卤化物，叠氮化物，酐、咪唑胺或活化的酯，如N-羟基-琥珀酰亚胺，M-羟基-苯并三唑，对硝基苯酯、N-羟基-苯并三唑酯或五氟化苯酚酯。上述缩合反应中最常用的方法为碳化二亚胺法、叠氮化物法、混合酐法和使用活化酯的方法，如同ThePeptides，Analysis，Synthesis，BiologyVol.1-3(Ed.gross，E.andMeienhofer，J.)1979，1980，1981(AcademicPress，Inc.)中描述的。使用“固相”制备上述提到的本发明的肽的片断正如J.Amer.Chem.Soc.852149(1963)和Int.J.PeptideProteinres.35161-214(1990)中描述的。要制备的肽的氨基酸的偶联通常从羧基末端开始。对这种方法需要一个具有反应基团或可引进反应基团的固相。例如这可以为具有反应性的氯甲基的苯和二乙烯基苯的共聚物或提供反应性的羟甲基或胺官能团的聚合的固相。例如，一个特别适合的固相为对烷氧苄醇树脂(4-羟基-甲基-苯氧基-甲基-共聚苯乙烯-1％二乙烯基苯树脂)，描述于J.Am.Chem.Soc.951328，作者为wang(1974)。合成后在温和条件下肽可从固相上裂解。在所要求的氨基酸序列合成后，接着从树脂上分开这些肽，例如使用含有清除剂的三氟乙酸，例如三异丙基硅烷，苯甲醚或乙二硫醇，苯硫基甲烷。如所陈述在不能参与缩合反应的反应基团有效地被借助于酸、碱或还原作用很容易重新水解下来的基团所保护。因此，羧基基团可以有效地被保护，例如通过与键合于固相支持物上的甲醇、乙醇、叔丁醇、苄醇或对硝基苄醇的酯化作用和与胺的结合。能够有效保护氨基的基团为乙氧羰基、苄氧羰基、叔丁氧羰基(t-boc)或对甲氧苄氧基羰基，或来自磺酸的酸性基团如苯磺酰基或对甲苯磺酰基，但其它基团也可被使用，如取代或未取代的芳基或芳烷基，例如苄基和三苯甲基，或者象正硝基苯磺酰基和2-苯甲酰基-1-甲基-乙烯基这样的基团。例如特别适宜的α-氨基保护基团为碱敏感的9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)〔Carpino&Han(1970)J.Amer.Cbem.Soc.925748〕。对于可能的保护基团的更深入的报道见于ThePeptides，Analysis，Synthesis，Biology，Vol.1-9(Eds.Gross，UdenfriendandMeienhofer)1979～1987(AcademicPress，Inc.)。根据特殊基团的本质保护基团可通过各种常规的方法被裂解，例如借助于三氟醋酸或温和的还原剂，例如使用氢和催化剂，如钯，或使用溶于冰醋酸的HBr。如上所述，本发明的HCgp-39和肽类也可以借助于重组DNA技术来制备。出于这个目的，编码HCgp-39或本发明的肽类或上述肽的多聚体的核酸序列被插入到表达载体中。合适的表达载体其中包括包含了复制及表达所需控制区的质粒，粘粒，病毒和YAC’s(酵母人工染色体)。表达载体可以被带到宿主细胞中表达。例如合适的宿主细胞为细菌，酵母细胞和哺乳动物细胞。这些技术为本领域公知的技术(Sambrook等，MolecularCloningaLaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，1989)。虽然用激活免疫系统的相同抗原来降低免疫系统的敏感性看起来不合理，但控制剂量的HCgp-39和/或包含HCgp-39序列的肽类可以有效地降低免疫系统的敏感度。根据本发明，软骨遭受自身反应性T细胞侵害的病人可以用包含HCgp-39、本发明的一种或多种肽类和可以接受的药物载体的药物组合物来治疗，以使这些病人的特异性自身反应性T细胞对遭受侵害的软骨中的HCgP-39和其它含有明确的T细胞表位的自身抗原产生耐受性T细胞表位具有SEQIDNo.1-8之一给出的氨基酸序列。并且减弱炎症反应。