专利名称：抗病毒化合物的制作方法
技术领域：
本发明属于人医学领域，特别是病毒感染的治疗。更具体地讲，本发明涉及鼻病毒、肠病毒和黄病毒感染的治疗。
病毒性上呼吸道疾病即感冒的发病率是很高的。据估计仅在美国每年约有十亿人发病。鼻病毒为细小核糖核酸病毒科的一员，它是引起人感冒的主要原因。因为已鉴定了110多株鼻病毒，因此鼻病毒疫苗的开发是不可行的，化疗似乎为更理想的途径。细小核糖核酸病毒科的另一成员为肠病毒，该病毒包括约80种人病原体。许多此类肠病毒引起感冒样症状，其它的此类病毒可以引起更为严重的疾病例如脊髓灰质炎、结膜炎、无菌性脑膜炎和心肌炎。
与鼻病毒感染有关的疾病可以由鼻的排出物和阻塞物证明。而且，它还与中耳炎有关、诱使支气管炎发病、恶化窦炎并与哮喘性altoclis的沉积有关。尽管许多人认为仅仅让人有点损害，但是由于它在健康个体中的频繁发病并从雇员的缺勤和医师的访问导致的经济方面的重大损失方面考虑使其成为广泛的研究课题。
可以用病毒血小板抑制试验(virus plaque suppression test)或致细胞病变作用试验(cytopathic effect test)(CPE)(Cf Siminoff,AppliedMicrobiology,9(1),66(1961))可以很容易地证明化学性化合物体外抑制病毒生长的能力。尽管已经鉴定了许多抑制细小核糖核酸病毒例如鼻病毒的化学性化合物，但是许多是不能令人接受的，因为1)活性谱的限制，2)不需要的副作用或3)不能预防动物或人的感染或疾病(见Textbook of Human Virology,由Robert B.Belshe编辑，第16章，“鼻病毒”，由Roland A.Levandowski编写，391-405(1985))。因此，尽管已经认识到使用鼻病毒抑制剂的治疗潜力并且已经扩大了该方面的研究努力，然而到目前为止还没有出现可行的治疗药物。例如美国专利系列号4008243、4018790、4118573、4118742、4174454和4492708公开了抗病毒苯并咪唑化合物。
一般而言，上述专利公开的化合物并不具有用于治疗鼻病毒感染的所需的药理模式。这些化合物尤其不具有令人满意的口服生物利用度或者具有足够高的抑制活性以弥补它们的相对低的口服生物利用度，以使它们得到广泛应用。此外，本领域普遍认为从毒理学的观点而言，用于治疗鼻病毒感染的化合物应该非常安全。
因此，本发明的主要目的是提供新的苯并咪唑化合物，它们可以抑制细小核糖核酸病毒例如鼻病毒、肠病毒如脊髓灰质炎病毒、A和B组科萨奇病毒或埃可病毒的生长，并具有所需的药理模式。
本发明提供式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐
其中a为0、1、2或3；每个R独立为氢、卤素、氰基、氨基、卤代(C1-C6)烷基、二(C1-C4)烷基氨基、叠氮基、C1-C6烷基、氨基甲酰基、氨基甲酰氧基、氨基甲酰氨基、C1-C6烷氧基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷基亚磺酰基、C1-C4烷基磺酰基、吡咯烷并、哌啶子基或吗啉代；R0为氢、卤素、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基；R1为卤素、氰基、羟基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、甲硫基、甲基亚磺酰基或甲基磺酰基；R2为氢、氨基或-NHC(O)(C1-C6烷基)；
R3为二甲基氨基、C1-C10烷基、C3-C7环烷基、取代的C3-C7环烷基、卤代(C1-C6)烷基，苯基、取代的苯基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、噻唑烷基、吡咯烷并、哌啶子基、吗啉代或下式的基团
R4和R5独立为氢、C1-C4烷基。
本发明也提供含有本发明的化合物或其药学上可接受的盐以及与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂结合的药用制剂。
本发明也提供抑制细小核糖核酸病毒的方法，该方法包括给予需要的宿主有效量的式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐，其中a、R、R0、R1、R2、R3、R4和R5与上述定义相同。
本发明也提供抑制黄病毒的方法，该方法包括给予需要的宿主有效量的式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐，其中a、R、R0、R1、R2、R3、R4和R5与上述定义相同。
在此所用的温度为摄氏温度(℃)。在此使用的测量单位为重量单位(除液体用体积单位外)。
如在此所用，术语“C1-C10烷基”代表具有一至十个碳原子的直链或支链烷基链。一般C1-C10烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、2-甲基己基、庚基等。术语“C1-C10烷基”在其定义中包括术语“C1-C6烷基”和“C1-C4烷基”。
“卤素”代表氯、氟、溴或碘。
