肽衍生物的制作方法

专利名称：肽衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及某些具有药理学有用性质的新型肽衍生物，它们可用于治疗自身免疫性疾病或医学紊乱，诸如类风湿性关节炎和其它MHCⅡ类依赖性T细胞介导的疾病。本发明也包括所述新肽衍生物的药用组合物、其生产方法和它们在治疗一种或多种上述疾病或医学紊乱方面和生产用于这类医学治疗的新型药物生产方面的用途。
人免疫应答的刺激依赖于T细胞对蛋白抗原的识别。然而，T细胞不能对单独的抗原应答，仅当抗原与诸如B细胞、巨噬细胞或树突细胞之类的抗原提呈细胞表面上的主要组织相容性复合物(MHC)分子复合时，才触发T细胞。
MHCⅠ类分子引起T杀伤细胞导致带有该抗原的细胞破坏的反应。MHCⅡ类分子引起T辅助细胞控制选定B细胞的扩张和成熟(即产生抗原特异性抗体)以及巨噬细胞的激活的反应。
免疫系统关键性的要求是区别“自身”抗原和“非自身”(即外源)抗原的能力。这种辨别要求能够使免疫系统封固(mount)对侵入性外源病原体的应答，而保持对自身蛋白的耐受，并由此防止对正常组织的损害。当自身耐受出现障碍使得免疫系统对诸如类风湿性关节炎中的关节之类的自身组织反应时，产生自身免疫疾病。人们认为，耐受的保持并由此防止自身免疫病关键取决于MHC分子的功能。
许多自身免疫病与特定MHC等位基因的遗传相关的观察，提示MHC分子在自身免疫病发病机理中的重要作用。例如多发性硬化症与HLA-DR2的遗传相关，胰岛素依赖性糖尿病与HLA-DR3和/或HLA-DR4相关，而桥本甲状腺炎与HLA-DR5相关。详细地说，在慢性炎症性关节疾病类风湿性关节炎的发病因素与HLA-DR4Dw4和/或HLA-DR4w14和/或HLA-DR1的遗传之间存在特别强的联系。人们认为该自身免疫病相关的MHC分子与某些自身抗原结合，并将它们提呈于T细胞，由此刺激自身免疫应答。可以与所述自身免疫相关的MHC分子结合和/或或者防止该结合或者取代已经结合的自身抗原和/或抑制T细胞(特别是致病T细胞(例如Th1细胞)活性)激活和/或增加保护性T细胞(例如Th2细胞)活性的其它肽，或与通过其它作用机制与MHC分子相互作用以便防止或修饰通过所述MHC分子介导的自身免疫应答的肽，可以特异性地抑制自身免疫应答。
该种类的药物可能提供对该自身免疫疾病的治疗，而避免通常的该免疫系统的抑制，由此限制了有害的副作用。该种类的效果对于诸如类风湿性关节炎之类的疾病具有明显优于目前治疗的优点。现代的医疗实践最初用诸如NSAID的症状减轻药物治疗类风湿性关节炎，所述药物对疾病进程没有有益的作用，而常常伴随产生不良的副作用。治疗更严重的疾病依赖于使用所谓的二线药物。通常这些药物是一般的细胞毒性化合物，它们具有有限的效力，并可以引起严重的毒性问题。因此，合理基础的不伴随产生非特异性细胞毒性的疾病改善药物在治疗类风湿性关节炎方面可能提供显著的益处。
在公开号为WO 92/02543、WO 93/05011和WO 95/07707的国际专利申请中公开了与MHC结合并抑制T细胞激活的肽。
尽管已经发现了通过与HLA-DR分子结合而抑制HLA-DR限制的T细胞激活的许多肽，但仍然需要与这类分析结合和/或或者防止结合或取代已经结合的自身抗原和/或抑制T细胞激活和/或提高保护性T细胞活性的其它化合物，或通过另一作用机制与MHC分子相互作用以便防止或修饰引起上述疾病或紊乱的自身免疫应答的刺激。
我们已经发现本发明的肽衍生物(下面陈述的)意外地具有这类药理学上有用的性质，这是本发明的基础。
按照本发明的一个方面，提供式Ⅰ(下文陈述的)的肽衍生物或其药学上可接受的盐，其中
P为疏水残基；AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6、AA7和AA8为L-氨基酸残基，其中AA1、AA4和AA7中的1个、2个或3个选自式Ⅱ(下文陈述的)L-氨基酸残基，其中n为1、2、3或4的整数；X为-NH-CO-、-CO-(羰基)或-O.CO-(酯基)；R1和R2选自(A)、(B)和(C)，其中(A)为式-(CH2)a-CO-N(R3)(R4)的基团，其中a为1或2的整数，R3和R4独立地选自-[(CH2)bO]m-Ra的基团，其中Ra为甲基或乙基，而m为1、2、3、4或5的整数；当m为1时，b为2或3，而当m为2、3、4或5时，每个-(CH2)bO-单位的b值独立地选自2和3；(B)为式-(CH2)cO(CH2)d-CO-N(R5)(R6)的基团，其中c为2或3的整数，d为1、2或3的整数，而R5和R6独立地选自基团-[(CH2)eO]p-Rb，其中Rb为甲基或乙基，p为1、2、3、4或5的整数；当p为1时，e为2或3，而当p为2、3、4或5时，每个-(CH2)eO-单位中的e值独立地选自2和3；以及(C)为式-[(CH2)f-O]g-R7的基团，其中R7为甲基或乙基，而g为1、2、3、4或5的整数；当g为1时，f为2或3，而当g为2、3、4或5时，每个-(CH2)fO-单位中的f值独立地选自2和3；或AA1、AA2、AA3、AA6、AA7和AA8为L-氨基酸残基，其中AA1和AA7的一个或两个选自以上定义的式Ⅱ的L-氨基酸残基，并且AA4和AA5一起形成式Ⅲ、Ⅲa、Ⅳ、Ⅳa、Ⅴ或Ⅴa(下文陈述的)的基团，其中Ra、Rb和Rz独立地选自氢和(1-4C)烷基，而A为氧或亚甲基；或AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA8为L-氨基酸残基，其中AA1和AA4的一个或两个选自以上定义的式Ⅱ的L-氨基酸残基，而AA6和AA7一起形成式Ⅲ、Ⅲa、Ⅳ、Ⅳa、Ⅴ或Ⅴa(下文陈述的)的基团，其中Ra、Rb和Rz独立地选自氢和(1-4C)烷基，而A为氧或亚甲基；而Q为OH、NH2、NRcRd，其中Rc选自(1-4C)烷基、2-氨甲酰基环戊基、2-吡啶基甲基、4-氨甲酰基环己基、4-氨甲酰基环己基甲基、3-氨甲酰基苯基、4-氨甲酰基苯基、4-(氨甲酰基甲基)苯基、4-(羧甲基)苯基、2-吗啉代乙基和式-A1-G1的基团，其中A1为(3-7C)亚烷基或A1选自(1)式-A2-B2-的基团，其中A2为对亚苯基或1,4-亚环己基，而B2为(1-4C)亚烷基，或A2为亚甲基，而B2为对亚苯基或1,4-亚环己基；以及(2)式-A3-B3-C3的基团，其中A3为亚甲基，B3为对亚苯基或1,4-亚环己基，而C3为(1-3C)亚烷基；以及G1为式-N=C[N(Rp)2]2的基团，其中每个Rp独立地选自氢、甲基、乙基和丙基；而Rd为氢或(1-4C)烷基；或Q为1-哌嗪基、4-甲基-1-哌嗪基、4-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)-1-哌嗪基、4-脒基-1-哌嗪基、1-哌啶基或4-取代的-1-吡啶基，其中4-取代基选自羧基、氨甲酰基、N-(2-氨乙基)氨甲酰基和N-(4-氨丁基)氨甲酰基；或Q为1-6个氨基酸残基或其酰胺的序列。
按照本发明的另一方面，提供式Ⅰ(下文陈述的)肽衍生物或其药学上可接受的盐，其中AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6、AA7和AA8为L-氨基酸残基，其中AA1、AA4和AA7的一个选自式Ⅱ(下文陈述的)的L-氨基酸残基，其中n、X、R1和R2具有以上定义的任何含义；或AA1、AA2、AA3、AA6、AA7和AA8为L-氨基酸残基，其中AA1和AA7的一个选自以上定义的式Ⅱ的L-氨基酸残基，而AA4和AA5一起形成以上定义的式Ⅲa的基团；或AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA8为L-氨基酸残基，其中AA1和AA4的一个选自以上定义的式Ⅱ的L-氨基酸残基，而AA6和AA7一起形成以上定义的式Ⅲa的基团；而P和Q具有以上定义的任一值。
应该理解，Q的氨基酸独立地具有D-或L-立体化学。此外，当Q定义为羟基(OH)时，这应该理解为C-末端氨基酸AA8的羟基。同样，当Q定义为NH2、NRcRd、哌嗪基、哌啶基等时，这是指C-末端氨基酸AA8的羟基被这一基团取代。也应该理解，当提到氨基酸时，指α-氨基酸。也应该理解，当提到L-氨基酸时，也包括诸如Gly、2,2-二乙基Gly、氮杂丙氨酸和氮杂甘氨酸之类的没有手性碳原子的氨基酸。还应该理解，诸如“烷基”之类的种类术语当所述碳数允许时包括，直链和支链变体。同样的习惯用于其它基团。
还应该意识到，当R1和R2为式(A)的两个基团时，R1中的a、R3和R4的值可以与R2中的值相同或不同。同样，当R1和R2为式(B)的两个基团时，R1中的c、d、R5和R6的值可以与R2中的值相同或不同；而当R1和R2为式(C)的两个基团时，R1中的f、g和R7的值可以与R2中的值相同或不同。
本领域内众所周知，具有手性中心的化合物可能以外消旋体(或有多于1个手性中心时为非对映异构体的混合物)形式或作为旋光性对映体或非对映异构体存在。本领域内也众所周知，与外消旋体或非对映异构体混合物相关的特殊的生物学活性可以主要或仅仅由单一的旋光性异构体产生。因此应该理解，本发明涉及式Ⅰ具有上述药学有用性质的任何形式的式Ⅰ肽衍生物。本领域众所周知如何获得单一的旋光性异构体，例如通过采用诸如色谱之类的常规技术从含有所述异构体的外消旋体或非对映异构体混合物中进行分离，或通过采用例如本文例举的合适的旋光性原料或中间体进行手性合成来获得。本领域也众所周知如何确定这类外消旋体或非对映异构体混合物和各个旋光性异构体的药理学性质，例如通过采用本文所述的分析方法来确定。因此，本领域技术人员能够容易地获得具有本文提到的有益药理学性质的式Ⅰ肽衍生物的特定异构体。应该理解，本发明也包括具有本文提到的有益的药理学性质的式Ⅰ的肽衍生物的任何多晶形式、任何互变体或任何溶剂化物或或它们的任何混合物。
当α-氨基酸残基AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6、AA7和AA8不是式Ⅱ氨基酸残基时或形成式Ⅲ、Ⅲa、Ⅳ、Ⅳa、Ⅴ或Ⅴa基团的部分时，其合适的独立的有用基团(values)包括例如由遗传密码编码的20种天然存在的氨基酸，特别是丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)和脯氨酸(Pro)的氨基酸残基。诸如肌氨酸(Sar)、3,3,3-三氟丙氨酸、2,2-二乙基甘氨酸、2,3-二氨基丙酸(Dap)、2,4-二氨基丁酸(Dab)、2-氨基丁酸(Abu)、高精氨酸、高苯丙氨酸、反式-4-羟脯氨酸(Hyp)、氮杂丙氨酸(H2N-N(CH3)-COOH；Azala)、氮杂甘氨酸[H2N-NH-COOH；Azgly]、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)、八氢吲哚-2-羧酸(Oic)、十氢异喹啉-3-羧酸(Dic)之类的氨基酸残基也是合适的。(这里Dic是指其中环状接头二者都具有R构型或都具有S构型的形式)。相应的N2-甲基化氨基酸残基也可以使用，其中游离侧链羧酸官能团被酯化(例如作为(1-6C)烷基酯或苄基酯)和游离侧链氨基被烷基化(例如甲基化)、乙酰化或转化为氨基甲酸酯(例如氨基甲酸烷基酯(例如甲酯或乙酯)、苯基酯或苄基酯)的相应的氨基酸残基也可以使用。其它合适的有用基团包括例如2-取代甘氨酸的残基，其中2-取代基为式-(CH2)5NH2的基团，其中s为1-3；或式-(CH2)pN(Re)3+.X-基团，其中p为2-4,X-为相反离子(例如乙酸根、三氟乙酸根、氢氧化物或氯化物)；或式-(CH2)qN(Re)2基团，其中q为0-4；或式-(CH2)rN=C[N(Re)2]2基团，其中r为1-4，并其中最后三个基团中每个Re独立地选自氢和(1-4C)烷基(例如甲基或乙基)。
疏水残基P(应该认识到它连接到N-末端氨基酸AA1的氨基上)的合适的有用基团包括例如有机疏水基团，诸如5-20个碳原子(对于含杂芳族基团还有1、2或3个杂原子，选自氧、硫和氮)的疏水脂族、芳族、杂芳族或混合脂族/芳族或脂族/杂芳族有机基团，例如式R-、R.CO-、R.SO2-、R.O.CO-、R.NHCO-、R.O.CS-、R.S.CO-、RNHCS-、R.S.CS-和R.CS-的基团，其中R包括例如(5-10C)烷基、芳基、杂芳基、芳基(2-10C)烷基、杂芳基(2-10C)烷基、二芳基(2-8C)烷基、芳基(2-10C)链烯基、芳基环丙基、(5-10C)环烷基、(5-10C)环烷基(2-6C)烷基、3-联苯基、4-联苯基、4-环己基苯基、2-萘氧甲基、3-萘氧甲基、苯氧苯基和四氢萘基、其R的有用基团可以带有一个或多个(1-4C)烷基、卤代(halogeno)、氰基或(1-4C)烷氧基取代基的芳基或杂芳基。本发明一个特定实施方案包括例如式Ⅰ化合物，其中P为以上定义的R.CO-。本发明另一个具体实施方案包括例如式Ⅰ的肽衍生物，其中P为5-20个碳原子的疏水脂族、芳族或脂族/芳族有机基团。
R的具体有用基团当R为(5-10C)烷基时，包括戊基、异戊基、叔戊基、2-甲基戊基、己基、异己基、5-甲基己基和辛基；当R为芳基时，包括例如苯基、萘基和茚基；当R为杂芳基时，包括2-、3-、5-或6-吲哚基、2-、3-、5-或6-二氢吲哚基、2-、3-、5-或6-苯并[b]噻吩基(thiophenyl)、噻吩基、2-、4-或5-苯并噻唑基、2-、4-或5-苯并噁唑基、2-、4-或5-苯并咪唑基、在2-、3-、6-或7-位连接的1,4-苯并二噁烷基和2-、3-、5-或6-苯并呋喃基；当R为芳基(2-10C)烷基时，包括芳基(2-6C)烷基(其中，所述芳基部分包括例如以上给出的芳基的任一具体有用基团，所述(2-6C)烷基部分包括例如亚甲基、亚乙基、三亚甲基、四亚甲基和五亚甲基)，诸如2-苯基乙基、3-苯基丙基、4-苯基丁基和5-苯基戊基；当R为杂芳基(2-10C)烷基时，包括杂芳基(2-6C)烷基(其中所述杂芳基部分包括例如以上给出的杂芳基的任一具体有用基团，所述(2-6C)烷基部分包括例如亚甲基、亚乙基、三亚甲基、四亚甲基和五亚甲基)，例如在2-(2-氰基苯并[b]噻吩-5-基中的情况；当R为二芳基(2-8C)烷基时，包括二芳基(2-6C)烷基诸如2,2-联苯基乙基、3,3-联苯基丙基和4,4-联苯基丁基；当R为芳基(2-10C)链烯基时，包括芳基(2-6C)链烯基，诸如苯乙烯基、3-苯基丙烯-2-基和4-苯基丁烯-1-基；当R为芳基环丙基时，包括苯基环丙基、1-萘基环丙基和2-萘基环丙基；当R为(5-10C)环烷基时，包括环戊基、环己基和1-金刚烷基(adamantyl)；而当R为(5-10C)环烷基(2-6C)烷基时，包括2-(环己基)乙基、3-(环己基)丙基和4-(环己基)丁基。作为R的芳基上取代基的具体有用基团包括例如甲基、乙基、氯代、溴代、碘代、甲氧基、乙氧基和氰基。
