专利名称：北美人参馏分的制备方法、含有它们的产物以及作为免疫调节剂的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及制备北美人参(西洋参)馏分的化学方法和含有这些馏分的组合物。本发明的产物可以用于刺激抗体生成，或作为靶向治疗剂用于以免疫力低下为特征的病症，例如感冒、流行性感冒、慢性疲劳综合征、AIDS、癌症等。本发明的产物还可以给接受化疗或放射疗法的癌症患者用作补剂，已知这些疗法可引起严重的免疫抑制。
背景技术：
数百年来，某些无毒物质如草药化合物的应用业已在多种生理条件下被广泛接受，尤其是在东方。人参是最为人们所熟知的传统中草药。人参提取物本身或它与其他药物联合使用时的药理学活性包括减轻肾损伤、抑制癌的发生且预防应激反应。另外还有许多关于人参作用于个体免疫反应的报导。迄今有关人参的一些免疫调节性质已见诸报导，其中包括增强宿主对感染的抵抗力、抗炎作用、抑制肿瘤生长和在细胞水平调节某些免疫功能。美洲人参，即西洋参，是另一个种的人参，它作为具有多种有益健康作用的保健补品已被公众接受。数组科学家业已尝试分离并阐明了人参中的多糖类化合物的结构。已证实一些多糖在免疫系统中具有调节活性。
日本Kyoritsu药学院的Tomoda小组对人参多糖的分离、鉴定和生物价值进行了一系列研究。在一组实验中，对人参多糖的分馏是基于其酸性不同。已从高丽参(西洋参)的根部分离出两种具有免疫学活性的酸性多糖[1，2]。用热水提取根切片。该提取物在硫酸钠存在下用溴化十六烷基三甲铵(CTAB)处理。沉淀物被分离、透析并且上样至葡聚糖凝胶(Sephadex)G25色谱柱、DEAE-葡聚糖纤维素(Sephacel)(Parmacial)色谱柱，得到两种纯净多糖，被称作人参烷(ginsenan)PA和人参烷PB。分别在Toyopearl HW-55F上进行凝胶色谱，得到人参烷PA和人参烷PB的分子量各为1.6×105和5.5×104。定量分析显示，人参烷PA含有21.3％阿拉伯糖、53.4％半乳糖、2.0％鼠李糖、16.0％半乳糖醛酸和2.7％葡糖醛酸。这些糖组分的摩尔比为11∶22∶1∶6∶1。人参烷PB含有11.0％阿拉伯糖、32.2％半乳糖、8.1％鼠李糖、39.9％半乳糖醛酸和5.0％葡糖醛酸。这些糖组分的摩尔比为3∶7∶2∶8∶1。这两种多糖在碳清除实验中表现出显著的网状内皮系统增效作用，以及明显的抗补体活性和剂量依赖的碱性磷酸酶诱导活性。
在另一个实验中[3]，从上述用CTAB处理的提取物的上清液中，分离出另外两种多糖，其方法是把上清液倾入乙醇中。分离出沉淀物并上样至DEAE-Sephadex A-25和Sephadex G-25色谱柱上，得到另外两种纯净多糖，被称作S-ⅠA和S-ⅡA。分别在Yoyopearl HW-55F上进行凝胶色谱分析，获得S-ⅠA和S-ⅡA的分子量各为5.6×104和1.0×105。人参烷S-ⅠA含有42.3％阿拉伯糖、50.8％半乳糖和16.0％半乳糖醛酸，其摩尔比为8∶8∶1。人参烷S-ⅡA由42.0％L-阿拉伯糖、32.6％半乳糖、6.2％葡萄糖和19.2％半乳糖醛酸组成，其摩尔比为15∶10∶2∶5。
日本Kitasato学院东方医学研究中心的Yamada小组已从西洋参的叶和根中分离出若干种多糖馏分。他们研究并比较了这些馏分的化学性质和生物活性[4]。
中国人参的根和叶在经过乙醇处理除去其人参皂甙后用水提取，再将残余物用0.5M NaOH提取，得到水溶性多糖馏分和碱性可溶多糖馏分(水溶性馏分分别称作GR-2和GL-2，碱溶性馏分分别称作GRA-2和GLA-2)。基于多糖成分的酸性，经过十六烷基三甲胺处理的上述所有馏分进一步被分为强酸性(称作产物GR-3、GL-3、GRA-3和GLA-3)、弱酸性(称作GR-4、GL-4、GRA-4和GLA-4)和中性(称作GR-5、GL-5、GRA-5和GLA-5)多糖馏分。根的多糖含量大于叶的多糖含量。得自根部的强酸性多糖馏分具有高含量的糖醛酸，甚至超过了50％。从所有馏分中都可以检测出类似的糖组分。它们是鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸。半乳糖醛酸是主要的醛酸组分。
具有最高抗补体活性的馏分GL-3被用DEAE-Sephadex、Sepharose(琼脂糖)CL-6B、DEAE Toyopearl色谱柱进一步分馏，由乙醇沉淀获得了被称作GL-PⅠ至GL-PIV的馏分[5]。所有馏分都含有32-44％的醛酸。馏分PI具有最大分子量，为50，000。PⅠ和PⅡ主要由Rha、Gal和GalA组成，而PⅢ还另外含有Fuc，PIV由Gal、Glc和GalA组成。对结构将进行详尽的测定。
通过在DEAE Sepharose CL-6B和Sepharose CL-6B上进行层析，在弱酸性多糖馏分GL-4中分离出抗溃疡果胶多糖(GL-BⅢ)。它主要由Rha、Ara、Man、Gal、Glc、GalA和GlcA以摩尔比3∶4∶2∶10∶1∶7∶4组成。对其结构进行详细测定[6]。
在DEAE-Sepharose CL-6B上通过阴离子交换色谱法可以从GL-4分离出另一种具有增强巨噬细胞Fc受体表达作用的多糖(GL-4Ⅱb2)。化学分析显示，该样品含有共65％的碳水化合物和33.7％醛酸。对其进行组成分析和结构测定[7]。
同一组的技术人员还研究了另一种具有抗补体活性的西洋参提取物G-115[8]。将G-115分馏以鉴定具有抗补体和促有丝分裂活性的活性物质。在该多糖粗馏分G-115G中观察到最强的抗补体活性，而水溶性可透析馏分G-115E表现出最有效的促有丝分裂活性。通过溴化十六烷基三甲铵沉淀、在DEAE-Sepharose上进行阴离子交换层析和在Sepharose CL-4B上进行凝胶过滤，将G-115G进一步提纯，得到一种重要的有效抗补体多糖G-115Ⅰ1-Ⅱa-2-3。此多糖为同型多糖。估计其分子量为3.68×105。其中除了含有少量半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸和鼠李糖以外，主要是由阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖组成。
日本Tohoku大学药学院的Hikino小组从韩国、中国和日本人参中分离出人参多糖。他们对人参多糖的降血糖活性进行了试验。已阐明了其组成和一些结构特征。
从美国人参中分离出三种多糖，quiquefolans A至C[14]。通过Sephacryl(聚丙烯酰胺葡聚糖)S-S00的凝胶色谱法测出它们的分子量大于2.0×106。quinquefolan A内的中性糖组分是甘露糖和葡萄糖(摩尔比为1.0∶2.3)，quinquefolan B内的是甘露糖和葡萄糖(摩尔比1.0∶5.5)，quinquefolan C是木糖。发现在quinquefolan A至C中酸性糖组分分别占10.8％、11.7％和7.1％。对于quinquefolan A至C来说，上述聚糖中的肽部分含量分别是2.7％、2.9％和2.3％。所有这些多糖在正常和四氧嘧啶减少型低血糖小鼠中均表现出降血糖作用。