“卤代(C1-C6)烷基”代表具有一至六个碳原子并连接有1、2或3个卤原子的直链或支链烷基链。一般卤代(C1-C6)烷基包括氯代甲基、2-溴代乙基、1-氯代异丙基、3-氟代丙基、3-溴代丁基、3-氯代异丁基、碘代叔丁基、三氯甲基、三氟甲基、2,2-氯代-碘代乙基、2,3-二溴代丙基等。
“C1-C4烷硫基”代表具有一至四个碳原子连接于硫原子的直链或支链烷基链。一般C1-C4烷硫基包括甲硫基、乙硫基、丙硫基、异丙硫基、丁硫基等。
“C1-C6烷氧基”代表具有一至六个碳原子连接于氧原子的直链或支链烷基链。一般C1-C6烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基等。术语“C1-C6烷基”在其定义中包括术语“C1-C4烷基”。
“二(C1-C4)烷基氨基”代表具有一至四个碳原子连接于共有的氨基的两条直链或支链烷基链。一般二(C1-C4)烷基氨基包括二甲基氨基、乙基甲基氨基、甲基丙基氨基、乙基异丙基氨基、丁基甲基氨基、仲丁基乙基氨基等。
“C1-C4烷基亚磺酰基”代表具有一至四个碳原子连接于亚磺酰基部分的直链或支链烷基链。一般C1-C4烷基亚磺酰基包括甲基亚磺酰基、乙基亚磺酰基、丙基亚磺酰基、异丙基亚磺酰基、丁基亚磺酰基等。
“C1-C4烷基磺酰基”代表具有一至四个碳原子连接于磺酰基部分的直链或支链烷基链。一般C1-C4烷基磺酰基包括甲基磺酰基、乙基磺酰基、丙基磺酰基、异丙基磺酰基、丁基磺酰基等。
“取代的苯基”代表具有1-3个选自下列取代基取代的苯环卤素、氰基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、氨基或卤代(C1-C4)烷基。
“取代的C3-C7环烷基”代表用1-3个选自下列的取代基取代的环烷基环卤素、氰基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、氨基或卤代(C1-C4)烷基。
权利要求的化合物可以以顺式或反式形式存在。在本说明书中，顺式指这样一些化合物，即甲酰胺部分相对于苯并咪唑环为顺式，反式指这样一些化合物，即甲酰胺部分相对于苯并咪唑环为反式。此两种异构体都属于权利要求的化合物的范围。
如上所述，本发明包括式Ⅰ所定义的化合物的药学上可接受的盐。因此，本发明的化合物可以具有充分的酸性、碱性或两种官能团，并因此可以与任何的无机碱和无机酸和有机酸反应形成药学上可接受的盐。
在此所用术语“药学上可接受的盐”指上式的化合物的盐，它们对于生物体基本无毒性。一般药学上可接受的盐包括那些通过使本发明的化合物与无机酸或有机酸或无机碱反应制备的盐。已知此类盐为酸加成盐和碱加成盐。
通常使用的形成酸加成盐的酸为无机酸例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸等，有机酸如对甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸、草酸、对溴代苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸等。
此类药学上可接受的盐的实例为硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1,4-二酸盐、己炔-1,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯代苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯基乙酸盐、苯基丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、羟乙酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-1-磺酸盐和扁桃酸盐等。优选的药学上可接受的酸加成盐为与矿物酸例如盐酸和硫酸形成的酸加成盐，以及与有机酸例如马来酸和甲磺酸形成的酸加成盐。
碱加成盐包括由无机碱例如铵或碱或碱土金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等衍生的盐。因此用于制备本发明的盐的此类碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钙、碳酸钙等。特别优选钾盐和钠盐形式。
应该理解形成本发明任何盐部分的特定的相反离子不是关键因素，只要作为整体的盐是药学上可接受的盐并且只要相反离子不引起作为整体的盐的不需要的性质即可。
本发明优选的化合物为下式的化合物或其药学上可接受的盐
其中a为0、1或2；每个R独立为氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基或二(C1-C4)烷氨基；R0为氢；R2为氨基；R3为二甲基氨基、C1-C6烷基、卤代(C1-C6)烷基、苯基、取代的苯基、C2-C7环烷基、取代的C3-C7环烷基、噻吩基、噻唑烷基、吡咯烷并、哌啶子基或吗啉代；R4为氢、甲基或乙基；R5为氢、甲基或乙基。
在优选的化合物中，更优选的为这样一些式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐，其中a为0或1；每个R独立氢、氟代、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、二甲氨基；R3为C1-C4烷基、苯基、取代的苯基、C3-C7环烷基或取代的C3-C7环烷基。
