去饱和酶基因及其用途的制作方法

专利名称：去饱和酶基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的去饱和酶及其用途。
在过去的几年里，已经从高等植物(最值得注意的是鼠耳芥拟南芥菜(Arabidopsisthaliana))分离出许多微粒体和可溶性脂肪酸去饱和酶。这是用基因和生物化学的组合方法来产生和补充脂肪酸去饱和作用或延伸作用缺陷的突变型拟南芥菜而得到的(Somerville C，Browse J(1996)Trends Cell Biol.6，148-1153)。该方法的重要性通过分离并特性分析了编码微粒体去饱和酶的基因而得到证实，这些去饱和酶例如是Δ12去饱和酶(Okuley J.等人，(1994)，Plant Cell 6.147-158)和Δ15去饱和酶(Arondel V，等人，(1992)Science 258，1353-1355)，它们分别由FAD2和FAD3基因编码，在以前由于这些酶具有疏水性，因此很难采用经典的纯化技术获得。分离了这些酶及相关的酶(例如蓖麻的Δ12羟化酶(van de Loo FN等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，6743-6747))，就能鉴定植物微粒体去饱和酶中许多保守的基序，其中最值得注意的是所谓的“组氨酸盒”(Shanklin，J等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，674306747)。含有这些基序的蛋白质可归类为含有两个铁中心的酶(Shanklin，J等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，2981-1986)。
WO93/11245(Du Pont)公开了从各种植物中分离出的编码去饱和酶、尤其是Δ12和Δ15去饱和酶的各种核酸片段。最近，通过对这些组氨酸基序进行高度简并的PCR，从积累γ-亚油酸(GLA)的植物琉璃苣(Borago officinalis)中分离出一个cDNA克隆。US5614393(Rhone-Poulenc Agrochimie)公开并要求了琉璃苣Δ6去饱和酶核苷酸序列的专利。尽管其说明书提示本领域技术人员可以毫不困难地从动物细胞中分离出编码Δ6去饱和酶的核酸，但是却没有指出合适的动物细胞(与提示真菌和细菌细胞相反)，也没有公开从动物细胞分离这些核酸的技术。该分离的DNA克隆在转基因烟草中显示为异源表达，编码一个微粒体Δ6去饱和酶(Sayanova O等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，4211-4216)。Δ6位的去饱和作用是高等植物中不同寻常的修饰，只发生于种子和/或叶子中积累Δ6-不饱和脂肪酸GLA和十八碳四烯酸(OTA∶18∶4Δ6，9，12，15，也称为硬脂四烯酸(stearidonic acid))的少数植物如琉璃苣、月见草(月见草属)和红浆果(茶藨子属)中。
GLA是一种高价值的植物脂肪酸，广泛用于治疗多种医学疾病，包括湿疹和乳腺痛。现假定，GLA的应用代替了内源Δ6-不饱和脂肪酸的损失或满足了对内源Δ6-不饱和脂肪酸的增加的需要(Horrobin，D.F.(1990)Rev.Contemp.Pharmacother.11-45)。
为了参考目的，图5简单地示出了认为在某些生物(包括人)中发生并涉及Δ6去饱和酶的代谢途径。可以看出，GLA可以在Δ6去饱和酶作用下体内由亚油酸合成，而GLA可用来合成二高-GLA，而后者能在Δ5去饱和酶作用下转变成花生四烯酸。花生四烯酸是各种重要的类二十烷酸(包括前列腺素和白三烯)的前体。Δ6去饱和酶还将α亚油酸转变成OTA。因此，Δ6去饱和酶显然是这些生物活性分子生物合成途径的第一个关键步骤(见图5)。
