Mage－b家族成员的分离的核酸分子及其用途的制作方法

专利名称：Mage－b家族成员的分离的核酸分子及其用途的制作方法
相关申请本申请是1996年6月5日系列号为08/658,578的申请的部分继续申请，而后者是1995年3月14日系列号为08/403,388的申请的部分继续申请，本文引用这两篇文献作为参考。发明领域本发明涉及编码肿瘤排斥抗原前体的核酸分子。更具体地说，本发明涉及的基因其肿瘤排斥抗原前体特别是可加工成至少一种肿瘤排斥抗原。所述肿瘤排斥抗原前体似乎与其它已知的肿瘤排斥抗原前体编码序列并不密切相关，该肿瘤排斥抗原前体从人X染色体的Xp区域分离，相反与之最密切相关的基因是在Xq区上发现的。这些新分离的基因是MAGE-B家族的成员，而目前认为Xq区的这些基因是MAGE-A家族的成员。背景和现有技术哺乳动物免疫系统识别并与外源或外来物质反应的过程是一个复杂的过程。该系统的一个重要的方面是T淋巴细胞，或“T细胞”反应。该反应需要T细胞识别称为人白细胞抗原(“HLA”)或主要组织相容性复合物(“MHC3”)的细胞表面分子复合物和肽并与之相互作用。该肽来自由也具有HLA/MHC分子的细胞加工的较大分子。关于这点参见Male等，免疫学进展(J.P.Lipincott公司，1987)，特别是第6-10章。T细胞与HLA/肽复合物的相互作用受到限制，它需要对HLA分子和肽的特定组合具有特异性的T细胞。如果不存在特异性T细胞，即使存在其配偶体复合物，也无T细胞反应。在特异性T细胞，即使存在其配偶体复合物，也无T细胞反应。同样，如果缺乏特异性复合物但存在T细胞，也没有反应。该机制涉及在自身免疫病理中与外源物质的免疫系统反应，还涉及细胞异常反应。很多研究集中在将蛋白质加工成HLA结合肽的机制上。关于这点，参见Barinaga，科学257:880(1992)；Fremont等，科学257:919(1992)；Matsumura等，科学257:927(1992)；Latron等，科学，257:964(1992)。
在癌症中也涉及T细胞识别细胞异常的机制。例如，在作为参考文献引用的1992年5月22日申请，1992年11月26日公开的PCT申请PCT/US92/04354中，公开了-个基因家族，它们加工成肽，肽在细胞表面表达，可经过特异性CTLs细胞溶解性T淋巴细胞或下文的“CTLs”导致肿瘤细胞溶解。该基因据说编码“肿瘤排斥抗原前体”或“TRAP”分子，由其产生的多肽称为“肿瘤排斥抗原”或“TRAs”。关于该基因家族的更进一步的信息参见Traversari等，免疫遗传学35:145(1992)；Van der Bruggen等，科学254:1643(1991)。也可参见以其全文作为参考文献引用的1991年12月12日申请的系列号为807,043的美国专利申请，即现在的美国专利5,342,774。在该专利中公开了肿瘤排斥抗原前体的“MAGE”家族。
在其说明书作为参考文献引用的美国专利申请系列938,334,即现在的1995年4月15日的美国专利5,405,940中，描述了MAGE-1基因编码肿瘤排斥抗原前体，该前体被加工成九肽，该九肽由HLA-A1分子提供。结合HLA-A1的九肽遵守满足基序的结合“规则”。关于这点，参见例如，PCT/US93/07421；Falk等，自然351:290(1991)；Engelhard，免疫学年鉴定，12:181-207(1994)；Ruppert等，细胞74:929-937(1993):Rotzschke等，自然，348:252-254(1990)；Bjorkman等，自然，329:512-518(1987)Traversari等，实验医学杂志；176:1453-1457(1992)。这些参考文献教导了如果已知特定多肽对特定HLA分子具有特异性，那只可预期特定多肽结合一种HLA分子，而不是其它分子。这一点很重要，因为不同的个体具有不同的HLA表型。结果，尽管对作为特异性HLA分子的配偶体的特定多肽的鉴定具有诊断和治疗性衍生物，但它们仅与具有特定HLA表型的个体相关。在这一领域还需要进一步的研究，因为细胞异常不限于一种特定的HLA表型，且靶向疗法需要对所关注的异常细胞的表型有一些了解。
在作为参考文献引用的1993年1月22日申请的系列号为008,446的美国专利申请中，公开了MAGE-1表达产物被加工成第二TRA的事实。这一第二TRA由HLA-Cw*1601分子提供。该说明书表明，如果TRAP可产生许多TRAs，则其中每一种将会满足结合MHC分子的基序规则。
在本文作为参考文献引用的申请日为1992年12月22日的系列号为994,928的美国专利申请中教导了由一些正常细胞(例如，黑色素细胞)产生的酪氨酸酶分子在肿瘤细胞中被加工以产生由HLA-A2分子提供的多肽。
在以其全文作为参考文献引用的1993年3月18日申请的系列号为08/032,978的美国专利申请中，教导了由HLA-A2分子提供一种不是由酪氨酸酶产生的第二TRA。TRA由TRAP产生，但由非MAGE基因编码。该说明书显示特定HLA分子可提供不同来源的TRA。
在本文作为参考文献引用的1993年6月17日申请的系列号为08/079,110的美国专利申请中，描述了一种无关肿瘤排斥抗原前体，即所谓的“BAGE”前体，BAGE前体与MAGE家族无关。
在本文作为参考文献引用的系列号为08/096,039的美国专利申请和系列号为08/250,162的申请中，也公开了一种无关TRAP前体GAGE。
上面引用的论文，专利和专利申请提供的研究大部分涉及MAGE基因家族、无关BAGE、GAGE和DAGE基因，表明细胞可表达不同的、其它的肿瘤排斥抗原前体。
现在已发现还存在另一个肿瘤排斥抗原前体基因家族。这些核酸分子与MAGE基因家族表现出同源性，但该同源性不足以经过与例如PCT申请PCT/US98/04354和美国专利5,342,774所述的MAGE-A家族的成员在本文所述的严格条件下杂交来鉴定MAGE-B家族的成员。而且，本发明分离的核酸分子均在X染色体的Xp臂上发现，与此相反，以前鉴定的MAGE-A家族的成员均在Xq臂上发现。因此，本发明涉及编码MAGE-B肿瘤排斥抗原前体的分离的核酸分子及其用途。
在下面的说明书中将更详细地解释本发明。优选实施方案的详细描述实施例1粘粒D5和4965已由Muscatelli等，自然，372；672-676(1994)以及Muscatelli等，美国科学院学极，92:4987-4991(1995)进行了描述，其公开内容以参考文献的形式引用。这些粘料含有部分X染色体的Xp臂。使用限制性核酸内切酶EcoRⅠ,BamHⅠ,HindⅢ,和PstⅠ消化粘粒。消化后，在琼脂糖凝胶上进行琼脂糖电泳迁移后将DNA转移到尼龙膜上。
此后，使用以SEQ ID NO:1，即Xp1序列，为基础的探针进行杂交实验。该探针大约0.45千个碱基对长，且含有41个碱基对的第一外显子(全长73个碱基对)，完整的第二外显子和299个碱基对的第3外显子(全长1603个碱基对)。本文称为“MAGE-B1”和在其它地方称为“Xp”的序列可参见Muscatelli等，美国科学院学报，出处同上。另外，该序列参见EMBL序列的数据库，参考登记号emb×82539，可在1995年2月7日前获得。
为了制备0.4kb的探针，使用下列引物，即，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，在B1 cDNA上进行PCR5’-GTGGTGTCCAGCAGTGTCTC-3’5’-GTCAGATTCGGTACATGACACAG-3’具体地说，将DNA用NaOH变性且在凝胶中中和，之后使用20×SSC(SSC=0.15M NaCl,0.015M柠檬酸钠，pH7)转移到尼龙膜上。转移后，将膜在室温下在6×SSC中漂洗5分钟，在80℃烧烤1小时，并在65℃下在6×SSC,10×Denhardt’s溶液(0.02％Ficoll,0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％BSA)中预处理4小时。
然后将膜在3.5×SSC、1×Denhardt’s溶液、25mm磷酸钠缓冲液(pH7.0)、0.5％SDS、2mM EDTA和3×106cpm/mlα32P-CTP放射标记的探针中杂交。杂交在65℃进行18小时。然后将膜在65℃洗涤4次，每次在2×SSC、0.5％SDS、1×Denhardt’s溶液中洗涤一次1小时，并在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次30分钟；在0.1×SSC、0.1％SDS中洗涤一次30分钟。使用柯达X-ARS胶片和柯达X-Omatic精细增感屏对膜进行放射自显影。
杂交后，观察到一些不同强度的信号。其中，3个杂自粘粒4965的EcoRⅠ片段长度为1.5,2.2和2.5千碱基，分离它们并克隆进载体pTZ19R中以便测序。部分测序表明，各片段含有与B1的第3外显子同源的序列。这3个序列相对于B1的同源性为75％,60％和80％，对于基因下文称为MAGE-B2,MAGE-B3和MAGE-B4。它们分别在SEQ ID NO:2,3和4中提供。