在这些化合物中，最优选的为下列化合物或其药学上可接受的盐
可以通过使适当取代的乙酰胺与碱反应得到相应的阴离子，然后使其与适当取代的式ⅠA的酮反应得到醇的中间体制备式Ⅰ化合物。所述反应一般在有机溶剂中，在约-90℃至室温下，用相对于所述酮反应物过量的碱和乙酰胺反应物进行1至12小时。优选在用于该反应前，用适当的保护基团保护乙酰胺。一般碱包括氢化钠、二异丙基酰氨锂(LDA)和正丁基锂。优选的碱为正丁基锂。溶剂的选择不是关键，只要该溶剂对于所进行的反应而言是惰性的，并且所述反应物被加溶至足以进行所需的反应。尽管乙酰胺反应物也可以用作溶剂，但是适合该反应的溶剂为四氢呋喃。当于-78℃开始该反应并使其缓慢升至室温时，一般反应1-18小时制备醇中间体。可以用HPLC监测该反应，当其基本完成时通过加入酸终止反应。一般酸包括盐酸、氢溴酸、甲酸等。优选的酸为浓盐酸。优选使产生的醇中间体脱水，但不必在分离或纯化前进行。
特别是，在约室温至该混合物的回流温度之间，使所述醇中间体与酸反应30分钟至12小时，得到所需的式Ⅰ化合物。一般酸包括盐酸、氢溴酸、甲酸、乙酸和酸的组合。优选的酸组合为含有浓盐酸的甲酸。当该反应在该混合物的回流温度下进行时，一般反应约30分钟至7小时制备所需化合物。该反应优选用例如HPLC监测以保证该反应完全。
优选用本领域已知的方法分离式Ⅰ化合物和产生的顺式/反式异构体。例如，用柱层析像反相HPLC可以分离得到的顺式和反式异构体。用适当的乙腈和水或甲醇和水的比例可以由柱上洗脱所述化合物。通过暴露于hν辐射可以将该化合物的顺式形式转化为顺式/反式混合物并通过上述纯化步骤循环。
根据本领域的详细的方法，可以制备式ⅠA化合物的酮中间体。例如，根据下列反应流程Ⅰ可以制备酮中间体。
反应流程Ⅰ
其中X为氰基或-COOR’，其中R’为C1-C4烷基；X’为卤素；a、R、R0、R1、R2和R3与上述定义相同。
通过进行反应1-4完成上述反应流程Ⅰ。一旦反应完成，根据本领域已知的方法可以分离中间体化合物(如果需要)。例如，可以使所述化合物结晶，然后通过过滤收集，或通过萃取、蒸发或倾出去除反应溶剂。(如果需要)可以用普通的技术例如结晶或用固体支持物例如硅胶或氧化铝层析进行所述中间体化合物的进一步纯化，然后进行反应流程的下一步骤。
通过在有机溶剂中，于约-10℃至约40℃温度下，首先使适当取代的卤代-硝基苯胺和适当取代的苯基乙腈或苯甲酸盐暴露于碱中1至24小时得到酮前体完成反应Ⅰ.1。该反应一般在两个当量的碱存在下，用等摩尔比例的反应物进行。一般碱包括氢化钠、叔丁醇钾、二异丙基酰氨锂(LDA)。优选的碱为叔丁醇钾。适合用于该反应的溶剂的实例为二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺等。溶剂的选择不是关键，只要所用的溶剂对所进行的反应而言是惰性的，并且所述反应物具有足够的可加溶性以进行所需的反应。当反应在约0℃开始并使其进行至约室温时，一般用约1至15小时制备所述酮前体。优选用同样的反应混合物氧化所述酮前体，而不必在分离或纯化前进行。
特别是，在约0℃至约30℃温度之间，使所述酮前体与氧化剂反应30分钟至15小时得到相应酮化合物。一般氧化剂包括过氧化氢、氧和空气。一般向所述反应混合物中通入氧和空气。优选的氧化剂为过氧化氢，优选为30％的溶液。当所述反应在约0℃至室温之间进行时，一般反应约30至5小时制备该酮。用例如TLC监测该反应，以保证该反应完全。
在反应Ⅰ.2中，根据本领域已知的方法还原所述酮上的硝基取代基得到相应的二氨基二苯酮化合物。例如，用催化氢化例如通过将由反应Ⅰ.1分离的酮与氢气以及催化剂合并于乙醇或四氢呋喃中，可以使硝基取代基还原。优选的催化剂为钯炭或阮内镍。溶剂的选择不是关键，只要所用的溶剂对所进行的反应而言是惰性的，并且硝基反应物具有足够的可加溶性以进行所需的反应。氢气一般于高达60psi压力下使用，优选为或约30psi。当在约0℃至约40℃温度范围内进行时，该反应一般在约1至24小时后基本完成。所述反应优选在约20℃至约30℃温度范围内进行约2至5小时。
在反应Ⅰ.3中，通过在醇性溶剂例如异丙醇中，使二苯酮化合物与溴化氰反应得到腈中间体然后使由反应Ⅰ.3分离的化合物环化。该反应一般在约0℃至约30℃温度下进行。当二苯酮完全溶解时，将产生的溶液与溴化氰合并。一般以溶液(例如3-7M的乙腈溶液)的形式加入溴化氰。当于室温下搅拌该反应混合物时，该反应一般在1至18小时后完成。然而，在一定的情况下，腈中间体会从该反应混合物中沉淀出来。为形成所需的酮，分离该沉淀，然后于醇性溶剂例如异丙醇中回流1至4小时得到所需的式Ⅰ酮化合物。
具有下式结构的化合物
其中X’、R0和R3与上述定义相同；可以通过在有机溶剂中，用式NH2R3(其中R3与上述定义相同)的伯胺取代下式化合物上的氯或氟取代基制备
其中Y为氯或氟，其前提为当X’为氟时，Y不能为氯。该反应一般在酸清除剂例如碳酸钾或大量过量的伯胺存在下进行。一般溶剂包括四氢呋喃、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺等。当在约20℃至约80℃进行时，该反应一般在1至20小时完成。然后根据上述反应流程Ⅰ所述使产生的烷基化的卤代硝基苯胺反应。