以前分离的琉璃苣微粒体Δ6去饱和酶的序列与以前鉴定的植物微粒体去饱和酶/羟化酶的不同之处在于它含有与细胞色素b5同源的N-端延伸序列，而且第三个(最靠C端)组氨酸盒与共有序列H-X-X-H-H(Shanklin H等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，2981-1986)不同，以谷氨酰胺替代了第一个组氨酸。发现在蓝细菌集胞蓝细菌Δ6去饱和酶(GenBank IDL11421)情况下也是如此。WO93/06712(Rhone PoulencAgrochimie)公开了一种编码分离自集胞蓝细菌属的Δ6去饱和酶的分离的核酸，并要求了该细菌Δ6去饱和酶及其应用的专利权。
尽管Δ6脂肪酸去饱和酶作用在高等植物中是不同寻常的修饰，但是认为它在动物中是共同的。类二十烷酸(包括前列腺素和白三烯)生物合成途径的第一步是必需脂肪酸亚油酸(18∶2Δ9，12)受Δ6去饱和酶作用去饱和形成GLA。这导致GLA迅速代谢(成为二高-GLA和花生四烯酸；即分别是20∶3Δ8，11，14和20∶4Δ5，8，11，14)。因此通常观察不到GLA的积累。
线虫Caenorhabitis elegans是非常有用的，因为它的遗传学被充分了解，并且与高等动物(如人)有许多相似之处，因此非常适合用来开发用于这些动物的去饱和酶。
本发明提供了具有去饱和酶活性的多肽，它包含

图1所示的氨基酸序列。
图1所示的氨基酸序列是存在于线虫Caenorhabitis elegans中的Δ6去饱和酶的序列。这是非常有意义的，因为在本发明之前没有报道对动物Δ6去饱和酶的成功测序和纯化。由于C.elegans不积累GLA，因此从此线虫分离Δ6去饱和酶对分离去饱和酶基因而言它是一个未曾想到的目标。
本发明的去饱和酶与已知的去饱和酶明显不同。经用BESTFIT程序测定，本发明的Δ6去饱和酶与WO93/11245中描述的拟南芥菜的微粒体Δ12和Δ15去饱和酶之间的同源性分别为24％和16％。本发明的Δ6去饱和酶基因与Spychalla，J.P.等人Proc.Natl.Acad.Sci 94 1142-1147中描述的C.elegans FAT-1去饱和酶只有21％的相同性。本发明的Δ6去饱和酶与WO93/06712中的集胞蓝细菌属之间的序列同源性只有23％。
因此，本发明另一方面提供了一种分离的动物Δ6去饱和酶。
图1所示的氨基酸序列也是有意义的，因为其与琉璃苣Δ6去饱和酶(在本发明之前仅有的另一个经测序的真核生物Δ6去饱和酶)的序列相同性非常低实际上，该序列相同性低于32％。在如此低的相同性水平下，预计这两种多肽将具有完全不同的功能。出乎意料的是，两者均具有去饱和酶活性。
然而，本发明并不局限于具有图1所示序列的Δ6去饱和酶。它还包括与其序列相同性至少为32％的其它去饱和酶。本发明的较佳的多肽与图1所示序列有至少40％(更佳的至少50％)的氨基酸序列相同性。更佳的该序列相同性程度至少为75％。序列相同性为至少90％、至少95％或至少99％是最佳的。
出于本发明的目的，可用Wisconsin序列分析软件包GCG 8.0的“BESTFIT”程序来测定序列相同性(无论是氨基酸还是核苷酸)。
当有高度序列相同性时，氨基酸序列的差别可能相当少。因此，例如可能少于20、10或甚至不到5个差别。
上述的多肽片段也在本发明范围内，只要它们具有去饱和酶活性，也就是说它们具有将双键导入底物特定位置的能力(通过GCMS测定)，这是活性的最低限度。这些片段宜至少长100个氨基酸。更佳的，该片段至少长150个氨基酸。
总之，本发明的多肽具有去饱和酶活性，并且a)包含图1所示氨基酸序列；b)相对于上述a)中定义的多肽有一个或多个氨基酸缺失、插入或替换，但是与该多态的氨基酸序列相同性至少为32％；或c)是上述a)或b)中确定的多肽的片段，其长度至少有100个氨基酸。
本文所用的术语“多肽”广义上指包含由肽键连接在一起的多个氨基酸的特定分子。因此，其范围内包括的物质有时在文献中称为肽、多肽或蛋白质。