疏水残基P也包括例如疏水L-氨基酸，诸如苯丙氨酸(Phe)及其氢化类似物，诸如环己基丙氨酸(Cha)、对氯Phe、3-(2-噻吩基)丙氨酸、酪氨酸(Tyr)、Tyr(O甲基)、色氨酸(Trp)、联苯丙氨酸、3-(1-萘基)丙氨酸、3-(2-萘基)丙氨酸和它们的氢化类似物，诸如3-(1-金刚烷基)丙氨酸(Ada)、Glu(氧苄基)、3-(苄氧基)Ala、3-(苄基硫烷基)Ala和9-芴基Gly，它们每个可任选地在N-末端含有一个上述定义或例举的疏水脂族、芳族、杂芳族或混合脂族/芳族或脂族/杂芳族有机基团。或者，所述疏水氨基酸可任选地含有例如1-3个氨基酸的另一序列，其中所述氨基酸选自以上定义的AA1-AA8的合适的独立有用基团。例如，P包括具体序列Ala-Cha、Ala-Ala-Cha、Tyr-Ala-Ala-Cha、Tyr-Ala-Ala-Phe、Ala-Phe-Phe-Phe和Ala-Ala-Ala-Phe。这种1-3个氨基酸的另一序列的第一个氨基酸(从左读到右)可以是L-氨基酸或D-氨基酸，也可任选地含有一个上述定义或例举的疏水脂族、芳族、杂芳族或混合脂族/芳族或脂族/杂芳族有机基团。
P的其它具体有用基团包括例如3-(苄酯基)丙酰基-Phe、3-(苄酯基)丙酰基-Cha、4-(苄酯基)丁酰基-Phe、4-(苄酯基)丁酰基-Cha、(5-氧代-吡咯烷-2-基)羰基-Phe-Tyr、(5-氧代-吡咯烷-2-基)羰基-Gly(O苄基)-Tyr、乙酰基-Glu(O苄基)-Tyr、二苯甲基.CONH.CH2CH2.CO-Cha、二苯甲基.CONH.CH2CH2.CO-Tyr、二苯甲基.CONH.CH2CH2CH2.CO-Cha、二苯甲基.CONH.CH2CH2CH2.CO-Tyr、二苯甲基.NHCO.CH2CH2CH2.CO-Cha、二苯甲基.NHCO.CH2CH2CH2.CO- Tyr、苄基.NHCO.CH2CH2.CO-Cha、苄基.NHCO.CH2CH2.CO-Tyr、N-乙酰基-4-氯代-β-羟基Phe、4-苯氧苯基.NHCO-、苄基.NHCO.CH2CH2.CO.(N-甲基Phe)、苄基.NHCO.CH2CH2.CONH.CH(CHPh2).CO、苄基.NHCO.CH2CH2.CO-Tyr、3,3-二苯基丙酰基、反式-肉桂酰基、5-苯基戊酰基和3-(2-氰基苯并[b]噻吩-5-基)丙酰基。
特别感兴趣的P的有用基团包括例如Ph.(CH2)4.CO-(5-苯基戊酰基(Phv))、Ph.(CH2)4.CS-和3-(2-氰基苯并[b]噻吩-5-基)-丙酰基。
疏水残基P的优选有用基团包括例如3-(2-氰基苯并[b]噻吩-5-基)-丙酰基和5-苯基戊酰基(Phv)，尤其是后者。
当Rc为式-A1-G1的基团时，当A1为亚烷基时，A1的具体有用基团包括例如亚甲基、亚乙基、亚丙基和亚丁基；当B2为(1-4C)亚烷基时，B2的具体的有用基团包括例如亚甲基、亚乙基和亚丙基；当C3为(1-3C)亚烷基时，C3的具体的有用基团包括例如亚甲基、亚乙基和亚丙基。
-A1-G1的具体的有用基团包括例如3-胍基丙基、4-(2-胍基乙基)苯基、4-(2-吗啉代乙基.NH.CO.CH2)苯基和4-(4-[2-(2-羟基乙氧基)乙基]哌嗪-1-基.CO.CH2)苯基。
当Q为1-6个氨基酸残基的序列时，Q的具体的有用基团包括例如独立选自以上定义的AA1-AA8的任一合适独立的有用基团的L-氨基酸残基序列(诸如Ala-Thr-Gly-OH)或它们的D-类似物或既含有D-氨基酸也含有L-氨基酸的序列或它们的酰胺，诸如由氨、(1-4C)烷基胺(诸如甲胺)或二(1-4C)烷基胺(诸如二甲胺)衍生的酰胺。
Q的优选有用基团包括例如4-氨基甲酰基-1-哌啶基(哌啶-4-甲酰胺的残基(Pip-NH2))、4-羧基-1-哌啶基(哌啶-4-甲酸的残基(Pip-OH))、4-(氨基甲酰基甲基)苯胺基(4-氨基苯基乙酰胺的残基(Papa-NH2))、4-(羧甲基)苯胺基(4-氨基苯乙酸的残基(Papa-OH))和4-(2-胍基乙基)苯胺基(2-(4-氨基苯基)乙基胍的残基(Pape-NHC(=NH)NH2)。Pip-NH2和Papa-NH2为Q特别优选的有用基团，尤其是Papa-NH2。
本发明具体的新肽衍生物包括例如以上定义的式Ⅰ的肽化合物，其中
(1)在式Ⅱ中，n=1,X=-CO-；(2)在式Ⅱ中，n=4,X=-NHCO-；(3)在式Ⅱ中，R1和R2为式(A)的基团(相同或不同)，其中a=1；(4)在式Ⅱ中，R1和R2为式(A)的基团(相同或不同)，其中R3和R4为式-[(CH2)bO]m-Ra的基团(相同或不同)，其中b=2；(5)在式Ⅱ中，R1和R2为式(A)的基团(相同或不同)，其中R3和R4为式-[(CH2)bO]m-Ra的基团(相同或不同)，其中m=1、2或3；(6)在式Ⅱ中，R1和R2为式(B)的基团(相同或不同)，其中c=2；(7)在式Ⅱ中，R1和R2为式(B)的基团(相同或不同)，其中d=2；(8)在式Ⅱ中，R1和R2为式(B)的基团(相同或不同)，其中R5和R6为式-[(CH2)eO]p-Re的基团(相同或不同)，其中e=2；(9)在式Ⅱ中，R1和R2为式(B)的基团(相同或不同)，其中R5和R6为式-[(CH2)eO]p-Re的基团(相同或不同)，其中p=1；(10)在式Ⅱ中，R1和R2为式(C)的基团(相同或不同)，其中f=2；以及(11)在式Ⅱ中，R1和R2为式(C)的基团(相同或不同)，其中g=3；并且其中，除非另外说明，否则AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6、AA7、AA8、P和Q具有上文定义的任何含义。
当R3、R4、R5和R6以及R1和R2选自式-[(CH2)fO]g-R7的基团时，其具体有用基团包括例如-CH2CH2OCH3、-CH2CH2CH2OCH3、-CH2CH2OCH2CH2OCH3、-CH2CH2OCH2CH2CH2OCH3、-CH2CH2CH2OCH2CH2OCH3、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3、-CH2CH2OCH2CH2CH2OCH2CH2OCH3和-CH2CH2OCH2CH2CH2OCH2CH2CH2OCH3。
其它具体的本发明新肽衍生物包括例如式Ⅰ的以下肽衍生物(ⅰ)P-AA1-AA2-AA3-Ⅱ-AA5-AA6-AA7-AA8-Q；(ⅱ)P-Ⅱ-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-Q；(ⅲ)P-AA1-AA2-AA3-Ⅲa-AA6-Ⅱ-AA8-Q；(ⅳ)P-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-Ⅱ-AA8-Q；(ⅴ)P-AA1-AA2-AA3-Ⅱ-AA5-Ⅲa-AA8-Q；和(ⅵ)P-Ⅱ-AA2-AA3-AA4-AA5-Ⅲa-AA8-Q；其中Ⅱ表示上文定义的式Ⅱ的L-氨基酸残基，Ⅲa表示下文提出的式Ⅲa的基团，并且其中除非另外陈述，否则AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6、AA7、AA8、P和Q具有在此定义的任何含义，包括具体和优选的有用基团。(应该认识到，在出现AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6、AA7或AA8的基团(ⅰ)-(ⅵ)中，它们为L-氨基酸残基，具体指明了式Ⅱ或Ⅲa基团的存在和位置)。基团(ⅰ)-(ⅵ)为本发明其它独立的方面。
(ⅰ)-(ⅵ)中特别感兴趣的肽衍生物包括例如这样的肽衍生物，其中在式Ⅱ中，n=1或2,X=羰基，以及R1和R2都为式(C)基团(尤其其中f=2,g=3和/或R7甲基，诸如-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3)或都为式(A)基团(尤其其中a=1,b=2,m=1或3和/或Ra=甲基，诸如-CH2CON(CH2CH2OCH3)2)或-CH2CON[(CH2CH2O)3CH3)]2。在(ⅰ)-(ⅵ)的基团中，基团(ⅰ)和(ⅴ)的肽衍生物是特别感兴趣的。优选的肽衍生物包括例如基团(ⅴ)的化合物，其中，在式Ⅱ中，n=1,X=羰基，以及R1和R2都为式(A)基团。
AA1-AA8的优选有用基团(当AA1、AA4或AA7不是式Ⅱ的氨基酸残基时，以及当AA4与AA5一起或AA6与AA7一起不是式Ⅲ、Ⅲa、Ⅳ、Ⅳa、Ⅴ或Ⅴa的基团时)包括例如，
选自Ala、Ile、Tyr、Val、Glu、Lys、Arg、Gly、Gap、GapMe4和3,3,3-三氟丙氨酸，特别是Ala、Ile、Arg、Gap、GapMe4，尤其是Ala、Arg和Ile，更尤其是Ala和Arg的AA1；选自Ala、Lys、Glu、Sar、Val、Arg、Gly、Pro、Ile、Tic、3,3,3-三氟丙氨酸和N6-二乙基Lys，特别是Ala、Arg、Ile、Lys和Tic，尤其是Ala、Arg、Ile和Tic，更尤其是Ala和Arg的AA2；选自Ala、His、Gln、Val、Thr、Glu、Gly、Asp、Asn和N3-二乙基Dap，特别是Ala、His、Asp和Asn，尤其是Ala和Asn，更尤其是Ala的AA3；选自Ala、Lys、Asn、Arg、Thr、Glu、Sar、Gly、Pro、His和N6-二乙基Lys，特别是Ala、Arg、Lys和His，尤其是Ala、Arg和His，更尤其是Ala的AA4；选自Thr、Val、Ala、Gly、Dap、Dab、Pro、Hyp、Asn、Ser和N3-二乙基Dap，特别是Thr、Val和Dap，尤其是Thr和Val的AA5；选自Gly、Leu、Lys、Ala、Pro、Glu、Sar、His和Dap(尤其是Ala和Pro)的AA6；选自Pro、Ala、Lys、Arg、Glu、Sar、Gly、Oic和Dic(尤其是Ala和Arg)的AA7；和选自Ala、Gly、Dap、氮杂丙氨酸和氮杂甘氨酸，特别是Ala、Gly和氮杂甘氨酸，尤其是Ala和Gly的AA8。(这里Gap是指-NH.CH[CH2NH.C(=NH).NH2].CO-残基，这里GapMe4是指-NH.CH(CH2N=C[N(CH3)2]2.CO-残基)。
本发明肽衍生物的其它具体独立的基团包括例如式Ⅰ的肽衍生物，其中AA1、AA4和AA7中的1个或2个选自上文定义的式Ⅱ的L-氨基酸残基，AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6、AA7和AA8中其余的为L-氨基酸残基(包括以上定义的合适的、具体的和优选的有用基团)。
当式Ⅰ肽衍生物含有式Ⅲ、Ⅳ、Ⅳa或Ⅴ的基团时，式Ⅲ中的Ra和Ⅳ和Ⅳa中的Rb以及式Ⅴ中的Rz为烷基时，它们的具体有用基团包括甲基、乙基、丙基和异丙基。在含有式Ⅲ、Ⅲa、Ⅳ、Ⅳa、Ⅴ或Ⅴa基团的肽衍生物中，最好是含有式Ⅲa基团的肽衍生物。
本发明的另一优选方面包括含有精氨酸残基的式Ⅰ肽衍生物，特别是其中AA1或AA2为精氨酸的化合物(诸如部分序列AA1-AA2-AA3为Ala-Arg-Ala或Arg-Ala-Ala的化合物)。
特别感兴趣的本发明的肽衍生物包括例如下文所附的实施例中提出的具体实施方案。其中实施例3和6的肽衍生物特别重要，这些化合物或其药学上可接受的盐作为本发明的其它特征被提供。(SEQ ID NO:3)
实施例3(SEQ ID NO:6)
实施例6本发明的另一方面包括保护的(例如用Fmoc)或未保护的式Ⅱ氨基酸，其中n、X、R1和R2具有以上定义的任何有用基团，包括具体的和优选的有用基团。
对于具有足够碱性的肽衍生物，例如具有游离氨基的肽衍生物而言，其药学上可接受的盐包括例如与形成生理上可接受的阴离子的酸的盐，诸如与无机酸的盐，所述无机酸例如为卤化氢(诸如氯化氢和溴化氢)、磺酸和膦酸；和与有机酸的盐，所述有机酸例如为乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、三氟乙酸等等，而对于足够酸性的肽衍生物，例如具有游离羧酸基团的肽衍生物而言，其药学上可接受的盐包括例如与形成生理上可接受的阳离子的碱的盐，诸如与碱金属(诸如钠和钾)、碱土金属(诸如镁和钙)、铝和铵盐的盐以及与合适有机碱的盐，所述有机碱诸如乙醇胺、甲胺、二乙胺、异丙胺、三甲胺等等。
如上所述，式Ⅰ的肽衍生物或其药学上可接受的盐在温血动物(包括人类)的多种自身免疫疾病或紊乱中将具有有益的药理学作用，以治疗症状或作为疾病改善剂或作为预防性治疗。这类疾病可以包括例如类风湿性关节炎、多发性硬化症、Goodpasture氏综合征、特发性血小板减少性紫癜、少年性类风湿性关节炎、腹腔疾病、系统性红斑狼疮、关节强硬性脊椎炎、Sjogren综合征、重症肌无力、1型(胰岛素依赖性)糖尿病、Hashimoto氏病、Grave氏病、Addison氏病、硬皮病、多肌炎、皮肤肌炎、寻常性天疱疮、大疱性类天疱疮、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、肾小球性肾炎、移植排斥等等，尤其是类风湿性关节炎和多发性硬化症。
可以采用各种各样的标准试验和临床研究，包括国际专利申请公开号WO92/02543、WO93/05011和WO95/07707(或其修改)中描述的和下述的试验或研究，评价式Ⅰ肽衍生物或其药学上可接受的盐的实用性。式Ⅰ肽衍生物在一个或多个这类试验或研究中表现出显著活性。
试验A纯化的HLA-DR肽的体外结合试验。(该试验可以用来证明式Ⅰ的肽衍生物与疾病相关MHCⅡ类分子的结合。)将磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的30μl 800nM的生物素-FHA307-320(用长链生物素在N末端衍生的FHA(307-320)肽，生物素-Ahx-Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Gly-OH)与30μl浓度为0.5-5μg/ml的纯化HLA-DR4Dw4，在V形孔的微量滴定板(Nunc)中孵育48小时，其中加或不加抑制剂肽。孵育结束时，将100ul浓度为10μg/ml的孵育物转移至先前包被抗MHC抗体(Lampson和Levy(1980)J.Immunol.125,293-299中所述的L243-美国典型培养物保藏中心(ATCC)HB55)的酶联免疫吸附测定(ELISA)板(Nunc)上，于室温下孵育1小时，此后用PBS和0.05％Tween20中的1％牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时。再过1小时后，洗去未结合的肽，加入具有诸如NP-40(Sigma)的0.01％的合适洗涤剂的稀释度为1/4,000的PBS中的抗生蛋白链菌素过氧化物酶(Sigma)，于室温下孵育2小时。再次洗涤后，在每块板中加入四甲基benzidene(TMB)底物溶液(10ml 0.1M pH6.0柠檬酸盐/乙酸盐缓冲液中1片TMB(Sigma)，和36μl过氧化氢脲(UHPO)(Fluka))。加入2M硫酸(每孔10μl)终止反应，于450nm下读出吸收值，以定量测定结合肽的量。通过将吸收值对浓度作图，获得肽的抑制活性。
