专利名称：包含免疫球蛋白－受体相互作用的抑制剂的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物组合物，其含有能抑制免疫球蛋白与其受体之间相互作用的肽。
众所周知，免疫球蛋白(Igs)与位于细胞表面的其相关受体的相互作用可诱导一系列不同的反应，其不同取决于受体所识别的Ig同种型。例如IgG结合在巨噬细胞表面相应的受体FcgR上，会引起胞吞作用，使抗原抗体复合物被溶酶体降解，并使细胞分泌有效的炎症介质，如前列腺素，白三烯，氧中间体和中性蛋白酶(Unkeless等，1981，实验医学杂志，171期，597-611页)。
同样众所周知的是，免疫球蛋白通过其稳定区(称之为Fc)与其相关受体相互作用，而与抗原抗体特异性无关(Fridman等，1992，免疫学综述，125期，49-76页)。
目前尚不能得到可干扰免疫球蛋白/受体相互作用的合成化合物。只有通过基因工程技术，作为重组产物得到的名为sFcR的可溶性天然受体能作为这种重要相互作用的抑制剂(Sautes等，1994，染色体杂志，662期，197-207页)。
因此，在必须控制Ig过量产生以及Ig/受体的识别对细胞周期具有负面影响的所有那些病例中，很显然，对它们的重要治疗方法之一是抑制免疫球蛋白与受体之间的相互作用。
如多发性骨髓瘤，因其对常规化疗的耐受性而无法治疗，但已有实验数据显示，基于施用Fc的可溶性受体进行的间接免疫治疗可降低肿瘤细胞的生长和免疫球蛋白的分泌(Hoover等，临床研究杂志，95期，247-247页)。
同样，在艾滋病(AIDS)中，病人血清中存在抗体，其与相应细胞受体的相互作用可增加病毒的感染力(Homsy等，1989，科学，244期，1357-1360页)，因此，基于施用能干扰与Ig相互作用之受体的分子的治疗对于HIV病毒的感染性有显著的治疗意义。
某些炎症性疾病，如类风湿性关节炎，其病因就是免疫球蛋白与其相应细胞受体的相互作用(Fearon & Wong，1983，免疫学年鉴，1期，243页)。同前述病例一样，基于施用能干扰Ig/受体识别之分子的治疗具有明显的治疗效果。
甚至过敏反应也是由免疫球蛋白(此时是E族)与其相应细胞受体的相互作用引发的。
考虑到治疗上的广泛应用和病理学的严格性，迫切需要有能干扰免疫球蛋白与其相应受体间相互作用的合成化合物，这样化合物中就不含任何生物来源的污染，并且成本低。
现在业已发现式(I)的肽具有这些特点，(H2N-X1-Thr-X2-CO)n-R (I)其中互不相同的X1和X2是L或D型构象的酪氨酸和精氨酸残基，其中苏氨酸的羟基和精氨酸的胍基部分可以被肽化学中常规用于分别保护羟基和胍基部分的化合物所保护；n为2，3或4，以及R为能形成二聚体，三聚体和四聚体肽的基团。
这些化合物的制备已在本申请人1996年6月19日的欧洲专利申请号96201706.7中进行了描述。该申请目前尚未公开，其中描述了这些化合物作为免疫球蛋白配体的特性。
因此，本发明的第一个目的是提供一种药物组合物，其中含有生物学有效量的式(I)肽(H2N-X1-Thr-X2-CO)n-R (I)其中互不相同的X1和X2是L或D型构象的酪氨酸和精氨酸残基，其中苏氨酸的羟基和精氨酸的胍基部分可以被肽化学中常规用于相应保护羟基和胍基部分的化合物所保护，n为2，3或4，R为能形成二聚体，三聚体和四聚体肽的基团，
并且其中还至少含有一种药学可接受的惰性成分。
n较优选为4。
式(1)化合物中每个氨基酸均可为L或D型构象。
在本说明书及权利要求书中，术语“二聚体”、“三聚体”、和“四聚体”指分别含有2个，3个或4个H2N-X1-Thr-X2-CO-序列的肽，其中X1和X2具有上文所述含义。
适于形成二聚体(n＝2)的基团的典型实例为赖氨酸残基。适于形成三聚体(n＝3)的基团的典型实例是化学式为Lys-Lys的赖氨酸-赖氨酸二肽。适于形成四聚体(n＝4)的基团的典型实例是化学式为Lys-Lys((Lys)的分支三肽和化学式为Gly-Lys-Lys((Lys)的分支四肽。
式(1)四聚体的一个典型实例具有下述化学式(H2N-X1-Thr-X2-CO)4-(Lys)2-Lys-Gly-OH(IA)其中X1和X2具有前述含义，且其中苏氨酸和酪氨酸的羟基及精氨酸的胍基部分可以被肽化学中常规用于相应保护羟基和胍基部分的化合物所保护。