韩国汉城的韩国癌症中心医院免疫实验室的研究人员从西洋参中分离出分子量为150，000被称作Ginsan的酸性多糖[15]。此多糖是由3.7％蛋白质和47.1％己糖(葡萄糖和半乳糖)和43.1％醛酸(半乳糖醛酸)组成的。Ginsan诱发T细胞和B细胞增生，并且通过产生内源性多细胞因子，从天然杀伤细胞和T细胞繁殖出淋巴因子激活型杀伤细胞[16]。
中国东北师范大学的Miao等人已从美国人参中分离出多糖。并且进行了纯化和结构测定。
白求恩医科大学的研究小组业已对美国人参中的多糖的生物活性进行了研究。他们发现，美国人参(PPQ)中的多糖可以促使淋巴细胞转化。他们研究了西洋参(PPQ-1)多糖对离体鼠脾淋巴细胞生成细胞因子的作用。数据表明PPQ-1可以调节免疫功能。
发明概述本发明人发现，某些美国人参提取物具有免疫调节性质。CVT-E002及其纯化馏分PQ2和PQ223特异性地刺激小鼠脾细胞增生B细胞，随后产生大量抗体。该馏分还可以提高血清免疫球蛋白(例如总的IgG)的水平，并刺激巨噬细胞产生IL-1、IL-6和TNF-α。这些馏分可以用来预防或治疗全身感染和其他免疫缺陷相关性疾病。
因此，本发明涉及从美国人参样品中制备人参馏分PQ2、PQ223和CVT-E002的方法。
具体而言，一种制备人参馏分PQ2的方法包括-将美国人参与含有醇的第一溶剂混合，将所得溶液在约80-100℃的温度下加热约2-4小时，制得第一人参溶液；-此后分离上述第一人参溶液，得到醇/人参溶液和第一人参残余物；-再将该第一人参残余物和水混合，将所得溶液在约80-100℃的温度下加热约2-4小时，生成人参残余物溶液；-进而分离该人参残余物溶液，生成第二人参残余物和含有第一人参提取物的第一水提液；-制备含有至少部分第一人参提取物的第二水提液，其中第一人参提取物和水在第二水提液中的比例约为1∶18-1∶22；-此后将该第二水提液和含醇的第二溶剂混合，其中第二溶剂和水的比例约为1∶1-3∶5，生成第一沉淀物和第一上清液；-随后将前一步骤获得的第一上清液和含醇的第三溶剂混合，其中，第三溶剂和第一上清液的比例约为3∶2-3∶1，生成第二沉淀物和第二上清液；和-分离该第二沉淀物，得到人参馏分PQ2。
一种制备人参馏分PQ223的方法包括-获得如上所述的人参馏分PQ2；-将人参馏分PQ2分馏，生成第一洗脱馏分和第二洗脱馏分，其中第一洗脱馏分相应于洗脱体积为35-50ml之间的碳水化合物峰，并且第二洗脱馏分相应于洗脱体积为50-85ml之间的碳水化合物峰，通过凝胶过滤色谱法，采用下列原料测定(1)一个色谱柱，其中含有烯丙基葡聚糖和N，N′-亚甲基二丙烯酰胺的球形交联共聚物基质，该色谱柱的床层尺寸为16×600mm，床层体积为120ml，该色谱柱的分馏范围(MW)对于球蛋白是5000-250，000，对于葡聚糖是1000-80，000；和(2)含有0.1N HCl和0.3M NaCl且pH为7.0的Tris-HCl洗脱缓冲液；和-分离且将第一洗脱馏分和第二洗脱馏分合并，生成人参馏分PQ223。
一种制备人参馏分CVT-E002的方法包括-将美国人参和含有醇的第一溶剂以每1克人参约7-9ml溶剂的比例进行混合，将所得溶液在约80-100℃的温度下加热约2-4小时，制得第一人参溶液；-随后分离该第一人参溶液，得到醇/人参溶液和第一人参残余物；-再将该第一人参残余物和水以约7-9ml的水/克人参残余物的比例混合，将所得残余物溶液在约80-100℃的温度下加热约2-4小时，生成人参残余物溶液；-进而分离该人参残余物溶液，得到第二人参残余物和含有人参提取物的水提液；和-将该水提液干燥，得到人参馏分CVT-E002。
本发明还涉及人参馏分PQ2、PQ223和CVT-E002，它们通过上述方法制备。
本发明也涉及含有特定碳水化合物的人参馏分。
第一人参馏分具有一种碳水化合物，其中含有约2-6mol％鼠李糖、约41-49mol％半乳糖醛酸、约12-18mol％葡萄糖、约16-22mol％半乳糖和约12-19mol％阿拉伯糖。
第二人参馏分具有一种碳水化合物，其中含有约3-8mol％鼠李糖、约36-44mol％半乳糖醛酸、约2-7mol％葡萄糖、约25-33mol％半乳糖和约17-25mol％阿拉伯糖。
第三人参馏分具有一种碳水化合物，其中含有约0.5-5mol％鼠李糖、约11-22mol％半乳糖醛酸、约40-60mol％葡萄糖、约10-19mol％半乳糖和约11-19mol％阿拉伯糖。
本发明还涉及含有与药物可接受载体结合的本发明人参馏分的药物组合物。
本发明进一步涉及本发明所述的人参馏分单独使用或与另一种药物合用在制备适于治疗以免疫力低下为特征的疾病的药物组合物中的应用。
本发明也涉及本发明所述的人参馏分刺激细胞内IL-1、IL-6和/或TNF-α的生成的应用。
本发明进一步涉及本发明所述的人参馏分刺激体外或体内免疫球蛋白生成的应用。
本发明还涉及本发明所述人参馏分激活B淋巴细胞增生及其抗体生成的应用。
本发明还涉及一种在需要治疗的患者中治疗以免疫力低下为特征的疾病的方法，该方法包括给患者施用疾病治疗有效量的本发明所述人参馏分。
附图简述
图1表示色谱柱上洗脱体积相对于标准葡聚糖样品的分子量对数所作的图示。
图2表示人参馏分CVT-E002的色谱图。
图3表示人参馏分PQ的色谱图。
图4表示人参馏分PQ2的色谱图。
图5表示人参馏分PQ3的色谱图。
图6表示人参馏分PQ223的色谱图。
图7表示人参馏分PQ223对小鼠脾细胞B细胞增殖作用的影响。
图8表示人参馏分PQ223对小鼠脾细胞T细胞增殖作用的影响。
图9表示人参馏分PQ223作用于小鼠脾细胞T和B细胞增殖的特异性。
图10表示人参馏分PQ223对小鼠脾脏体外抗体生成的影响。
图11表示注射了人参馏分PQ223的小鼠中蚀斑形成细胞(PFC)的增强。
发明详述一种制备人参馏分PQ2的方法包括(a)将美国人参与含有醇的第一溶剂混合，将所得溶液在约80-100℃的温度下加热约2-4小时，制得第一人参溶液；(b)此后将第一人参溶液分离，得到醇/人参溶液和第一人参残余物；(c)再将上述第一人参残余物和水混合，将所得溶液在约80-100℃的温度下加热约2-4小时，制得人参残余物溶液；(d)进而分离该人参残余物溶液，制得第二人参残余物和含有第一人参提取物的第一水提液；(e)制备含有至少部分第一人参提取物的第二水提液，其中第一人参提取物和水在第二水提液中的比例约为1∶18-1∶22；(f)此后将该第二水提液和含有醇的第二溶剂混合，其中第二溶剂和水的比例约为1∶1-3∶5，制得第一沉淀物和第一上清液；(g)随后将步骤(f)获得的第一上清液和含有醇的第三溶剂混合，其中，所述第三溶剂和第一上清液的比例约为3∶2-3∶1，生成第二沉淀物和第二上清液；和(h)分离该第二沉淀物，得到人参馏分PQ2。
第一溶剂、第二溶剂和第三溶剂中各自所述的醇分别包括对于所述人参呈惰性且易于从预期产物中分离出来的醇。所属领域技术人员应很容易选择出满足这些要求的醇。各种情况中所优选的醇分别包括饱和或不饱和C1-C6醇。在各情况中更优选的醇分别包括乙醇或甲醇。