可以如下获得所述纯化HLA-DR4Dw4(ⅰ)HLA-DR在杆状病毒系统中的表达在昆虫细胞中由杆状病毒载体表达重组蛋白是一个已建立的获得高产量重组蛋白的方法[Luckow,VA和Summers,MD(1988)Biotechnology,6,47-551]。为了能够表达异二聚体HLA-DR，例如HLA-DR4Dw4，由单重组杆状病毒载体(与具有分别用于α和β链的重组病毒，然后进行共感染不同)构建携带α和β两条链的双重组杆状病毒。
将编码α多肽序列的cDNA克隆到转移载体pacYM1[Matsuura,Y；Possee,RD；Overton,HA和Bishop,DHL(1987),J.Gen.Virol.68,1233-1250]中，将该蛋白的表达置于多角体蛋白启动子的控制之下。通过同源重组，将该单位插入Sf21昆虫细胞中的杆状病毒基因组中，以产生用于α链的单重组杆状病毒。Summers MDD和Smith GE(1987)[A Manual of Methodsfor Baculovirus Vectors and Insect CellCulture Procedures；Texas Agricultural Experiment Station,Bulletin No.1555]全面描述了用于培养和感染昆虫细胞、用于同源重组和监测/分离重组病毒的技术。同样，在所述文献中可容易地得到用来构建所述重组载体的分子遗传技术，Sambrook,J；Fritsch,EF和Maniatis T,(1989)[分子克隆，实验室手册，第二版.冷泉港实验室出版社]最全面地描述了这些技术。
为了产生双重组杆状病毒，将编码β链的cDNA克隆到转移载体pAcUW1[Weyer,U；Knight,S和Possee,RD(1990)J.Gen.Virol.,71,1525-1534]中，以将该蛋白的表达置于P10启动子的控制之下。然后将该单位插入携带α链的单重组杆状病毒的基因组中。通过将用从所述转染物中随机挑选的病毒感染的昆虫细胞点在膜上，将其与例如L243的单克隆抗体反应，检测双重组病毒，所述L243特异性地识别HLA-DR异二聚体。采用在所述文献中容易得到的标准流式细胞仪技术检测该抗体与Sf21昆虫细胞的结合。噬斑纯化表达HLA-DR的稳定的双重组杆状病毒。(ⅱ)从昆虫细胞纯化HLA-DR所用方法为Gorga等1987(Gorga等，1987.J.Biol.Chem.262,16087-16094)所述方法的修改方法。通过用特氟隆玻璃匀浆器进行10个冲程匀化，将表达HLA-DR的杆状病毒/Sf21细胞(10L，大约等于2×1010细胞)溶于100ml 5mM EDTA(钠盐)、50mM Tris-HCl pH8.5、2％NP40、150nM NaCl、1mM碘乙酰胺、1mM PMSF中。将匀浆液以100,000g离心1小时，收集上清液。将以50mg L243对10ml A蛋白-快速琼脂糖(Sepharose fast flow)(Pharmacia)的比率共价偶联并与10mM Tris-HCl pH8.0、0.1％NP-40预孵育的抗HLA-DR单克隆抗体LB3.1(Gorga等1986,Cell.Immunol.103,160-172)与所述上清液孵育过夜。然后将该树脂放入柱中，用10mM Tris-HCl pH8.0、0.01％NP-40(20个柱体积)洗涤，然后用0.15M NaCl、50nM Na2HPO4pH7.0、1％辛基葡糖苷(20个柱体积)洗涤。用50mM二乙胺pH11.0、0.15M NaCl、1％辛基葡糖苷洗脱HLA-DR。柱流分立即用1MTris-HCl pH8.0中和，并通过centricon-10膜超速离心浓缩。通过BCA蛋白测定(Pierce)测定蛋白含量，通过SDA-PAGE电泳测定纯度。
一般而言，在试验A中测试的以上定义的式Ⅰ肽衍生物在大约10μM或低得多的浓度下表现出显著的抑制。
本发明另一优选的方面包括不与HLA-DR3结合而与HLA-DR1和/或HLA-DR4Dw4和/或HLA-DR4Dw14结合的式Ⅰ肽衍生物或其药学上可接受的盐。HLA-DR3为与类风湿性关节炎无关的普通HLA-DR等位基因。因此，在携带HLA-DR3作为其中一个等位基因的类风湿性关节炎病人(大约为总的类风湿性关节炎病人中的三分之一)中。这种式Ⅰ肽衍生物不干扰HLA-DR3在宿主防御功能中的正常作用。因此，由于使用这种肽衍生物导致的免疫抑制低于用非选择性DR结合物发生的免疫抑制，用这种肽衍生物对于治疗类风湿性关节炎病人特别有利。
作为试验A的变体，如下评价本发明肽与一种或多种HLA-DR分子结合的能力(ⅰ)从细胞系中纯化HLA-DR类型所用方法为Gorga等(1987.J.Biol.Chem.262,16087-16094)所述方法的修改方法。通过免疫亲和色析从不同的细胞系纯化人HLA-DR抗原。简单地说，用特氟隆玻璃匀浆器进行10个冲程的匀化，将1×109-5×109选自Hom2(DR1来源)、BBF(DR2来源)、AVL-B(DR3来源)、JAH(DR4Dw4来源)、JHAF(DR4Dw13来源)或PE117(DR4Dw14)的合适细胞系的沉淀细胞于大约4℃溶于50ml的5mMEDTA(钠盐)、50mM Tris-HCl pH7.4、2％NP40、150mM NaCl、1mM碘乙酰胺、1mM PMSF中。将匀浆液以100,000g离心1小时，收集上清液。将共价偶联到CNBr-Sepharose 4B(Pharmacia)上的抗HLA-DR单克隆抗体LB3.1(Gorga等1986,Cell.Immunol.103,160-173)与150mM NaCl、50mM Tris-HCl pH7.4、0.1％NP-40预平衡，并与所述上清液孵育过夜。然后将该树脂装入柱中，用0.15M NaCl、50mM Tris-HCl pH7.4、1％辛基葡糖苷(20个柱体积)洗涤。用50mM二乙胺pH11.0、0.15M NaCl、1％辛基葡糖苷洗脱出所述HLA-DR。柱流分立即用0.5M HEPES NaOH pH7.4中和。通过Biorad蛋白测定法测定蛋白含量，通过SDS-PAGE电泳测定纯度。(ⅱ)肽的选择性结合测试将磷酸缓冲盐水(PBS)中的200nM生物素-FHA307-320在具有或不具有测定缓冲液(PBS,0.01％NP40(Sigma))中的抑制肽的V形孔微量滴定板(Nunc)中或者与纯化的HLA-DR1、DR2、DR4Dw4、DR4Dw13或者与DR4Dw14(2-20μg/ml)孵育。对于DR3抑制而言，将400nM生物素-Ahx-(D)Ala-Ala-Ala-Che-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Leu-Lys-Ala-Ala-(D)Ala-OH与纯化的DR3(20μg/ml)一起孵育并按上述孵育。48小时后，处理所述孵育物，按试验A中所述取吸收读数。采用PC上的Microcal Origin软件计算肽的抑制活性，以IC50值表示。
试验B:T细胞激活的体外抑制。(该测试可以用来证明式Ⅰ肽衍生物抑制通过MHCⅡ类分子介导的T细胞免疫应答的能力)。
测试抑制肽阻断B52.24鼠T细胞杂交瘤系对由HLA-DR4Dw4分子提呈的FHA307-320肽(H-Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Th-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Gly-OH)反应的刺激的能力。通过按Woods等(1994)(J.Exp.Med.180,173-181)概述的，并按照Current Protocols inImmunology，第2卷，7.21中给出的用于产生T细胞杂交瘤的通用方法，将取自FHA307-320免疫的HLA-DR4Dw4转基因小鼠(国际专利申请公开号WO95/03331)的淋巴结T细胞与BW5147鼠T细胞淋巴瘤系(White等(1989)J.Immunol.143,1822)融合，生产B52.24。
通过在96孔微量滴定板(Nunc)中的PRM1-1640培养基(Gibco)中稀释，将浓度为100-0.1μM(或更低)的抑制肽与或者浓度为100-1.0μM或者为10μM固定浓度的抗原肽FHA307-320混合，最终体积为100μl。通过在1％戊二醛(Sigma)中悬浮，用戊二醛以4×106细胞/ml将诸如JAH EBV转化类淋巴母细胞细胞系(欧洲培养物保藏中心ECACC85102909)的表达HLA-DR4Dw4的B细胞、或取自HLA-DR4Dw4纯合个体并用EB病毒按照Current Procotols in Immunology 7.22.1中所述方法转化的B细胞固定30秒，此后，加入等体积的200mM赖氨酸(Sigma)3分钟。通过以300g离心收集细胞，在PRMI-1640中洗涤，以每孔2×105细胞浓度加入含有抗原和抑制化合物的微量滴定板中。将所述微量滴定板于37℃和5％CO2下孵育2小时。
然后通过以300g离心并吸出2次，将所述微量滴定板在PRMI-1640中洗涤，然后加入培养基(PRMI-1640,10％胎牛血清(Gibco)和2mM谷氨酰胺(Gibco))中的每孔105细胞的B52.24T细胞杂交瘤系。然后将微量滴定板于37℃和5％CO2下再孵育2天。然后将所述板以300g离心10分钟，从所有孔取出150μl上清液，在生物测试IL-2含量之前于-20℃冷冻。
将含待分析上清液的培养板于室温下放置解冻，将100ml上清液转移至新的96孔圆底板中。用培养基(PRMI-1640(Gibco)、10％胎牛血清(Advanced Protein Products)、100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素(Gibco)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)和50μM 2-巯基乙醇(Sigma))将IL-2进行1∶1连续稀释，产生最后的250单位/ml-0.04单位/ml IL-2的标准曲线。收集诸如CTLL-2细胞(Nature(1977)268 154-156)或HT-2细胞(J.Immunol.Methods(1987)94-104)的IL-2依赖性细胞系，在以5×104细胞/ml再悬浮之前，用培养基洗涤2次。向标准曲线样品和测试样品的每孔中加入100μl IL-2依赖性细胞悬浮液。将培养板于37℃和5％CO2下孵育72小时。此后，每孔加入20μl(1mCi)3H-胸苷(Amersham International)，将所述板放回培养箱中16小时。在玻璃纤维滤垫(filter mat)上收获每板的内容物，用β板(betaplate)闪烁计数器测定放射活性。
一般而言，在试验B中测试的以上定义的式Ⅰ肽衍生物在大约10μM或低得多的浓度下表现出显著的抑制。
试验C:BALB/C小鼠中肽刺激的DTH(迟发型超敏反应)。(该试验可以用来证明式Ⅰ肽衍生物在动物模型中的体内活性)。用0.1ml与弗氏完全佐剂(Sgima)1∶1(v/v)混合的卵清蛋白(Sigma)(盐水中2mg/ml)乳液在每组5只的Balb/c雌性小鼠(18-20g)的胁腹皮下免疫。7天后，用双径卡尺测微计(dual caliper micrometer)测量爪垫的厚度，然后在一只后爪垫足底下注射30μl盐水中的1％热聚集卵清蛋白进行激发。抗原激发后24小时，测量爪垫，按与对侧对照爪垫相比，以注射爪垫的爪垫厚度增加的百分比计算DTH反应。通过在抗原激发前24小时植入的3天微型渗透泵(Alzet)给与抑制剂，剂量范围为10mg/kg/天-0.1μg/kg/天。通过用给与溶媒的对照减去抑制剂处理的爪垫的肿胀值，除以该对照值再乘以100％，计算抑制程度。
一般而言，在试验C中测试的以上定义的式Ⅰ肽衍生物在大约1mg/kg/天或低得多的剂量下表现出显著的抑制，而没有任何明显的毒理学作用或其它不适当的药理学作用。
试验D(该测试可以用来证明式Ⅰ肽衍生物在关节炎动物模型中的体内活性)。
通过皮下注射0.1ml含等体积盐水中2mg/ml甲基化牛血清白蛋白(met-BSA,Sigma)和弗氏完全佐剂(Sigma)的乳液，在第0天免疫Balb/c雌性小鼠(19-21g,5-10/组)，并在第7天加强，所述弗氏完全佐剂补充2.5m/ml结核分支杆菌(MTB，菌株C、DT和PN、MAFF,Weybridge,Surrey)，因此产生的MTB终浓度为3.5mg/ml。同时腹膜内注射另外0.1ml盐水中的109百日咳杆菌生物(Wellcome Pertussis疫苗)。14天后，用30号针头和hamilton注射器，在一个膝关节内注射含100ug met-BSA的10μl盐水激发动物。对侧膝盖注射相似体积的盐水用作对照。13天后，通过用双径卡尺测微计测量，测定与双膝相关的炎症/肿胀程度。通过用平头剪刀和镊子，在所述膝盖上下大约5mm的皮肤做一切口并继续沿该膝盖侧，形成一片，然后将其小心地切下，暴露下面的关节来做到这一点。保持在固定位置中的弯曲肢上测量该膝盖水平面的最宽部分。按照下式计算与对照相比注射抗原膝盖中炎症增加的百分比[注射抗原的膝盖厚度-注射盐水的膝盖厚度/注射盐水的膝盖厚度]×100。采用抗原激发前24小时植入的14天微型渗透泵(Alzet)给与抑制剂，其剂量范围为10mg/kg/天-0.1ug/kg/天。从给与溶媒的对照的肿胀值减去抑制剂处理组的肿胀值，除以对照值再乘以100，计算炎症/肿胀的抑制百分比。疾病的其它评价包括1)在用苏木精和曙红染色的固定膝盖切片上进行炎症、滑膜炎和软骨/骨侵蚀的组织学评价，以及2)测定血清中的急性相反应物、血清淀粉状蛋白P和/或触珠蛋白水平。
以上定义的式Ⅰ肽衍生物在试验D中在大约10mg/kg/天或低得多的剂量下可以表现出显著的抑制。
通过说明特定的式Ⅰ肽衍生物的药理学活性，实施例3和实施例6的化合物在不高于0.1微摩尔的浓度下表现出与试验A(或上文所述试验A的变体)中的HLA-DR4Dw4显著结合，在试验C中在＜0.1mg/kg/天下有活性。实施例3的化合物也表现出与HLA-DR4Dw14显著结合，但用实施例3或实施例6化合物没有发现与HLA-DR1、HLA-DR2或HLA-DR3显著结合(IC50＞100微摩尔)。提取的聚合物贮存制剂形式的两种化合物在pH3和pH7.6下都表现出良好的水稳定性，表现出最低限度的由挤压降解引起的损失和从这种贮存制剂中释放时最低限度的降解。
用本领域已知的可用于类似肽合成的肽化学的任何方法制备式Ⅰ的肽衍生物。