在上文的说明书中提供了许多对本领域的技术人员而言极有价值的手段。开始，在实施例中鉴定了编码MAGE-B肿瘤排斥抗原前体的分离的核酸分子以及与其互补的核酸分子。已知DNA以双链形式存在，且两条链之间互相互补。核酸杂交技术已发展到如果提供一条DNA链，则本领域的技术人员可分离其互补链或合成该链。本发明特别包括允许技术人员鉴定X染色体，特别是Xp成分以及该染色体中的缺陷的双链现象。
本领域的技术人员使用标准方法可进行该测定。例如，使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)，人们可使用下列引物为鉴定B25’-TAAAAAAGGTGCCAAGAGCCAC-3’(SEQ ID NO:5)；5’-TGAGGCCCTCAGAGGCTTTC-3’(SEQID NO:6)。
为鉴定B3:
5’-AGTCTGCTGGTAGGTCACGTA-3’(SEQID NO:7)；5’-TCAGGAACTGCACCAACATATTT-3’(SEQIN NO:8)。
为鉴定B4:
5’-AGGGATACTGCCTCCAGCTC-3’(SEQID NO:9)；5’-CAGGAACTGCACTAACATCTTC-3’(SEQ ID NO:10)。
下面的实施例2显示了可进行的一种方式。实施例2例如，使用SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的引物以确定MAGE-B2是否在肿瘤中表达。
使用熟知的异硫氰酸胍/氯化铯方法(例如，参见Davis等，BasicMethods in Molecular Elsevier,NY(1986),Pp.130-135)从肿瘤细胞样品提取总细胞RNA，在此不再重复。接着，使用来自样品的2μg总RNA合成cDNA。根据作为参考文献引用的Desmet等人的免疫遗传学39:121-129(1994)，在20μl反应体积中用寡聚dT(15)延伸进行合成。在42℃培养1小时后，用水将cDNA反应混合物稀释至100μl。然后使用SEQ ID NO:5和6进行PCR。使用5μlcDNA(相应于100ng RNA)，补充5μl 10×PCR缓冲液，各种dNTP(10mM)各1pl,0.5μl各种80μM的引物溶液，1.25单位的AmpliTaq DNA聚合酶，加水至总体积50μl进行各PCR反应。然后将该混合物在94℃加热5分钟，接着在热循环仪中扩增30个循环(94℃1分钟，63℃2分钟，72℃2分钟)。然后以最后的延伸步骤(72℃,15分钟)结束循环。在各反应的10μl样品的1％琼脂糖凝胶上走电泳，并使用溴化乙锭荧光观察。
证实RNA的完整性，按照本文作为参考文献引用的Weynants等，国际癌症杂志，56:826-829(1994)，经过使用对β-肌动蛋白具有特异性的引物进行20个循环的PCR试验排除含强烈降解的RNA的样品。
肿瘤结果如下。第一栏是试验的肿瘤样品数，第二栏是对MAGE-B2为阳性的数目睾丸精原细胞瘤 6 5非小细胞肺癌 206黑色素瘤 265乳腺 102肉瘤 101白血病 101除了阳性白血病外，对MAGE-B2为阳性的任何肿瘤样品对至少一种MAGE-Xq也为阳性。
在胎儿和成人精巢中发现MAGE-B2表达，但在任何正常的肾，肝脏，肾上腺，皮肤，乳腺，脑，心脏，卵巢，前列腺，小脑，外周血淋巴细胞，结肠，胃，肺，膀胱，骨髓或子宫内膜细胞中没有发现。实施例3对上文实施例1讨论的粘粒D5和4965进行另外的实验。具体地说，对Muscatelli等，美国科学院学报92:4987-4991(1995)公开的eDNA进行PCR扩增。在这些扩增中，使用引物5’-GTGGTGTCCAGCAGTGTCT C-3’(SEQ ID NO:11)和SEQ IDNO:12产生0.45kb的探针。然后使用5’-AATGTGTTGGGAGCCTATGAT-3’(SEQ ID NO:13)和5’-ATTATGTTGTGTGAGGTTCTTTCA-3’(SEQ ID NO:14)制备第二探针以产生726个碱基对的探针。
第一探针含有MAGE-B1的41bp的外显子1,105bp的外显子2和300bp的外显子3，而第2针由3’端的726bp的外显子4组成。
使用例如，可见于Lurguin等，细胞58:293-303(1989)的标准方法对两粘粒进行Southern印迹。将任何与探针杂交的粘粒片段克隆进商业上可获得的载体(乙基Ptz18R或Ptz19R)中并随后测序。
该研究的结果鉴定出有3个序列与Muscalilli等，出处同上报道的MAGE-B1的最后一个外显子表现出明显的相同性。一个序列与Lurquin等，美国专利5,587,289描述为MAGE-Xp2及Dabovic等，哺乳动物基因组6:571-580(1995)描述为“DAM 6”的MAGE-B2相同。这意味着在该粘粒中存在另外两个同源基因。实施例4为了测定精确位置并完成上文所述的阳性序列，在粘粒D5和4965中发现了X染色体的部分Xp臂，它包括由“染色体漫步”测序的杂交片段的序列(如分子细胞生物学，Alberts等，第二版，P.262-265)。
共测序了40,352kb，该完整序列在SEQ ID NO:15中列出。获得这一40,352kb的序列后不需进行进一步的测序，因为MAGE-B2的起始位点和5’UTR位于该40,35Skb序列的5’端，且MAGE-B1的终止密码子和多聚A信号位于该40,352kb序列的3’端。在这点上很清楚，Southern分析的所有Xp杂交片段(如实施例3中描述)位于该40,352kb序列内，不需要进一步测序。
当将实施例3所获得的序列信息与SEQ ID NO:16的全部40,352个碱基进行比较时，发现如下基因在SEQ ID NO:15中的位置B2 3266-7979B3 23546-25194B4 29748-31474B1 31403-39691在这些序列内，进一步分析表明，B2分别在核苷酸3266-3364，和6278-7979处含有2个外显子。在核苷酸6283-7224处发现了该完整的编码区域。在核苷酸7961-7966处发现了多聚A信号。
至于B3基因，在核苷酸23546-25194处发现了单个编码外显子。编码区由核苷酸23607-24647组成，poly-A信号在核苷酸25152-25157。
B4基因据认为延伸到31822-31827的poly-A信号处，发现编码序列位于核苷酸29808-30848。MAGE-B1基因是4种中最复杂的。在核苷酸31403-31474处的第一外显子位于编码MAGE-B4的外显子内。发现外显子2、3和4位于核苷酸33958-39691处，即分别位于33958-34062,35057-35139和38088-39691处。发现编码序列完全位于第4外显子内，即位于核苷酸38148-39191处。Poly-A信号位于39674-39679处。实施例5这些序列和其它已知的肿瘤排斥抗原前体的核苷酸的比较在下面表1中列出。可见MAGE-B1,B2和B4形成密切相关的一组，具有大约80％的相同性，而MAGE-B3与其余的具有大约70％的相同性。
进一步比较揭示编码蛋白质的区域相应于MAGE-B蛋白质的347,313,346和346个氨基酸。这些显示出49-68％的相同性。
表1.人和小鼠MAGE编码区及蛋白质的序列比较％核酸相同性A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9A10A11A12 B1 B2 B3 B4mB1mB2mB3MAGE-A1 100 80 61 84 81 81 84 77 76 68 75 81 62 69 61 6058 57 56MAGE-A2 80 100 92 82 82 92 91 76 76 85 73 93 50 60 50 6188 88 56MAGE-A3 81 82 100 82 85 86 80 76 76 88 75 92 61 61 60 6254 54 54MAGE-A4 84 82 52 100 87 83 84 79 79 69 77 63 63 61 61 4267 87 57MAGE-A5 81 82 88 87 10086 74 77 73 60 74 84 50 46 62 4751 51 55MAGE-A6 81 92 98 82 86 100 80 77678 68 76 92 61 51 60 6164 54 64MAGG-A7 84 81 80 84 74 10 100 83 87 79 79 81 54 56 54 6248 48 45MAGE-A8 77 76 78 79 77 76 83 10078 88 76 76 60 69 59 6147 47 48MAGE-A9 76 74 78 79 73 76 87 79 10089 76 77 62 59 61 6367 57 56MAGE-A10 80 65 68 