要用于本发明药物组合物的非常适宜的肽类为具有SEQIDNo.5，6，7和8中给出的氨基酸序列的肽类。同样非常适用于本发明药物组合物的是包含对HCgp-39或本发明一种或多种肽类进行编码的DNA的DNA(表达)载体。DNA(表达)载体的传递表达为一定水平的重组HCgp-39蛋白或本发明的肽类，这与直接给予包含HCgp-39蛋白或肽类的药物组合物得到的水平相似。自身抗原和本发明的肽类具有的优点为与免疫抑制甾类药物的非特异抑制作用相比对自身反应性T细胞具有特异耐受作用而使免疫系统的其它成分未受触动。使用自身抗原或本发明的肽类的疗法是安全的并且没有毒副作用发生。通过使用高或低剂量的自身抗原或本发明的肽类可以获得耐受性。自身抗原或肽的量取决于给药途径、给药时间、病人的年龄及总的健康状况和饮食。通常使用的剂量为每千克体重0.01到1000μg的肽或蛋白质，优选0.5到500μg，更优选0.1到100μg的肽或蛋白质。药学上可接受的载体是本领域技术人员公知的，例如包括无菌盐，乳糖，蔗糖，磷酸钙，白明胶，糊精，琼脂，果胶，花生油，橄榄油，芝麻油和水。其它的载体可以是例如第二类MHC，如需要，嵌入脂质体中。此外，本发明的药物组合物可以包含一种或多种佐剂。适合的佐剂其中包括氢氧化铝，磷酸铝，两性离子，维生素E，单磷酸苯脂A，胞壁酰二肽和皂角苷例如皂树A(QuillA)。佐剂的量取决于其自身的性质。此外，本发明的药物组合物可包含一种或多种稳定剂，例如碳水化合物包括山梨糖醇，甘露糖醇，淀粉，蔗糖，糊精和葡萄糖，蛋白质如白蛋白和酪蛋白，以及缓冲液如碱性磷酸盐。适宜的给药途径为肌肉注射，皮下注射，静脉注射或腹膜内注射，口服和鼻内给药。口服和鼻内给药为优选的给药途径。由于它的关节炎基因本质，HCgp-39或本发明的肽类可用于临床诱导非人类哺乳动物的关节炎。给小剂量的HCgp-39或一种或多种本发明的肽类，关节炎的症状将在上述哺乳动物身上发展最终导致疾病模型暗示着关节炎，特别是类风湿性关节炎疾病的发展。当给Balb/c鼠皮下注射HCgp-39蛋白质时，这些动物出现关节炎症状。HCgp-39诱导的疾病过程其特征为前脚爪和/或后脚爪的周期性复发并且从轻的关节炎逐渐发展为更严重的类型。同样，观察到的对称分布的关节痛和周期性复发及小瘤的形成，暗示着关节炎疾病特别是类风湿性关节炎的发展。因此，这些患有疾病的动物提供了适当的动物模型来研究关节炎产生和发展的基础机理。另外，上述患有疾病的动物可以用来寻找治疗关节炎的新的药物并且研究这些药物在关节炎发展中的作用。对于关节炎，特别是类风湿性关节炎鼠被优选用做动物模型。为了诱导上述哺乳动物的关节炎，应给其适当剂量的HCgp-39或本发明的一种或多种肽类。适当的剂量为每千克体重0.1～1000μg，优选1～100μg，更优选10～50μg。HCgp-39或肽的量取决于给药途径，给药时间和使用的动物种类。适宜的给药途径与前面所述的相同。为了诱导关节炎诱导的作用，HCgp-39蛋白质或本发明的肽可以包含一种或多种如前所述的稳定剂或佐剂。HCgp-39或本发明的肽类也非常适用于一种诊断方法来检测关节软骨慢性感染中活化的自身反应性T细胞的存在。本发明的诊断方法包含下述步骤a)从个体血样分离外周血单核细胞(PBMC)，b)在适合条件下培养上述PBMC，c)在自身抗原或由其得到的本发明的一种或多种肽存在下温育上述PMBC培养物，d)检测T细胞的反应，例如增殖反应，指明个体活化的自身反应性T细胞的存在。在通过测量自身反应性T细胞的增殖反应来检测反应的情况下，放射性同位素例如3H胸苷的结合是对增殖的一个量度。存在于PBMC中的自身反应性T细胞反应也可以通过使用细胞因子特异性ELISA测量细胞因子释放或51铬释放测定的细胞毒性来检测。另一种检测方法是通过FACS分析来测量活化标记的表达，例如Il-2R。因此，包含本发明的一种或多种肽类和适合的检测试剂的诊断组合物构成了本发明的一部分。