根据本领域已知的方法，通过使所述酮中间体或式Ⅰ相应的化合物(其中R2为氨基)酰化可以制备式Ⅰ化合物(其中R2为-NHC(O)(C1-C6)烷基)。例如，在酸清除剂像叔胺，优选三乙胺存在下，用适当的酰卤、异氰酸酯或氯代甲酸酯使所述胺化合物酰化。优选的酰化剂为乙酸酐。该反应一般在约-20℃至约25℃温度下进行。该反应的溶剂一般包括醚和氯代烃，优选乙醚、氯仿或二氯甲烷。一般使用相对于酰化剂反应物等摩尔比例的胺反应物，优选在等摩尔量酸清除剂例如叔胺存在下。该反应的优选的酸清除剂为N-甲基吗啉(NMM)。
在本发明的化合物的合成中用作原料的化合物是本领域已知的，在不能由商业购得时可以用本领域常规的标准方法很容易地合成。
本领域技术人员可以理解在执行上述方法时，可以需要向反应物中引入化学的保护基团以预防二级反应的发生。存在于反应物中的胺、醇、烷基胺或羧基可用任何标准的氨基-、醇基-或羧基-保护基团进行保护，只有这些基团不对分子其余部分以所需的方式反应的能力产生不利影响即可。任何用本领域已知的方法同时或随后去除各种保护基团。
一般通过使式Ⅰ化合物与等摩尔或过量的酸或碱反应形成本发明的药学上可接受的盐。一般将反应物与共有的溶剂结合，对于酸加成盐例如乙醚、四氢呋喃、甲醇、乙醇、异丙醇、苯等，或对于碱加成盐如水、醇或氯代溶剂像二氯甲烷。所述盐正常在约1小时至约10天沉淀出来，可以用过滤或其它常规方法分离。
下列制备和实施例进一步说明本发明的特殊的方面。然而，可以理解包括这些实施例仅仅是为了说明而不在任何方面用于限制本发明的范围。
在下列制备和实施例中，术语熔点、核磁共振谱、电子冲击质谱、磁场吸收质谱、快速原子轰击质谱、红外光谱、紫外光谱、元素分析、高效液相层析和薄层层析分别缩写为“m.p.”、“NMR”、“ElMS”、“MS(FD)”、“MS(FAB)”、“IR”、“UV”、“分析”、“HPLC”和“TLC”。除特别指明外，MS(FD)数据用质谱数字表示。此外，IR光谱列出的最大吸收仅仅是重要的，而不是观察到的最大的。
结合NMR光谱，使用下列缩写“s”为单峰，“d”为双峰，“dd”为双峰的双峰，“t”为三峰，“q”为四峰，“m”为多峰，“dm”为多峰的双峰且“br.s”、“br.d”、“br.t”和“br.m”分别为宽单峰、宽双峰、宽三峰和宽多峰。“J”代表赫兹(Hz)的偶合常数。除特别指明外，NMR数据指本发明化合物的游离碱。
在Bruker Corp.250 MHz设备上或在General Electric QE-300300MHz设备上获得NMR光谱数据。化学位移用delta即δ值表示(由四甲基硅烷向低场移动的百万分之几)。用碳树枝晶发射体在Varion-MAT 73l光谱仪上获得MS(FD)光谱。从由ConsolidatedElectrodynamics Corporation CEC 21-110仪器上获得EIMS光谱。用Perkin-Elmer 281设备获得IR光谱。用Cary 118设备获得UV光谱。在E.Merck硅胶板上进行TLC。熔点未校正。
实施例1A．2-异丙氨基-4-氟代-硝基苯向43.35ml(400mmol)的2,4-二氟代硝基苯和55g(约400ml)碳酸钾的400ml四氢呋喃的冷却(0℃)的混合液中加入约34.4ml异丙胺(400mmol)。将该反应混合物加热至室温，反应60小时，然后过滤。用乙酸乙酯洗涤碳酸钾，然后真空浓缩有机物，得到所需化合物的结晶，然后通过过滤分离并用小体积的己烷洗涤。
产量66.37g，黄色结晶(84％)。
B．3-异丙氨基-4-硝基-2’,3’-二氟代二苯酮向7.65g(50mmol)2,3-二氟代苯基乙腈和9.9g(50mmol)的实施例lA化合物的80ml二甲基甲酰胺的冷却(0℃)混合液中加入11.22g(100mmol)叔丁醇钾。将该反应混合物加热至室温并反应约l小时。当该反应基本完成后(用TLC监测)，冷却该混合物至0℃，接着加入15ml30％的过氧化氢溶液。将该混合物加热至室温，搅拌过夜，然后倾至1升1N盐酸中，形成橙色固体16g，将其不经纯化用于下一步骤。
C．3-异丙氨基-4-氨基-2’,3’-二氟代二苯酮在60psi氢(气体)下，用2.1g Raney镍催化剂将实施例1B化合物在250ml四氢呋喃中氢化6小时。过滤该反应混合物，真空浓缩滤液得到14g固体，将其不经纯化用于下一步骤。
向14g实施例1C的125ml异丙醇的冷却(0℃)的混合液中加入一当量的溴化氰(9.6ml的5M乙腈溶液)。将产生的混合物加热至室温，搅拌2天，然后真空浓缩得到残留物。将该残留物再溶于乙酸乙酯中，然后超声形成13.0g结晶。
元素分析C17H16N3OBrF2计算值C,51.53；H,4.07；N,10.61；Br,20.17；实测值C,51.64；H,4.17；N,10.51；Br,20.41.MS(FD): 315(M+).1H NMR(300 MHz；d6-DMSO):δ1.56(d,6H)；4.85(septet,1H)；7.41(m,2H)；7.33(d,1H)；7.67(d,1H)；7.74(m,1H)；8.01(s,1H)和8.87(s,2H).IR(CHCl3):ν3088,2984,1663,1626,1481,1304和1276cm-1.UV/VIS(95％EtOH):λmax=318nm(E=11480)；223nm(E=24524).