例如可以用Atherton和Sheppard的“Solid Phase Peptide Synthesis:Apractical approach”(由牛津大学出版社的IRL出版社出版，1989)中公开的类似方法，获得式Ⅰ的肽衍生物。Stewart和Young(由PierceChemical Company,Illinois出版，1984)的“Solid Phase PeptideSynthesis”、“Principles of Peptide Synthesis”(由Springer-Verlag,Berlin出版，1984)和一系列书“Amino Acids,Peptides and Proteins”(第1-25卷；1994年出版的第25卷)(由the Royal Society of Chemistry,Cambridge,UK出版)。
最好是，通过固相连续合成制备式Ⅰ的肽衍生物。采用该技术，保护待成为该肽C末端氨基酸的氨基酸的α-氨基，必要时保护侧链中的氨基，将所述氨基酸偶联到固相载体上，所述固相载体如果在裂解后需要游离羧酸，则例如为2-氯三苯甲基氯树脂或Merrifield树脂(氯甲基聚苯乙烯-二乙烯基苯)，或如果裂解后需要甲酰胺，则为Rink酰胺树脂(4-(2’,4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧基树脂)或Rink酰胺MBHA树脂(N-(4-[2’,4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧基乙酰胺基-正亮氨酰基)-4-甲基二苯甲胺树脂(所有都可得自Calbiochem-Novabiochem)，此后除去α-氨基上的保护基团。保护待连接到C末端氨基酸的氨基酸的α-氨基，必要时保护侧链中的氨基，将所述氨基酸偶联到仍连接到该固相载体上的碳末端氨基酸上。重复所述α-氨基的去保护和偶联下一个氨基酸的分步过程，产生连接到该固相载体上的保护或未保护的多肽。例如，按所述实施例中所述或按下文的流程Ⅰ中说明的方法，或与其类似的方法，采用对称或非对称的式R1R2NH胺，可以获得式Ⅱ的保护氨基酸。可以通过本领域已知的方法，例如所述实施例中所述的或在下文流程2中说明的方法，或与其类似的方法，获得式R1R2NH胺。用来进行流程1和2反应步骤的试剂和条件是本领域已知的，并在标准教科书中进行了描述，所述反应步骤诸如为醇类和胺类的烷基化、胺和羧酸形成酰胺的偶联、形成脲和氨基甲酸酯和保护基团的保护和去保护。采用适当保护的(3-氨基-2-氧代-吡咯烷-1-基)链烷酸(对于含Ⅲ的肽化合物，其中A=亚甲基)，或按J.Med.Chem.,1993,36,256-263中所述方法或通过与其类似的方法获得的相应的氧杂类似物(对于其中A为氧的含Ⅲ肽化合物)，或(6-氧代-1,7-二氮杂螺[4.4]壬-7-基)链烷酸(对于含Ⅳ的肽化合物)取代保护的氨基酸，将式Ⅲ或Ⅴ的基团加入该序列中。采用按J.Med.Chem.,1993,36,256-263中所述方法(或通过与其类似的方法)或按下文实施例中所述方法(或与其类似的方法)获得的适当保护的3-氨基-2-氧代全氢化吖庚因-1-链烷酸，可以将式Ⅴ的基团加入该序列中。用标准方法，例如采用三氟乙酸、三乙基硅烷和水的混合物，从该固相载体释放所述保护或未保护的多肽。
应该认识到，可以在用来从该固相载体释放该多肽的条件下裂解侧链保护基团，或可以在从该固相载体释放该多肽之前或之后作为单独的步骤进行裂解。也应该认识到，可以通过在具体的偶联步骤中采用2个或多个适当保护的氨基酸的序列，修改构建该多肽的方法。该合成可以采用人工技术或例如采用Applied Biosystems 431A或430A肽合成仪、Advanced Chemtech ACT357肽合成仪或相似的自动肽合成仪自动进行，或可以采用两种技术的组合。
在装配所述肽期间，用各种官能团保护不参加所述反应的氨基酸官能团。例如采用9-芴基甲酯基(Fmoc)、叔丁酯基(Boc)、联苯基异丙酯基(Bpoc)、2-[3,5-二甲氧基苯基]丙-2-酯基(Ddz)、金刚烷酯基(Adoc)、烯丙酯基(Aloc)、2,2,2-三氯乙酯基(Troc)、苄酯基和各种取代苄酯基保护N-末端和侧链的氨基。需要时，可以用标准技术(例如酸或碱处理、催化氢解和Pd(O)处理或锌/乙酸处理)裂解这些保护基团。
用来保护含有精氨酸残基的肽中侧链胍基的合适的保护基团包括硝基、金刚烷酯基、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基(Mtr)、2,2,5,7,8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)和(尤其是)2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)。
用来保护侧链羟基的合适的保护基团包括叔丁基、苄基和三苯甲基(Trt)。用于含组氨酸残基肽的侧链咪唑基的合适的保护基团包括三苯甲基、苄基、甲苯磺酰基、二硝基苯基、Adoc、Boc或Fmoc基团。
用来保护侧链羧基的合适的保护基团包括各种酯(例如甲酯、乙酯、叔丁酯、苄酯、硝基苄酯、烯丙酯和9-芴基甲酯)。
进行保护基团裂解反应的温度可以为4-40℃(最好在周围温度下或其附近)，时间为10分钟至24小时。
用来偶联所述各个氨基酸的合适的偶联方法包括常用的叠氮化物、对称酸酐、混合酐和各种活性酯和碳二亚胺。在各种碳二亚胺的情况下(例如二环己基-碳二亚胺或二异丙基-碳二亚胺)，也可以加入多种添加剂(例如1-羟基苯并三唑(HOBT)和N-羟基琥珀酰亚胺)。另外，通过采用多种其它试剂，例如六氟磷酸1H-苯并三唑-1-基-氧代-三吡咯烷基(pyrrolidino)鏻(PyBOP)、四氟硼酸(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓(uronium)(TBTU)和四氟硼酸(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓(HBTU)。进行所述偶联反应的温度为-20℃至40℃，时间为10分钟至24小时。进行所述偶联反应的合适介质包括例如N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。特别合适的方法包括使用DMF中的HBTU、HOBT和二异丙基乙胺。
在本文引用的国际专利申请中例举了肽合成的这些方法和其它方法。为式R-、R.CO-、R.SO2-、RO.CO-、R.NHCO-、R.O.CS-、R.S.CO-、R.NHCS-、R.S.CS-和R.CS-基团(或作为P末端氨基上的取代基存在的基团，这里P为疏水氨基酸或带有其它氨基酸的疏水氨基酸)的疏水残基P可以作为最后一步，通过烷基化、酰化或其它末端氨基的标准官能团修饰而加入。当需要C末端修饰(以获得特定的Q的特定有用基团)时，它们可以在合成所述肽后，采用常规的官能团修饰进行。或者，可以通过适当选择最初的起始树脂和/或首先偶联到该树脂上的保护的实体(例如通过采用适当保护的式H-Q的基团)，获得Q特定的有用基团。下文的实施例中提供制备Ⅰ肽化合物的典型实例。
测定本发明肽衍生物稳定性的典型方法如下，其中为了最大限度地减小微生物污染和降解，用来制备肽溶液的所有设备都在高压灭菌器中灭菌，所有材料的转移都在Ⅱ类层流室中进行。采用无菌0.22μm的过滤装置和20ml注射器，将大约20ml pH3或pH7.6、含0.02％叠氮化钠的McIlvaine氏柠檬酸-磷酸盐缓冲液过滤到50ml瓶中。在带盖管制瓶中精确地称量大约1.2mg肽。用无菌移液吸头，将足够的缓冲液加入该管制瓶的所述肽中，使得肽浓度为0.1mg/ml。将该管制瓶盖上盖子，震荡以溶解该肽。采用无菌移液吸头，将大约1ml的数等份所述肽溶液转移到10个HPLC管制瓶中，然后将管制瓶盖上盖子。将5个管制瓶贮存于-18℃,5个管制瓶贮存于37℃。在初始和于-18和37℃贮存1、2、3和4周后，在每个时间点用含有双份样品注射液的新管制瓶，采用合适的标准品，通过HPLC测定该溶液肽峰的面积。从每个时间点所述肽峰面积与初始面积之比，测定于37℃贮存后在每个时间点的剩余肽百分比。优选的本发明肽衍生物在于37℃、pH3和pH7.6贮存后，剩余的肽高于90％，最好高于95％。
正如药学领域众所周知的，一般为了治疗或预防，将药用组合物形式的式Ⅰ肽衍生物给与需要这种治疗的温血动物(包括人类)。
按照本发明的另一特征，提供药用组合物，它包含式Ⅰ的肽衍生物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的稀释剂或载体。
所述药用组合物可以采用适于口服使用的形式，例如片剂、胶囊、水溶液或油溶液、悬浮液或乳液；适于鼻使用的形式，例如为嗅剂、喷鼻剂或滴鼻剂；适于阴道或直肠使用的形式，例如为栓剂；适于吸入给药的形式，例如为细粉末或液体气雾剂；适于舌下或颊使用的形式，例如为片剂或胶囊；或适于胃肠外使用(包括静脉内、皮下、肌内、血管内或输注)的形式，例如为无菌水溶液或油溶液或悬浮液。所述组合物可以采用适于局部给药的形式，例如为乳油、膏剂和凝胶。也设想皮肤贴剂。在Comprehensive Medicinal Chemistry，第5卷，第25.2章(Hansch等编辑，Pergamon Press 1990)中描述了一般的制剂。
一般而言，可以采用常规赋形剂，以常规方式制备以上组合物。然而，在口服给药组合物的情况下，所述组合物包含包衣以保护所述多肽活性组分不受胃中酶作用可能是便利的。
优选的本发明组合物是适于口服的单位剂量形式的组合物，例如每单位剂量含有2.5-500mg，最好含有10-100mg多肽的片剂或胶囊；或适于胃肠外给药的组合物，它每毫升含有0.5-100mg多肽，最好每毫升含有1-10mg多肽。
胃肠外组合物最好为等渗盐水中的溶液或等渗葡萄糖缓冲的溶液，必要时pH为5-9。或者，所述胃肠外组合物可以为设计用于缓释的组合物，在这种情况下，每单位剂量的多肽量一般高于所用常规注射制剂所需的量。优选的缓释制剂为连续释放制剂，例如欧洲专利说明书58481号中描述类型的制剂，或对于含至少一个碱性基团的式Ⅰ肽衍生物而言，为国际专利申请公开号WO93/24150中所述的制剂。本发明的某些肽衍生物具有溶解度特性，使得它们特别适于缓释胃肠外制剂、特别是含有诸如聚交酯的生物可降解聚酯制剂的生产和加工，也适于提供具有有益释放分布的缓释制剂。此外，含有一个或多个碱性基团、特别是精氨酸的本发明肽衍生物，也可以与诸如聚交酯的酸封端聚酯形成肽-聚合物盐，这类肽和肽-聚合物盐构成了本发明的另一方面。某些这类盐具有溶解度特性，使得它们特别适于例如WO93/24150中所述的缓释胃肠外制剂的生产和加工，也适于提供具有有益释放分布和贮存稳定性特性的缓释制剂。优选的缓释胃肠外制剂每单位剂量含有1-100mg(诸如5-50mg)多肽。优选的缓释胃肠外制剂也是设计在至少5天内缓释的制剂。
本发明的优选肽衍生物包括采用挤压聚合物贮存(depot)制剂时表现出最小的挤压时降解损失的那些肽衍生物，或从这种贮存制剂释放时表现出最少降解的肽衍生物。测定本发明肽降解水平的典型方法如下肽的挤压聚合物贮存制剂的制备精确称量大约20mg肽，加入足够的聚合物(50/50％(摩尔)聚(D,L-乳酸/乙醇酸)共聚物产生大约20％(w/w)的混合物，其中所述共聚物的重均分子量通过大小排阻色谱测定相对聚苯乙烯标准物大约为20kD，多分散性大约为1.7。将其溶于无酸酐的冰醋酸中，产生大约10％(w/v)的溶液。将该溶液冷冻干燥，将产生的冷冻干燥产物在使用前真空下贮存。
将大约100mg冷冻干燥材料加到小型实验室挤压机机筒中，压下柱塞以凝固该样品。将挤压机加热至90-95℃，于该温度保持10分钟，然后在压力下挤出所述冷冻干燥材料，产生直径大约为1mm的圆柱形挤出物。肽的挤压聚合物贮存制剂的肽含量分析精确称量2个大约长5mm的含肽的挤压聚合物贮存制剂，将每个制剂在单独的25ml量瓶中溶于1ml无酸酐冰醋酸。大约1.5小时后，将每个制剂的体积用蒸馏水加至25ml，使得所述聚合物沉淀。用0.5μm Millex PTFE滤器滤出所述固体，并收集溶液A。
由0.5mg/ml的蒸馏水中的肽贮液和2.5mg/ml的无酸酐冰醋酸中的聚合物贮液，用蒸馏水将每种溶液制成10ml，如下制备一系列标准溶液
将每种标准物通过5μm Millex PTFE滤器过滤，将采用双份样品注射，通过HPLC分析连同数等份溶液A的一等份滤液。由溶液A中肽的浓度计算挤压聚合物贮存肽制剂的肽含量，溶液A的肽浓度通过将溶液A的所述肽峰面积与所述标准溶液的所述肽峰面积比较而测定。优选的本发明肽衍生物表现出最少的挤压降解损失，因此所述挤压聚合物贮存制剂的肽含量接近大约20％(w/v)的理论值。
体外由挤压聚合物贮存物释放时肽的降解将含有0.02％叠氮化钠的pH7.6 McIlvaine氏柠檬酸-磷酸盐缓冲液的溶液通过0.22μ滤器过滤，并于4℃下贮存。将大约10mg含肽挤压聚合物贮存物置于2个小管制瓶中，加入2ml所述缓冲液。然后给管制瓶加盖，于37℃水浴中贮存1个月。在1个月内的适当时间点，从每个管制瓶中取出三等份各0.6ml的释放介质，在通过HPLC分析之前，或者通过HPLC分析或者于-18℃冷冻贮存在HPLC管制瓶中。将1.8ml所述缓冲液加入每个含所述贮存物的管制瓶中，以取代在每个时间点已经取出的释放介质。
采用双份样品注射，通过HPLC，将所述释放介质中的肽峰面积与已知肽浓度的标准缓冲液的肽峰面积相比，测定每个时间点所述释放介质中完整肽的平均量。通过HPLC，将所述释放介质中的其它新峰面积与已经肽浓度的标准缓冲液的肽峰面积相比，并且假定该消光系数未改变，测定每个时间点所述释放介质中肽降解产物的大致平均量。由每个时间点所述释放介质中完整肽和肽降解产物的量确定完整肽和总肽(完整肽和肽降解产物)的体外平均累积释放分布。优选的本发明肽衍生物表现出体外释放时最小的降解，并由此表现出于37℃下在pH7.6的McIlvaine氏缓冲液中体外释放1个月后，总肽降解产物低于总肽的10％，最好低于5％。
本发明的组合物一般给与人类，使得例如对于70kg病人而言，日剂量为10微克至5000mg，最好为0.1-100mg，必要时以均分量给与。按照医学领域熟知的原则，给与的组合物的准确量和给药途径和形式可以取决于待治疗病人的体重、年龄和性别，取决于待治疗的特定疾病或症状极其严重性。
为了治疗和预防，也可能最好将式Ⅰ的肽衍生物或其药学上可接受的盐与一种或多种其它药物一起给与，所述药物是本领域一般已知可以治疗或减轻一种或多种上文提到的疾病或病况的症状(或作为疾病改善剂)的药物，诸如NSAID(诸如布洛芬或炎痛喜康)、镇痛药(诸如对乙酰氨基酚)、皮质类固醇、肌松药、脂氧合酶抑制剂、甲胺蝶呤、硫唑嘌呤、D-青霉胺、环胞菌素A或单克隆抗体疗法(诸如抗CD-4或抗THF)。在糖尿病中，所述肽化合物可以与胰岛素或其它用于糖尿病或糖尿病并发症的其它疗法(诸如醛糖还原酶抑制剂)一起共同给与。应该理解，这种联合疗法构成本发明的另一方面。
按照本发明的另一方面，提供治疗MHCⅡ类依赖性T细胞介导的自身免疫疾病或炎症性疾病的方法，所述疾病例如本文提到的一种或多种疾病或病况，该方法包括给与需要这种治疗的温血哺乳动物(包括人类)有效量的式Ⅰ肽衍生物或其药学上可接受的盐。本发明也提供式Ⅰ肽衍生物或其药学上可接受的盐在生产用于治疗MHCⅡ类依赖性T细胞介导的自身免疫疾病或炎症性疾病的药物中的用途。