69 80 88 79 80 69 10072 68 69 80 62 6358 56 68MAGE-A11 78 73 75 77 74 76 78 78 76 72 10075 82 62 52 6569 56 58MAGE-A12 81 83 92 83 84 82 81 78 77 68 78 100 62 80 80 8256 59 67MAGE-B1 82 59 61 83 50 61 54 80 62 60 62 62 10080 68 6163 63 63MAGE-B2 58 80 61 81 48 61 58 59 58 60 62 80 80 100 66 7864 64 64MAGE-B3 81 58 60 81 62 80 64 66 61 62 62 60 66 88 100 7160 60 81MAGE-B4 60 61 82 82 47 61 62 81 83 63 83 82 81 78 71 100 61 61 613mige-B1 68 65 64 67 51 64 48 47 57 58 59 58 63 64 60 6110088 986mige-B2 57 58 64 67 51 64 48 47 57 58 48 66 63 84 60 8189 100988mige-B3 60 68 54 67 66 84 45 46 66 68 68 57 63 64 61 6198 98 100％氨基酸相同性A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A6 A9 A10A11A12 B1 B2 B3 B4 mB1 mB2mB3MAGE-A1 100 87 67 75 68 68 23 64 60 52 59 67 38 38 42 43 36 36 37MAGE-A2 87 100 84 87 80 10 62 69 48 56 68 89 38 38 40 33 33 33 33MAGE-A3 87 84 100 67 72 95 17 62 59 47 80 88 37 37 34 39 33 33 34MAGE-A4 78 67 67 100 76 67 23 66 54 51 62 87 42 39 41 41 38 38 38MAGE-A5 68 69 72 78 10072 18 61 52 39 69 69 38 30 20 24 18 19 30MAGE-A6 68 64 96 87 72 100 18 62 68 49 60 34 37 37 35 40 34 34 34MAGE-A7 23 18 17 23 13 18 100 25 27 20 21 17 16 10 20 14 13 13 14MAGE-A8 64 62 62 66 61 62 26 10066 64 60 64 38 35 36 38 29 28 29MAGE-A9 60 60 68 54 52 5l 27 68 10050 58 69 39 38 36 43 34 34 34MAGE-A10 52 46 47 51 39 49 20 64 50 10050 46 41 38 41 47 36 36 35MAGE-A11 59 69 80 62 89 60 21 60 59 60 10069 42 38 40 44 36 34 38MAGE-A12 67 88 86 67 60 84 17 64 59 45 50 100 30 37 36 40 33 33 34MAGE-B1 39 39 37 42 28 37 16 38 39 41 48 38 10082 49 48 47 47 47MAGE-82 39 38 37 39 30 37 10 85 39 38 38 37 82 100 49 89 40 48 47MAGE-B3 43 35 34 41 2O 38 20 38 3l 41 40 38 49 49 100 66 42 42 43MAGE-84 43 40 39 41 24 40 14 98 43 47 44 40 68 83 59 100 82 52 818mige-B1 36 33 33 38 19 34 13 29 34 36 38 33 47 48 42 52 100 100873mige-B2 36 40 33 38 18 34 13 89 34 38 38 33 47 48 42 52 100 100978mgge-B3 37 33 34 38 20 34 14 29 34 36 39 34 47 47 43 81 97 97 100实施例6在Muscatelli等，美国科学院学报，92:4987-4991(1995)报道的工作中，发现来自精巢cDNA文库的MAGE-B1包含2种类型，即，一种包括全部4个外显子，另一个包括外显子1,2和4。
使用上文所述的SEQ ID NOS:11和12，用RT-PCR在精巢cDNA文库上进行实验以证实这一结果。为进行实验，使用例如，Davis等，分子生物学基础方法，Elsevier科学出版公司，纽约(1986)的熟知的异硫氰酸胍/氯化铯方法提取总细胞RNA。使用总的RNA的样品(2μg)经过在20μl反应体积中进行寡聚dt(15)延伸而进行cDNA分析。见De Smet等，免疫遗传学39:121-129(1996)。cDNA在42℃温育1小时，然后用水稀释至100μ1。然后将上述引物与5μ1 cDNA以及5μl 10×DNA聚合酶缓冲液，1μl各10mM的dNTP和1单位的DNA聚合酶混合。加水至50μl的总体积。将该混合物在94℃加热5分钟，接着扩增30个循环(每循环94℃1分钟，63℃2分钟，72℃延伸2分钟)。以72℃15分钟的最终延伸步骤结束该循环。此后，将10μl的反应样品在1.5％琼脂糖凝胶上走电泳并经溴化乙锭(溴化3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓荧光观察。证实RNA的完整性，使用B一肌动蛋白特异性引物进行20轮PCR试验排除具有强烈降解的RNA的样品。
结果证实了以前的发现，即存在两种类型的转录子。含4个外显子的转录子远不如另一种丰富。
使用在精巢cDNA文库上的RT-PCR还测定了SEQ ID NO:17和12的扩增产物情况。除了含所有4个外显子的种类外，还获得了含外显子3和4的主要种类。
发现84种肿瘤样品和各种组织学类型的肿瘤细胞系用其序列位于第1和第4外显子中(SEQ ID NOS:11和12)的引物进行试验时为MAGE-B1表达阴性。然而，使用具有位于第3和第4外显子(SEQ ID NOS:17和12)中的序列的引物，在来自NSCLC和哺乳动物癌和其它组织学类型病人的肿瘤的样品中检测到MAGE-B1表达。实施例7通过RT-PCR研究MAGE-B基因表达的分布情况。
按下文所述的一些变化实施上面实施例5所述的方案。
以MAGE-B序列的基础使用各种引物组合。除了上文提供的SEQ ID NO:11和12外，使用下列引物用于MAGE-B1:
5’-GAT CAT CCA GGA GTA CAA CTC GA-3’(SEQ IDNO:16)5’-CCC GAG CGA GCT TAA GGA GT-3’(SEQ ID No:17)SEQ ID NO:11,16和17是有意义引物，分别相应于MAGE-B1的1,2和3外显子。其中一个用于与SEQ ID NO:12组合测定MAGE-B1的表达。
对于MAGE-B2，使用5’-AGC GAG TGT AGG GGG TGC G-3’(SEQ ID NO:18)或上文所述的SEQ ID NO:15与上文所述的SEQ ID NO:6。SEQ ID NO:5和18是MAGE-B2外显子1和2的有意义引物，而SEQ ID NO:6是外显子2的反义引物。
除了下列区别外，基本上按实施例5所述进行RT-PCR。对于MAGE-B1进行40轮循环，而使用30个循环测定MAGE-B2。上文实施例5中提供的循环参数作如下改进当使用SEQ ID NO:17和12及SEQ ID NO:18和6时，循环为在94℃1分钟，在68℃2分钟，接着是2分钟的延伸。当使用SEQ ID NO:16和12时，在65℃进行2分钟。