文献报道过很多可用于保护羟基的基团(Grant G.A.《合成肽操作手册》，Freeman，N.Y.，1992)。
所述保护基团的典型实例为叔丁基(tBu)(La Joie G.，Chvici A.，Adamson J.G.，合成，571-572页(1990))和苯甲基(Yojima“四面体”，44卷，805-819页，(1988))。
文献中还报道了很多可用于保护精氨酸胍基部分的基团(GrantG.A.，“合成肽操作手册”Freeman，N.Y.，1992)。
所述保护基团的典型实例是2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)和4-甲氧基-2，3，6-三甲苯基(Mtr)(Ramage和Green《四面体通讯》28期，2287页(1987)；Fujiino等，《化学制药通告》29期，2825页，1981)。
式(IA)化合物的特例为
(H2N-L-Arg(Pmc)-L-Thr(OtBu)-L-Tyr(OtBu)-CO)4-(Lys)2-Lys-Gly-OH(P-PAM)(H2N-L-Arg-L-Thr-L-Tyr-CO)4-(Lys)2-Lys-Gly-OH(L-PAM)(H2N-D-Arg-D-Thr-D-Tyr-CO)4-(Lys)2-Lys-Gly-OH(D-PAM)如下文所详述，已分析了式(1)肽在抑制免疫球蛋白与受体的结合(Ig-FcR)方面及抑制由人IgG衍生的绵羊红细胞(SRBC)与U937细胞间的花结形成方面的生物学活性，结果发现，式(I)化合物与Ig受体的相互作用类似于Ig，并且这种相互作用是剂量依赖性的。此外，还通过被动皮肤过敏试验，在体内评估了式(I)化合物的生物学活性，这种实验代表了研究抗过敏化合物的动物模型。
在小鼠急性毒性检验中，式(I)化合物无论经口服还是静脉用药均表现良好耐受性。
用本发明的药物组合物治疗能产生良好疗效的典型病例是干扰Ig与其受体间的相互作用是有用的或必须的那些病理状态。这些病理状况的典型实例是类风湿性关节炎及过敏反应。
较优选地，将本发明的药物组合物制成合适的剂型，其中包含至少一种式(I)化合物的有效剂量和至少一种制药可接受的惰性成分。
适当剂型的实例为片剂，胶囊，糖衣片剂，粒剂，口服溶液和糖浆，用于皮肤表面的油膏和药贴；直肠栓剂和可用于注射的无菌溶液，气雾胶及眼部用药。
剂型中还可含有其他常规组分，如防腐剂、稳定剂、表面活性剂、缓冲液、调节渗透压的盐、乳化剂、增甜剂、着色剂、调味剂等等。
若有特殊治疗要求，本发明的药物组合物还可包含其他活性药理成分，这种相伴使用有利于治疗。
本发明的药物组合物中式(I)肽的用量可以在一个较大范围内变动，这取决于一些已知的因素，诸如待治疗的疾病类型，病性严重程度，病人体重，剂型，所选用药途径，每日用药次数及所选式(I)肽的效力。
通常，本发明药物组合物中式(I)肽的含量应确保用药水平为1-200mg/kg/天，优选2-50mg/kg/天。
本发明的药物组合物剂型可按药物化学家熟知的技术制备，这些技术包括混合、成粒、压缩、溶解、灭菌等等。
就P-PAM，L-PAM和D-PAM肽而言，已对其抑制人IgG或IgA与相应受体Fcγ和Fcα间相互作用的能力进行了评估。
为此，已开发出了一种对人免疫球蛋白IgG和IgA与其位于U937人细胞系质膜上的受体间的结合进行抑制的试验。
U937细胞系(Sundstrom，C.和Nilsson K.，国际癌症杂志，17卷，565页，1976)由ECACC(产品目录号87010802)提供，它来自组织细胞淋巴组织瘤，是能表达组织细胞来源之细胞所示的很多单核细胞样性质的少数几种人细胞系之一。因此，它被广泛用于研究Ig和Fc受体(FcR)间的相互作用(McCool D.等，免疫学杂志，135期，1975-1980页，1985；Raychaudhuri G.等，分子免疫学，22卷，1009-1019页，1985；Burton D.R.等，分子免疫学，25卷，1175-1181页，1988)。
这一细胞系组成型地表达IgG受体FcgRI和FcgRII(Looney R.等，免疫学杂志，136卷，1641页，1986)和IgA受体Fc((Monteiro R.C.等，实验医学杂志，171卷，597-613页，1990)。