根据检测的类型，检测试剂可以是放射性同位素，一种酶，或对细胞表面的特异性抗体或活化标记。本发明的范围还包括包含一种或多种本发明的肽类的测试盒。这些测试盒适用于本发明的诊断方法。因而，本发明提供了一种方法，用于检测患T细胞介导软骨损伤例如关节炎特别是类风湿性关节炎病人是否存在对HCgp-39有反应性的自身攻击T细胞。如果存在HCgp-39特异性T细胞，那么这些T细胞对包含HCgp-39或本发明的肽的药物组合物的耐受性能延缓或抑制关节炎发展。下面的实施例是对本发明的举例说明而且不能理解为限定本发明的范围。图1HCgp-39耐受和非耐受Balb/c鼠中关节炎的产生和发展。前脚爪和后脚爪致敏后每天患病的动物总的关节炎得分。致敏后每天患病动物的数目也给出。实施例1方法病人收集根据美国风湿症协会(ARA)标准(Amett等，ArthritisRheum.31315，1988)诊断的患类风湿性关节炎病人的外周血单核细胞(PBMC)。通过X射线评分(Rntgenscore)将类风湿性关节炎病人的严重程度分为程度I-IV。收集来自健康供者带有DR4Dw4(DRB1*0401)或DR1特异性的外周血单核细胞做为对照。也收集了来自两健康供者不带有任一种类风湿性关节炎结合的DR分子的外周血单核细胞。MHC类型病人和健康供者PBMC染色体提取物使用DynalDR‘lowresolution’SSP测试盒进行分析。DR4亚定型使用DynalDRB1*04-SSP测试盒(UniversityTransfusionservice，Radboudhospital，Hijmegen，TheNtherlands)来进行。肽本发明的肽和一种对照肽通过固相肽合成法合成。简言之，具有自由氨基和羧基末端的肽在Milligen9050合成仪上合成，在PEG-PS树脂上使用Fmoc/tBu保护的活化酯。在分解和去保护以后，肽使用制备型HPLC纯化，用DowexAc树脂转变为醋酸盐或转变为氯化物盐并且冻干。这些肽类使用质谱检测。此研究中使用的肽类列于表1。一种N-末端生物素化的流感血凝集得到的肽(SEQIDNo.9)，生物素-间隔基团-IHA(307-319)F，其中第三个残基(Y)被F替代，(生物素-NH-(CH2)5-CO-PKFVKQNTLKLAT)，被使用为标记肽用于与DR4Dw4(DRB1*0401)结合的研究中。具有SEQIDNo9的非生物素化的肽IHA(307-319)F被用做对照肽。表1合成肽的氨基酸序列</tables>给出了肽1-4和控制肽IHA(307-319)F的氨基酸序列，相应的序列号。用于制备纯化的HLA-DR分子的细胞培养两个EBV一转化的B细胞系，即BSM(A2，B62，Cw3，DR4Dw4，DQ8，Dpw2)和BM92(A25，B51，Cw1，DR4Dw14，DQ8)是由AcademicHospitalLeiden，theNetherlands赠与的。细胞培养于DMEM/HAM’sF12(GibcoLaboratories，GrandIsland，NY)中，添加有10％FCS(HycloneLaboratories)、1％非必需氨基酸(ICI)，L-谷氨酰胺、2-ME和抗生素。细胞按常规每隔2-3天按1∶2比率传代。收集细胞后再用含有1mMPMSF的PBS(4℃)洗涤3次。细胞小颗粒贮存于-70℃直至使用。HLA-DR分子的亲合纯化从细胞溶胞产物通过使用单克隆抗体L243(ATCCHB55)亲和纯化HLA-DR分子，直接针对于DR复合物上的非多形性决定簇(Lampson等，J.Immunol125293，1980)。根据制备程序，蛋白质G琼脂糖凝胶纯化的L243偶联于NHS-琼脂糖凝胶4FF(Pharmacia)上。HLA-DR表达细胞在PBS，1％NP-40，1mMAEBSF(Calbiochem)中于冰上融化后溶解30分钟。溶胞产物于15000rpm(Sorvall，SS34rotor)离心30分钟使之澄清。