通过向实施例1D的乙酸乙酯中加入1N氢氧化钠获得所需化合物。分离各层，真空浓缩有机相。
元素分析C17H15N3OF2计算值C,64.76；H,4.80；N,13.33；实测值C,64.97；H,4.78；N,13.40.MS(FD):315(M+).1H NMR(300MHz；d6-DMSO):δ1.38(d,6H)；3.67(septet,1H)；7.01(s,2H)；7.18(d,1H)；7.35(m,3H)；7.66(s,1H)和7.77(s,1H).IR(CHCl3):ν3380,2910,1652,1608,1522,1307,1276和1264cm-1.UV/VIS(95％EtOH):λmax=341nm(E=21011)；220.5nm
向18.8ml(76mmol)双(三甲基甲硅烷基)乙酰氨的200ml四氢呋喃冷却(-78℃)溶液中缓慢加入30.4ml 2.5M正丁基锂的己烷(76mmol)溶液，接着加入3.0g(9.5mmol)实施例1E。于-78℃将该反应混合物搅拌8小时，然后加热至室温。当反应基本完成后(HPLC表明)，通过加入6.4ml(76mmol)的浓盐酸终止该反应，然后真空浓缩得到油状物，然后将其再溶于含有1％浓盐酸的甲酸中。使该混合物于95℃反应4小时。当反应基本完成后(HPLC表明)，真空浓缩该混合物得到油状物。用反相HPLC(用乙腈的水溶液洗脱)分离该油状物得到小标题化合物的顺式和反式异构体。
顺式未鉴定反式元素分析C19H21N4O2F2Cl:
计算值C,55.55；H,5.15；N,13.64；实测值C,54.21；H,4.93；N,12.98.MS(FD):356(M+).1H NMR(300MHz；d6-DMSO):δ1.48(d,6H)；4.73(septet,1H)；6.71(s,1H)；7.93(m,3H)；7.18(m,2H)；7.25(d,1H)；7.35(m,1H)；7.42(s,1H)；7.52(s,1H)；7.79(s,2H).IR(KBr):ν3152,2982,1662,1596,1483,1474和1269cm-1.UV/VIS(95％EtOH):λmax=310nm(E=9665)；223nm(E=24308).实施例2
根据实施例1F所述基本相同的方法，用N-甲基-N-三甲基甲硅烷基乙酰胺制备该化合物。
顺式未鉴定反式元素分析C20H23N4O2F2Cl计算值C,56.54；H,5.46；N,13.19；实测值C,56.32；H,5.10；N,13.06.MS(FD):370.3(M+).1H NMR(300MHz；d6-DMSO):δ2.52(d,6H)；2.59(d,3H)；4.81(septet,1H)；6.78(s,1H)；6.94(m,2H)；7.2(m,
1H)；7.4(m,2H)；7.6(s,1H)；8.19(m,1H)；8.75(m,1H)； 8.79(s,1H).IR(KBr):ν3068,1669,1627,1589,1482和1474cm-1.UV/VIS(95％EtOH):λmax=305nm(E=13688)；223nm(E=30904).
实施例3
根据基本与实施例1E所述相同的方法，但是缓慢向按下列制备的溶液中加入正丁基锂(15.85mmol)制备该化合物将冷却(-78℃)的双(三甲基甲硅烷基)酰胺(1当量)和N-乙基乙酰胺(1当量)的四氢呋喃溶液搅拌1小时，然后加入氯代三甲基甲硅烷基(1当量)。搅拌生成的溶液，然后缓慢加热至室温。
注意在加入正丁基锂之前将所述溶液再冷却至-78℃。
顺式未鉴定反式元素分析C21H22N4OF2·HCl·H2O计算值C,57.47；H,5.74；N,12.76；实测值C,57.25；H,5.65；N,12.74.MS(FD):384.2(M+).1H NMR(300MHz；d6-DMSO):δ0.96(t,3H)；1.49(d,6H)；3.0(p,2H)；4.80(septet,1H)；6.74(s,1H)；6.88(t,1H)；6.94(d,1H)；7.16(q,1H)；7.30-7.44(m,2H)；7.55(s,1H)；8.17(t,1H)；8.75(s,2H)；和12.8(s,1H).IR(CHCl3):ν2986,1664,1602,1514和1482cm-1.UV/VIS(95％EtOH):λmax=304.00 nm(E=13407.11)；224.00nm(E=31891.73).
根据与实施例1A-F基本相同的方法制备下列化合物。
实施例4
顺式MS(FD):338(M+).
元素分析C19H19N4OF·HCl:
计算值:C,60.88；H,5.38；N,14.95；实测值C,60.62；H,5.66；N,14.78.反式MS(FD):338(M+).