进行试验的第一步是制备U937细胞的质膜。该制备过程基本参照Hubbard A.L.等的程序(细胞生物学杂志，96卷，217-229页，1983)对受控细胞进行匀浆，不同的是此处匀浆所用为Dounce仪，且随后纯化质膜部分的过程在蔗糖密度梯度中完成。
按提供的条件培养细胞后，收获细胞并离心(10分钟，4℃，100×g)，用冷的D-PBS洗三次，再离心。所得细胞沉淀称重(1.5g)并悬浮于4ml 0.25M的STM〔0.25M蔗糖于TM(5mM Tris-HCl pH8，0.5mM MgCl2)〕中。
悬浮液于4℃置10分钟。
在Dounce仪中匀浆细胞〔用A匀浆棒(大号)匀浆40次，并用B匀浆棒(小号)匀40次〕，显微镜下检查细胞是否破裂，并离心(4℃，10分钟，280×g)去除完整细胞、核及细胞碎片。
回收上清，将沉淀重新悬浮于一半原始体积的STM中，用A匀浆棒在Dounce仪中匀10次。再次离心该悬浮液(4℃，10分钟，280×g)。回收上清，与上一步所回收的上清液合并，再次离心(10分钟，4℃，1500×g)。
将所得沉淀重新悬浮于0.25M STM中，并加入2M STM(TM中的2M蔗糖)，将溶液的密度调至1.18gr/cm3。使0.25M STM分层于所得溶液上层，再超速离心(1小时，4℃，78,000×g)。
从两层蔗糖梯度相之间的界面回收细胞膜部分。
竞争试验的第二步为人Ig的生物素化(IgG，Sigma目录号I-4506，IgA，Sigma目录号I-0663)。将150mM磷酸钠缓冲液(PBS)中的2mg/ml免疫球蛋白溶液0.5ml与H2O/EtOH 1∶1中的6mg/ml生物素溶液(生物素酰氨己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，Sigma目录号B-2663)0.5ml混合。将所得溶液在室温搅拌15小时。然后经50mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)透析去除过量的生物素。
通过生物素化的Ig与质膜制剂上的受体间的线性结合试验确立了Ig/Fc结合抑制试验的条件。
用于ELISA测定的微量板(Falcon目录号3912)用得自U937细胞的细胞膜，按100μl/孔，以PBS中0.1-10μg/ml(指质膜制剂中总蛋白含量)的不同浓度进行处理，在4℃处理15小时。用PBS洗板5次，再每孔加180μl含3％牛血清白蛋白(BSA，Sigma目录号A-9418的PBS溶液)以封闭非特异性位点。
室温1小时30分钟后，用PBS-T(含0.05％吐温的PBS)洗板5次，每孔中加100μl于PBS-BSA 0.5％中含0.02-2μg/ml各种不同浓度的生物素化Ig的溶液。
37℃温育1小时30分钟后，将按1∶1000稀释于PBS-BSA 0.5％中的过氧化物酶衍生的链霉抗生物素蛋白(Sigma，目录号S-5512)溶液加入各孔，每孔加100μl。37℃温育1小时后，用PBS-T洗板5次，每孔加入溶于磷酸盐缓冲液pH5和0.012％过氧化氢中的2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(Sigma，目录号A-9941)100μl。
约30分钟后，在平板读数仪(Merck，Mod.Mios)上检测每孔在405mm处的吸收值，结果如表1所示。
表1人生物素化IgG或IgA与得自U937细胞系的质膜(PM)制剂间的线性结合
表1的数据显示IgG和IgA与质膜制剂中相应受体的结合均为剂量依赖型。
利用浓度为10μg/ml的U937质膜固定于平板上，以及浓度为0.4μg/ml的生物素化Ig，已进行了Ig/Fc结合抑制试验。
将IgG与浓度为1-500μg/ml的本发明各种肽(L-PAM，D-PAM和P-PAM)及两种对照物即L型构象(称为CON-L)和D型构象(称为CON-D)的肽Arg-Thr-Tyr一起温育(表2)，而IgA的结合抑制试验条件与此类似，用的是L-PAM，P-PAM和CON-L肽(表3)。
表2IgG-FcR结合抑制实验
B/BO为抑制百分率，是用加了竞争物得到的O.D.值除以未加竞争物得到的O.D.值计算所得。