结果在下面表2中提供表2 Mage-B1 Mage-B2LUR171-1338 LUR84-LUR8540个循环和/或LUR162-LUR8530个循环手术肿瘤样品结肠癌0/120/12胃癌 0/2 0/2白血病0/481/50骨髓瘤0/1 0/1黑色素癌 8/368/37皮肤癌1/4 0/4痣(良性病灶) 0/8 0/6脑瘤 0/8 0/8成神经细胞瘤 0/2 0/2头颈扁平细胞癌0/122/12胸膜间皮癌0/3 0/3小细胞肺癌0/1 0/1非小细胞肺癌 4/2913/29肉瘤 1/112/11哺乳动物肌肉瘤2/123/12前列腺癌 0/6 0/6精巢肿瘤 8/9 8/9直肠细胞癌0/110/11膀胱癌0/120/12细胞系直肠癌0/5 0/5白血病0/3 0/3EBV转化的B淋巴细胞0/1 0/1黑素色瘤 2/9 3/9小细胞肺癌0/2 1/2非小细胞肺癌 0/6 3/6肉瘤 0/2 0/2正常组织结肠 0/1 0/1胃0/1 0/1肝0/1 0/1骨髓 0/1 0/1外周血淋巴细胞0/1 0/1胸腺细胞 0/1 0/1皮肤 0/1 0/1脑0/2 0/2小脑 0/1 0/1心脏 0/1 0/1肺0/1 0/1乳腺 0/2 0/2卵巢 0/1 0/1子宫 0/2 0/2前列腺0/1 0/1精巢 2/2 2/2肾上腺0/1 0/1肾0/1 0/1膀胱 0/1 0/1胎儿组织肝脏 0/1 0/1脑 0/1 0/1精巢 1/1 1/1胎盘 0/1 1/1注意在该表中，“LUR 171”是SEQ ID NO:17,“1338”是SEQID NO:12,“1339”是SEQ ID NO:11,“LUR 162”是SEQ ID NO:18,“LUR 84”是SEQ ID NO:5,“LUR 85”是SEQ ID NO:6。实施例8已知在黑色素瘤和在一般不表达该基因的不同细胞类型中用5-氮-2’-脱氧胞嘧啶可诱导某些MAGE基因。见Weber等，癌症研究，54:1766-1771(1994)；DeSmet等，美国科学院学报93:7149-7153(1996)；DePlaen等，基因组40:(1997)。也可使用其它的试剂诱导MAGE基因。
为了确定MAGE-1基因在诱导性方面是否类似于其它基因，按照DeSmet等，出处同上所述，在含1μm 5-氮-2’-脱氧胞嘧啶(下文称为“DAC”)的培养基中培养不同类型的细胞72小时。下表给出了其结果。
MAGE-B1 MAGE B-2LUR171-1338 1339-1338 LUR162-LUR85(外显子3-外显子4) (外显子1-外显子4) (外显子1-外显子2)-+DAC-+DAC -+DAC细胞系MZ2-MEL -+ -- -+SK23-MEL-- -- --M1665/2-MEL -+ -- -+LE92.11-RCC -- -- -+JAR -+ -- -+LB23-SAR-+ -- -+B-EBV -+ -- -+正常组织PBL-PHA -+ -- -+成纤维细胞 -- -- -+树枝状细胞 -+ -- -+
本文使用的“核酸分子”指具有上述特征的所有种类的DNA和RNA。基因组(“gDNA”)和互补DNA或“cDNA”均编码特定蛋白质，正如涉及MAGE编码序列的分离的实施例所示，本说明书教导了技术人员如何获得这两种DNA。
4个MAGE-B基因分布在160kb的X连锁的关键区中的40,352kb上，其中该连锁区定义为涉及性别决定(Bardoni等，自然遗传学7:497-501(1994))的DSS(剂量敏感性性逆转)基因座。该区域在具有雄性向雌性性别逆转表型的病人中复制。在区域中的基因可涉及X-连锁的疾病，如先天性肾上腺发育不全和性腺功能减退症。
本发明包括除MAGE-B1外的编码MAGE-B蛋白质的所有分离的核酸分子。它包括在严格条件下与MAGE-B2,MAGE-B3或MAGE-B4的任意一个杂交的那些核酸分子。本文使用的严格条件指例如，用5×106cpm/ml在65℃下杂交18小时，随后在65℃洗涤4,20分钟，每次洗涤使用2×SSC、0.5％SDS和1×Denhardt’s溶液，接着在0.2×SSC、1％SDS中洗涤(每次洗涤20分钟)二次，最后在68℃,1％SDS，不同浓度的SSC中洗涤2次，每次洗涤20分钟。SSC的最终浓度不高于0.5×SSC，更优选的是0.2×SSC，最优选0.1×SSC。
同样，可获得诸如mRNA的RNA分子。另外，对技术人员而言，一旦获得了编码序列，可分离或合成mRNA。
不编码TRAPs的互补序列，如“反义DNA”或mRNA可用于例如，对编码序列的探测中以及抑制其表达的方法中。
很明显人们也可以制备用编码或表达MAGE-B分子的核酸序列转化或转染的原核和真核细胞系的生物学纯的培养物。该培养物可用作例如，肿瘤排斥抗原的来源或作为治疗剂。本发明的这一方面在下文讨论。
用编码MAGE-B的序列转染的细胞也可用其它编码序列转染。其它编码序列的例子包括细胞因子基因，如白细胞介素(例如，IL-2或IL-4)，或主要组织相容性复合物(MHC)或人白细胞抗原(HLA)分子。细胞因子基因转染具有价值，因为预期其表达可增强体内细胞的生物学纯培养物的治疗效力。本领域熟知将白细胞介素转染子施用给受试者治疗癌症的疗法。在特别优选的实施方案中，分别用编码(ⅰ)MAGE-Xp分子，(ⅱ)HLA/MHC分子和(ⅲ)细胞因子的序列进行细胞转染。
用MHC/HLA编码序列转染是所希望的，因为某些来自MAGE-B的TRA优先或特别是仅由特定的MHC/HLA分子提供。因此，如果受体细胞已表达与提供TRA相关的MHC/HLA分子，则可不必进行另外的转染，尽管进一步的转化可用于引起该抗原的过度表达。另一方面，当受体细胞在正常情况下不表达相关MHC/HLA分子时，需要用第二种序列转染。当然，应明白用一个额外的序列转染并不排除用其它序列进行进一步的转染。
与本文所述的细胞系相关使用的术语“生物学纯的”简单地指基本上无其它细胞。严格地说，“细胞系”在定义上是“生物学纯的”，但上述术语将会完全确认这点。
细胞的转染需要使用合适的载体。因此，本发明包括感兴趣的MAGE-Xp TRAP的编码序列与启动子在其中有效相连的表达载体。该启动子可以是强启动子，如本领域熟知的那些启动子，或可以是差别启动子，即，仅在特定细胞类型中有效的启动子。表达载体也可含有全部或部分病毒或细菌基因组，如牛痘病毒或BCG。该载体在制备疫苗中特别有用。
表达载体可插入一些编码序列，只要是其中包含有MAGE-B序列即可。在具有TRAP序列的单个载体中可包括上文所述的细胞因子和/或HLA基因。如果不需如此，则可提供一种表达系统，其中使用2个或多个不同的载体，且其中各编码序列与启动子有效相连。另外，启动子可以是强启动子或差别启动子。共同转染是一种熟知的技术，本领域的技术人员预期可利用该技术。可构建载体使它们直接编码TRA分子而不是MAGE-Xp TRAP。这消除了对翻译后加工的需要。
从上面的讨论可清楚地看到这些序列编码“肿瘤排斥抗原前体”(“TRAPs”)，而其又可被加工成肿瘤排斥抗原(“TRAs”)。也许它们最值得注意的一个方面是作为治疗各种癌症的疫苗。证据表明在肿瘤细胞上提供TRAs，接着形成免疫反应并消除该细胞。本领域的证据表明，当给细胞施用各种TRA时，增强CTL反应并消除存在的细胞。这是疫苗的特征性行为，因此，可加工成TRA的TRAP和TRA本身可单独或在药用上合适的组合物中用作疫苗。同样，产生它们的细胞也可单独或与其它成份组合以相同方式使用或生产药用组合物。可用作疫苗的其它材料包括在其表面存在TRA分子的分离的细胞，以及TRAP片段，突变病毒，特别是减毒形式和转化的细菌。本文使用的“片段”指小于TRA，但具有上述疫苗所需特征的肽。另一疫苗包括或由TRA和HLA分子复合物组成。本文所述类型的疫苗可在预防上使用，即，给受试者施用足够的剂量以防止癌症的发作。
不管是T-细胞还是B-细胞产生的免疫反应均是存在肿瘤排斥抗原的特征性效应。对于B-细胞反应，它特别涉及抗TRA抗体的产生，即与其特异性结合。另外，TRAP分子的大小足以使其具有免疫原性，与其特异性结合的抗体是本发明的一个部分。这些抗体可以是多克隆的或单克隆的，后者以任意熟知的方法制备，其制备方法在此不必重复。例如，使用动物模型，例如，Balb/c小鼠或在试管中使用，例如，EBV转化子可制备的mAb。另外，可从患癌症的其中某些细胞存在TRA的受试者中分离抗血清。也可产生针对由TRA与HLA/MHC分子相互作用限定的表位的这类抗体。
对上面说明书的回顾显示，称为“肿瘤排斥抗原提供和识别”的系统有许多方面。这些现象的识别具有诊断意义。例如，特异性CTL克隆或抗TRA抗体的存在使得可经过监测受试者样品中的CTLS、抗体与TRAs的结合，或与受试者样品相连系的抗-TRA CTL的活性来诊断或监测癌症状态(下文解释)。同样，通过扩增(例如，“聚合酶链式反应”)反义杂交、探针技术等可监测TRAPs的核酸分子的表达。也可如此测定各种受试者样品，包括体液(例如，血液，血清和其它溢泌物)、组织和肿瘤。
诊断的具体方式是使用常规用于结核病诊断的标准“结核菌素试验”的改良方法。这种标准皮肤试验施用稳定形式的“纯化蛋白质衍生物”或“PPD”作为诊断辅助剂。以类似方式，可将根据本发明的TRA用于这种皮试作为诊断辅助或监测方法。
本文的术语“癌症状态”是指包括出现癌症起动并导致最终临床症状的所有生理学事件。肿瘤不会在一开始作为可见肿瘤突然出现，而是存在与正常细胞转化成恶生肿瘤，随后形成生物量生长，如肿瘤转移等相联系的各种事件。另外，缓解可组成“癌症状态”的一个部分，因为肿瘤很少自发消失。本发明的诊断方面包括涉及癌症形成，从单个细胞首次转化成恶性肿瘤到肿瘤形成和转移以及缓解的所有事件。本文包含所有这些事件。
如果使用“受试者”，该术语包含可患有癌症的任何物种。它包括人和非人类，如家养动物，繁殖的牲畜等。