上清液经0.45μM滤器过滤并加入到L243-NHS-琼脂糖凝胶珠中。经过夜培养，此珠被转移到柱中并用5体积PBS、1％NP-40；5体积PBS、0.5％NP-40；15体积PBS、0.5％NP-40、0.1％SDS；5体积PBS、0.05％NP-40；5体积PBS、1％正辛基-葡糖苷(Sigma，st.Louis，USA)和5体积50mM二乙胺(Fluka)、150mMNaCl，1％正辛基-葡糖苷PH＝8.0洗涤。HLA-DR分子用50mM二乙胺，150mMNaCl，1％正辛基-葡糖苷PH＝11洗脱。收集后立即用2M甘氨酸PH4.8中和各级分。收集的各级分在非还原条件下用SDS-PAGE分析然后进行银染色。含有纯化的HLA-DR的级分用30KD截流膜超滤浓缩。HLA-DR肽结合分析肽的结合研究使用前述半定量结合分析的改进的方案(Joosten等，Int.Immunol.6751，1994)。纯化的HLA-DR分子(0.5-500nM)在PH＝5.0下在50nM生物素化的标记肽(生物素-间隔基-IHA(307-319)F及在最终体积为25μl结合缓冲液(PBS，1mMAEBSF，1mMN-乙基马来酰亚胺，8mMEDTA，10μm胃蛋白酶抑制剂A，0.01％NaN3，0.05％NP-40和5％DMSO)中具有一定浓度范围的竟争肽(肽1-4和IHA(307-319)F做为对照肽)中保温。在室温保温约45小时后，结合或未结合的标记肽可通过在硝酸纤维素滤膜(BioRad)上印迹并结合SDS-PAGE或在硝酸纤维素滤膜(BioRad)及96孔Hybry.Dot装置(BRL)的真空DOT印迹法分离。印迹被0.1M马来酸PH＝7.5，150mMNaCl中的0.5％DNA封闭试剂(BoehringerMannheim，Germany)所封闭。半小时后，印迹经PBS，0.02％Tween20(Sigma，St.Louis，USA)洗涤并且分别以1∶40，000或1∶5，000的稀释度用Streptavidin-HRPO(SouthernBiotechnology)温育。DR-结合的生物素化的标记肽用采用WesternBlotECL测试盒(Amersham，U.K.)的增强的化学发光法根据制备说明检测。预先发光(Preflashed)的膜(hyperfilm-ECL，Amersham，U.K.)被暴露10分钟。所给肽的相对结合亲和力与同标记肽的竞争有关。这种相对亲和力定义为信号减少到50％(RIC50)时肽的浓度。在SDS-PAGE情况下，RIC50值的确定通过目视来检查。DOT印迹-斑点的密度分析使用计算密度计(MolecularDynamics，USA)及ImageQuantandExcel软件。血单核细胞的增殖反应为了确定T细胞对HCgp-39中肽序列的反应性，与健康的DR1或DR4对照品比较检验肽1-4诱导类风湿性关节炎病人PBMC增殖反应的能力。由肝素化静脉外周血经标准的菲可帕克(Ficoll-Paque)梯度离心，分离得到PBMC。细胞在平底的微量滴定板中于1，5×105细胞/孔的浓度下在添加有10％热钝化自身血浆、L-谷氨酰胺、2-ME和抗生素介质中培养3或4次。细胞在介质中单独温育或在PHA(2.5μg/ml)存在下或在抗原，包括此Candidaalbicans提取物(回忆抗原11μg/ml，0.1μg/ml)存在下或在肽1-4中一种浓度为100μg/ml、25μg/ml或10μg/ml存在下温育。培养物在总体积210μl，于370℃，增湿的5％CO2环境中温育7天。培养物在最后18小时与0.25μCi3H胸苷一起脉冲振动。确定将对两种浓度的至少一种试验肽产生反应的病人评定为高应答者(HR)，将对至少一种浓度的至少一种试验肽产生反应的病人评定为应答者(R)。而将对任一种试验肽都不产生反应的病人评定为非应答者(NR)。所给肽的相对结合的亲和力与同标记肽的竞争有关。这种相对亲和力定义为信号减少到50％(RIC50)时肽的浓度。