除上述在人类医疗中的用途外，式Ⅰ肽衍生物也可用于影响有经济价值的温血动物的相似疾病的兽医治疗中，所述动物诸如狗、猫、马和牛。对于这种治疗而言，式Ⅰ的肽衍生物一般以类似于上述用于给与人类的量和方式给与。在开发用于评价MHCⅡ类分子在实验室动物(诸如猫、狗、兔、猴、大鼠和小鼠)中的作用的试验系统并将其标准化中作为药理学工具及作为继续寻找新的、改进治疗剂或作为诊断试剂，式Ⅰ的肽衍生物也是有价值的。
现在将通过以下非限制性实施例说明本发明，其中，除非另外陈述，否则(ⅰ)通过真空旋转蒸发进行浓缩和蒸发；(ⅱ)于18-26℃的室温下进行操作；(ⅲ)给出收率时，仅仅是为了帮助读者，不必是通过努力可得到的最大值；(ⅳ)使用以下缩写(以及在流程1和流程2中)Phv=5-苯基戊酰基；Boc=叔丁酯基；tBu=叔丁基；DMF=N,N-二甲基亚砜；HOBT=1-羟基苯并三唑；Met=甲硫氨酸；Fmoc=9-芴基甲酯基；Fmoc-Pip-OH=N-(9-芴基甲酯基)哌啶-4-甲酸；Fmoc-Papa-OH=4-[N-(9-芴基甲酯基)氨基]苯乙酸；Z或CbZ=苄酯基；Pmc=2,2,5,7,8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基；Pbf=2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基；Trt=三苯甲基；THF=四氢呋喃；DMSO=二甲基亚砜；HBTU=六氟磷酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓；DIPEA=二异丙基乙胺；TFA=三氟乙酸；HPLC=高压液相色谱；以及RP-HPLC=反相高压液相色谱(除非另外陈述，否则在Vydac C18柱218TP54,4.6×250mm上进行)；(ⅴ)在得自德国E Merck,Darmstadt的Merck Kiesegel 60(Art No.9385)上进行快速层析和硅胶层析；(ⅵ)1H NHR谱用四甲基硅烷(TMS)作为内标，在CDCl3或d6-二甲基亚砜(d6-DMSO)中于200Mhz下测定，并以相对于TMS的每百万中的份数表示化学位移(δ)值，采用命名主峰的常规缩写s，单峰；m，多重峰；t，三峰；br，宽峰，d，双峰；(ⅶ)用以下Fmoc保护的氨基酸介绍Lys、Thr、Arg或His残基对于Lys:Fmoc-Lys(Boc)-OH；对于Thr:Fmoc-Thr-(OtBu)-OH；对于Arg:Fmoc-Arg(Pmc)-OH或Fmoc-Arg(Pbf)-OH；及对于His:Fmoc-His(Trt)-OH；(ⅷ)式中出现-Ⅱ-时，这是指下文提出的式Ⅱ的L-氨基酸残基，n、X、R1和R2的特定值已给出；以及(ⅸ)式中出现-Ⅲa-时，这是指下文提出的式Ⅲa基团。实施例1制备Phv-Ala-Ala-Ala-Ⅱ-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH2(SEQ ID NO:1)(式Ⅱ:n=1；X=羰基；R1=R2=-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3)1.1 N2-(9-芴基甲酯基)-N4,N4-双(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)-L-天冬酰胺的制备
(a)在氮气下，将1-溴-2-(2-甲氧基乙氧基)乙烷(30g)加入四氢呋喃(100ml)中的N-苄基二乙醇胺(10g)中。然后分次加入氢化钠(5.3g 60％的矿物油中的分散液)，同时在水浴中冷却。加入完成后，将该混合物搅拌2小时，再分次加入氢化钠(4.4g 60％的矿物油中的分散液)。然后，让该混合物于周围温度下搅拌16小时。小心地将水(50ml)加入该反应混合物中，以破坏过量的氢化钠，蒸发该混合物，以除去有机溶剂。将水(100ml)加入该残余物中，用浓盐酸将该混合物酸化至大约pH2，然后用乙醚(2×100ml)萃取。弃去萃取液。然后，加入浓氢氧化钠液，将水层调至大约pH12，用乙醚(2×150ml)萃取。合并醚萃取液，用盐水洗涤、干燥(MgSO4)并蒸发至干。通过硅胶层析，采用用浓氨水饱和的氯仿→5％甲醇/氯仿的梯度纯化该残余物。收集适当的流分，将其蒸发至干，产生胶状物(12g)。加入甲醇(100ml)，然后加入10％碳钯(2.5g)和甲酸铵(7.2g)，在氮气、60℃下搅拌该混合物1小时。然后将该混合物冷却、过滤并蒸发至干。通过硅胶层析，采用浓氨水饱和的氯仿→10％甲醇/氯仿的梯度纯化该残余物。收集适当的流分，将其合并蒸发至干，产生作为胶状物的N,N-双(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)胺(7.1g)；NMR(CDCl3):2.8(m,4H),3.3(s,6H),3.45(m,4H),3.6(m,16H)。
(b)边搅拌边将N-甲基吗啉(1.6g)、N-叔丁酯基-L-天冬氨酸α-苄酯(2.6g)、羟基苯并三唑(2.16g)和盐酸1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(1.68g)加入二甲基甲酰胺(12ml)中的N,N-双(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)胺(2.5g)中。将该混合物搅拌16小时，然后加入到水(50ml)中的2％乙酸中。用乙醚(2×50ml)萃取该混合物，合并的有机相用碳酸氢钠溶液洗涤并干燥(MgSO4)。通过蒸发除去挥发性物质，产生作为胶状物的N2-叔丁酯基-N4,N4-双(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)-L-天冬酰胺α-苄酯(2.8g)；NMR(CDCl3):1.4(s,9H),2.9(m,1H),3.2(m,1H),3.4(s,6H),3.6(m,24H),4.6(m,1H),5.2(q,2H),5.8(d,1H),7.4(s,5H)。
(c)将10％钯碳(0.8g)和环己烯(1.6g)加入N2-叔丁酯基-N4,N4-双(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)-L-天冬酰胺α-苄酯(2.6g)的甲醇(20ml)溶液中，将该混合物于55℃加热2小时。然后将该混合物冷却、过滤并蒸发。将丙酮(20ml)和水(8ml)加入该残余物中，加入浓盐酸(2ml)。将该混合物于55℃加热1小时，冷却并用过量的固体碳酸氢钠调至大约pH7。加入碳酸9-芴基甲基琥珀酰亚胺基(succinimidyl)酯(1.36g)，将混合物搅拌16小时。通过蒸发除去挥发性物质，在水(25ml)和乙醚(50ml)之间分配该残余物。分离水层，用浓盐酸将其酸化至大约pH3。然后用二氯甲烷(50ml)萃取该混合物。有机萃取液用水洗涤、干燥(硫酸镁)并蒸发，产生作为胶状物的N2-(9-芴基甲酯基)-N4,N4-双(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)-L-天冬酰胺[下文称为Fmoc-Asp(PE)-OH](2g)；NMR(CDCl3):2.8(q,1H),3.4(q,1H),3.4(s,6H),3.6(m,24H),4.2-4.6(m,4H),6.3(d,1H),7-42(m,4H),7.6(m,2H),7.8(d,2H)。1.2 Phv-Ala-Ala-Ala-Ⅱ-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH2的制备(式Ⅱ:n=1；X=羰基；R1=R2=-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3)通过Fmoc固相合成，由Fmoc Rink酰胺MBHA树脂(Novabiochem,0.50g,0.25mmole)开始，通过混合物的自动合成和手动合成，用Bond Elut管(Varian,15ml，底部备有滤器)制备所述肽。
首先采用ABI431自动肽合成仪，通过按照厂商建议的如下的用于引入HBTU/HOBT化学的单酰化条件，用Fmoc-Pip-OH(353mg,1mmole)、Fmoc-Ala-OH(311mg,1mmole)、Fmoc-Ala-OH(311mg,1mmole)、Fmoc-Ala-OH(311mg,1mmole)和Fmoc-Val-OH(339mg,1mmole)去保护该树脂并且连续偶联和去保护，获得Fmoc-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH-树脂。去保护后，该树脂用DMF(10×10-20ml)洗涤。用DMF中的HBTU(1当量)、HOBT(1当量)和DIPEA(2当量)活化该羧酸(1mmole)约11分钟，然后将其转移至该树脂上。酰化进行大约60分钟，然后该树脂用DMF(10×10-20ml)洗涤。每个阶段的Fmoc去保护用DMF中的20％哌啶溶液(用5ml处理2次，每次10分钟)进行。每次去保护后，用DMF(5×10ml)彻底洗涤该树脂。
手动相继偶联并去保护该序列中剩余的残基。加入合适的N-Fmoc-保护的氨基酸(1mmole)、DMF(1.5ml)、HOBT(165mg,1mmole)和二异丙基碳二亚胺(155微升，1mmole)溶液至该树脂中进行偶联。该偶联物放置大约30分钟，用DMF(5×10ml)洗涤，用Kaiser试验(E.Kaiser等，(1970),Anal.Biochem.34,595)检查该树脂小部分的偶联完成情况。按上述进行去保护。这样，将Fmoc-Asp(PE)-OH(323mg,0.5mmole)、Fmoc-Ala-OH(311mg,1mmole)、Fmoc-Ala-OH(311mg,1mmole)、Fmoc-Ala-OH(311mg,1mmole)和5-苯基戊酸(178mg,1mmole)连续偶联到该树脂上。该苯戊酸需要双偶联，以获得Kaiser试验阳性结果。
用三氟乙酸(7.9ml)和三乙基硅烷(0.395ml)的混合物，从该树脂裂解该肽。2小时后，用二氯甲烷(大约150ml)洗涤该树脂，将产生的溶液蒸发至干。产生的固体在乙醚(25ml)和水(25ml)之间分配，然后用另外数份水(2×25ml)萃取该乙醚。将水相合并并冷冻干燥。
用制备型RP-HPLC(Vydac 218TP1022柱，250mm×22mm)，将10ml 20％乙腈/水中的粗物质上柱，纯化该粗产物。用含0.1％TFA的乙腈-水梯度，以12ml/分钟的流速进行洗脱。合并含产物的部分，将其冷冻干燥，产生白色固体的Phv-Ala-Ala-Ala-Ⅱ-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH2(其中Ⅱ为式ⅡL-氨基酸的残基，其中n=1；X=羰基；R1=R2=-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3)(83mg)。
该产物通过HPLC、质谱和氨基酸分析鉴定如下。
RP-HPLC(Vydac C18柱，218TP54,4.6×250mm，用含0.1％TFA的乙腈和水洗脱，在30分钟内采用10-50％乙腈的梯度，流速为1.0ml/min)，表明纯度为94％，保留时间为23.29分钟。
质谱，m/e(ES+)1220.7(MH+)。
氨基酸分析(用含1％苯酚的6N HCl溶液于130℃酸水解24小时)产生Ala5.82,Val0.98,Asp1.19。
通过类似于E.Atherton和R.C.Sheppard所述(“Solid phase peptidesynthesis:a practical approach”,IRL press,1989，第51页)用于N-Fmoc-L-甲硫氨酸方法的方法获得Fmoc-Pip-OH。
Fmoc-Pip-OH:NMR(DMSO-d6)1.3(m,2H),1.7(m,2H),2.5(m,2H),2.9(t,2H),3.7(m,1H),4.2(t,1H),4.4(d,2H),7.4(m,4H),7.7(d,2H),7.9(d,2H)；质谱m/e(ES+)352.2(MH+)实施例2制备Phv-Ⅱ-Ala-Ala-Lys-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH2(SEQ ID NO:2)(式Ⅱ:n=1；X=羰基；R1=R2=-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3)
采用类似于实施例1.2所述的方法,通过将Fmoc-Lys(Boc)-OH(468mg,1mmole)、Fmoc-Ala-OH(311mg,1mmole)、Fmoc-Ala-OH(311mg,1mmole)、Fmoc-Asp(PE)-OH(323mg,0.5mmole)和5-苯基戊酸(178mg,1mmole)连续偶联(手动)到Fmoc-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH-树脂(采用手动偶联获得的)上，进行该合成。用与实施例1所述的相似的条件，从该树脂上裂解该肽并纯化该粗产物。该产物通过HPLC、质谱和氨基酸分析鉴定如下。
RP-HPLC(30分钟内的20-50％乙腈的梯度，流速为1.0ml/min)的保留时间为16.4分钟。
质谱，m/e(ES+)1277.8(MH+)。
氨基酸分析给出Asp1.07,Lys1.05,Ala4.9,Val0.92。实施例3制备Phv-Ala-Arg-Ala-Ⅱ-Thr-Ⅲa-Ala-Papa-NH2(SEQ ID NO:3)(式Ⅱ:n=1；X=羰基；R1=R2=-CH2CON(CH2CH2OCH3)2)3.1 N2-(9-芴基甲酯基)-N4,N4-双(2-甲氧基乙基)氨基甲酰基甲基]-L-天冬酰胺的制备