在步骤(a)和(c)中，优选将所得溶液加热约3小时。步骤(a)还优选将第一溶剂和所述人参以每1克人参约7-9ml第一溶剂的比例混合，首选按每1克人参约8ml第一溶剂的比例混合。在步骤(c)中，优选水和第一人参残余物以每1克人参残余物约7-9ml水的比例混合，首选按每1克人参残余物约8ml水的比例混合。
紧继上述方法的步骤(d)之后，可将第一人参提取物任选地浓缩。这可以采用任何所属领域普通技术人员所熟知的方法来完成。例如，将含有第一人参提取物的第一水溶液离心(例如，在2500-10，000rpm下离心约5-15分钟)。也可以将该第一水溶液过滤。或是除了浓缩该第一人参提取物以外，将第一人参提取物冷冻干燥以备随后使用。
在步骤(e)中，第二水提液含有至少一部分所述第一人参提取物。重要的是，该第一人参提取物和水在第二水提液中的比例为约1∶18-1∶22，更优选约1∶20。这可以通过多种途径来获得。如果该第一人参提取物在上述步骤(d)后被浓缩和/或冷冻干燥，应向该第一人参提取物中加入水至预定比例。或者，部分或全部的第一水提液可以用于第二水提液中。如果需要，再加入水达到预定比例。使用至少部分含有预定量第一人参提取物的第一水提液可以避免在步骤(d)和(e)之间进行额外的浓缩或冷冻干燥。
在步骤(f)中，优选的第二溶剂和水的比例约为3∶4。
在步骤(g)中，优选的第三溶剂和第一上清液的比例约为2∶1。
一种制备人参馏分PQ223的方法包括(a)按照上述方法获得人参馏分PQ2；(b)将人参馏分PQ2分馏，生成第一洗脱馏分和第二洗脱馏分，其中所述第一洗脱馏分对应于洗脱体积为35-50ml之间的碳水化合物峰，所述第二洗脱馏分对应于洗脱体积为50-85ml之间的碳水化合物峰，通过凝胶过滤色谱法，采用下列原料测定(1)一个色谱柱，内装有烯丙基葡聚糖和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的球形交联共聚物的基质，该色谱柱的床层尺寸为16×600mm，床层体积为120ml，该色谱柱的分馏范围(MW)对于球蛋白是5000-250，000，对于葡聚糖是1000-80，000；和(2)含有0.1N HCl和0.3M NaCl且pH为7.0的Tris-HCl洗脱缓冲液；和(c)分离且将第一洗脱馏分和第二洗脱馏分合并，制得人参馏分PQ223。
第一洗脱馏分也称作PQ2A，第二洗脱馏分也称作PQ2B。可以分别分离这些洗脱馏分。此外，利用上述相同方法可以制备另外的洗脱馏分PQ2C(相应于在洗脱体积95-110ml之间观察到的碳水化合物峰)，和PQ2D(相应于在洗脱体积120-250ml之间观察到的碳水化合物峰)。上述各个馏分也可以分别分离。而且，除了含有两种或多种PQ2A至PQ2D的PQ223以外，还可以制备其他组合物。
优选采用凝胶过滤色谱法对人参馏分PQ2进行分馏。然而，所属领域技术人员所熟知的其他任何类型的方法均适用。
所属领域普通技术人员很熟悉进行凝胶过滤色谱的方法，应该按照制造商推荐的流量、样品体积和操作温度来完成。这些因素在不同制造商说明书中的差别不会明显影响色谱操作的结果。
通过所属技术领域的已知方法可以测定碳水化合物的含量。优选微量滴定平板分析法来测定所述馏分中的碳水化合物组成。这种分析方法对于所属技术领域的专业人员来说是熟知的。参见，例如，Dubois等，(分析化学》，28350-56(1956)，该文献在此引入作为参考。在微量滴定平板分析法中，优选在492nm下检测样品的吸光度。
一种制备人参馏分CVT-E002的方法包括(a)将美国人参和含有醇的第一溶剂以每克人参约7-9ml溶剂的比例混合，将所得溶液在约80-100℃的温度下加热约2-4小时，制得第一人参溶液；(b)随后分离该第一人参溶液，得到醇/人参溶液和第一人参残余物；(c)再将该第一人参残余物和水以约7-9ml的水/克人参残余物的比例混合，将所得残余物溶液在约80-100℃的温度下加热约2-4小时，制得人参残余物溶液；(d)进而分离该人参残余物溶液，制得第二人参残余物和含有人参提取物的水提液；和(e)干燥或浓缩该水提液，得到人参馏分CVT-E002。
第一溶剂中含有的醇包括对人参呈惰性且易于自预期产物中分离出的醇。所属领域技术人员应很容易选择出满足这些要求的醇。优选的醇包括饱和或不饱和的C1-C6醇。更优选的醇包括乙醇或甲醇。
在步骤(a)中，优选所述第一溶剂和样品以每克样品约8ml第一溶剂的比例混合。在步骤(c)中优选水和所述第一人参残余物以每克人参残余物约8ml水的比例混合。
在步骤(a)和(c)中，优选将所述第一人参溶液加热约3小时。
本发明还涉及若干种人参馏分。
第一人参馏分具有一种碳水化合物，其中含有约2-6mol％鼠李糖、约41-49mol％半乳糖醛酸、约12-18mol％葡萄糖、约16-22mol％半乳糖和约12-19mol％阿拉伯糖。优选该碳水化合物含有约3-5mol％鼠李糖、约43-47mol％半乳糖醛酸、约14-16mol％葡萄糖、约18-20mol％半乳糖和约14-17mol％阿拉伯糖。最优选该碳水化合物含有约4mol％鼠李糖、约45mol％半乳糖醛酸、约15mol％葡萄糖、约19mol％半乳糖和约15mol％阿拉伯糖。
本发明的第二人参馏分具有一种碳水化合物，其中含有约3-8mol％鼠李糖、约36-44mol％半乳糖醛酸、约2-7mol％葡萄糖、约25-33mol％半乳糖和约17-25mol％阿拉伯糖。优选该碳水化合物含有4-7mol％鼠李糖、约37-42mol％半乳糖醛酸、约3-6mol％葡萄糖、约27-32mol％半乳糖和约19-24mol％阿拉伯糖。最优选该碳水化合物含有5mol％鼠李糖、约39mol％半乳糖醛酸、约4mol％葡萄糖、约29mol％半乳糖和约21mol％阿拉伯糖。
本发明的第三人参馏分具有一种碳水化合物，其中含有约0.5-5mol％鼠李糖、约11-22mol％半乳糖醛酸、约40-60mol％葡萄糖、约10-19mol％半乳糖和约11-19mol％阿拉伯糖。优选该碳水化合物含有约1-3mol％鼠李糖、约13-20mol％半乳糖醛酸、约42-57mol％葡萄糖、约12-17mol％半乳糖和约13-17mol％阿拉伯糖。
本发明还涉及药物组合物，所述组合物含有和药物可接受载体相组合的本发明的人参馏分。在这方面，所属领域技术人员很熟悉任何适用的药物可接受载体，因此，在此将不再详细探讨制备本发明药物组合物的方法。所属药物组合物可以是适当的片剂、胶囊、液体、锭剂、洗液或栓剂的形式。
本发明涉及本发明所述人参馏分在制备适合治疗以免疫力低下为特征的疾病(如感冒、流行性感冒、慢性疲劳综合征、AIDS和癌症)的药物组合物中的应用。所述人参馏分可以单独使用或和另一种药物联合使用。本发明的人参馏分特别适用于和化疗药物或作为放射疗法补剂联合给药，这是因为已知癌症患者的免疫体系被严重抑制。
本发明还涉及一种在需治疗患者中用于治疗以免疫力低下为特征的疾病的方法，该方法包括给该患者施用疾病治疗有效量的本发明所述人参馏分。优选所述疾病选自感冒、流行性感冒、慢性疲劳综合征、AIDS和癌症。本发明所述人参馏分的剂量取决于被治疗的特定病症和患者的年龄、性别和全身健康状况。然而，已发现适当的剂量是在1-5000 mg/kg体重/天的范围内，每天给药1-10次。所述人参馏分可以口服给药，经注射或灌注给药，局部、经鼻、经眼、经鞘或直肠给药。