表3IgA-FcR结合抑制实验
B/BO意义同上。
表2及表3中的数据显示，L-PAM、D-PAM和P-PAM均以剂量依赖的方式产生与IgG同样水平的相互作用。这种抑制作用是特异的，因为对照组(BSA)及两肽链CON-L和CON-D均不能抑制这种相互作用。
同样，L-PAM和P-PAM肽特异性地抑制IgA-FcR间的相互作用，而BSA及CON-L均未能达到这样的效果。
此外，还评估了本发明化合物对用人IgG衍生的SRBC与U937细胞间花结形成的抑制作用类型。
该试验用人IgG衍生的绵羊红细胞(SRBC)与U937细胞(如上所述制备而成)间的花结形成抑制实验，对L-PAM和D-PAM进行研究。
花结形成试验按Lund J.等(FASEB J.，9期115-119页，1995)的程序进行，并做如下改动。
按生产商提供的方案，利用鞣酸化SRBC(鞣酸预处理的SRBC，Sigma目录号R-8128)和人IgG(Sigma目录号I-4506)制备衍生的SRBC。衍生作用最后将IgG-SRBC重新悬浮于DPBS(Sigma目录号D-5527)中含0.1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma目录号A-9418)的溶液中。
从密度为7.5×105个细胞/ml的培养物中取2.5×105个U937细胞，于80×g离心5分钟，沉淀再悬浮于50μl DPBS-BSA 0.1％中，与50μl含2.5×107个SRBC-IgG的DPBS-BSA 0.1％一起温育，其中U937与SRBC-IgG的比率为1∶100。
25℃30分钟后计数花结，特别要计数有4个或4个以上的SRBC细胞结合于表面的U937细胞。结果发现，在这些情况下，平均有45％的经处理U937细胞形成花结。
用L-PAM，D-PAM，CON-L和CON-D肽以上述相同条件进行花结形成抑制试验。另用IgG作为抑制阳性对照，未衍生化的SRBC作为阴性对照，进行进一步的对照试验。
试验结果见表4，从中可看出，本发明的L-PAM和D-PAM肽可抑制IgG衍生的SRBC与U937膜上相关受体间形成玫瑰花结，如同IgG一样。这种抑制作用是特异的，因为SRBC对照和CON-L、CON-D肽均不能抑制这种相互作用。
表4SRBC-IgG和U937 FcR间的花结形成抑制
>(*)指使SRBC-IgG与U937 FcR间的花结形成减少50％所需的抑制剂量。
式(I)肽与IgE之间的相互作用先通过制备亲和层析柱，并评价其从生物液中纯化IgE的能力而进行测试。为此，将5mg肽(I)溶于5ml 0.1M的碳酸氢钠缓冲液pH9.0中，并加入1.2g已活化的CH-Sepharose树脂(Pharmacia，Uppsala，瑞典目录号17-0490-01)，即已预先活化以直接偶联肽和蛋白质的亲和层折支持物。将悬浮液混合24小时，在不同的时间点对反应混合物取样，并经RP-HPLC分析，以监控偶联效率。24小时后，约90％的起始肽共价结合于树脂上。再用50ml 1M Tris pH9.0洗涤该衍生化树脂，并装入100×6.6mm内径大小的玻璃柱中。为纯化E族免疫球蛋白，用25mM BIS-TRIS缓冲液pH6.5，以1ml/min的流速平衡亲和柱，在280nm监控洗脱液。
将1ml含抗卵白蛋白的IgE的腹水上样于亲和柱中，洗脱未结合物后，改用0.1M醋酸洗脱。收集解析物，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。电泳结果清楚地显示该层析柱可保留腹水中的免疫球蛋白级分，却不保留白蛋白，后者在空柱体积中被洗脱。
由L或D型构象氨基酸制得的式(I)化合物的纯化能力均与所用亲和层析支持物的类型无关。事实上，用其他支持物，如Protein-Pak支持物(Waters，美国)，Eupergit C30N(Sigma，美国)和Affi-gel(Bio Rad，美国)也获得了相似的结果。