元素分析C19H19N4OF·HCl·1.2H2O:
计算值C,57.56；H,5.70；N,14.13；实测值C,57.26；H,5.28；N,13.75.
实施例5
顺式元素分析C23H18N4O2F2计算值C,65.71；H,4.32；N,13.33；实测值C,65.44；H,4.30；N,13.05.
MS(FD):420(M+).1H NMR(250MHz；d6-DMSO):δ3.83(s,3H)；6.08(s,1H)；6.29(s,2H)；6.78(m,2H)；7.13(m,6H)；7.33(m,4H).IR(CHCl3):ν3390,3013,1664,1514和1254cm-1.UV/VIS(95％EtOH):λmax=217nm(E=40891).反式元素分析C23H18N4O2F2:
计算值C,65.71；H,4.32；N,13.33；实测值C,63.22；H,4.63；N,12.63.MS(FD):420(M+).1H NMR(250MHz；d6-DMSO):δ3.86(s,3H)；6.40(s,2H)；6.49(s,1H)；6.71(d,1H)；6.84(m,3H)；7.13(m,4H)；7.32(m,3H)和7.36(d,1H).IR(KBr):ν3416,3314,3201,1664,1582,1543,1513和1271cm-1.UV/VIS(95％EtOH):λmax=330nm(E=16300)；226nm(E=33818).
实施例6
顺式未鉴定反式MS(FD):382(M+).
元素分析C21H20N4OF2·HCl·1.2H2O:
计算值C,57.26；H,5.2；N,12.72；实测值C,57.21；H,5.08；N,12.47.
实施例7
顺式MS(FD):364(M+).
元素分析C21H21N4OF·1.2HCl:
计算值C,61.79；H,5.48；N,13.73；实测值C,61.68；H,5.60；N,13.56.反式MS(FD):364(M+).
元素分析C21H21N4OF·HCl:
计算值C,62.92；H,5.53；N,13.98；实测值C,62.78；H,5.55；N,13.68.用与实施例2基本相同的方法制备下列化合物。
实施例8
顺式MS(FD):378(M+).
元素分析C22H23N4OF·HCl·0.5H2O:
计算值C,62.33；H,5.94；N,13.22；实测值C,62.33；H,5.74；N,12.98.反式MS(FD):378(M+).
元素分析C22H23N4OF·HCl.0.2H2O:
计算值C,63.14；H,5.88；N,13.39；实测值C,63.00；H,5.92；N,13.33.
实施例9
顺式MS(FD):350(M+).
元素分析C20H19N4OF·1.5HCl·1.5H2O:
计算值C,55.59；H,5.48；N,12.97；实测值C,55.92；H,5.24；N,12.80.反式MS(FD):350(M+).
元素分析C20H19N4OF·1.6HCl:
计算值C,58.77；H,5.08；N,13.71；实测值C,58.89；H,5.42；N,12.55.
实施例10
顺式未鉴定反式MS(FD):366(M+).
元素分析C21H23N4OF·1.4HCl:
计算值C,60.42；H,5.89；N,13.42；实测值C,60.28；H,6.15；N,13.24.用与实施例1A-F基本相同的方法制备下列化合物。
实施例11
实施例12
本发明的化合物似乎通过干扰所述病毒复制复合物(病毒和细胞蛋白膜结合复合物)的结构和/或功能从而抑制正链病毒RNA的复制。已经分离了突变鼻病毒和肠病毒，它们具有非常低水平的药物耐受性。这些突变体在所述蛋白上含有单一的氨基酸取代基，所述蛋白由已知为“3A”的病毒基因表达。因此，本发明的化合物可以通过抑制3A功能而抑制鼻病毒和肠病毒。3A基因编码疏水蛋白，所述疏水蛋白为连接复制复合物和细胞内膜蛋白的骨架蛋白。
黄病毒例如肝炎C病毒(HCV)和牛腹泻病毒(BVDV)的复制方法与上述讨论的鼻病毒和肠病毒的复制方法相似。特别是，两种病毒家族均含有单链信息RNS，它可以通过负链RNA中间体在胞质复合物中复制。此外，两种病毒家族可以将它们的基因组转译为多蛋白，并随后裂解。而且，两种病毒的复制复合物与细胞内膜是紧密相关的。最后，两种病毒家族具有相似的基因组结构，包括存在病毒复制所需的5’和3’非转译区。在该细胞内结合中与两种HCV蛋白有关NS2和NS4。人们假定或者NS2或者NS4与细小核糖核酸病毒3A蛋白相似。
因此，本发明的另外的实施方案为治疗或预防黄病毒感染的方法，包括给予需要的宿主治疗有效量的式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐。优选抑制肝炎C。
如上所述，本发明的化合物用作抗病毒药物。已经表明它们对各种肠病毒和鼻病毒具有抑制活性。本发明的实施方案为治疗或预防细小核糖核酸病毒感染的方法，包括给予需要的宿主治疗有效量的式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐。