本发明现在将通过下列实施例得到进一步说明。实施例实施例1第一种制备馏分CVT-E002和纯化该馏分的方法将美国人参的根部通过化学方法提取并进一步纯化以得到馏分CVT-E001和CVT-E002。再将一定量的CVT-E002进一步提纯以得到馏分G1、G2和G3。详细方法描述如下。
搅拌下，将500g干燥的人参根粉用4L 85％乙醇或3L 90％甲醇在80-85℃的水浴上提取3小时并过滤，得到醇溶液和残余物。将该醇溶液浓缩并喷雾干燥，得到总皂甙的产物(CVT-E001)。搅拌的同时将该残余物用4L水在95-100℃的水浴上提取3小时。提取物经平纹细布袋过滤并离心，得到含有CVT-E002的水溶液，弃去剩下的残余物。
将一部分水溶液进一步提纯，向上述水溶液中加入等体积的95％乙醇，引发沉淀。将沉淀离心并冻干得到馏分G1。通过蒸发减小上清液的体积。加入等体积的95％乙醇，得到第二批沉淀G2，除去剩余上清液的乙醇且冷冻干燥，得到粉末G3。
按照下列方法进一步纯化G2。将2g G2溶解在80ml水中，并在截止分子量为1200的Sigma D-7884透析管中相对于3个体积的水进行透析。该透析是在4℃下持续72小时，每24小时收集两次透析液。将该透析液浓缩至15ml，随后用等体积甲醇沉淀。将该沉淀溶解在水中并冷冻干燥，得到粉末G22。
按照下列方法进一步纯化G22。将1.5g G22溶解在60ml水中，随后在截止分子量为1000的Fisher Spectral/Por分子多孔膜中在4℃下相对于600ml水透析。透析24小时后收集到第一透析液，通过蒸发将其浓缩至15ml，随后冷冻干燥。所得干燥粉末称作G221。以相同的方法，在48小时后收集到第二批透析液并称作G222。将残余物浓缩并冷冻干燥，得到的粉末称作G223。实施例2第二种制备馏分CVT-E002和提纯该馏分的方法本发明另一种制备人参馏分CVT-E002的方法如下所述。
搅拌下，将1000g干燥的美国人参根用8L 85％乙醇在95-100℃的水浴上提取3小时并过滤，得到醇溶液和残余物。在持续搅拌的条件下将残余物和水(1∶8)在热水浴上混合3小时。冷却至室温后，过滤该混合物。在5000rpm下离心该滤液10分钟。将上清液浓缩并冷冻干燥，得到提取物CVT-E002。通过这种方法制备的CVT-E002的产量与实施例1所述方法的大致相同，即约是人参原料重量的10％。
按照下列方法进一步分离一部分CVT-E002。将1600ml 95％乙醇加入到100g溶于2000ml水的CVT-E002溶液中。分离出沉淀，为PQ1。将上清液浓缩至500ml。再将另一部分95％乙醇(1000ml)加入到该浓缩溶液中，得到第二沉淀馏分。将该第二沉淀馏分分离并冷冻干燥，得到馏分PQ2。将上清液浓缩并冷冻干燥，得到PQ3。实施例3促有丝分裂活性试验通过基于对其体外淋巴细胞的促有丝分裂活性的筛选选择出多种纯化水平下的不同美国人参馏分。虽然促有丝分裂作用被认为是与体内免疫系统中正常活动相关的人为行为，但促有丝分裂剂为可能的效应子功能提供了良好的指示。
促有丝分裂活性的试验方法如下所述试验选用Balb/C或C57B1/6J小鼠。Balb/C小鼠得自于Health Sciences Laboratory AnimalServies Facility(University of Alberta，Edmonton，Canada)。C57B1/6J小鼠得自于Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)。在各个试验中令7-10周大的小鼠按年龄和性别相匹配。用颈部脱位法处死小鼠。通过无菌技术取出脾脏并在两个玻璃载玻片的磨砂端之间压碎。在汉克氏平衡盐溶液(HBSS)中离心洗涤后，将细胞悬浮在pH 7.4的RPMI 1640培养基中(Gibco，Grand Island，N.Y.)，其中含有10％胎牛血清(Flow Labs)、50mM巯基乙醇(ICN Pharmaceuticals，Plainview，N.Y.)和青霉素-链霉素(Gibco)。在96孔平底Linbro平板中一式三份进行培养，各孔内的终浓度为1.25×106细胞/ml。将被测馏分预先过滤灭菌并溶解在HBSS中，用这些馏分建立试验组。对照培养是由不含有促细胞分裂剂的一组和用20μg/ml植物凝集素(PHA)或25μg/ml脂多糖(LPS)处理的多个组组成。已知PHA能够特异性地刺激T型脾细胞，而LPS刺激B型脾细胞。培养物在37℃、5％CO2加湿空气中培养72小时。在72小时培养结束之前4小时，向各孔中加入1μCi氚代胸苷(New England Nuclear，Boston，Massachusetts)。用自动样品收集器(Skatron，Virginia)收集细胞，并随后通过闪烁计数法测定掺混的放射性。结果计算为相对于对照组计算的百分比(平均值±标准偏差，三次重复)。
实施例1和2中给出了不同的提取条件，例如CVT-E002在水中的浓度和沉淀所用的乙醇体积，对CVT-E002的进一步分馏的影响。比较由上述两种方法制得的产物的促有丝分裂活性。结果如下表所示。各试验采用三个批次的三份试样。
表1由实施例1所示方法制备的G1、G2和G3的促有丝分裂活性
表2由实施例2所示方法制备的PQ1、PQ2和PQ3的促有丝分裂活性
如表1和2所示，实施例1和2所述提取方法之间的改变和生物学活性从G1馏分至PQ2馏分的转变有关。实施例4PQ2的分离和一种制备PQ223馏分的方法按照分子量的分布、通过凝胶过滤色谱法、在HiPrep 16/60 Sephary1S-200高分辨色谱柱(Pharmacia Biotech，Cat.No.17-1166-01)上进一步分离实施例2所述的CVT-E002、PQ1、PQ2和PQ3，该色谱柱含有烯丙基葡聚糖和N，N′-亚甲基双丙烯酰胺的球形交联共聚物基质，色谱柱的床层尺寸为16×600mm，床层体积为120ml，分离范围(MW)对于球蛋白来说是5000-250，000，对于葡聚糖来说是1000-80，000。葡聚糖样品(MW=71.4k，37.5k，19.5k和9.5k)购自Sigma，用作标准品。将5mg各样品溶解在1ml水中，上样至柱内，用含有0.1N HCl和0.3M NaCl、pH为7.0的Tris-HCl洗脱缓冲剂洗脱，流速为0.3ml/min，环境温度为4℃。收集一定体积的洗脱液，得到每5ml一份的多个试样。
用微量滴定平板分析法检测每份洗脱液的碳水化合物总含量，以得到全部碳水化合物的含量。这是Dubois等人在《分析化学》28350-56(1956)中描述的方法的改进。推导洗脱液中的碳水化合物总量的目的是能够在确定的吸收光谱下进行检测。用D-葡萄糖作为标准品，所用的其他材料是浓硫酸(98％)和5％苯酚。聚苯乙烯微量滴定板购自SARSTDT(Quebec，Canada)。向微量滴定平板的各个孔中，加入40μl含有1-10μg D-葡萄糖的标准品和40μl 5％苯酚并混合。随后小心地加入200μl浓硫酸。用多道吸移管将试剂和各份洗脱液混合后，把平板放在80℃下保温1小时。冷却至室温后，用Multiskan微量滴定平板读数器在492nm下测定样品的吸光度。储存数据并用微软Excel程序将凝胶过滤色谱结果绘图。