结果为了确定T细胞对肽1-4的反应性，分析了类风湿性关节炎病人和健康供者的PBMC增殖反应。至此，大多数对由HCgp-39得到的肽的高应答者或应答者带有DR1、DR4Dw4、DR4Dw14或DR10的特异性，已知这些均与类风湿性关节炎发展的增大的风险相联系。肽1-4与DR4Dw4和DR4Dw14的结合如表2中所示。表2肽1-4与HLA-DR分子的结合具有SEQIDNo.5-8给出的氨基酸序列的肽1-4分别与HLA-DR分子结合。在PH＝5，使用50nMIHA(307-319)F做为标记肽，用半定量结合分析(如实施例1方法所描述)测定了肽的结合。其值为以微摩尔表示的RIC50值。(浓度竞争肽其信号减少到没有竞争肽存在时信号的大约50％)。除了肽4外所有的结果均来自于两个独立的试验(分别为SDS-PAGE和斑点印迹)。大多数类风湿性关节炎病人对本发明的一种或多种肽有反应(表3)，而在健康供者群反应极少发现(表4)。发现6例类风湿性关节炎病人对任何试验肽均不起反应(结果未示出)。类风湿性关节炎病人疾病的严重程度被评定为程度I-IV。这里所示X射线评分为对关节损伤程度的估计。对肽1-4的高应答者和应答者在所有程度的疾病中都有发现。本发明的肽相当于自身反应性T细胞的表位并且对这些表位的反应性被最显著地发现于类风湿性关节炎病人但极少发现于健康供者。因而，类风湿性关节炎病人具有直接针对自身抗原HCgp-39的活化的自身反应性T细胞。很明显，自身抗原HCgp-39遭到T细胞侵袭，导致了炎症及对软骨中HCgp-39抗原的损害。表4在10％自身血清中测得的健康供者新分离的PBMC对肽1-4的增殖反应</tables>健康供者的PBMC分别对具有SEQIDNo.5-8给出的氨基酸序列的肽1-4的增殖反应。结果表示为刺激指数(SI)值(＝抗原特异性Cp5m(测量平均值)/对照Cp5m(测量平均值)。SI值＜2被认为阴性。R＝应答者(在检测的最高肽浓度下+反应)。-＝测量平均值的标准偏差，超过了可接受的值，因此未给出值。实施例2方法从MG63骨肉瘤细胞系纯化HCgp-39MG63细胞(人骨肉瘤ATCCCRL1427)在细胞工厂于DMEM/HAM’sF12无血清介质中培养。由肝素亲和色谱使随后的葡聚糖(superder75)色谱从培养物上清液中纯化HCgp-39。纯度由SDS-PAGE检测。而且，N-末端氨基酸测序证实此纯化的蛋白质与Hakala等人描述的蛋白质相同。Balb/c鼠中HCgp-39的关节炎基因性质将溶于100μl体积PBS(0.5MNaCl，0.01M磷酸钠缓冲液，PH7.5)中的10或50μg纯化的HCgp-39与不完全弗氏佐剂(IFA)按1∶1混合后皮下注射于雌性Balb/c鼠胸部2×4区域(HarlanCPB，Zeist，TheNetherlands)，同时用PBS(1∶1，IFA中)注射于4只对照鼠。每天检查鼠的关节炎临床症状。通过记录每只脚爪0-3的分数(根据Glant等人的文献)来评定关节炎的严重程度。简言之，得分0＝没有变化，得分1＝红斑疹和肿胀，得分2＝肿胀和出现畸形，得分3＝因失去弯曲和伸展能力而不能活动。鼻内给药HCgp-39诱导耐受性使用PT45微导管和汉密尔顿(Hamilton)注射器给10只雌性Balb/c鼠(用Enflurance轻微麻醉)鼻内给药28μg蛋白质。于诱导关节炎前15天、10天，5天给予抗原。对照(n＝10)经同样的程序但仅接受载体(PBS)(表5)。在0天如上描述使用10μg蛋白质致敏后通过测定迟发型超敏(DTH)反应来评价免疫耐受性。在第0天致敏后在第8天于左后爪肉趾注射溶于50μg体积的10μgHCgp-39(攻击)。迟发型超敏(DTH)反应的量度体现在爪肉趾上的反应的增加(C左边肿胀(mm×10-3)-右边肿胀(mm×10-3)I/右边肿胀(mm×10-3))×100％。在攻击后0，24和48小时使用自己设计的μ测量仪(μmeter)测量了爪肉趾的肿胀。