理想的是本发明的多肽具有一个细胞色素结构域。细胞色素结构域可以定义为含有一个血红素辅基的电子运送结构域。较佳的是存在一个细胞色素b结构域。更佳的是存在细胞色素b5结构域(理想的是它包括H-P-G-G-X15-F-X3-6-H基序，其中X是任何氨基酸)。细胞色素b5结构域存在于图2B所示的琉璃苣Δ6去饱和酶和C.elegansΔ6去饱和酶氨基酸序列中。细胞色素b5结构域宜为N-端结构域—即它距去饱和酶的N端比C端近。这与其它去饱和酶相反。例如，酵母Δ9去饱和酶具有C-端细胞色素b5结构域，而植物Δ12和Δ15去饱和酶没有任何b5结构域。
本发明的多肽宜具有一个或多个(最佳的有三个)组氨酸盒。其中一个可能有H→Q替换。(这提供了认为在一定范围的动物/植物种类中保守的一种组氨酸盒的变体。)本发明的多肽可以具有任何区域特异性(包括顺/反活性)，但是较佳的它们是在C3和C7位(从基团的COOH(Δ尾端)来计算)之间引入双键的前端去饱和酶。本领域技术人员容易通过测定去饱和酶引入的双键的不同位置来区别不同的去饱和酶。这可用已知的分析技术来实现，例如采用气相色谱和质谱法。
特别佳的去饱和酶是Δ6去饱和酶。
理想的是该去饱和酶天然存在于不积累GLA的一种或多种生物中(即此生物能产生GLA，但是GLA通常不能被检测到，因为它被非常迅速的代谢掉)。这些去饱和酶可能天然存在于一种或多种动物中。这些去饱和酶天然存在于一种或多种线虫中，例如C.elegans中。
为了更全面地了解本发明的范围，现在将更详细地描述在上述a)、b)和c)范围内的多肽。
范围a)内的多肽范围a)内的多肽可由图1所示氨基酸序列组成，或可以具有一个额外的N端和/或一个额外的C端氨基酸序列。
额外的N端或C端序列可因各种理由而提供，提供这些额外序列的技术是本领域所熟知的。这些技术包括采用基因-克隆技术，从而将核酸分子连接在一起，然后用来在合适宿主中表达多肽。
为了改变特定多肽的特征，可以提供额外的序列。这可用于在特定表达系统中改进表达或调节表达。例如，此额外的序列可以提供保护作用防止蛋白水解切割。
额外的序列还可用来改变多肽的性质以帮助鉴定或纯化。例如，可以由一个信号序列来指导多肽运输至细胞内的特定位置，或将多肽运输出细胞。不同的信号序列可用于不同的表达系统。
提供额外序列的另一个例子是使多肽与能被亲和层析分离的部分连接。该部分可能是一个表位，而亲和柱可包含结合所述表位(理想的是以高度特异性结合)的固定的抗体或固定的抗体片段。所得融合蛋白通常可通过加入合适的缓冲液来洗脱下柱。
然而，额外的N-端或C-端序列的存在仅仅是作为用来获得本发明多肽的一种特定技术的结果，而不需要提供特定的有利特征。
范围b)内的多肽现在看上述b)中确定的多肽，应理解这些多肽是上述a)中给出的多肽的变体。
通常可以对具有所需性质的多肽氨基酸序列进行各种改变，以便产生仍然具有该性质的变体。上文a)中描述的多肽的这些变体在本发明范围内，并且在下文章节(ⅰ)至(ⅲ)中有更详细的讨论。它们包括等位基因和非等位基因变体。
(ⅰ)替换本发明变体的一个例子是上文a)中确定的多肽，只是有一个或多个氨基酸被其它的一个或多个氨基酸替换。
本领域技术人员都知道，不同的氨基酸可具有相似的性质。多肽中的一个或多个这样的氨基酸通常可以被一个或多个其它的氨基酸替换而不至于除去该多肽的所需性质(如去饱和酶活性)。
例如，氨基酸甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸(具有脂肪族侧链的氨基酸)通常可相互替换。在这些可能的替换中，较佳的是甘氨酸和丙氨酸之间相互替换(因为它们具有较短的侧链)，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸之间相互替换(因为它们具有较长的疏水性脂肪族侧链)。其它常可相互之间替换的氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳族侧链的氨基酸)；赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；以及半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。