式(I)肽结合E族免疫球蛋白的能力还通过ELISA测定进一步证实。为此，将式(I)肽固定于ELISA测定微量板(Falcon目录号3912)上，进行式(I)肽-IgE特异性生物素化抗原线性结合实验。与牛血清白蛋白(BSA，Sigma目录号A-9418)偶联后，将式(I)肽铺板，浓度为于0.1MNaHCO3pH8.5中50μg/ml，100μl/孔，4℃放置15小时。用PBS洗板5次，向每孔加入含3％奶粉溶液180μl封闭非特异性位点。室温1小时30分钟后，用PBS-T(PBS-0.05％吐温)洗板5次，再向每孔加100μl腹水溶液，内含于PBS-0.5％奶粉中浓度为10μg/ml的卵白蛋白抗原特异性IgE。37℃温育1小时30分钟后，向每孔加入100μl于PBS-0.5％奶粉中1-30μg/ml各种不同浓度的生物素化卵白蛋白溶液。
37℃温育1小时30分钟后，加入稀释于PBS/0.5％奶粉中的过氧化物酶衍生的链霉抗生物素蛋白(Sigma目录号S-5512)溶液(100μl/孔)。
37℃温育1小时后，用PBS-T洗板5次，向每孔加100ml于柠檬酸盐磷酸盐缓冲液pH5和0.012％过氧化氢中的2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)溶液(Sigma目录号A-9941)。
大约30分钟后，用平板读数仪(Merck Mod.Mios)测定每孔的吸收值，结果见表5。所得数据表明PAM肽以特异的和剂量依赖性的方式结合IgE。
表5
此外，还评估了本发明肽在体内的抗过敏活性。
将含有卵白蛋白抗原特异性IgE并且免疫球蛋白总含量为4mg/ml的大鼠腹水按比例稀释于PBS中，对CD种雄性大鼠进行皮内注射。
皮内注射量为50μl，注射部位为动物的去毛背部。
这样能使腹水中的IgE结合局部肥大细胞的FcεR，使它们致敏。
24小时后，静脉注射于1ml PBS中的1mg卵白蛋白及2％Evan’sBlue染料。
15分钟后，观察到大鼠背部皮肤出现着色区，其范围和颜色深浅与和腹水一起注射的抗原特异性IgE量成正比。
蓝染区是由于在皮内注射部位注射的抗原与IgE结合而产生的，导致脱颗粒并释放介质，从而使局部血管通透性增加，染料从血管中漏出所致。
阴性对照是皮内注射50μl不含腹水的PBS，未出现蓝染区。
抑制试验中，将含IgE并适当稀释后的腹水与L-PAM和D-PAM肽以总免疫球蛋白-肽摩尔比为1∶2，1∶20，1∶200，1∶2000，1∶20,000和1∶200,000(对应于26ng，260ng，2.6μg，26μg，260μg，2600μg的L-PAM和D-PAM肽)的比例一起温育。
分别对两种肽进行试验。
在CD1大鼠中，皮内注射各种浓度的腹水-肽混合物50μl。
阳性对照是注射不含肽的腹水50μl。
24小时后，如上述注射抗原及Evan’s Blue染料。
15分钟后可见大鼠背部蓝染区的颜色深汪和面积大小与注射的肽量成比例，当肽浓度达到最高值时，完全没有蓝染区出现。
用L-PAM和D-PAM肽得到的结果如表II所示。这些结果说明两种肽均能以剂量依赖的形式抑制IgE-受体间的相互作用，直至炎症反应完全消失。
表权利要求
1.一种药物组合物，其中含有生物学有效量的式(I)肽(H2N-X1-Thr-X2-CO)n-R (I)其中互不相同的X1和X2是L或D型构象的酪氨酸和精氨酸残基，其中苏氨酸的羟基和精氨酸的胍基部分可以被肽化学中常规用于分别保护羟基和胍基部分的化合物所保护，n为2，3或4R为相应能形成二聚体，三聚体和四聚体肽的基团，并且其中至少含一种制药可接受的惰性成分。
2.权利要求1的药物组合物，其中R为4。
3.权利要求1或2的药物组合物，其中式(I)化合物中的每个氨基酸可以是L或D型构象。
4.权利要求2或3的药物组合物，其中R为具有式(Lys)2-Lys-Gly-OH的四肽。
5.权利要求1至4中任何一项的药物组合物，其中X1为精氨酸。
6.权利要求1至5中任何一项的药物组合物，其中X2为酪氨酸。
7.权利要求1至4以及6中任何一项的药物组合物，其中X1为Arg(Pmc)。
8.权利要求1至5以及7中任何一项的药物组合物，其中X2为Tyr(OtBu)。
9.权利要求1至8中任何一项的药物组合物，其中式(I)化合物中的苏氨酸羟基由叔丁基保护。
全文摘要
一种药剂组合物,其中含有生物学有效量的式(Ⅰ)肽:(H
文档编号A61P35/00GK1240357SQ97180694
公开日2000年1月5日 申请日期1997年12月11日 优先权日1996年12月16日
发明者G·法西纳, S·迪法尔科 申请人:泰克诺根公司