通过在同一色谱柱中洗脱一系列分子量已知的标准葡聚糖(Sigma)可得到标准曲线(图1)。CVT-E002和批次21的PQ1、PQ2和PQ3的色谱图如图2-5所示。在各图中，X轴上的各点表示相当于实际体积五分之一的洗脱体积。所以，为了得到洗脱体积的真实值，须将图中的结果乘以5。
CVT-E002的凝胶过滤色谱(图2)显示出三个主峰。根据标准曲线推测第一个峰的分子量(洗脱馏分7-10)为70，000或更高(图1)。第三个峰的分子量(洗脱馏分18-22)约为1，000。还观察到峰宽较小的第二个峰(洗脱馏分10-17)。这三个峰的比例为57.2∶8.5∶34.4。
PQ1的色谱(图3)显示为一个主峰(洗脱馏分7-10)和一个小峰(洗脱馏分18-21)。主峰对应于CVT-E002的高分子量馏分。两个峰的比例是86.8∶13.2 。
PQ2的色谱(图4)显示为三个主峰。峰A(洗脱馏分7-10)和峰C(洗脱馏分19-22)和CVT-E002的两个主峰相对应。另一个宽峰，也就是峰B(洗脱馏分10-17)位于峰A和C之间。据推算峰B的分子量约为2，000-60，000。三个峰A-C的比例是34.1∶45.7∶20.3。还观察到一个小峰区，称作峰D(洗脱馏分24-50，如图4所示)。
PQ3的色谱(图5)仅仅显示出一个主峰(洗脱馏分18-21)，它对应于CVT-E002的低分子量馏分。
收集PQ2的A、B、C和D馏分并冷冻干燥。将干粉分别重新命名为PQ2A、PQ2B、PQ2C和PQ2D。再将馏分A和B合并，并将合并的馏分称作PQ223(图6为其色谱图)。试验PQ2A、PQ2B、PQ2C和PQ2D的促有丝分裂活性并将PQ223、PQ2和CVT-E002的活性进行比较。
结果如下表所示。
表3．美国人参馏分的促有丝分裂活性(相对于对照组计的3H-胸苷掺混百分率％)
*和**分别表示P＜0.05和P＜0.01。n=3如上述结果所示，有效性的顺序是PQ223＞PQ2＞CVT-E002。实施例5CVT-E002、PQ1、PQ2、PQ3和PQ223的总碳水化合物和蛋白组成的化学测定得到各馏分CVT-E002、PQ1、PQ2、PQ3和PQ223的三个批次，测定各馏分中总的碳水化合物和蛋白质组成。用苯酚-硫酸法测定碳水化合物总量，该方法是所属领域技术人员已知的方法。用Lowry法测定蛋白组成，此方法为本领域所已知，用牛血清白蛋白作标准。结果如下表所示。
表4．馏分中蛋白质和碳水化合物含量的对比
实施例6CVT-E002、PQ1、PQ2和PQ223的单糖组成的化学测定由于碳水化合物的总量主要代表多糖和寡糖的量，所以还需测定某些馏分中单糖的摩尔比例。
将不同批次的馏分CVT-E002、PQ1、PQ2和PQ223酸催化水解，以便释放出其结构单位--单糖。在用MPP(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮)衍生化后，通过HPLC法对释放出的单糖进行定性和定量分析。详细方法如下所述将溶于2N HCl中的样品溶液在95-100℃下加热6小时。用NaOH溶液中和该混合物。加入内标。随后向此混合物中加入甲醇和氢氧化钠水溶液(0.3N)。随后在50-60℃下搅拌8小时(或在室温下搅拌1周)。用水稀释该混合物(1∶10)并用C-18柱分析，用含有18％乙腈的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7)洗脱，流速为1ml/min，UV检测器被设定在245nm。下表列出了CVT-E002、PQ1、PQ2和PQ223的单糖的摩尔比例。在一些CVT-E002、PQ1和PQ2样品中发现了痕量的葡萄糖醛酸。
表5 CVT-E002、PQ1、PQ2和PQ223的单糖组成(摩尔％)
如结果所示，葡萄糖含量的顺序为PQ1＞CVT-E002＞PQ2＞PQ3；半乳糖醛酸的含量如下PQ2＞PQ223＞CVT-E002＞PQ1。实施例7人参馏分的免疫调节作用1．巨噬细胞活性利用腹膜渗出的巨噬细胞来体外研究CVT-E002、PQ2、G2和PQ223对小鼠巨噬细胞的作用，所述巨噬细胞得自于选择性提高细胞介导反应的C57B1/6小鼠和选择性提高抗体介导反应的Balb/c小鼠。用100μg/ml被测样品刺激巨噬细胞，之后测试IL-1、IL-6和TNF-α的生成。方法如下所述。
A．从腹膜渗出细胞和细胞上清液中制备巨噬细胞1)将1ml 3％巯基乙酸盐注射到小鼠腹膜腔内，3天后自腹腔中收集腹膜渗出巨噬细胞。
2)在1100rpm、4℃下用的Hanks缓冲液离心5分钟，洗涤细胞悬浮液两次。
3)把巨噬细胞悬浮在RPMI-10％FBS培养基中。
4)对细胞计数并用RPMI-10％FBC培养基稀释至终浓度106/ml。
5)在37℃下将巨噬细胞在10×106/10ml RPMI-10％FBS中培养2小时。弃去上清液并将沉淀的巨噬细胞用10ml PBS洗涤两次。
6)收集巨噬细胞并再次悬浮在RPMI-10％FBS中。
7)用10mg/ml LPS或100mg/ml被测样品培养巨噬细胞(5×105)24或48小时，此后收集上清液并过滤灭菌，以进行生物检测(IL-1、IL-6和TNF-α)。试验一式三份。
B．上清液中IL-1的测定NOB1细胞系是EL4细胞系的TK变种，在对IL-1反应中它产生CTLL生长刺激活性(IL-2)。由于NOB1细胞没有掺混3HTdR，所以可以通过CTLL系的摄取来测定对IL-1的反应。所用方法如下所述1)在96孔平底微量滴定平板的各个孔中，将104CTLL细胞和4×104NOB1细胞在200μl存在于IMDM中的5％FBS中混合。加入IL-1测试样品的4、8、16或22倍稀释液或IL-1标准样的系列稀释液。各孔的终体积为200μl。各样品按一式三份制备。
2)把平板在37℃、5％CO2的加湿培养箱中培养24小时。
3)在培养的最后5小时加入[3H]-胸苷。
4)收集细胞并通过液体闪烁计数法测定掺混的[3H]-胸苷。
5)计算IL-1的浓度。结果如下表所示。
表6．人参馏分对小鼠巨噬细胞IL-1生成作用的影响
1．将腹膜渗出巨噬细胞5×105/ml用100μg/ml样品、10μg/ml LPS培养48小时并收集培养物上清液。
2．利用NOB1和CTLL细胞系测定IL-1，结果表示为平均值+SD。
*P＜0.05；**P＜0.01结果表明，CVT-E002、PQ2、G2和PQ223明显刺激C57B1/6小鼠的巨噬细胞产生IL-1。所有试验样品显示出相同的刺激IL-1生成的功效。
C．IL-6的测定小鼠B细胞杂交瘤细胞系B9的增殖依赖于IL-6。在含有浓度递减的被测样品的一系列微孔内培养B9细胞。方法如下。
1)将从储备培养瓶内取出的等分试样中的处于对数生长期的B9细胞计数。
2)4℃下，将细胞在台式离心机中以180×g离心5分钟，将沉淀团重新悬浮在10ml的完全RPMI-10培养基中。将上述方法重复两次并将细胞重新悬浮在完全RPMI-10培养基中，浓度为2×103细胞/ml。