本发明也涉及治疗性方面。施用有效量的作为疫苗的TRAPs和TRAs的效果已在上文讨论。同样，人们可在体外形成特异性CTLs，然后将它们施用给受试者。可用特异性结合至存在感兴趣的TRA的细胞上的多克隆或单克隆抗体用药。这些抗体可以与特异性抗肿瘤的试剂偶联，这些试剂包括，但不限于氨甲蝶呤、放射性碘标记的化合物，毒素，如蓖麻毒蛋白、其它抑制细胞或溶解细胞的药物等。因此，本文包含“靶向”抗体疗法，因为它是使用CTL消除癌症细胞的应用。
已使用的术语和表述是用作描述的术语而不是限制的术语，在使用这些术语和表述时不打算排除显示并描述该特征或其部分的任何等价术语和表述，因为应认识到在本发明范围内可作出各种变化。
下面是MAGE-B基因簇序列。MAGE-B基因簇序列10 20 30 40 50 60 70 80 901001234567890 1234567090 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890AAGCTTCAGA GTTGAGAGAC TAAGCCTATA ATGGAAAAGT GCTCTTAACT TTGGAGAAAA CTGGAAAGAA GCTCCACCAG GGGCAGCACT GGAAAGTGAC 100TATGCTCTTG TCCCAGTGCA GATGAAGACA GTGCAGAAAC TAGCTGCTTT ATATACATTG TATCCAGTGA GCTTCGGAGA AATAAGGATG ATACTCCCTT 200AAGAAGAAAT GATAAGAAGC CGCTGGGTAC TCTGCACTGG GCTGGAAGAG TTAAGAGTCA ATTTCATTAA AAGGAGCATT CAAATTAGGC TATCATGTAC 300ATAATTTGGC AAGCTCTAGG CAAGTTCTAG GTGTTTGGTG CTTGTTAAAT TAATGAAAAT AAAGGTGATT TAGATGGAAG TGACACTGGG AGGGAAGGAA 400GTTGTTAGTC CTTGACGCAA ATGCGTTGTG TTGCACCTAA ACTGGAGAAG TCTACCTCAC ATTGAATAAT ATATCATTTA ATGGGGAAAT ATTACTTGAT 500TTTTCGTGCT AATCTGCATT TTGGCTTATT GGGTTTTCTT TCTTCTAGAA TGCTGCATAT TCTCTGACAT CTGTTGGATT AAGAAAAAGC AATCACAGTG 600GGATGGGTGG TATCATCAAG TTAATCATAG GTAATAGCTG CCATGTTGAA ACCTCAATAT GGGCCAAGTA TTGTGCCAGG TGCTTTACAT ACATTAACCA 700CATTTCACCA ATTCCACAAG GAAGGGGCTT ATCAAACCTA TTTCACAGAT GCAGAGCCTG AGGCTCACAG AGTTTAGTAA TGTGCCTGAG TTCACATAGC 800TGGTAAGTGG CAGGGCTGAA ACCAGACCCC CAGTCTGGAT TAATCTACAT CCCACACTGT TCCAGTCTTC CCATTCTGAG GCTAACCTCA TGTTGCTTCA 900TTCATTTTTT CTCTCTATTT TTGAAAAATG TATCTCAGGC AATAAAAAGA AGGACTCTGT GCCCATACTA CTGGGTCAAA TATATTCCCA GACCAATATG 1000AATGCCAAAA TAAATGAGAG GCATAAATAA AAAAAAGAAA AATAGTACCT GGTGTCAATA GGTGTCAATA CGTTCATCTA CACAAGCAAT CTCAGGTAAT 1100CAGAAGCTCC CAAAATCATC CTGGACAGTC TCTTCCCTGT AGAAAATAAA TGTGTCAGAA CAGAATTTTC GTGAGAATCT AAGTCTAGCA AGATGGAAAA 1200AATCAGCATG TTTTTTTCTC TGACAGCCCA CTACCTGTCC TGGAGCTTCT GCCTTGTGCT TCAGCTTCCC TATCTCACAT CACTCCCGGA ACACGGCTCC 1300TTCTCTGCAA GGTTTGCAGT AGAAAAACTG GTCATGTTTG CAGGGATGTG ACATTTCCCA GAAAGCCTTT AATGAAAGAT GATCCCCAGT TCAGAGGACA 1400TGGGAAACCA ATATCTCAGA ATATATGAGG TTATGCATAG ACTGACTCTC ATCTGCTCTC AGACCTAGAG AGCTCGAGAC AGAACTGTCA GGCTGAGCAT 1500CCACTCATTT AATCTTCAGA CCTCTCATGG ACATGGCCTA AGAAGGTCAA CTTCATGTCA GTAGATGCAG TTCAGCCTCT GATAGATATG AACGTGAGGA 1600CCCTGAATGA AGATGATGGA AGGACCCAGC CAGAACTGTG GGGTCCCAAA AAGTCCAGCT CAGGCTGTCA GCCCTTCAAA GTCCAGAACA GCCCTGGCTA 1700AATGTAGCTC ACCACAACTT CCAGTTCAGA GGTCGGCAGA GGGTGAGTAC CTTGATCTGA TGGGAACAGC CTCAGGTCAG TGGAGGATGG AGTGCCCCAA 1800GACTGGCCAG GTGTCATGGT GAGGACCCTG AAGAGAAATA AGAGAACTGT TATAGGACCA ACGAGTTTCT GTGTCAGCTG CAAAGTAACA GACCCACTAT 1900AATAAAACAG CAAAGTTTGC AGCAAAGAGT TTAATGATTG CAGGGTGCCA AGTGAGGAGA TGAGAAGAGA CTCTCAAATT CATCTCCCCA AGGAGTTCTG 2000GGCTGGGATT TGCAAGGAGA TCATGGAGGG CGAGGGGCTG GAGAACTGAG GTTGTTGATT CGTTGGGGTA AAGGGGATGA AATCATCAGA ATGTGGAAAC 2100TGCGTTTTTT TTTTTTTAGT CAGCTCCTGT GGGGTCTTTT GGACCAGCTG ATGTCAGTAG GGTCCTTTAG AGCAGCTGGC ATCAGTGGGG TCCTTCAGAC 2200CAGCTGAGTC ATTAGAATCA TCAGTATGCA GGACCTTAAG GAATATCTCA AAGAAAAAAA GTTTCATTAT GTTAAAATTG TTATCTATAG AGCAATTAAG 2300GGCAACTATA ATCTAGTAAC AGGATCTACA TGATTCTGGG ATAATAGGCA CCAAACTACT ATGAGGAAGC AGGTCAGAGA GCAGCTGACT TCATGATTAA 2400TGCTGAATGT TCTGCAAGCT TGGCGTATCT TCATTTATCT CCCTTCCCTC TTCCCTGATT AATTTTATAC AGTTCATAGG GGCAGTTTCA AAACCACCCA 2500CCCAGAACAG AGGAGCCCAC AAATTCCACC AATCTGTCAC CCTTGGGGAG CCCAGAAGAG AATTATGAGG TGGAGAAATC CCATCAATAT GCCTCGTGTG 2600TTTCACAGAG GTGAAGACCT TGGACTAGTG GAAATGGCCC TAGGTCAAAG AGACAAAACC CACGCCCTAA CAGGAATCAA GGTGAGGATC CTAAGTGTTA 2700CGAGGGGGCT CTCCCCCTTG CAACACCAGC AGAGGGGGCC AAACAGAGCC CTCGCCATTG TTAGCACCGA GAGCCCCAAA ATAAGTATCA CTGAATCCCT 2800TCATTCCACC TGTATAGTCT CGGGGAAGGA AGGGCCTTTG TCTGAAGAGG GTGACCCAGT TGTGCAGAGA GAGAGTCTTG GCTTTCACGG GAATCAAGGT 2900GAGGACTCTG AGGGCGGATG AGAAGACCTC TCCCCAAAAA AGGCACATTC ACAGAGCCCT GCCGCTGCTG TCAGGCCTGT GAGGCCAGGC AGGGGTGGCC 3000TGTTTGGCAC GCTTAGATTT CCACAGTGGG GGCTGAGGGA