(a)将N-甲基吗啉(2g)、羟基苯并三唑(4g)、双(2-甲氧基乙基)胺(3.5g)和盐酸1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(3.8g)加入二甲基甲酰胺(15ml)中的N-(苄酯基)亚氨基二乙酸(2.7g)中，将该混合物搅拌16小时。通过蒸发除去挥发性物质，将该残余物在水和二氯甲烷之间分配。用水洗涤有机萃取液、干燥(硫酸镁)并蒸发。通过硅胶层析，采用氯仿→10％甲醇/氯仿的梯度纯化该残余物，产生作为胶状物的N-(苄酯基)亚氨基二-[N,N-双(2-甲氧基乙基)]乙酰胺(2.3g)；NMR(d6-DMSO):3.1-3.4(由于旋转异构体有4个单峰，12H),3.5(m,16H),4.2(s,4H),5.05(s,2H),7.3(m,5H)。(b)将10％钯碳(0.2g)和环己烯(2ml)加入N-(苄酯基)亚氨基二-[N,N-双(2-甲氧基乙基)]乙酰胺(3.5g)的乙醇(20ml)溶液中，在氮气下将该混合物于55℃搅拌4小时。然后将该反应混合物冷却、过滤并蒸发。边搅拌边将N-甲基吗啉(1.4g)、羟基苯并三唑(1.85g)、N-叔丁酯基-L-天冬氨酸α-苄酯(2.4g)和盐酸1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(1.6g)加入在二甲基甲酰胺(15ml)中的该残余物溶液中。将该混合物搅拌16小时，然后加入到含2％乙酸的水溶液(50ml)中，用乙醚(2×50ml)萃取。将合并的有机萃取液用碳酸氢钠溶液洗涤、干燥(硫酸镁)并蒸发，产生作为胶状物的N2-叔丁酯基-N4,N4-双[N,N-双(2-甲氧基乙基)氨基甲酰基甲基]-L-天冬酰胺α-苄酯(4.1g)；NMR(d6-DMSO):1.4(s,9H),2.6(m,2H),3.2(由于旋转异构体产生的重叠单峰，12H),3.4(m,16H),4.0-4.4(m,5H),5.1(s,2H),6.8(d,1H),7.4(s,5H)。(c)采用类似于实施例1的(c)部分所述的步骤，但采用N2-叔丁酯基-N4,N4-双[N,N-双(2-甲氧基乙基)氨基甲酰基甲基]-L-天冬酰胺α-苄酯(4g)作为原料，因此获得作为胶状物的N2-(9-芴基甲酯基)-N4,N4-双[N,N-双(2-甲氧基乙基)氨基甲酰基甲基]-L-天冬酰胺(下文称为FMoc-Asp(TE)-OH)(3g)；NMR(CDCl3):2.8(m,1H),3.1(m,1H),3.3(由于旋转异构体产生的重叠单峰，12H),3.6(m,16H),4.2-4.8(m,8H),6.4(d,1H),7.4(m,4H),7.6(d,2H),7.8(d,2H)。3.2 Phv-Ala-Arg-Ala-Ⅱ-Thr-Ⅲa-Ala-Papa-NH2的制备(式Ⅱ:n=1；X=羰基；R1=R2=-CH2CON(CH2CH2OCH3)2)采用类似于实施例1.2所述的方法，通过用Fmoc-Papa-OH、Fmoc-Ala-OH、(2S)-[(3R)-3-(N-9-芴基甲酯基氨基)-2-氧代-吡咯烷-1-基]丙酸(Fmoc-Ⅲa-OH)、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(TE)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH和5-苯基戊酸在适当的偶联阶段去保护该树脂并且连续偶联和去保护，进行该合成，所有步骤都手动进行。该产物通过HPLC、质谱和氨基酸分析鉴定如下。
RP-HPLC(30分钟内的10-50％乙腈的梯度，流速为1.0ml/min)保留时间为21.88分钟。
质谱，m/e(ES+)1395.8(MH+)。
氨基酸分析给出Asp1.04,Thr0.93,Ala3.12,Arg0.92。
通过类似于E.Atherton和R.C.Sheppard所述(“Solid phase peptidesynthesis:a practical approach”,IRL press,1989，第51页)用于N-Fmoc-L-甲硫氨酸方法的方法获得Fmoc-Papa-OHFmoc-Papa-OH:NMR(DMSO-d6)3.5(s,2H),4.25(t,1H),4.5(d,2H),7.1(d,2H),7.4(m,6H),7.75(d,2H),7.9(d,2H),9.6(s,1H)；质谱m/e(ES-)372.1(M-H)-如下获得(2S)-2-[(3R)-3-(N-[9-芴基甲酯基]氨基)-2-氧代-吡咯烷-1-基]丙酸(Fmoc-Ⅲa-OH):(Ⅰ)Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe的合成
将N-甲基吗啉(5.6g)、盐酸L-丙氨酸甲酯(3.9g)、HOBt(4.6g)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(5.3g)加入在干燥DMF(50ml)中的Boc-(D)-甲硫氨酸(7g,0.028mol)的溶液中。搅拌该混合物过夜。通过蒸发除去溶剂，将该残余物在二氯甲烷(100ml)和5％乙酸水溶液(50ml)之间分配。放置时，HOBt结晶，并通过过滤将其除去，分离有机层，用碳酸氢钠水溶液洗涤、干燥(硫酸镁)并蒸发。通过在烧结玻璃漏斗中的快速色谱，用二氯甲烷和乙醚(0-100％乙醚)的混合物洗脱，纯化该残余物(8.5g)。合并并蒸发含产物的部分，产生放置时结晶的作为胶状物的Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe(7.2g)；NMR(CDCl3):1.4(d,3H),1.45(s,9H),1.95(m,1H),2.1(s,3H),2.1(m,1H),2.6(m,2H),3.75(s,3H)4.3(bs,1H),4.6(m,1H),5.3(m,1H),6.9(bs,1H)。(ⅱ)(2S)-2-[(3R)-3-(N-[叔丁酯基]氨基)-2-氧代-吡咯烷-1-基]丙酸甲酯的合成
注意该反应必须在干燥条件下用干燥溶剂进行，否则将发生差向异构。将甲基碘(10ml)加入含Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe(8g)的DMF(20ml)和二氯甲烷(20ml)的混合物中，将该混合物静置16小时，然后蒸发至干。再加入二氯甲烷(2×50ml)，蒸发除去残留的甲基碘，将该残余物溶于DMF(300ml)和二氯甲烷(300ml)的混合物中。将该混合物冷却至～5℃，一次性加入氢化钠(0.76g 80％的矿物油中的分散体)，于该温度下将该混合物搅拌2小时。加入饱和氯化铵溶液(50ml)，将该混合物蒸发至干，然后在水和乙醚之间分配。乙醚萃取液用盐水洗涤，干燥并蒸发，产生的胶状物通过在烧结漏斗上进行快速色谱进行纯化(25％乙酸乙酯∶己烷至100％乙酸乙酯)，产生静置时结晶的作为胶状物的(2S)-2-[(3R)-3-(N-[叔丁酯基]氨基)-2-氧代-吡咯烷-1-基]丙酸甲酯(4.2g):NMR(CDCl3):1.4(s,9H),1.4(d,3H),1.8(m,1H),2.6(m,1H),3.4(m,2H),3.7(m,3H),4.2(m,1H),4.9(q,1H),5.2(bs,1H)。(ⅲ)(2S)-2-[(3R)-3-(N-[9-芴基甲酯基]氨基)-2-氧代-吡咯烷-1-基]丙酸(Fmoc-Ⅲa-OH)的合成
将(2S)-2-[(3R)-3-(N-[叔丁酯基]氨基)-2-氧代-吡咯烷-1-基]丙酸甲酯(4g)在丙酮(60ml)、水(40ml)和浓盐酸(24ml)的混合物中回流3小时，然后将该混合物蒸发至干。加入水，重复蒸发。将该残余物溶于水(15ml)中，加入过量的固体碳酸氢钠。加入含9-芴基甲基琥珀酰亚胺基碳酸酯(5.2g)的丙酮(30ml)。将该混合物搅拌16小时，然后蒸发除去溶剂，将该残余物在水和乙醚之间分配。分离水层，用盐酸将其pH调至～3，用二氯甲烷萃取。有机层用水洗涤，干燥(硫酸镁)并蒸发，产生白色泡沫，用乙醚研磨结晶，产生(2S)-2-[(3R)-3-(N-[9-芴基甲酯基]氨基)-2-氧代-吡咯烷-1-基]丙酸(4.2g)白色固体，熔点191-3℃(分解)；NMR(CDCl3):1.4(d,3H),2.0(m,1H),2.6(m,1H),3.4(m,2H),4.2(t,1H),4.4(m,3H),4,9(m,1H),5.8(bs,1H),7.4(m,4H),7.6(d,2H),7.7(d,2H)。实施例4制备Phv-Ala-Ala-Ala-Ⅱ-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH2(SEQ ID NO:4)(式Ⅱ:n=1；X=羰基；R1=R2=-CH2CON(CH2CH2OCH3)2)采用与实施例2所述方法相似的方法，在适当的偶联阶段用Fmoc-Asp(TE)-OH代替Fmoc-Asp(PE)-OH，进行该合成。该产物通过HPLC、质谱和氨基酸分析鉴定如下。
RP-HPLC(30分钟内的10-50％乙腈的梯度，流速为1.0ml/分钟)保留时间=23.9分钟。
质谱，m/e(ES+)1274.7(MH+)。
氨基酸分析给出Asp1.03,Ala5,94,Val0.98。实施例5制备Phv-Arg-Ala-Ala-Ⅲa-Ala-Ⅱ-Ala-Papa-NH2(SEQ ID NO:5)(式Ⅱ:n=1；X=羰基；R1=R2=-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3)采用与实施例1.2所述方法相似的方法，通过连续偶联和去保护(手动)Fmoc-Papa-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(PE)-OH、Fmoc-A1a-OH、Fmoc-Ⅲa-OH、Fmoc-Ala-OH(2次)、Fmoc-Arg(Pbf)-OH和5-苯基戊酸，然后从该树脂上裂解，通过制备型RP-HPLC进行纯化。该产物通过HPLC、质谱和氨基酸分析鉴定如下。
RP-HPLC(30分钟内的10-50％乙腈的梯度，流速为1.0ml/分钟)保留时间=20.45分钟。
质谱，m/e(ES+)656.4(M+2H++)。
氨基酸分析给出Arg1.06,(Ala+Ⅲa)4.85,Asp1.09实施例6制备Phv-Arg-Ala-Ala-Ⅱ-Thr-Ⅲa-Ala-Papa-NH2(SEQ ID NO:6)(式Ⅱ:n=1；X=羰基；R1=R2=CH2CON[(CH2CH2O)3CH3]26.1 N2-(9-芴基甲酯基)-N4,N4-双[N,N-双(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)氨基甲酰基甲基]-L-天冬酰胺的制备
采用类似于实施例3.1中所述的步骤，制备Fmoc-Asp(TE)-OH，但在部分(a)中用按比例量的双(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)胺代替双(2-甲氧基乙基)胺，由此获得作为油的N2-(9-芴基甲酯基)-N4,N4-双[N,N-双(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)氨基甲酰基甲基]-L-天冬酰胺(下文称为Fmoc-Asp(TPE)-OH；NMR(CDCl3):2.9(m,1H),3.1(m,1H),3.4(m,12H),3.6(m,48H),4.2-4.6(m,8H),7.4(m,4H),7.6(m,2H),7.8(d,2H)。
进行步骤(a)和(b)时分别获得以下中间产物N-(苄酯基)亚氨基二-[N,N-双(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)]-乙酰胺；NMR(CDCl3):3.4(m,12H),3.6(m,48H),4.3(s,2H),4.4(s,2H),5.05(s,2H),7.3(s,5H)。
N2-叔丁酯基-N4,N4-双[N,N-双(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)氨基甲酰基甲基]-L-天冬酰胺α-苄酯；NMR(CDCl3):1.9(s,9H),2.7(m,1H),3.05(m,1H),3.4(m,12H),3.6(m,48H),4.4(m,5H),5.2(s,2H),5.9(bd,1H),7.4(m,5H)。6.2 Phv-Arg-Ala-Ala-Ⅱ-Thr-Ⅲa-Ala-Papa-NH2的制备(式Ⅱ:n=1；X=羰基；R1=R2=-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3)采用类似于实施例1.2所述的方法，通过连续偶联和去保护(手动)Fmoc-Papa-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ⅲa-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(TPE)-OH、Fmoc-Ala-OH(2次)、Fmoc-Arg(Pbf)-OH和5-苯基戊酸，然后从该树脂上裂解，通过制备型RP-HPLC纯化，进行该合成。该产物通过HPLC、质谱和氨基酸分析鉴定如下。
RP-HPLC(30分钟内的10-50％乙腈的梯度，流速为1.0ml/分钟)保留时间为23.61分钟。
质谱，m/e(ES+)1748.0(MH+)。
氨基酸分析给出Arg1.01,Ala3.18,Ⅲa1.05,Asp0.97,Thr0.78实施例7制备Phv-Ala-Ala-Ala-Ⅱ-Thr-Pro-Arg-Gly-Papa-NH2(SEQ ID NO:7)(式Ⅱ:n=1；X=羰基；R1=R2=-CH2CON(CH2CH2OCH3)2)采用类似于实施例1.2所述的方法，通过连续偶联和去保护(手动)Fmoc-Papa-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(TE)-OH、Fmoc-Ala-OH(3次)和5-苯基戊酸，然后从该树脂上裂解，通过制备型RP-HPLC纯化，进行该合成。该产物通过HPLC、质谱和氨基酸分析鉴定如下。
RP-HPLC(30分钟内的20-50％乙腈的梯度，流速为1.0ml/分钟)保留时间为16.07分钟。
质谱，m/e(ES+)1395.7(MH+)。
氨基酸分析给出Arg1.01,Ala3.06,Asp1.02,Thr0.92,Pro0.92,Gly1.05实施例8制备Phv-Ⅱ-Arg-Ala-His-Val-Ⅲa-Ala-Papa-NH2(SEQ ID NO:8)(式Ⅱ:n=2；X=羰基；R1=R2=-CH2CON(CH2CH2OCH3)2)8.1 N2-(9-芴基甲酯基)-N4,N4-双[N,N-双(2-甲氧基乙基)氨基甲酰基甲基]-L-谷氨酰胺的制备
采用类似于实施例3.1中所述的步骤，制备Fmoc-Asp(TE)-OH，但在部分(b)中用按比例量的N-叔丁酯基-L-谷氨酸α-苄酯代替N-叔丁酯基-L-天冬氨酸α-苄酯，由此获得作为油的N2-(9-芴基甲酯基)-N4,N4-双[N,N-双(2-甲氧基乙基)氨基甲酰基甲基]-L-谷氨酰胺(下文称为Fmoc-Glu(TE)-OH)；NMR(CDCl3):2.0-2.4(m,4H),3.3(m,12H),3.5(m,16H),4.2-4.6(m,8H),7.4(m,4H),7.6(m,2H),7.8(d,2H)。