3)向96孔微量滴定平板的各孔中加入100μl洗涤过的细胞(2×103细胞/ml)。
4)在各孔内加入100μl试验样品的2倍连续稀释液，但为IL-6标准物保留2或3行平板孔。
5)把平板在37℃、5％CO2的加湿培养箱中培养72小时。
6)加入[3H]-胸苷，将平板在37℃下培养4小时。
7)收集细胞，通过液体闪烁计数法测定掺混的[3H]-胸苷。
8)计算IL-6的浓度。结果如下表所示。
表7．人参对小鼠巨噬细胞的IL-6生成作用的影响
1．将腹膜渗出巨噬细胞5×105/ml用1001μg/ml样品、10μg/ml LPS培养24小时并收集培养物上清液。
2．利用B9细胞系测定IL-6，结果表示为平均值+SD。
*P＜0.05；**P＜0.01CVT-E002、PQ2和PQ223提高C57B1/6小鼠和Balb/c小鼠的巨噬细胞上清液中IL-1的生成。功效依次为PQ223＞PQ2＞CVT-E002。
D.TNF-α的测量下列方案采用对TNF敏感的、用放线菌素D处理的小鼠L929成纤维细胞来定量测定得自细胞培养物的上清液中的TNF活性。
1)向各孔中加入4×104存在于50μl IMDM-5％FSC中的L929细胞。
2)在各行的第二个孔内(第2列)加入50μl被测样品。通过轻轻混合第2孔的内含物制备两倍连续稀释液，并从第2孔中取50μl转移到第3孔中。将第3孔轻轻混合，并从第3孔中取50μl转移到第4孔内。连续进行该操作直至第12孔。最后轻轻混合第12列各孔中的内含物且从各孔中弃去50μl。此时，所有孔内均含有50μl的内含物。
3)在各孔(2μl ml)内加入50μl的放线霉素D溶液。
4)把平板在37℃下的含有5％CO2的空气内培养24小时。
5)向各孔中加入5μl中性红并将平板培养2.5小时。
6)将各孔内的全部上清液迅速且仔细地漂洗和排空，用200μl PBS洗涤两次平板。
7)抽吸PBS，并将1001μl在0.05M Na2HPO4中的50％的乙醇加入到各孔中，在室温下振摇5分钟。
8)立刻在570nm下用微量滴定平板读数器读取各孔的吸光度。
9)计算TNF-α的浓度。结果如下表所示。
表8．人参对小鼠巨噬细胞TNF-α生成作用的影响
1．将腹膜渗出巨噬细胞5×105/ml用100μg/ml样品、10μg/ml LPS培养48小时并收集培养物上清液。
2．利用L929-8细胞系测定TNF-α，结果表示为平均值+SD。
*P＜0.05；**P＜0.01
TNF-α的生成被来自于Balb/c或C57B1/6细胞系的巨噬细胞上清液中的CVT-E002和PQ223所诱导。Balb/c小鼠巨噬细胞上清中的TNF-α被G2显著刺激。PQ2似乎不刺激巨噬细胞的TNF-α产生。
2．血清免疫球蛋白的生成和用水饲养的小鼠相比，用CVT-E002饲养的小鼠的血清免疫球蛋白的生成(总IgG)提高了21％，用PQ2饲养的小鼠提高了26％，用PQ223饲养的小鼠提高了31％。效价依次为PQ223＞PQ2＞CVT-E002。结果如表9所示。
表10．小鼠体内免疫球蛋白的生成(n=15)
3．PQ223的促有丝分裂活性的特异性著名的促有丝分裂原例如PHA或LPS表现出对受其刺激类型的细胞具有特异性。重要的是，人参馏分能够刺激哪种特定类型的脾细胞。所以，我们通过亲和色谱柱分离出T细胞，以此通过排除T细胞来富集B细胞。
A.T细胞的富集把脾细胞的单细胞悬浮液在淋巴细胞-M(Cedarlane Labs)上铺层以除去红细胞。随后把淋巴细胞通过亲和色谱柱(Biotex Co.Ltd.，Edmonton，Alberta)，通过使B细胞粘附在小鼠免疫球蛋白包被珠粒上来除去B细胞。洗脱液包括富集的T细胞。利用抗-胸苷1.2(anti-thy 1.2)单克隆抗体和补体处理的存活试验来测定T细胞相对于其他类型细胞的百分比。
B.B细胞的富集在从脾细胞群中除去红细胞以后，将淋巴细胞和单克隆抗-胸苷1.2抗体一起在37℃下温育1小时。此后加入低毒兔补体且在4℃下温育半小时。此操作去除了细胞悬浮液中的T细胞，得到富集的B细胞群。
C．用PQ223培养用不同剂量的PQ223培养B或T细胞，利用氚代胸苷掺杂法测定其反应。图7和8分别显示，PQ223对较纯的B细胞和T细胞具有增殖作用。对照组包括用LPS(一种B细胞特异性促有丝分裂原)和PHA(一种T细胞特异性促有丝分裂原)处理的细胞。发现PQ223具有B细胞特异性(参见图9)。
4．PQ223对体外抗体生成的影响在不同剂量PQ223的存在下将脾细胞培养72小时。对照培养是由加入25μg的LPS组和另一未加入促有丝分裂原的组组成。利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定上清液中可溶性免疫球蛋白的存在。在0.1MTris缓冲液(pH 9)中连续稀释含有可溶性免疫球蛋白的上清液。将该上清液涂布在微量滴定平板上并在4℃下温育过夜。用PBS吐温洗涤平板3次，随后以1∶1000的稀释度加入100μl抗体-酶螯合山羊F(ab′)2抗-小鼠Ig辣根过氧化物酶(Tago Inc.，Burlingame Califomia)。平板在室温下保温1小时。再用PBS洗涤平板3次，随后向各孔内加入100μl ABTS过氧化物酶底物(Kirkegaard & Perry Lab Inc.)。1小时后，利用流动多扫描(Flow Multiscan)ELISA读取器在405nm的波长下测定吸光度。
图10显示，与25μg LPS相比，50μg/ml PQ223促进了免疫球蛋白的生成。较高浓度的PQ223500μg/ml，没有引起较高水平的抗体生成。该剂量反应曲线由异型脾细胞群和纯化的B细胞的增殖反应构成。
5．体内抗体蚀斑形成细胞将三个浓度的PQ223静脉内注射给三组动物，每组3只小鼠。给对照组注射平衡盐溶液。在PQ223静脉内处理的第7天末，用在HBSS中的0.2ml的10％SRBC悬浮液免疫小鼠。免疫5天后，处死小鼠并从脾脏制备单细胞悬浮液，将浓度调至4×106细胞/ml。将该细胞悬浮液的0.1ml等分试样与0.3ml 10％SRBC溶液豚鼠补体和0.5ml RPMI培养基混合。取70μl该混合物转移至Cunningham室内。该室用聚乙烯石蜡混合物密封并在37℃下培养1小时，随后对蚀斑形成细胞计数。所有PFC水平表示为每1百万脾细胞。图11表明，在注射了化合物的小鼠中，上述三个剂量均能够明显提高抗体的生成。
总之，上述研究结果表明，本发明的人参馏分激活巨噬细胞产生细胞因子，例如IL-1、IL-6和TNF-α。它们还激活淋巴细胞，特别是B淋巴细胞的增殖和抗体生成。全身体系介导的免疫系统被增强表明对感染的抵御作用。已报导TNF-α的产生具有抗病毒和抗肿瘤的有益作用。另外还有报导说TNF-α在多种寄生虫感染的治疗中具有疗效。