GGTGGGGCTA TTGTTTGGAG GCTGGCGGAT TTGGGACAGC ACGCATATTC GTCCCAGGCT 3100GCTAGATACT GAGGTGAGGA CCCTAGTGGA GACGAAGGGA CCAGCAACGC TAGAACAGTG ACGTCCGGTA GCGTCCAGCC GTCAGCCCCT CAGACGCCAC 3200MAGE-B基因簇序列10 20 30 40 50 60 70 80 901001234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890GGGCIGCCCG ATGTGAGTCA TCCTGACTTC CGCTTTGAAA AAAAAGACCC GAGCGGATGT GGCTCATCCT GACTTCCGCT TTGGAGGCGA GGACCCGAGC 3300GAGTGTAGGG GGTGCGGCGT CTGGTCAGCC AGGGGTGAAT TCTCACGACT GGTCGGCAGT CAAGGTGAGG ACCCTGAGTG TAAACTGAAG AGACCACCCC 3400CACCTGTAAC AAAGAGGGCC CCACTAAGTC CCGCTTCTGC ATTTGGTCCT GAGAGGCTCC GGTAAAGCCG TCCGGCAATG TTCCACCTGG AAAGTTCCAG 3500GGCAGGGGAA GGGTGGGGGG AGGGGCAGTC GCGGGGGAAG GAGGTTTGGA CGCAGGGAAT AGGCCTCATT CTGCACGTAG GGTGGGTGTA GGCCCTAACT 3600GAAATCAATT TGAGGGCCCT AAATGTGGAC TGAAGAGAAC ATCTCCTACC CTTAACAAAG GTGGCCTCAC TAAGTCTCGT CCCTGAAGAC GGCTCTGGGA 3700GGCCCCAGCA AAGCTGTGCC TGGAAAGTCT CAGGGAGGGG AGGGCCTTGA ACCTAGGAAG CAGCCCTGCT TCTGCTCATA TGGCATCAAC CTAAAACCTA 3800ACTGGGGTTA AGGTGAGGAC TCTGAGTATT AATGAGCGGA CCTCTACCCA AAAGAGGAGT CATGCTGGGC AGTTCCCAGG CCGAGGTGAC ACTGGGTTTT 3900AGATGGTCCC AGGCTGACAT GACAAATGCA GAGCAACCTG ACTTCCTCTC CCGGGACTAA AGAAGTTGAG GGCTACATCC AAGACCCACA TCTGCTGCCA 4000GCAATAGGAA GGTCAGGGCA AAGCTAGCAA GCTGAGATGC TCTCTAGTTT CCTCTGGAAG GTGGTCTCAG GGAGGTGAGG GTCTGGTGTA TGGGGTTAGGT 4100CTAATGCGAC AGAGAGGCCC AGTCTCTAAC AGGAAGCAAG GATGTGACAC TGAGTGATGA GGAGGGGACT CCAACCAGAA AGAAGTGCCA TATAGAGCCC 4200ACTCTTGTTG TCAGACCAGG GAGACCTGAG CATGGCATGT TGAGTTGTAC TCACTCTCCC CAAGACATCT CAGAGAAGTG AACGACCCCA TTAAAGAGGG 4300CAGCCTGGCC GGGCGCGGTG GCTCACGCCT GTAATCCCAG CACTTTGGGA GGCCGAGACA GGCGGATCAC GAGGTCAGGA GATCGAGACC ATCCTGGCTA 4400ACACGGTGAA ACCCTGTCTC TACTAAAAAT ACCAAAAAAA AAATTAGCGG GGAGCGGTGG CGGGCGCCTG TAATCCCAGC TACTCGGGAG GCTGAGGCAG 4500GAGAATGGTG TGAACCTGGG AGGCGGAGTT TGCAGTGAGC CGAGATAGAG CCACTGCAGT CCGGCCTAGG CGAAAGGGCG AGACTCCGTC TCTTAAAAAA 4600AAAAAAATAA AAAGGCAGCT TGAGGTCAGC AGAGGGAGGG TTTCCAGGTT GTGCCAGATG TTATGATAAG AACTCTGACG ACTGCAGGGG GCTCCCACCC 4700CATATTAGTG GAGCCACACA TCCTCAGTAC TGTCAGCTCT GAGAGACCCC AGGCAGAAAT GTGAAACAGA GTGCCCATCA GTTCCCACTC AAGGGTAACA 4800GGGAAATGAG AGTTTAATCT GAGGGTGTGA TCACTTGTCA ACAGAAGTAA TGTACTAATT GGTCCATTCT GGCATTACTA TAAATACCCA AGACTGGGTA 4900ATTTACAAAG AAAAGAGGTT TAATTGGCTC ACAGTTCTGC AGGCTGTACA GGAAGCATGA TGCTGGCATT TGCTCAGCTT CTGGGAGCAG GGCTCAGGAA 5000ATTTACAATC ATGGCAGAAG GGGAAGGGGA AGCAGACATG TTACATGGCC AGAGCAGGAT CAAGAGGCCA GGGGAGGCGC TACACACTTT TAAATGACCA 5100GATCTCATGA GAAGTCATCG TTAAGGGGAA TGGTGCTAAA CCATTCATGA AAAACCTGCC CTCATGATCC AGTCATCTCC CACCAGGCTC CACCTCCAAC 5200ATTGAGGATT ACAGTTAGAC ATGAGATTTG GTGAGGATAC AGATCCAAAC CATATCAGGG AAGAATCTTA GACCCTCTCA TGAGTCAAAT TTAGAGGCTG 5300AGTTGGGACT GTATGTGGGA CCATCTATCA CAGGGCAGTT ATCTGCCTGC CACAGCTTTT ACTTTTGGGA AGACCACATT TGGTCAGATA AGGCCACCCT 5400CACTTCCTCC TATGGGTTCT CAGGGATGTT CACTCTTACC ATGACGACAT AGGCCTCAGT TCAATTAAAA GGAGAGCTCC TCTACCAGGA GTCAAATTGA 5500GGAATCTGAG AATTCAAGGA ACCACTGAAC CCTTAACAGT GGAGACATCA AAGAATCCAG TCCAACCCTT TATTTTCAGC CCTAGAAAGC TCAGGAAAGG 5600GTTATCAGGT TTAGTGTCCC CCTCTCTTTT TTATATAAGA TCTAAGAGAG GTGAGATTCT TAGTCTGACG GTGTAGCCAC CACTCAGCAG AAGGGGGCTG 5700GTGCCAAGCC CTACATGAAG CCAAGGTGGG GACCTTGAAT GAGAGCTGAA GACTCTAATG ATTCCAAGAC ATCAAAGACC CCACTGAACT CTCAGCACTG 5800GGTGTCACTT CTCAGGGTGG TGGTTGAGGC ACCCCTTCAA 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TTGAAGGCGA GGACCCGAGC GAGCTTAAGG AGTGGGGTGC AGCGTCTGGT 35100CAGCCGAGGG TGAATTCTCA GGACTGGTCG GGAGTCAAGG TGAGGACCCT GAGTGTAAAT TGAAGAGACC ACCCCCACCC GTAACAAAGA GGTCCCCTCT 35200MAGE-B基因簇序列10 20 30 40 50 60 70 80 901001234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890AAGTCCCGCT TCTGCATTTG GTCCTGGGAG GCCTCAGGTA ACCAGATGGG TAGCACCCTG ACTGTCTCTT CAGCGACTCA GGGAGACGAA GGCTTTGGCC 35300TAAGCCTTAT AGACTCAGGT CAATAGAGGG AGGAGTCCTA AACCCTACTA CCCGTAATCC CAGAACTCTG GGAGGCCGAG GCAGGCGGAT CACGAGGTCA 35400GGATATCAAG