每天检查这些鼠对关节炎诱导的耐受性，直到致敏后31天为止。用前面提到的方法评定关节炎的严重程度。表5耐受性表DTH＝迟发型超敏反应PBS＝0.5MNaCl，0.01M磷酸钠缓冲液pH7.5结果HCgp-39的关节炎基因性(Arthritogenicity)一次注射与不完全弗氏佐剂(IFA)混合的50μgHCgp-39后，所有的鼠逐渐发展为严重的关节炎(表6)。在致敏后15～20天于4只动物的3只前爪上第一次观察到关节炎症状。那些在前爪未显出任何症状的鼠于致敏后第34天后爪发展为关节炎。HCgp-39诱导的疾病过程其特征为前脚爪或后脚爪的周期性复发并且从轻的关节炎逐渐发展为更严重的关节炎(对疾病的进程进行了62天的观察)。常常(＞50％)观察到对称分布的关节痛，意味着在相同时间前脚爪和后脚爪两者都显示出关节炎症状。使用与不完全弗氏佐剂(IFA)混合的10μg(而不是50μg)HCgp-39类似地获得诱导的关节炎。然而，关节炎的得分有一些低(未列出数据)。4只鼠中的3只发展为严重的关节炎。在试验期间一只鼠仅显现出轻微症状。在整个试验期间对照鼠未显现出关节炎症状。总之，10和50μg蛋白质两者都足以诱导Balb/c鼠的发展的关节炎。由HCgp-39诱导的关节炎的慢性特征(除周期性复发外还有对称的关节痛)是类风湿性关节炎(RA)疾病发展的征兆。表6用HCgp-39致敏的Balb/c鼠关节炎的产生和发展FP＝前脚爪HP＝后脚爪conlr＝对照。关节炎症状没有得分＝0，中度每只动物得分不超过2，重度每只动物得分≥4。用迟发型超敏反应(DTH)分析测定免疫耐受性在0天给对照鼠注射HCgp-39表现出强的抗原特异性DTH反应，这意味着致敏后引发了对HCgp-39的细胞免疫反应(表7)。然而鼻内给药HCgp-39完全消除了对自身抗原攻击的迟发型超敏反应，因此显示出HCgp-39特异性T细胞实际上耐受了。值得注意的是，非耐受组10只动物中的4只于攻击侧相邻近的脚踝发展为关节炎。相反，耐受组于攻击侧相邻近的关节并未发展为关节炎，因此表明，对HCgp-39的免疫耐受性导致了保护机体阻止关节炎的发展。表7经鼻内给药耐受后对HCgp-39的DTH反应。</tables>对关节炎诱导或发展的耐受性进一步监测了对HCgp-39耐受和非耐受的Balb/c鼠关节炎的产生和发展。在对照(非对受的)组的所有鼠，经HCgp-39致敏后产生了疾病(表8)。7只鼠逐渐发展为严重的关节炎同时3只鼠仅表现出轻微的症状(最高得分为2)。相反，试验期间HCgp-39耐受组中的5只鼠被保护阻止了疾病发展。此外，耐受组的两只动物在短暂时间内显现出仅仅是轻微的症状。三只动物发展为得分为4的较严重的关节炎。令人感兴趣的是，在耐受的动物中，前脚爪和后脚爪关节炎的发作分别被延迟了最少7-9天(图1)。虽然耐受组的少数动物受到影响，每只动物前脚爪关节炎得分可与非耐受动物关节炎得分相比。然而耐受动物中每只动物后脚爪关节炎得分有些低(图1)。表8HCgp-39耐受和非耐受的Balb/c鼠关节炎的产生和发展</tables>关节炎发作第一个症状出现-最大数量动物受到伤害。关节炎症状没有症状得分＝0，中度每只动物得分不超过2，重度每只动物得分≥4。上述试验说明了在Balb/c鼠中HCgp-39的关节炎基因的特性。HCgp-39诱导的疾病过程其特征为前脚爪和/或后脚爪的周期性复发并且从轻的关节炎逐渐发展为更严重的类型。同样，观察到的对称分布的关节痛和周期性复发，暗示着在类风湿性关节炎疾病的发展。HCgp-39的高度的关节炎基因特性通过单次皮下注射10或50μg能在所有动物身上引起关节炎症状的蛋白质予以说明。通过诱导HCgp-39特异性迟发型超敏反应表明实际上激发了HCgp-39特异性T细胞对HCgp-39的致敏反应。这些数据通过对用HCgp-39在脚爪肉趾免疫过的动物的HCgp-39特异性体外增殖反应的说明被进一步证实(数据未给出)。