下列在本发明背景中引用的文献在此引入作为参考1．Tomoda等，《生物学和药理学通讯》(Biol.Pharm.Bull.)，16，22-5(1993)2．Tomoda等，《生物学和药理学通讯》(Biol.Pharm.Bull.)，17，1287-91(1994)3．Tomoda等，《生物学和药理学通讯》(Biol.Pharm.Bull.)，16，1087-90(1993)4．Gao等，《植物医学》(Planta Medica)，55，9-12(1989)5．Gao等，《碳水化合物研究》(Carbohydr.Res.)，181，175-87(1988)6．Kiyohara等，《碳水化合物研究》(Carbohydr.Res.)，263，89-101(1994)7．Shin等，《碳水化合物研究》(Carbohydr.Res.)，300，239-49(1997)8．Yamada等，《植物治疗法研究》(Phytotherapy res.)，9，264-9(1995)9．Konno等，《植物医学》(Planta Medica)，50，434-6(1984)10．Hikino等，未公开
11．Oshima等，《人种药理学杂志》(J.Ethnopharmacology)，14，255-9(1985)12．Konno等，《国际生药研究杂志》(Int.J.Crude Drug Res.)，25，53-6(1987)13．Konno等，《人种药理学杂志》(J.Ethnopharmacology)，14，69-74(1985)14．Oshima等，《天然产物杂志》(J.Natural Products)，50，188-90(1987)15．Lee等，《抗癌研究》(Anticancer Res.)，17，323-32(1997)16．Kim等，《植物医学》(Planta Medica)，64，110-5(1998)17．苗等，《生物化学杂志》9，610-4(1993)18．马等，《白求恩医科大学学报》，23，236-8(1997)19．朱等，《中国药理学通报》13，76-8(1997)
权利要求
1．一种制备人参馏分PQ2的方法，该方法包括(a)将美国人参与含有醇的第一溶剂混合，并将所得溶液在约80-100℃的温度下加热约2-4小时，制得第一人参溶液；(b)此后将第一人参溶液分离，得到醇/人参溶液和第一人参残余物；(c)再将上述第一人参残余物和水混合，并将所得溶液在约80-100℃的温度下加热约2-4小时，制得人参残余物溶液；(d)进而将上述人参残余物溶液分离，制得第二人参残余物和含有第一人参提取物的第一水提液；(e)制备含有至少部分第一人参提取物的第二水提液，其中在第二水提液中第一人参提取物和水的比例约为1∶18-1∶22；(f)此后将上述第二水提液和含有醇的第二溶剂混合，其中第二溶剂和水的比例约为1∶1-3∶5，制得第一沉淀物和第一上清液；(g)随后将步骤(f)获得的第一上清液和含有醇的第三溶剂混合，其中，所述第三溶剂和第一上清液的比例约为3∶2-3∶1，生成第二沉淀物和第二上清液；和(h)分离上述第二沉淀物，得到人参馏分PQ2。
2．如权利要求1所述的方法，其中所述的在第一溶剂、第二溶剂和第三溶剂中的醇独立地包括饱和或不饱和C1-C6醇。
3．如权利要求1所述的方法，其中所述的在第一溶剂、第二溶剂和第三溶剂中的醇独立地包括乙醇或甲醇。
4．如权利要求1所述的方法，其中在步骤(e)中第二水提液含有至少部分的第一水提掖。
5．如权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中将所得溶液加热约3小时。
6．如权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)中将所得溶液加热约3小时。
7．如权利要求1所述的方法，其中在步骤(e)中第一人参提取物和水的比例约为1∶20。
8．如权利要求1所述的方法，其中在步骤(f)中第二溶剂和水的比例约为3∶4。
9．如权利要求1所述的方法，其中在步骤(g)中第三溶剂和第一上清液的比例约为2∶1。
10．如权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中所述第一溶剂和人参是以每克人参约7-9ml第一溶剂的比例混合。
11．如权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中第一溶剂和人参是以每克人参约8ml第一溶剂的比例混合。
12．如权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)中水和第一人参残余物是以每克人参残余物约7-9ml水的比例混合。
13．如权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)中水和第一人参残余物是以每克人参残余物约8ml水的比例混合。
14．人参馏分PQ2，它是按照权利要求1-13中任一项的方法获得的。
15．一种制备人参馏分PQ223的方法，该方法包括(a)按照权利要求1-13中的任一项所述的方法获得人参馏分PQ2；(b)将人参馏分PQ2分馏，得到第一洗脱馏分和第二洗脱馏分，其中所述第一洗脱馏分对应于洗脱体积在35-50ml之间所观察到的碳水化合物峰，所述第二洗脱馏分对应于洗脱体积在50-85ml之间所观察到的碳水化合物峰，这是通过凝胶过滤色谱法采用下列原料测定的(1)一个色谱柱，内装有烯丙基葡聚糖和N，N′-亚甲基双丙烯酰胺的球形交联共聚物基质，该色谱柱的床层尺寸为16×600mm，床层体积为120ml，该色谱柱的分馏范围(MW)对于球蛋白是5000-250，000，对于葡聚糖是1000-80，000；和(2)含有0.1N HCl和0.3M NaCl且pH为7.0的Tris-HCl洗脱缓冲液；和(c)分离并将第一洗脱馏分和第二洗脱馏分合并，制得人参馏分PQ223。
16．如权利要求15所述的方法，其中人参馏分PQ2是通过凝胶过滤色谱法分馏的。
17．如权利要求15或16所述方法制备的人参馏分PQ223。
18．一种制备人参馏分CVT-E002的方法，该方法包括(a)将美国人参和含有醇的第一溶剂以每克人参约7-9ml第一溶剂的比例混合，并将所得溶液在约80-100℃的温度下加热约2-4小时，制得第一人参溶液；(b)随后将上述第一人参溶液分离，得到醇/人参溶液和第一人参残余物；(c)再将上述第一人参残余物和水以约7-9ml的水/克人参残余物的比例混合，将所得人参残余物溶液在约80-100℃的温度下加热约2-4小时，制得人参残余物溶液；(d)进而将所得人参残余物溶液分离，制得第二人参残余物和含有人参提取物的水提液；和(e)干燥或浓缩上述水提液，得到人参馏分CVT-E002。
19．如权利要求18所述的方法，其中在步骤(a)中第一溶剂和样品是以每克样品约8ml第一溶剂的比例混合。
20．如权利要求18所述的方法，其中在步骤(c)中水和第一人参残余物是以每克人参残余物约8ml水的比例混合。
21．如权利要求18所述的方法，其中在步骤(a)中将第一人参溶液加热约3小时。
22．如权利要求18所述的方法，其中在步骤(c)中将所述人参残余物溶液加热约3小时。
23．如权利要求18所述的方法，其中第一溶剂中的醇包括饱和或不饱和C1-C6醇。
24．如权利要求18所述的方法，其中第一溶剂中的醇包括乙醇或甲醇。