进行步骤(b)时获得以下中间产物作为胶状物的N2-叔丁酯基-N4,N4-双[N,N-双(2-甲氧基乙基)氨基甲酰基甲基]-L-谷氨酰胺α-苄酯；NMR(CDCl3):1.4(s,9H),2.0(m,1H),2.2(m,1H),2.4(m,2H),3.3(s,12H),3.5(m,16H),4.1-4.5(m,5H),5.2(s,2H),7.3(s,5H)。8.2 Phv-Ⅱ-Arg-Ala-His-Val-Ⅲa-A1a-Papa-NH2的制备(式Ⅱ:n=2；X=羰基；R1=R2=-CH2CON(CH2CH2OCH3)2)采用类似于实施例1.2所述的方法，通过连续偶联和去保护(手动)Fmoc-Papa-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ⅲa-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(TE)-OH和5-苯基戊酸，然后从该树脂上裂解，通过制备型RP-HPLC纯化，进行该合成。该产物通过HPLC、质谱和氨基酸分析鉴定如下。
RP-HPLC(30分钟内的10-50％乙腈的梯度，流速为1.0ml/分钟)保留时间=22.23分钟。
质谱，m/e(ES+)1472.2(MH+)。
氨基酸分析给出Arg0.95,Ala2.17,His0.98,Glu0.99,Val0.92,Ⅲa0.96实施例9对于治疗和预防使用，将常规药用组合物形式的本发明化合物给与诸如人类的温血动物，其典型实例包括以下内容注射液将0.01-100mg活性组分溶于多至2ml的含水注射溶媒中，使活性组分的浓度为0.01-100mg/ml。所述含水注射溶媒用药学上可接受的缓冲液(例如磷酸盐或乙酸盐)缓冲至pH5-8，该溶液含有加入以达到等渗性的药学上可接受的张力调节剂(例如氯化钠或葡萄糖)。该溶媒也可任选地含有其它药学上可接受的赋形剂，诸如增溶剂(例如DMSO、乙醇、丙二醇或聚乙二醇)、防腐剂和抗氧化剂。所述活性组分通常可以是上文描述的实例，可以便利地以药学上可接受的盐形式存在。注释(1)对于含式Ⅳ基团的肽而言，可以如下获得(S)-2-[1-(9-芴基甲酯基)-6-氧代-1,7-二氮杂螺[4.4]壬-7-基]丙酸(Fmoc-Ⅳ-OH)(ⅰ)(RS)-2-烯丙基-N-(苄酯基)脯氨酸的合成
在氮气下，于-78℃将含N-苄酯基脯氨酸甲酯(13g)的THF(20ml)滴加到二异丙基氨化锂(27.5ml,2M在己烷/THF中的THF(100ml)的溶液中)。将该混合物搅拌30分钟，然后滴加烯丙基碘(5.5ml)，将该化合物再搅拌30分钟，然后让其温热至周围温度。然后将该混合物加入到氯化铵水溶液(200ml)中，用乙醚(2×200ml)萃取。蒸发乙醚层，采用己烷→20％乙酸乙酯∶己烷的梯度，通过硅胶层析纯化该残余物。将合适的部分蒸发至干，产生作为油的(RS)-2-烯丙基-N-(苄酯基)脯氨酸甲酯(9g)。
将8.5g该物质溶于甲醇(40ml)，加入水(20ml)中的氢氧化钠(4.5g)，将该化合物回流60分钟。然后用浓盐酸将该混合物的pH调至7，通过蒸发除去甲醇。将该混合物的pH调至3，用乙醚(2×50ml)萃取该混合物。蒸发合并的乙醚萃取液，产生作为胶状物的(RS)-2-烯丙基-N-(苄酯基)脯氨酸；NMR(d6-DMSO(373K)):1.9(m,2H),2.1(m,2H),2.6(q,1H),2.9(q,1H),3.4(m,1H),3.6(m,1H),5.0(m,4H),5.75(m,1H),7.3(m,5H).(ⅱ)[(RS)-2-烯丙基-N-(苄酯基)]脯氨酰-(S)-丙氨酸甲酯的合成
将HOBt(7.7g)、N-甲基吗啉(6.6g)、盐酸L-丙氨酸甲酯(4.5g)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺(5.7g)加入含(RS)-2-烯丙基-N-(苄酯基)脯氨酸(6.5g)的DMF(30ml)中，将该混合物搅拌18小时，然后蒸发。将该残余物在乙醚和水之间分配，过滤除去HOBt，并分离有机层。蒸发有机层，采用己烷中20％乙酸乙酯增至己烷中50％乙酸乙酯的梯度，通过硅胶层析纯化该残余物。合并适当的部分并蒸发至干，产生[(RS)-2-烯丙基-N-(苄酯基)]脯氨酰-(S)-丙氨酸甲酯(7g)；NMR(d6-DMSO(373K))由于非对映异构体的混合物使得峰有某些加倍，1.25和1.3(2d,3H),1.75,(m,2H),2.2(m,2H),2.65(m,1H),2.9(m,1H),3.4(m,1H),3.65(2s,3H),3.7(m,1H),4.3(2q,1H),5.0(m,4H),5.7(m,1H),7.3(m,5H),7.4和7.5(bs,1H)。(ⅲ)(S)-2-(1-苄酯基-6-氧代-1,7-二氮杂螺[4.4]壬-7-基]丙酸甲酯的合成。(CbZ-Ⅳ-OMe)
将四氧化锇(1.5ml 4％的水溶液)加入含[(RS)-2-烯丙基-N-(苄酯基)]脯氨酰-(S)-丙氨酸甲酯(1.45g)的乙醇(30ml)和水(20ml)的混合物中。在氩气下将该混合物搅拌10分钟，然后分次加入高碘酸钠(2.45g)。将该混合物搅拌2小时，然后加入水(100ml)，用乙酸乙酯(2×70ml)萃取该混合物。干燥并蒸发合并的萃取液，产生1.4g胶状物。将该胶状物溶于二氯甲烷(30ml)和三乙基硅烷(0.65g)中，然后滴加三氟乙酸(4g)。将该混合物搅拌3小时，蒸发，将该残余物在碳酸氢钠溶液和乙醚之间分配。分离乙醚萃取液，将其蒸发至干。采用己烷中25％乙酸乙酯增至100％乙酸乙酯的梯度，通过硅胶层析纯化该残余物。合并适当的部分并蒸发至干，产生(S)-2-(1-苄酯基-6-氧代-1,7-二氮杂螺[4.4]壬-7-基]丙酸甲酯(0.8g)；NMR(d6-DMSO(373K))由于非对映异构体的混合物使得峰有某些加倍，1.25和1.35(2d,3H),1.95(m,6H),3.1-3.5(m,4H),3.6和3.65(2s,3H),4.5和4.65(2q,1H),5.05(m,2H),7.25(m,5H)。(ⅳ)(S)-2-(6-氧代-1,7-二氮杂螺[4.4]壬-7-基]丙酸(H-Ⅳ-OH)的合成
将碳酸钾(2.5g)加入含(S)-2-(1-苄酯基-6-氧代-1,7-二氮杂螺[4.4]壬-7-基)丙酸甲酯(3.3g)的甲醇(40ml)和水(40ml)的混合物中，将该混合物于周围温度下搅拌10小时。用浓盐酸将pH调至～5，将该混合物蒸发至干。将该残余物溶于水(40ml)中，用浓盐酸将pH调至3。然后用二氯甲烷(2×50ml)萃取该混合物。将合并的萃取液干燥(硫酸镁)并蒸发，产生泡沫物(2.8g)。将该泡沫物溶于甲醇(20ml)中，加入环己烯(0.7g)，然后加入10％Pd/C(0.5g)。该混合物回流2小时，冷却，过滤，将滤液蒸发，产生作为泡沫物的(S)-2-(6-氧代-1,7-二氮杂螺[4.4]壬-7-基]丙酸(1.9g)；NMR(d6-DMSO)由于非对映异构体的混合物使得峰有某些加倍，1.25和1.3(2s,3H),1.8(m,4H),2.0(m,2H),3.0(m,2H),3.3(m,2H),4.5(m,1H)。(ⅴ)(S)-2-[1-(9-芴基甲酯基)-6-氧代-1,7-二氮杂螺[4.4]壬-7-基]丙酸(Fmoc-Ⅳ-OH)的合成
将过量的固体碳酸氢钠加入含(S)-2-(6-氧代-1,7-二氮杂螺[4.4]壬-7-基]丙酸(0.42g)的水(2ml)中，然后加入含9-芴基甲基琥珀酰亚胺基碳酸酯(0.7g)的丙酮(3ml)。将该混合物搅拌18小时。然后将该混合物加入水(10ml)中，用乙醚(10ml)萃取，并分离水层。(弃去乙醚萃取液)。用浓盐酸将水层的pH调至～3，然后用二氯甲烷(2×10ml)将其萃取。分离合并的萃取液，干燥(硫酸镁)并蒸发，产生作为白色泡沫物的(S)-2-[1-(9-芴基甲酯基)-6-氧代-1,7-二氮杂螺[4.4]壬-7-基]丙酸(0.62g)；NMR(d6-DMSO(373K))由于非对映异构体的混合物使得峰有某些加倍，1.3(2d,3H),1.6-2.0(m,6H),3.05(m,1H),3.2-3.45(m,3H),4.2-4.4(m,1H),4.5(m,1H),6.2(s,2H),7.35(m,4H),7.8(m,4H)。(2)对于含式Ⅴa基团的化合物而言，可以如下获得(3S)-3-(9-芴基甲酯基氨基)-2-氧代全氢化吖庚因-1-乙酸(Fmoc-Ⅴa-OH)(ⅰ)将(3S)-3-氨基-ε-己内酰胺(25g)和三乙胺(19.7g)溶于THF(200ml)中，并冷却至5℃。在30分钟内滴加含氯甲酸苄酯(33g)的THF(50ml)。将该反应混合物于周围温度下搅拌18小时，然后倒入水(500ml)中。该反应混合物用乙酸乙酯(3×100ml)萃取。将合并的萃取液干燥(硫酸镁)并蒸发。用乙醚(40ml)研磨该残余物，将其过滤，产生作为白色固体的20g的(S)-3-苄酯基氨基-ε-己内酰胺；NMR(d6-DMSO):1.1-2(m,6H),2.9-3.2(m,2H),4.1-4.25(m,1H),5.0(s,2H),7.25-7.4(m,5H),7.75(t,1H)。(ⅱ)在氩气流下，将氢化钠(2g)在DMF(100ml)中的混合物冷却至0℃。在20分钟内分次加入(3S)-3-苄酯基氨基-ε-己内酰胺(10g)，其加入速率为使该反应温度保持低于5℃。于0℃继续搅拌40分钟，然后在10分钟内滴加溴乙酸叔丁酯(8.2g)。将该反应混合物于0℃搅拌1小时，于周围温度下再搅拌18小时。将该反应混合物倒入水(600ml)中，用乙酸乙酯(6×75ml)萃取。合并的萃取液用水(3×100ml)洗涤，干燥(硫酸镁)并蒸发。通过硅胶MPLC，用20％乙酸乙酯/二氯甲烷洗脱，纯化该残余物，产生作为透明油的(3S)-3-苄酯基氨基-2-氧代全氢化吖庚因-1-乙酸叔丁酯(15g)；NMR(d6-DMSO):1.4(s,9H),1.5-1.9(m,6H),3.5-3.65(m,1H),3.9-4.15(m,2H),4.4(m,1H),5.0(s,2H),7.1(d,1H),7.35(m,5H)；质谱，m/e(ES+)377(MH+)。(ⅲ)将(3S)-3-苄酯基氨基-2-氧代全氢化吖庚因-1-乙酸叔丁酯(15g)溶于乙醇(150ml)中，用氩气清洗。加入10％钯碳(1.5g)，排空该烧瓶，由气囊将其充满氢气。该反应混合物于周围温度下搅拌4小时。然后用氩气清洗该反应混合物，并通过硅藻土过滤。蒸发该滤液，产生作为粘性油的(3S)-3-氨基-2-氧代全氢化吖庚因-1-乙酸叔丁酯(7.7g)；NMR(CDCl3):1.45(s,9H),1.55-2.05(m,6H),3.2-3.3(d,1H),3.55-3.75(两个重叠双峰，2H),3.95-4.25(q,2H)；质谱，m/e(ES+)243.2(MH+)。(ⅳ)将含(3S)-3-氨基-2-氧代全氢化吖庚因-1-乙酸叔丁酯(7g)的THF(50me)加入含碳酸钠(3g)的水(30ml)溶液中。然后在30分钟内，边搅拌边滴加含N-(9-芴基甲酯基氧基)琥珀酰亚胺(9.7g)的THF(100ml)的溶液中。于周围温度下将该反应混合物再搅拌30分钟。加入水(200ml)，用乙酸乙酯(3×100ml)萃取该反应混合物。将合并的萃取液用盐水(100ml)洗涤，干燥(硫酸镁)并蒸发。通过硅胶MPLC，最初用二氯甲烷，然后逐渐增至15％乙酸乙酯/二氯甲烷进行洗脱，来纯化该残余物，产生作为透明油的(3S)-3-(9-芴基甲酯基氨基)-2-氧代全氢化吖庚因-1-乙酸叔丁酯(10.9g)；NMR(d6-DMSO):1.45(s,9H),1.5-2.15(m,6H),3.1-3.25(m,1H),3.6-3.75(m,1H),4.0-4.5(m,5H),6.25(d,1H),7.25-7.45(m,4H),7.6(d,2H),7.75(d,2H)；质谱，m/e(ES+)465.2(MH+)。(ⅴ)将(3S)-3-(9-芴基甲酯基氨基)-2-氧代全氢化吖庚因-1-乙酸叔丁酯(10.5g)溶于二氯甲烷(30ml)中，加入三氟乙酸(20ml)。将该反应混合物于周围温度下搅拌18小时。加入二氯甲烷(100ml)用水(4×100ml)洗涤该反应混合物，将其干燥(硫酸镁)并蒸发。通过硅胶MPLC，用25％乙酸乙酯/二氯甲烷洗脱，然后用乙酸乙酯洗脱纯化残留物，产生油。用异己烷研磨，产生白色泡沫物，将其过滤并于60℃真空干燥，产生(3S)-3-(9-芴基甲酯基氨基)-2-氧代全氢化吖庚因-1-乙酸(5.5g)；NMR(d6-DMSO):1.4-1.95(m,1H),3.15-3.4(m,1H),3.55-3.7(m,1H),3.9-4.2(m,2H),4,25-4.45(m,2H),7.15(d,1H),7.25-7.45(m,4H),7.75(m,2H),7,85(d,2H)；质谱，m/e(ES-)407.1(M-H-)。
化学式P-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-Q 1
Ⅱ
Ⅲ
Ⅲa
Ⅳ
Ⅳa
Ⅴ
Ⅴa
序列表(1)一般资料(ⅰ)申请人(A)姓名ZENECA LIMITED(B)街道15 STANHOPE GATE(C)城市伦敦(E)国家英国(F)邮编(ZIP):W1Y 6LN(G)电话0171304 5000(H)传真0171304 5151(I)电传0171834 2042(ⅱ)发明名称肽衍生物(ⅲ)序列数8(ⅳ)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)(ⅵ)在先申请数据(A)申请号GB 9611881.5(B)提交日期1996年6月7日(ⅵ)在先申请数据
(A)申请号GB 9622890.3(B)提交日期1996年11月2日(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1(D)其它信息/产物=“其它”/注释=“5-苯基戊酰基-Ala”(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置4(D)其它信息/产物=“其它”/注释=“[N4,N4-双(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)]-Asn”(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽
(B)位置8(D)其它信息/产物=“其它”/注释=“Ala-哌啶-4-甲酰胺”(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:1:
Xaa Ala Ala Xaa Val Ala Ala Xaa1 5(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1(D)其它信息/产物=“其它”/注释=“5-苯基戊酰基-[N4,N4-双(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)]-Asn”(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置8