重要的是，非耐受的动物于注射部位邻近的脚踝发展为关节炎，因此实际上意味着HCgp-39特异性T细胞涉及关节炎的诱导。肽类抗原鼻内给药被用于诱导抗原特异性免疫耐受性。试验表明HCgp-39鼻内给药导致免疫非反应性。致敏后的DTH反应在HCgp-39耐受鼠中完全消除而对照鼠表现出抗原特异性肿胀。这些现象表明给予HCgp-39导致了外周免疫耐受性。对非耐受动物，10只鼠中4只的DTH反应伴随着脚踝(邻近攻击部位)关节炎。相反，HCgp-39耐受的动物脚踝实际上被完全保护，这意味着自身反应性T细胞被有效地抑制了。通过观察到的耐受组10只动物中的5只在整个试验期间完全被保护的现象，进一步说明了用HCgp-39产生的耐受性保护机体阻止疾病发展的概念。虽然这一组中其它5只动物最终显示出临床症状，但关节炎的发作被显著地延迟。因此可以断定，HCgp-39特异性T细胞与关节炎基因的过程有关并且更重要的是，通过使用本发明的药物组合物使T细胞耐受可以延迟或抑制关节炎的发展。序列一览表(1)一般资料(i)申请人(A)名称AKZONOBELN.V.(B)街Velperweg76(C)城市Arnhem(E)国家荷兰(F)邮政编码(ZIP)6824BM(G)电话0412-666376(H)传真0412-650592(I)电报37503akphanl(ii)发明名称来自自身抗原的用于自身免疫疾病的免疫治疗的新的肽类(iii)序列数目9(iv)计算机可读型式(A)介质类型软盘(B)计算机IBMPC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentInRelease#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQIDNO1的资料(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQIDNO1PheGlyArgSerPheThrLeuAlaSer15(2)SEQIDNO2的资料(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQIDNO2PheThrLeuAlaSerSerGluThrGly15(2)SEQIDNO3的资料(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQIDNO3TyrAspAspGlnGluSerValLysSer15(2)SEQIDNO4的资料(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQIDNO4PheSerLysIleAlaSerAsnThrGln15(2)SEQIDNO5的资料(i)序列特征(A)长度13个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQIDNO5ProThrPheGlyArgSerPheThrLeuAlaSerSerGlu1510(2)SEQIDNO6资料(i)序列特征(A)长度13个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQIDNO6ArgSerpheThrLeuAlaSerSerGluThrGlyValGly1510(2)SEQIDNO7的资料(i)序列特征(A)长度13个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQIDNO7ValGlyTyrAspAspGlnGluSerValLysSerLysVal1510(2)SEQIDNO8的资料(i)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQIDNO8SerGlnArgpheSerLysIleAlaSerAsnThrGlnSerArg1510(2)SEQIDNO9的资料(i)序列特征(A)长度13个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQIDNO9ProLyspheValLysGlnAsnThrLeuLysLeuAlaThr1510权利要求1.