在此所用术语“有效量”指能够抑制病毒复制的式Ⅰ化合物的量。认为本发明方法对细小核糖核酸病毒的抑制包括(如果适当)治疗或预防处理。当然，为获得治疗或预防效果，根据本发明给予的化合物的特定的剂量将由病例的特定的情况决定，包括例如给予的所述化合物、给药的途径、治疗的疾病和所治疗的个体。本发明化合物的一般日剂量为约0.01mg/kg至约50mg/kg体重。一般优选的日剂量为约0.05mg/kg至约20mg/kg体重，理想的日剂量为约0.1mg/kg至约10mg/kg体重。
本发明的化合物可以通过多种途径给药，包括经口、直肠、透皮、皮下、静脉、肌内和鼻内。优选本发明的化合物在给药前制成制剂。因此，本发明的另外的实施方案为含有有效量的式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药用制剂。
在此类制剂中活性组分的含量为所述制剂的0.1％至99.9％(重量)。“药学上可接受的”的意思为所述载体、稀释剂或赋形剂与该制剂的其它成分是相容的并且不对患者有害。
可以用熟知并且容易获得的成分，根据已知的方法制备本发明的药用制剂。在制备本发明的组合物时，通常将活性组分与载体混合或用载体稀释，或者用胶囊、小药囊、纸或其它的容器包装。当该载体用作稀释剂时，它可以为固体、半固体或液体物质，可以作为活性组分的载体、赋形剂或介质。因此，本发明的组合物可以为含有例如多至10％(重量)活性组分的片剂、丸剂、粉剂、锭剂、小药囊剂、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液、糖浆、气溶胶(为固体或在液体介质中)、膏剂，软和硬胶囊剂、栓剂、无菌注射溶液、无菌包装粉剂等形式。
下列制剂实施例仅仅为了说明，并不以任何方式限制本发明的范围。术语“活性组分”指根据式Ⅰ的化合物或其药学上可接受的盐。
制剂1用下列成分制备硬明胶胶囊用量(mg/胶囊)活性组分250干淀粉 200硬脂酸镁 10总量 460mg制剂2
用下列成分制备片剂用量(mg/胶囊)活性组分250微晶纤维素 400二氧化硅，熏制的10硬酯酸 5总量665mg将所述组分混合并压制成片剂，每片重665mg。
制剂3制备含有下列成分的气溶胶重量活性组分0.25甲醇 25.75抛射剂22(氯代二氟甲烷)70总量 100.00将所述活性组分与乙醇混合，并将该混合物加至部分抛射剂22中，冷却至-30℃并转移至装填装置中。然后将所需的量送入不锈钢容器内并用其余的抛射剂稀释。然后给该容器配备阀。
制剂4根据下述制备每片含有60mg活性组分的片剂用量(mg/片)活性组分60淀粉45微晶纤维素 35聚乙烯吡咯烷酮(10％的水溶液)4羧甲基淀粉钠4.5硬脂酸镁0.5滑石粉 1总量150使所述活性组分、淀粉和纤维素通过U.S.筛第45目筛并彻底混合。将含有聚乙烯吡咯烷酮的水溶液与产生的粉末混合，然后使该混合物通过U.S.筛第14目筛。将如此产生的颗粒于50℃干燥并通过U.S.筛第18目筛。预先使羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁和滑石粉通过U.S.筛第60目筛，然后混合后加至上述颗粒中并于压片机上压制成每片重为150mg的片剂。
制剂5根据下述制备每胶囊含有80mg活性组分的胶囊用量(mg/胶囊)活性组分 80淀粉 59微晶纤维素 59硬脂酸镁 2总量 200将所述活性组分、纤维素、淀粉和硬脂酸镁混合通过U.S.筛第45目筛并以200mg的量装填入硬明胶胶囊中。
制剂6根据下述制备每栓剂含有225mg活性组分的栓剂活性组分 225mg饱和的脂肪酸甘油酯2000mg总量 2225mg将所述活性组分通过U.S.筛第60目筛并悬浮于预先用必须的最小的热量融化的饱和的硬脂酸甘油酯中。将该混合物倾至2g(公称)容量的栓剂模子中并使其冷却。
制剂7根据下述制备每5ml剂量含有50mg活性组分的悬浮液活性组分50mg羧甲基纤维素钠50mg糖浆 1.25ml苯甲酸溶液0.10ml矫味剂适量着色剂适量纯净水加至总量5ml使所述活性组分通过U.S.筛第45目筛并与羧甲基纤维素钠和糖浆混合形成均匀的糊。用部分水稀释苯甲酸溶液、矫味剂和着色剂并在搅拌下加入。加入足量的水以得到所需体积。
制剂8如下述可以制备静脉制剂活性组分100mg等渗生理盐水1000ml一般以每分钟1ml的速率静脉给予患者上述组分的溶液。
进行下列实验以证明式Ⅰ化合物抑制某些病毒的能力。
抗细小核糖核酸病毒测定的实验方法使非洲绿猴肾脏细胞(BSC-1)或Hela细胞(5-3)于37℃生长于25ccFalcon烧瓶中的含有5％灭活胎牛血清(FBS)、青霉素(150单位/ml)和链霉素(150微克/毫升(μg/ml))的培养基199中。当形成融合的单层后，取出上清液生长培养基并向每个烧瓶中力入0.3ml适当的病毒(埃可、门哥、科萨奇、骨髓灰质炎或鼻病毒)的稀释液。于室温下吸收1小时后，用含有下列物质的培养基覆盖病毒感染的细胞层一部分1％的Ionagar 2号和一部分用FBS、青霉素和链霉素加强的双倍强度(double strength)的培养基199，所述培养基含有药物浓度为100、50、25、12、6、3和0μg/ml。用不含药物的烧瓶作对照实验。用二甲基亚砜将乙烯基乙炔苯并咪唑化合物的储备液稀释至浓度为104μg/ml。然后将烧瓶孵育骨髓灰质炎、科赛奇、艾柯和门哥于37℃孵育72小时，鼻病毒于32℃孵育120小时。在病毒感染和细胞繁殖的区域观察到病毒斑。向每个烧瓶中加入10％福尔马林和2％乙酸钠溶液使所述病毒灭活并将细胞层固定于烧瓶的表面上。用结晶紫对周围细胞区域染色后对病毒斑计数(不管体积大小)。将在每一药物浓度下的斑计数与对照的计数相比。用斑减少的百分比或抑制的百分比表示试验药物的活性。或者，可以用抑制斑形成50％的药物浓度作为活性的测量。50％抑制用符号IC50代表。