(D)其它信息/产物=“其它”/注释=“Ala-哌啶-4-甲酰胺”(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:2:
Xaa Ala Ala Lys Val Ala Ala Xaa1 5(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1(D)其它信息/产物=“其它”/注释=“5-苯基戊酰基-Ala”(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置4(D)其它信息/产物=“其它”
/注释=“(N4,N4-双[N,N-双(2-甲氧基乙基)氨基甲酰基甲基])-Asn”(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置6(D)其它信息/产物=“其它”/注释=“[(S)-2-((R)-3-氨基-2-氧代吡咯烷-1-基)丙酰基]-Ala-4-氨苯基乙酰胺”(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:3:
Xaa Arg Ala Xaa Thr Xaa1 5(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1
(D)其它信息/产物=“其它”/注释=“5-苯基戊酰基-Ala”(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置4(D)其它信息/产物=“其它”/注释=“(N4,N4-双[N,N-双(2-甲氧基乙基)氨基甲酰基甲基])-Asn”(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置8(D)其它信息/产物=“其它”/注释=“Ala-哌啶-4-甲酰胺”(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:4:
Xaa Ala Ala Xaa Val Ala Ala Xaa1 5(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链
(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1(D)其它信息/产物=“其它”/注释=“5-苯基戊酰基-Arg”(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置4(D)其它信息/产物=“其它”/注释=“[(S)-2-((R)-3-氨基-2-氧代吡咯烷-1-基)丙酰基]-Ala”(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置5(D)其它信息/产物=“其它”/注释=“[N4,N4-双(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)]-Asn”(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置6(D)其它信息/产物=“其它”
/注释=“Ala-4-氨基苯基乙酰胺”(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:5:
Xaa Ala Ala Xaa Xaa Xaa1 5(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1(D)其它信息/产物=“其它”/注释=“5-苯基戊酰基-Arg”(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置4(D)其它信息/产物=“其它”/注释=“(N4,N4-双[N,N-双(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)氨基甲酰基甲基])-Asn”(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置6(D)其它信息/产物=“其它”/注释=“[(S)-2-((R)-3-氨基-2-氧代吡咯烷-1-基)丙酰基]-Ala-4-氨基苯基乙酰胺”(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:6:
Xaa Ala Ala Xaa Thr Xaa1 5(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1(D)其它信息/产物=“其它”
/注释=“5-苯基戊酰基-Ala”(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置4(D)其它信息/产物=“其它”/注释=“(N4,N4-双[N,N-双(2-甲氧基乙基)氨基甲酰基甲基])-Asn”(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置8(D)其它信息/产物=“其它”/注释=“Gly-4-氨基苯基乙酰胺”(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:7:
Xaa Ala Ala Xaa Thr Pro Arg Xaa1 5(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽
(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1(D)其它信息/产物=“其它”/注释=“5-苯基戊酰基-(N4,N4-双[N,N-双(2-甲氧基乙基)氨基甲酰基甲基])-Gln”(ⅸ)特征(A)名称/关键词肽(B)位置6(D)其它信息/产物=“其它”/注释=“[(S)-2-((R)-3-氨基-2-氧代吡咯烷-1-基)丙酰基]-Ala-4-氨基苯基乙酰胺”(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:8:
Xaa Arg Ala His Val Xaa1 权利要求
1．式IP-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-Q的肽衍生物或其药学上可接受的盐，其中P为疏水残基；AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6、AA7和AA8为L-氨基酸残基，其中AA1、AA4和AA7的1个、2个或3个选自式Ⅱ的L-氨基酸残基，
其中n为1、2、3或4的整数；X为-NH-CO-、-CO-或-O.CO-；R1和R2选自(A)、(B)和(C)，其中(A)为式-(CH2)a-CO-N(R3)(R4)的基团，其中a为1或2的整数，R3和R4独立地选自-[(CH2)bO]m-Ra的基团，其中Ra为甲基或乙基，而m为1、2、3、4或5的整数；当m为1时，b为2或3，而当m为2、3、4或5时，每个-(CH2)bO-单位的b值独立地选自2和3；(B)为式-(CH2)c-O(CH2)d-CO-N(R5)(R6)的基团，其中c为2或3的整数，d为1、2或3的整数，而R5和R6独立地选自基团-[(CH2)eO]p-Rb，其中Rb为甲基或乙基，p为1、2、3、4或5的整数；当p为1时，e为2或3，而当p为2、3、4或5时，每个-(CH2)eO-单位中的e值独立地选自2和3；以及(C)为式-[(CH2)f-O]g-R7的基团，其中R7为甲基或乙基，而g为1、2、3、4或5的整数；当g为1时，f为2或3，而当g为2、3、4或5时，每个-(CH2)fO-单位中的f值独立地选自2和3；或AA1、AA2、AA3、AA6、AA7和AA8为L-氨基酸残基，其中AA1和AA7的一个或两个选自以上定义的式Ⅱ的L-氨基酸残基，并且AA4和AA5一起形成式Ⅲ、Ⅲa、Ⅳ、Ⅳa、Ⅴ或Ⅴa的基团，
Ⅲ
Ⅲa
Ⅳ
Ⅳa
Ⅴ
Ⅴa其中Ra、Rb和Rz独立地选自氢和(1-4C)烷基，而A为氧或亚甲基；或AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA8为L-氨基酸残基，其中AA1和AA4的一个或两个选自以上定义的式Ⅱ的L-氨基酸残基，而AA6和AA7一起形成以上定义的式Ⅲ、Ⅲa、Ⅳ、Ⅳa、Ⅴ或Ⅴa的基团；而Q为OH、NH2、NRcRd，其中Rc选自(1-4C)烷基、2-氨甲酰基环戊基、2-吡啶基甲基、4-氨甲酰基环己基、4-氨甲酰基环己基甲基、3-氨甲酰基苯基、4-氨甲酰基苯基、4-(氨甲酰基甲基)苯基、4-(羧甲基)苯基、2-吗啉代乙基和式-A1-G1的基团，其中A1为(3-7C)亚烷基或A1选自(1)式-A2-B2-的基团，其中A2为对亚苯基或1,4-亚环己基，而B2为(1-4C)亚烷基，或A2为亚甲基，而B2为对亚苯基或1,4-亚环己基；以及(2)式-A3-B3-C3的基团，其中A3为亚甲基，B3为对亚苯基或1,4-亚环己基，而C3为(1-3C)亚烷基；以及G1为式-N=C[N(Rp)2]2的基团，其中每个Rp独立地选自氢、甲基、乙基和丙基；而Rd为氢或(1-4C)烷基；或Q为1-哌嗪基、4-甲基-1-哌嗪基、4-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)-1-哌嗪基、4-脒基-1-哌嗪基、1-哌啶基或4-取代的-1-哌啶基，其中4-取代基选自羧基、氨甲酰基、N-(2-氨基乙基)氨甲酰基和N-(4-氨基丁基)氨甲酰基；或Q为1-6个氨基酸残基或其酰胺的序列。
2．权利要求1中要求保护的肽衍生物或其药学上可接受的盐，它为式P-AA1-AA2-AA3-Ⅱ-AA5-AA6-AA7-AA8-Q的肽衍生物，其中AA1、AA2、AA3、AA5、AA6、AA7和AA8为L-氨基酸残基，P和Q具有权利要求1中定义的任一含义，Ⅱ为权利要求1中定义的式Ⅱ的L-氨基酸残基。
3．权利要求1中要求保护的肽衍生物或其药学上可接受的盐，它为式P-AA1-AA2-AA3-Ⅲa-AA5-Ⅱ-AA8-Q的肽衍生物，其中AA1、AA2、AA3、AA5和AA8为L-氨基酸残基，P和Q具有权利要求1中定义的任一含义，而Ⅱ为权利要求1中定义的式Ⅱ的L-氨基酸残基，Ⅲa为权利要求1中定义的式Ⅲa的基团。
4．权利要求1中要求保护的肽衍生物或其药学上可接受的盐，它为式P-AA1-AA2-AA3-Ⅱ-AA5-Ⅲa-AA8-Q的肽衍生物，其中AA1、AA2、AA3、AA5和AA8为L-氨基酸残基，P和Q具有权利要求1中定义的任一含义，Ⅱ为权利要求1中定义的式Ⅱ的L-氨基酸残基，Ⅲa为权利要求1中定义的式Ⅲa的基团。
5．权利要求中1要求保护的肽衍生物或其药学上可接受的盐，它为式P-Ⅱ-AA2-AA3-AA4-AA5-Ⅲa-AA8-Q的肽衍生物，其中AA2、AA3、AA4、AA5和AA8为L-氨基酸残基，P和Q具有权利要求1中定义的任一含义，Ⅱ为权利要求1中定义的式Ⅱ的L-氨基酸残基，Ⅲa为权利要求1中定义的式Ⅲa的基团。
6．权利要求1-5的任一项中要求保护的肽衍生物或其药学上可接受的盐，其中P为5-20个碳原子的脂族、芳族或混合脂族/芳族有机基团，或为5-20个碳原子和选自氧、硫和氮的1、2或3个杂原子的杂芳族或混合脂族/杂芳族有机基团。
7．权利要求1-6的任一项中要求保护的肽衍生物或其药学上可接受的盐，在式Ⅱ的L-氨基酸残基中，n=1或2,X=羰基，以及R1和R2都为权利要求1中定义的式(A)的相同基团或都为权利要求1中定义的式(C)的相同基团。
8．权利要求7中要求保护的肽衍生物或其药学上可接受的盐，其中R1和R2都为-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3或都为-CH2CON(CH2CH2OCH3)2或都为-CH2CON[(CH2CH2O)3CH3]2。
9．任一先前权利要求中要求保护的肽衍生物或其药学上可接受的盐，其中AA1-AA8当存在时选自以下氨基酸残基AA1选自Ala、Ile、Tyr、Val、Glu、Lys、Arg、Gly、Gap、GapMe4和3,3,3-三氟丙氨酸；AA2选自Ala、Lys、Glu、Sar、Val、Arg、Gly、Pro、Ile、Tic、3,3,3-三氟丙氨酸和N6-二乙基Lys；AA3选自Ala、His、Gln、Val、Thr、Glu、Gly、Asp、Asn和N3-二乙基Dap；AA4选自Ala、Lys、Asn、Arg、Thr、Glu、Sar、Gly、Pro、His和N6-二乙基Lys；AA5选自Thr、Val、Ala、Gly、Dap、Dab、Pro、Hyp、Asn、Ser和N3-二乙基Dap；AA6选自Gly、Leu、Lys、Ala、Pro、Glu、Sar、His和Dap；AA7选自Pro、Ala、Lys、Arg、Glu、Sar、Gly、Oic和Dic；和AA8选自Ala、Gly、Dap、氮杂丙氨酸和氮杂甘氨酸。
10．任一先前权利要求中要求保护的肽衍生物或其药学上可接受的盐，其中Q选自4-氨基甲酰基-1-哌啶基和4-(氨基甲酰基甲基)苯胺基。
11．任一先前权利要求中要求保护的肽衍生物或其药学上可接受的盐，其中疏水基团P为5-苯基戊酰基。
12．权利要求1中要求保护的肽衍生物或其药学上可接受的盐，它为下式化合物或其药学上可接受的盐，
其中Phv代表5-苯基戊酰基。
13．权利要求1中要求保护的肽衍生物或其药学上可接受的盐，它为下式化合物合或其药学上可接受的盐，
其中Phv代表5-苯基戊酰基。
14．药用组合物，它包含权利要求1-13的任一项中要求保护的式Ⅰ肽衍生物或其药学上可接受的盐及药学上可接受的稀释剂或载体。
15．制备权利要求1中要求保护的肽衍生物或其药学上可接受的盐的方法，包括以适当的顺序连续偶联适当保护的氨基酸或者两个或多个适当保护的氨基酸的序列、适当保护的式H-Ⅱ-OH、H-Ⅲ-OH、H-Ⅲa-OH、H-Ⅳ-OH、H-Ⅳa-OH、H-Ⅴ-OH或H-Ⅴa-OH的基团以及任选的适当保护的式H-Q基团，然后可任选地进行N末端氨基的官能团修饰，以引入疏水基团P，并除去任何残留的保护基团和任何固相载体。
16．治疗MHCⅡ类依赖性T细胞介导的自身免疫病或炎症性疾病的方法，它包括给与需要这种治疗的温血动物有效量的权利要求1中要求保护的式Ⅰ肽衍生物或其药学上可接受的盐。
17．权利要求16中要求保护的方法，用于治疗类风湿性关节炎或胆囊性纤维变性。
18．权利要求1中要求保护的式Ⅰ肽衍生物或其药学上可接受的盐在生产用于治疗MHCⅡ类依赖性T细胞介导的自身免疫性疾病或炎症性疾病的新的药物中的用途。
19．保护的或未保护的式Ⅱ氨基酸或其盐，其中n、X、R1和R2具有权利要求1中定义的任何含义。
全文摘要
本发明涉及药学上有用的式(Ⅰ)P－AA
文档编号A61K31/00GK1221424SQ9719521
公开日1999年6月30日 申请日期1997年6月3日 优先权日1996年6月7日
发明者R·科顿, P·N·爱德华兹, R·W·A·鲁克, K·奥尔德哈姆 申请人:曾尼卡有限公司