ACCATCCTGG CTAACACGGT GAAACCCCGT CTCTACTAAA AATAGAAAAA ATTAGCCAGG TGTGGTGGTG GGCTGCTGTA GTCCCAGCTA 35500CTCAGGAGGC TGAGGCAGGA GAATGGCGTG AACCAGGGAA GCGGACGTTA CAGTGAGCCG AGATTGCACC ACTGCACTCC AGCCTGGGTG ACAGAGCGAG 35600ACTCAGTCTC AAGAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAGTCCCGC TCCTGCTGTC GGCACACGCA GGCCCCAGTC AGCCTTGGTG GGATGTGGCC 35700CACTATGACT GTGAACTTAG GTCCAAGGAA TATGAGAACT TTTGTCTACG GGGCATGGTG TTAGGAGCAG TTGATGGGTG GAGTCCCAGA AAGAGTGCTG 35800AGTGGAGGTG GAGACACTGA GTGAGGAAAT GGCGGCTACT CTATACACGA GGGAGACAAT TGCGCCTGAT GCTGTCCCTG GGAGTCCCAG GCCAGAGCTG 35900GCAGGCTCAA GTCTCCCTGG CTTCTGCCTT CATGGTCTTA GAGAGAGGAG GGCCTTGGTT TAAGGCCTCA CTGCCCCAGT TCAGTAGAGA GATAGGAGTC 36000ATACGCCAAG ACAGGTGTCA AGGTACAATT TCTTTATGAG GAATGAGGTA ACCGTCTAGT CCAGCAACAG GCAGGAACAC AGTCTTACCT TGGCGTTCAT 36100TCCTTAGAAG CCAGGGTTAG ACTCTCAAGT TGAGATGCCC CTCATTTCCT TCAGGTACTG TTTCAGGTAC ATAATGGCTT TGGTTTAACA TGAAAGCCCT 36200TGTTTAGTAC AGGGAGGAGG CCCAGTTCCT AAAAGATGGT GACACTGAGG GAGTATGAGG GGACCCCCTC CAAGAAAGAG GTAACACAGA TAGAGCCCTA 36300TCCCCACTGA GACCTGGGAG ATCCAGGTAT GGTGACATGA TGAGTCTCAC TCACTTCTTC CTAGAGCATC TCAGGAAGTG GGAACTTCAT CAAAGGGGGC 36400AGCCTTATGT TAGCAGCTAG AGATTCCTAG TAATTCCAGG AGTCAAAAGA AGACCCTGAG AACTGGGGAA CCACTCATCC CATAACAGTG AAAGAAACAC 36500GGAATTCCTT CCTGATTTTC ATCCTTGGGA GATGATGGAC AATTGTAGCC AGATGGGAAA AGTTTCACTT CTTCCTCAGG GAGTTGTCGG GGGGTGCTTT 36600GTATGACTGG ATAGGCGTTA GATCAAGACA GAGAAGTCAC TGAGGGAGGA ATGAGATGAG CATTTACCTA GAGAGTGGGC TTCACCAAGT TCTACCCCCT 36700CTCAGCTCTG GGAAACCCCA GGCAGAAGTA CCCAGATGTG TCATCCCCTC AAGACTAGCC CTGGGTACTC AGAGAGGTGA AGGCTTTTGT ATGAGCCTGG 36800AAGAATCAAG TGGGATTAGA GAGGAGCTCA GACTCTGCTT GAGTGAAGAC TAAAGAGAAC AACGACCCCA GAACAGTGGA GCCCCATAGA GGACGTGGTG 36900ACTGGATGTG ATTCAGGCTT TCTTTCATCT TGGGACTATG AGGCAATGAG AATCTTAATC TGATGTAAGG GGCCTCAGGT CAGTAGAGAG AGGATTTCCA 37000GGTTGTGCCA GGCCTCATAG AGAGGACTTG AGGGAACTCC CACCTCATCA GTGGGGATCC CTCAGAGTCC CTCTGTATGT CAGCGCTAGG AAGCCCCGAG 37100CATAAATGTC AGAAATGCCC CTAAATTCCT CTTCAGAAGT AACAGGGAAA TGAAGGTCTT AGTCAGATGG GTTAGCAGGA GGGGTGGGAG GCATTTTAGG 37200CCCTCCCAGG AGTCAAACTG GAGACCTTGA GTGAGGACCA TGAGTGGGGC TACACATCAC AGGGCTTCAA CCTGCCAGCC ACAGCTTTCA GCCTCTGGAG 37300AATATGGGCA TTGTGACCAG ATACAGCCAC CCTCATTTCC TCCATTGGGT CTCAGGCAGA TGTAGGCCTT ACTATGAGTA AATGTCCTCA GGTGTAGAGA 37400GAACAGAGCC CTAGGCCCTT CTGGGAGTCG AAGTGTGAGT GTGGACTGAA GGCACCATTC CCCCAAGCCC CCAACCCCCA CCCCAAATAG AGGAAAAACA 37500ACGATGCTAG CCCTGTCTCT GCACTTAGCT CTGAAAGGCC TTGGCCAAGG GTTGCCAGGC TGAGACTTTA TTTCTTTGCA TCAGGTCTAA GGGAGGTGAC 37600AGCTTTGGTC TGAAGATGCA GCACCAGTTA GCAGAAGACA GGTTCCCAGA ACTTAGATAT AGATGAGATG AGGACTCTGA ATTAAGATTG AGGTCCAACT 37700AGCCCAGGAC AGAGAGAGTT CCATAGAACT GTCAGCACTG CCATCCCGCC AGCCCCCGGT AAGGATGGTA GGTTGAAGCA GTGCCTCATT TTTCTTTGTG 37800GATTCCAGGG AGCTTTGAAG TGTCAGCTTC AGAGCAGCAC AGGAAGGAGT CCCAGACCCT TCCAAGAGTA GATATGAAGA TCCTGTATAT GAATTGAGAG 37900GCCTTGAACA CAGAGGAGTC TACACTGCCA ACCTCTGCTG TCACCCAGTC AGCCCAGGCA GGTTTGGCAA CAAGAACCAG TGGTTCCTAG AGCAATGCCC 38000TCAAGAAAAC CAGCAGAAGT GCTCTCTAAA AGCCAAGTTG TACCTCCCTG CTGCAAGTAC TCACAGATCT CATTCTCTCT CCTTCAGGTG CCACATCTCC 38100TGCCTTTCTG CTCACTTTCC TGCCTGTTTT GCCTGACCAC AGCCATCATG CCTCGGGGTC AGAAGAGTAA GCTCCGTGCT CGTGAGAAAC GCCGCAAGGC 38200GCGAGAGGAG ACCCAGGGTC TCAAGGTTCG TCACGCCACT GCAGCAGAGA AAGAGGAGTG CCCCTCCTCC TCTCCTGTTT TAGGGGATAC TCCCACAAGC 38300TCCCCTGCTG CTGGCATTCC CCAGAAGCCT CAGGGAGCTC CACCCACCAC CACTGCTGCT GCAGCTGTGT CATGTACCGA ATCTGACGAA GGTGCCAAAT 38400MAGE-B基因簇序列10 20 30 40 50 60 70 80 901001234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890GCCAAGGTGA GGAAAATGCA AGTTTCTCCC AGGCCAGAAC ATCCACTGAG AGCTCAGTCA AAGATCCTGT AGCCTGGGAG GCAGGAATGC TGATGCACTT 38500CATTCTACGT AAGTATAAAA TGAGAGAGCC CATTATGAAG GCAGATATGC TGAAGGTTGT TGATGAAAAG TACAAGGATC ACTTCACTGA GATCCTCAAT 38600GGAGCCTCTC GCCGCTTGGA GCTCGTCTTT GGCCTTGATT TGAAGGAAGA CAACCCTAGT AGCCACACCT