包含HCgp-39的亚序列的肽，上述肽包含氨基酸序列FGRSFTLAS(SEQIDNO.1)，FTLASSETG(SEQIDNo.2)，YDDQESVKS(SEQIDNo.3)和FSKIASNTQ(SEQIDNo.4)中的一种或多种。2.根据权利要求1的肽，上述肽包含氨基酸序列PTFGRSFTLASSE(SEQIDNo.5)，RSFTLASSETGVG(SEQIDNo.6)，VGYDDQESVKSKV(SEQIDNo.7)和SQRFSKIASNTQSR(SEQIDNo.8)中的一种或多种。3.根据权利要求1或2的肽，具有氨基酸序列PTFGRSFTLASSE(SEQIDNo.5)。4.根据权利要求1或2的肽，具有氨基酸序列RSFTLASSETGVG(SEQIDNo.6)。5.根据权利要求1或2的肽，具有氨基酸序列VGYDDQESVKSKV(SEQIDNo.7)。6.根据权利要求1或2的肽，具有氨基酸序列SQRFSKIASNTQSR(SEQIDNo.8)。7.HCgp-39蛋白质或根据权利要求1至6中任何一项的肽做为治疗物质的应用。8.包含HCgp-39蛋白质或根据权利要求1至6中任何一项的一种或多种肽和可接受的药物载体的药物组合物。9.HCgp-39蛋白质或根据权利要求1至6中任何一项的一种或多种肽作为制备药物制剂的应用，该制剂用于患T细胞介导的软骨损伤的病人来诱导特异性T细胞对自身抗原HCgp-39的耐受性。10.HCgp-39蛋白质或根据权利要求1至6中任何一项的一种或多种肽作为制备药物制剂的应用，该制剂用于患关节炎、特别是类风湿性关节炎的病人来诱导特异性T细胞对自身抗原HCgp-39的耐受性。11.HCgp-39蛋白质或根据权利要求1至6中任何一项的一种或多种肽用于诱导非人类的哺乳动物、特别是鼠的临床关节炎的方法中。12.根据权利要求1至6中任何一项的肽做为诊断物质的应用。13.包含根据权利要求1至6中任何一项的一种或多种肽和一种检测试剂的药物组合物。14.用于检测活化的自身反应性T细胞的诊断方法，它包含下述步骤a)从一个个体血样分离外周血单核细胞(PBMC)，b)在适宜条件下培养上述PBMC，c)在HCgp-39，其片断和/或根据权利要求1至6中任何一项的一种或多种肽存在下温育上述PBMC培养物，并且d)检测T细胞的反应，指示个体中活化的自身反应性T细胞的存在。15.用于检测活化的自身反应性T细胞的测试盒，上述的测试盒包含HCgp-39或根据权利要求1至6中任何一项的一种或多种肽。16.根据权利要求1至15中任何一项的肽，具有9-55个氨基酸残基的一个氨基酸序列。全文摘要本发明涉及得自自身抗原HCgp-39的新型肽类，该肽类至少含有氨基酸序列FGRSFTLAS(SEQIDNo.1)，FTLASSETG(SEQIDNo.2)，YDDQESVKS(SEQIDNo.3)和FSKIASNTQ(SEQIDNo.4)中的一种。这些肽类类似于关节软骨中自身抗原HCgp-39上的MHCII类限制的T细胞表位。在自身免疫疾病中，HCgp-39和该肽类可用于关节软骨损伤的特异性治疗以诱发免疫系统耐受性。自身抗原HCgp-39和该肽类也适于诱导非人的动物特别是小鼠的关节炎。本发明还涉及含有该自身抗原和/或该肽类的药物组合物、检测试样中自身反应性T细胞的诊断方法以及用于该方法的测试盒。文档编号A61K38/00GK1168677SQ95190944公开日1997年12月24日申请日期1995年10月25日优先权日1994年10月27日发明者A·M·H·布茨,G·F·M·沃海登申请人:阿克佐诺贝尔公司