具有该特征的替换通常称为“保守的”或“半保守的”氨基酸替换。
(ⅱ)缺失氨基酸缺失是可能有利的，因为这样可以减少多肽的整体长度和分子量而仍维持所需的活性。这样能使特定目的所需的多肽数目减少。
(ⅲ)插入还可对上文a)中定义的多肽作氨基酸插入。插入可能改变该多肽的性质(例如有助于鉴定、纯化或表达)。
相对于上文a)定义的多肽序列掺入氨基酸变化(无论是替代、缺失还是插入)的多肽可用任何合适的技术来提供。例如，可通过定点诱变提供掺入所需序列变化的核酸序列。然后可用它来表达氨基酸序列中具有相应改变的多肽。
范围c)内的多肽如上所述，减少多肽长度通常是有利的。因此，本发明的特征c)包括了长度至少有100个氨基酸、但不需要象图1所示全长多肽那样长的上述a)或b)的多肽的片段。理想的是这些片段的氨基酸长度至少有200个，至少有300个或至少有400个。
现在将参照实施例来描述本发明多肽的各种用途。
可用本发明的多肽来获得有用的分子。例如，Δ6去饱和酶可用来获得γ-亚麻酸(GLA)或GLA是前体的代谢物。例如，可通过α-亚麻酸的Δ6去饱和作用来产生十八碳四烯酸(OTA；18∶4Δ6，9，12，15，n-3(或ω-3)脂肪酸的一个成员)。
GLA、OTA及其代谢物可用作药品。它们可用来制备一种药剂，该药剂可用来治疗涉及缺乏GLA或GLA体内衍生的代谢物(例如类二十烷酸)的疾病。可治疗的疾病包括湿疹、乳腺痛、高胆固醇血症、动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病性神经病、病毒性感染、痤疮、高血压、肝硬化和癌症。
这些代谢物可由合适的宿主在体内或体外产生。
当在体外产生代谢物时，通常是分开提供本发明的去饱和酶及其底物，然后在希望产生该代谢物的时候将它们合并。因此，本发明的范围包括一种制备GLA或OTA的方法，该方法包括用本发明的Δ6去饱和酶将亚油酸底物或α-亚麻酸底物分别转变成GLA或OTA。
当代谢物在诸如植物或动物的生物中产生时，通常由有关的非人生物本身来提供本发明的去饱和酶底物。因此，代谢物的体内产生可通过将编码本发明去饱和酶的基因插入生物中并使该生物表达去饱和酶来实现。然后该去饱和酶作用于其底物。因此，应理解，本发明的多肽可用来在通常不具有这种活性的生物中提供去饱和酶活性，或在已经具有一些去饱和酶活性的生物中提高去饱和酶活性的水平。如果需要，可以从这种生物中纯化有用的代谢物。或者，该生物本身可直接用作代谢物来源。下面将讨论可用来提供具有去饱和酶活性的转基因生物的特定的克隆技术。
本发明的多肽还可用作生物转化作用的指示剂。例如，如果待转化的生物不具有特定的去饱和酶以及用于转化的编码该去饱和酶的核酸，则在尝试性转化后可以进行试验来确定去饱和酶是否存在。因此，在Δ6去饱和酶情况下，可进行测定GLA存在的试验，GLA可作为简单的标记来确定含有Δ6去饱和酶编码序列的功能性转基因盒的存在。
本发明的另一个用途是提供抗体。本发明的范围包括结合本发明多肽的抗体。
较佳的抗体可特异性结合本发明多肽，因此可用来纯化这些多肽。(例如可将它们固定并用来结合本发明的多肽。然后通过用合适的洗脱剂在合适的条件下进行洗涤来洗脱该多肽。)本发明范围内的抗体或其衍生物可用于诊断。例如，采用这种抗体或衍生物的结合试验可用来确定是否存在特定的去饱和酶。这可用来诊断由于缺乏功能性去饱和酶而引起的疾病。
本发明范围内的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
多克隆抗体可以这样产生将本发明的多肽注射入动物体内，在合适的动物宿主(例如小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、绵羊、山羊或猴子)中刺激该抗体生成。如果需要，一种佐剂可以和本发明多肽一起给予。然后，利用抗体与本发明多肽的结合，纯化该抗体。