体外CPE/XTT抗-BVDV测定将MDBK细胞以每孔10000细胞分散于96孔微效价板上，所述孔内含有Earl氏平衡盐水溶液(EBSS)、2％马血清、青霉素(100单位/ml)和链霉素(100μg/ml)的最低基本培养基。将该板的内容物于37℃在二氧化碳培养箱中生长。然后用约0.02 moi(感染多重性)的牛病毒性腹泻病毒(BVDV、ATCC VR-534)感染MDBK细胞。使所述病毒吸收细胞1-2小时后，将含有系列稀释药物的培养基或单独的培养基加至所述孔中。再进一步孵育3-4天(当在单独的培养基孔中出现明显的多cpe时)，根据下述进行XTT测定评价受试药物的抗病毒作用。
用温热的不含FBS的培养基新鲜配制浓度为1mg/ml XTT[2,3-双(甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑鎓-5-羧基苯胺、内盐、钠盐]并立即使用。每5ml XTT溶液，加入25μl 5mM PMS(吩嗪N-甲硫酸盐)的磷酸盐缓冲液。然后向每个微效价孔中加入50μl新鲜制备的XTT/PMS混合液。于37℃孵育(二氧化碳)3-4小时或至颜色变化显著。在分光光度计上于450nm/ref.650nm处读出吸收值。将引起50％细胞毒性作用所需的药物的浓度与无药物无病毒对照(TC50)进行比较，然后由每剂量反应曲线的线性部分测定产生病毒细胞毒性作用(cpe)的50％抑制(IC50)。
权利要求
1．式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐
其中a为0、1、2或3；每个R独立为氢、卤素、氰基、氨基、卤代(C1-C6)烷基、二(C1-C4)烷基氨基、叠氮基、C1-C6烷基、氨基甲酰基、氨基甲酰氧基、氨基甲酰氨基、C1-C6烷氧基、C1-C4烷硫基、C1-C4烷基亚磺酰基、C1-C4烷基磺酰基、吡咯烷并、哌啶子基或吗啉代；R0为氢、卤素、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基；R1为卤素、氰基、羟基、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、甲硫基、甲基亚磺酰基或甲基磺酰基；R2为氢、氨基或-NHC(O)(C1-C6烷基)；R3为二甲基氨基、C1-C10烷基、C3-C7环烷基、取代的C3-C7环烷基、卤代(C1-C6)烷基、苯基、取代的苯基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、噻唑烷基、吡咯烷并、哌啶子基、吗啉代或下式的基团
R4和R5独立为氢或C1-C4烷基。
2．权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐
其中a为0、1或2；每个R独立为氢、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基或二(C1-C4)烷氨基；R0为氢；R2为氨基；R3为二甲基氨基、C1-C6烷基、卤代(C1-C6)烷基、苯基、取代的苯基、C3-C7环烷基、取代的C3-C7环烷基、噻吩基、噻唑烷基、吡咯烷并、哌啶子基或吗啉代；R4为氢、甲基或乙基；R5为氢、甲基或乙基。
3．权利要求2的化合物或其药学上可接受的盐，其中a为0或1；每个R独立氢、氟代、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、二甲氨基；R3为C1-C4烷基、苯基、取代的苯基、C3-C7环烷基或取代的C2-C7环烷基。
4．权利要求3的化合物为下列化合物或其药学上可接受的盐
5．含有权利要求1-4任何一项的式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐以及与一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的药用制剂。
6．用作药物的权利要求1-4任何一项的式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐。
7．用作抗病毒剂的权利要求1-4任何一项的式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐。
全文摘要
本申请提供一系列苯并咪唑化合物,它们可以抑制细小核糖核酸病毒例如鼻病毒、肠病毒、脊髓灰质炎病毒、A和B组科萨奇病毒、埃可病毒和门哥病毒以及黄病毒如肝炎C和牛腹泻病毒的生长。
文档编号A61K31/4184GK1220601SQ97195098
公开日1999年6月23日 申请日期1997年6月5日 优先权日1996年6月5日
发明者L·N·琼黑姆, T·A·舍菲尔德, W·A·斯皮策尔, M·J·特贝 申请人:伊莱利利公司