ACACCCTCGT CAGTAAGCTA AACCTCACCQ 38700ATGATGGAAA CCTGAGCAAT GATTGGGACT TTCCCAGGAA TGGGCTTCTG ATGCCTCTCC TGGGTGTGAT CTTCTTAAAG GGCAACTCTG CCACCGAGGA 38800AGAGATCTGG AAATTCATGA ATGTGTTGGG AGCCTATGAT GGAGAGGAGC ACTTAATCTA TGGGGAACCC CGTAAGTTCA TCACCCAAGA TCTGGTGCAG 38900GAAAAATATC TGAAGTACGA GCAGGTGCCC AACAGTGATC CCCCACGCTA TCAATTCCTA TGGGGTCCGA GAGCCTATGC TGAAACCACC AAGATGAAAG 39000TCCTCGAGTT TTTGGCCAAG ATGAATGGTG CCACTCCCCG TGACTTCCCA TCCCATTATG AAGAGGCTTT GAGAGATGAG GAAGAGAGAG CCCAAGTCCG 39100ATCCAGTGTT AGAGCCAGGC GTCGCACTAC CGCCACGACT TTTAGAGCGC GTTCTAGAGC CCCATTCAGC AGGTCCTCCC ACCCCATGTG AGAACTCAGG 39800CAGATTGTTC ACTTTGTTTT TGTGGCAAGA TGCCAACCTT TTGAAGTAGT GAGCAGCCAA GATATGGCTA GACAGATCAT CATATATATC TCCTTTGTGT 39300TCCTGTTAAA CATTAGTATC TTTCAAGTGT TTTTCTTTTA ATAGAATGTT TATTTAGAGT TGGGATCTAT GTCTATGAGC GACATGGATC ACACATTTAT 39400TGGTGCTGCC AGCTTTAAGC ATAACAGTTT TGATATTCTA TATTTTTCAA ATCCTTGAAT CTTTTTTGGG TTGAAGAAGA AGAAAGCATA GCTTTAGAAT 39500AGAGATTTTC TCAGAAATGT GTGAAAGAAC CTCACACAAC ATAATTGGAG TCTTAAAATA GAGGAAGAGT AAGCAAAGCA TGTCAAGTTT TTGTTTTCTG 39600CATTCAGTTT TGTTTTTGTA AAATCCAAAG ATACATACCT GGTTGTTTTT AGCCTTTTCA AGAATGCAGA TAAAATAAAT AGTAATAAAT TATATTACTT 39700GTTCAGTGGC TCATTTATTC TCACCATAAA TTGAGCATCT GCTCTTTGTA AGGCTCTGTG ATAGTAGTGA TTGTACTAAG TTAAAGAAGA CCCTTCGCCT 39800GCACACAGAT TTTTAGTCTA AGGACAGTTA TTATTTAAAG AAGATGGTGA GATACACTCT AACATGTACA GATTTTTTTT TTTACATATA AACACTCATT 39900TAAAAAAAAA AGAAGTGAGA ATGGTGGGAG AAGGTTCAGA CAAGAGCAGT CAAGTGTTAA TTTCCTAGCC AAGGCACTTC GTGGTGTGGG ACAATGCAAG 40000TCCCTCGTTG GGAGGTCATT TTAAGTTAGC TCCATGGTGA ACTGGATGAG GTTGTGATAA TCATAAGAAG GTGCCAAACC CTCAGATCAT GAGCCTTAGA 40100GTTGAGAGAT TAAGCCTGGA AAGGGAAACT GCCCTTAACA GTTACTTTGG GATTGTGGGT AAAGCAGAGA GAACCTGTGT CTGGAGGAGG AGTGGAAGAA 40200TACAGTGCTC TCGTCCCAGG GCAGTCAAAC ACAGTGCACA AACTAGTTGT TTTATGCACA TTGTCTCCAG AAAGTGTTTG AGAAATAAGG GTTATACTTC 40300CTTGAGGTGA GATGCCAAGA AGCCACTAAG CTAACACTGT TTCCCTAAGC TT 4035权利要求
1.筛选样品中睾丸精原细胞瘤、非小细胞肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、肉瘤或白血病可能性的方法，包括将所说的样品与至少一种能与相应于MAGE-Xp基因的mRNA杂交的核酸分子接触，并测定杂交从而测定所说的样品中存在睾丸精原细胞瘤、非小细胞肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、肉瘤或白血病的可能性。
2.权利要求1的方法，包括聚合酶链式反应。
3.权利要求2的方法，包括将所说的样品与至少2个核酸引物接触。
4.权利要求1的方法，其中所说的MAGE-Xp基因是MAGE-Xp2,MAGE-Xp3或MAGE-Xp4。
5.权利要求4的方法，包括将所说的样品与(a)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6,(b)SEQID NO:7和SEQ ID NO:8，或(c)SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10接触。
6.权利要求5的方法，包括将所说的样品与SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6接触。
7.一种分离的核酸分子，由编码MAGE-B的基因组DNA组成，该DNA由SEQ ID NO:15的核苷酸3266-7979,SEQ ID NO:15的核苷酸23546-25194,SEQ ID NO:15的29748-31474,SEQID NO:15的核苷酸29748-31827，或SEQ ID NO:15的核苷酸31403-39691组成。
8.编码MAGE-B1变异体的分离的核酸分子，以5’到3’顺序，由SEQ ID NO:15的核苷酸31403-31474,33958-34062,35057-35139和38088-39691；SEQ ID NO:15的核苷酸31403-31474,33958-34062和38088-39691；SEQ ID NO:15的核苷酸35057-35139和38088-39691；和SEQ ID NO:15的核苷酸33958-34062和38088-39691组成。
9.测定皮肤癌或乳腺癌存在的方法，包括测定样品中MAGE-B1基因的mRNA的存在，其中存在所说的mRNA是在所说的样品中具有皮肤癌或乳腺癌可能性的征兆。
10.测定样品中存在白血病、淋巴瘤，头颈扁平细胞癌或乳腺癌的方法，包括测定所说的样品中的MAGE-B2的mRNA，其中所说的mRNA存在是在所说的样品中具有白血病、淋巴瘤、头颈扁平细胞癌或乳腺癌可能性的征兆。
11.权利要求9的方法，包括借助于聚合酶链式反应测定所说的mRNA，该反应包括使用SEQ ID NO:11,16或17所述的一种寡核苷酸和SEQ ID NO:12所述的寡聚核苷酸作引物。
12.权利要求10的方法，包括借助于聚合酶链式反应测定所说的mRNA，该反应包括使用SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，或SEQID NO:8和SEQ ID NO:6所述的寡聚核苷酸作引物。
13.用作寡聚核苷酸引物的分离的核酸分子，所说的分离的核酸分子具有SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所述的核苷酸序列。
14.在扩增MAGE-B基因中有用的试剂盒，包含一对寡聚核苷酸引物，所说的引物对选自(a)SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:11,16或17之一，或(b)SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:18。
全文摘要
本发明涉及MAGE－B家族成员的核酸分子。这些分子与以前描述的MAGE核酸分子的区别在于MAGE－Xp家簇的成员不与以前鉴定的MAGE序列杂交。而且发现MAGE－B家族的成员在X染色体的Xp臂上，而不象以前鉴定的MAGE基因在Xq染色体上。
文档编号A61K48/00GK1227611SQ97195246
公开日1999年9月1日 申请日期1997年6月5日 优先权日1996年6月5日
发明者克里斯托夫·吕尔坎, 弗朗西斯·布拉瑟尔, 蒂埃里·布恩 申请人:路德维格癌症研究所