25．由权利要求18-24中任一项所述的方法制备的人参馏分CVT-E002。
26．一种含有碳水化合物的人参馏分，所述碳水化合物包括约2-6mol％鼠李糖、约41-49mol％半乳糖醛酸、约12-18mol％葡萄糖、约16-22mol％半乳糖和约12-19mol％阿拉伯糖。
27．如权利要求26所述的人参馏分，其中所述碳水化合物包括约3-5mol％鼠李糖、约43-47mol％半乳糖醛酸、约14-16mol％葡萄糖、约18-20mol％半乳糖和约14-17mol％阿拉伯糖。
28．如权利要求26所述的人参馏分，其中所述碳水化合物包括约4mol％鼠李糖、约45mol％半乳糖醛酸、约15mol％葡萄糖、约19mol％半乳糖和约15mol％阿拉伯糖。
29．一种含有碳水化合物的人参馏分，所述碳水化合物包括约3-8mol％鼠李糖、约36-44mol％半乳糖醛酸、约2-7mol％葡萄糖、约25-33mol％半乳糖和约17-25mol％阿拉伯糖。
30．如权利要求29所述的人参馏分，其中所述碳水化合物包括约4-7mol％鼠李糖、约37-42mol％半乳糖醛酸、约3-6mol％葡萄糖、约27-32mol％半乳糖和约19-24mol％阿拉伯糖。
31．如权利要求29所述的人参馏分，其中所述碳水化合物包括约5mol％鼠李糖、约39mol％半乳糖醛酸、约4mol％葡萄糖、约29mol％半乳糖和约21mol％阿拉伯糖。
32．一种含有碳水化合物的人参馏分，所述碳水化合物包括约0.5-5mol％鼠李糖、约11-22mol％半乳糖醛酸、约40-60mol％葡萄糖、约10-19mol％半乳糖和约11-19mol％阿拉伯糖。
33．如权利要求32所述的人参馏分，其中所述碳水化合物包括约1-3mol％鼠李糖、约13-20mol％半乳糖醛酸、约42-57mol％葡萄糖、约12-17mol％半乳糖和约13-17mol％阿拉伯糖。
34．一种药物组合物，该组合物含有与药物可接受载体组合的如权利要求14、17和25-33中任一项所述的人参馏分。
35．权利要求14、17和25-33中任一项所述的人参馏分单独或和另一种药物联合在制备适用于治疗以免疫力低下为特征的疾病的药物组合物中的应用。
36．如权利要求35所述的应用，其中所述疾病选自感冒、流行性感冒、慢性疲劳综合征、AIDS和癌症。
37．权利要求14、17和25-33中任一项所述的人参馏分在刺激细胞中IL-1、IL-6和/或TNF-α生成中的应用。
38．权利要求14、17和25-33中任一项所述的人参馏分在体外或体内刺激免疫球蛋白生成中的应用。
39．权利要求14、17和25-33中任一项所述的人参馏分在激活B淋巴细胞增殖和由此激活抗体生成中的应用。
40．一种治疗患者患有的以免疫力低下为特征的疾病的方法，该方法包括给所述患者施用治疗有效量的如权利要求14、17和25-33中任一项所述的人参馏分。
41．如权利要求40所述的方法，其中所述疾病选自感冒、流行性感冒、慢性疲劳综合征、AIDS和癌症。
42．一种制备人参馏分PQ2A的方法，该方法包括(a)按照权利要求1-13中任一项所述的方法获得人参馏分PQ2；(b)将人参馏分PQ2分馏，生成一种洗脱馏分，通过凝胶过滤色谱法并采用下列材料测定，该馏分对应于洗脱体积在35-50ml之间所观察到的碳水化合物峰(1)一个色谱柱，内装有烯丙基葡聚糖和N，N′-亚甲基双丙烯酰胺的球形交联共聚物基质，该色谱柱的床层尺寸为16×600mm，床层体积为120ml，该色谱柱的分馏范围(MW)对于球蛋白是5000-250，000，对于葡聚糖是1000-80，000；和(2)含有0.1N HCl和0.3M NaCl且pH为7.0的Tris-HCl洗脱缓冲液；和(c)分离上述洗脱馏分得到人参馏分PQ2A。
43．按照权利要求42所述方法制备的人参馏分PQ2A。
44．一种制备人参馏分PQ2B的方法，该方法包括(a)按照权利要求1-13中任一项所述的方法获得人参馏分PQ2；(b)将人参馏分PQ2B分馏，生成一种洗脱馏分，通过凝胶过滤色谱法并采用下列材料测定，该馏分对应于洗脱体积在50-85ml之间所观察到的碳水化合物峰(1)一个色谱柱，内装有烯丙基葡聚糖和N，N′-亚甲基双丙烯酰胺的球形交联共聚物基质，该色谱柱的床层尺寸为16×600mm，床层体积为120ml，该色谱柱的分馏范围(MW)对于球蛋白是5000-250，000，对于葡聚糖是1000-80，000；和(2)含有0.1N HCl和0.3M NaCl且pH为7.0的Tris-HCl洗脱缓冲液；和(c)分离上述洗脱馏分得到人参馏分PQ2B。
45．按照权利要求44所述方法制备的人参馏分PQ2B。
46．一种制备人参馏分PQ2C的方法，该方法包括(a)按照权利要求1-13中任一项所述的方法获得人参馏分PQ2；(b)将人参馏分PQ2分馏，生成一种洗脱馏分，通过凝胶过滤色谱法并采用下列材料测定，该馏分对应于洗脱体积在95-110ml之间所观察到的碳水化合物峰(1)一个色谱柱，内装有烯丙基葡聚糖和N，N′-亚甲基双丙烯酰胺的球形交联共聚物基质，该色谱柱的床层尺寸为16×600mm，床层体积为120ml，该色谱柱的分馏范围(MW)对于球蛋白是5000-250，000，对于葡聚糖是1000-80，000；和(2)含有0.1N HCl和0.3M NaCl且pH为7.0的Tris-HCl洗脱缓冲剂；和(c)分离上述洗脱馏分得到人参馏分PQ2C。
47．按照权利要求46所述方法制备的人参馏分PQ2C。
48．一种制备人参馏分PQ2D的方法，该方法包括(a)按照权利要求1-13中任一项所述的方法获得人参馏分PQ2；(b)将人参馏分PQ2分馏，生成一种洗脱馏分，通过凝胶过滤色谱法并采用下列材料测定，该馏分对应于洗脱体积在120-250ml之间所观察到的碳水化合物峰(1)一个色谱柱，内装有烯丙基葡聚糖和N，N′-亚甲基双丙烯酰胺的球形交联共聚物基质，该色谱柱的床层尺寸为16×600mm，床层体积为120ml，该色谱柱的分馏范围(MW)对于球蛋白是5000-250，000，对于葡聚糖是1000-80，000；和(2)含有0.1N HCl和0.3M NaCl且pH为7.0的Tris-HCl洗脱缓冲液；和(c)分离上述洗脱馏分得到人参馏分PQ2D。
49．按照权利要求48所述方法制备的人参馏分PQ2D。
50．一种组合物，该组合物含有下列人参馏分中的至少两种(a)如权利要求43所述的人参馏分PQ2A；(b)如权利要求45所述的人参馏分PQ2B；(c)如权利要求47所述的人参馏分PQ2C；和(d)如权利要求49所述的人参馏分PQ2D。
全文摘要
本发明涉及制备北美人参(西洋参)馏分的化学方法和含有这些馏分的组合物。本发明的产物可用于刺激细胞因子和/或抗体的生成,或作为以免疫力低下为特征的疾病如感冒、流行性感冒、慢性疲劳综合征、AIDS和癌症的靶向治疗剂。
文档编号A61K36/00GK1285752SQ98812069
公开日2001年2月28日 申请日期1998年12月11日 优先权日1997年12月12日
发明者杰奎琳·J·单, 彼得·K·T·庞, 黄步汉, 凌雷 申请人:Cv技术公司