单克隆抗体可从杂交瘤产生。这些杂交瘤可通过将骨髓瘤细胞和产生所需抗体的脾细胞融合来形成，以形成无限增殖的细胞系。因此，可以采用众所周知的Kohler&Milstein技术(Nature 256 52-55(1975))或该技术的变化方案。
现在，用来产生结合特定多肽的单克隆和多克隆抗体的技术在本领域中已经很好地建立。它们在免疫学标准教科书中有所讨论，例如Roitt等人，《免疫学》第2版(1989)，Churchill Livingstone，London。
除了全抗体，本发明还包括能结合本发明多肽的抗体衍生物。因此，本发明包括抗体片段和合成的构建物。Dougall等人在Tibtech 12 372-379(1994年9月)中给出了抗体片段和合成构建物的例子。
抗体片(段例)如包括Fab，F(ab′)2和Fv片段。(这些在上文的Roitt等人的书中有所描述)。可对Fv片段进行修饰，以产生称为单链Fv(scFv)分子的合成构建物。这包括共价连接Vh和V1区的肽接头，该接头赋予分子稳定性。可采用的其它合成构建物包括CDR肽。这些是包含抗原结合决定簇的合成的肽。还可采用肽模拟物。这些分子通常是构型受到限制的有机环，它模拟了CDR环的结构并包括与抗原相互作用的侧链。
合成的构建物包括嵌合分子。因此，例如人化(或灵长化)抗体或其衍生物也在本发明范围内。人化抗体的一个例子是具有人构架区、但有啮齿类动物超变区的抗体。
合成的构建物还包括包含额外部分的分子，该额外部分除抗原结合性外还为分子提供了某些所需的性质。例如该部分可能是一个标记(例如荧光或放射活性标记)。或者，它可能是一种药物活性剂。
本发明范围内还包括核酸分子。
这些核酸分子a)编码本发明的多肽；或b)与上文a)定义的分子互补；或c)与上文a)或b)定义的分子杂交。
这些核酸分子及其用途在下文有更详细的讨论考虑到熟知的遗传密码简并性，本发明的多肽可以由多种核酸分子编码。所有这些编码核酸分子均在本发明范围内。较佳的编码核酸分子编码了图1所示的多肽。它们包括含有图1所示编码序列的核酸分子及其简并性变体。
核酸分子可以直接使用。或者，它们可被插入载体中。
核酸或含有该核酸的载体可用于克隆。它们可用本领域技术人员已知的技术来导入非人宿主中，从而能够表达本发明的多肽。另外，可以采用无细胞表达系统。
用来克隆、表达和纯化多肽的技术是本领域技术人员所熟知的。各种这些技术公开在标准的教科书中，例如Sambrook等人《分子克隆》第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)；Old&Primrose《基因操作理论》第5版，Blackwell ScientificPublications(1994)；以及Stryer《生物化学》第4版，W H Freeman and Company(1995)。
利用合适的表达系统，可以产生所需形式的多肽。例如，多肽可以由微生物(如细菌或酵母)、培育的昆虫细胞(可能是被杆状病毒感染的昆虫细胞)或哺乳动物细胞(如CHO细胞)产生。
然而，较佳的宿主是植物或植物的繁殖性物质，例如油菜、向日葵、谷类包括玉米、烟草、荚果包括花生和大豆、红花、油棕、椰子和其它棕榈、棉花、芝麻、芥菜、亚麻籽、蓖麻、琉璃苣和月见草，或它们的繁殖性物质。
现在，提供植物或植物繁殖性物质的技术已经很好地建立了。该技术例如在WO96/21022中有所讨论。从动物中分离出的去饱和酶已经成功地在植物中表达。例如，Spychalla，J.P.等人(见上文)描述了在转基因拟南芥菜中表达C.elegans去饱和酶。另外，EP0550162(Pioneer Hi-Bred International，Inc)公开了从转化了产生脂肪酸的构建物的大鼠和植物中分离的编码Δ9去饱和酶的嵌合基因构建物。该出版物中描述的去饱和酶与本发明的Δ6去饱和酶只有22％的相同性。
下面讨论可采用的特定技术。当然应理解这些技术没有限制性。
(ⅰ)基于根癌农杆菌的载体系统它们包括Ti为基础的系统，例如pGV3850，其中T-DNA已经被拆除。需要的是存在一个可选择的标记(例如提供抗生素抗性的标记)。
还可采用中间载体(Ⅳ)。它们很小，因此比大的Ti为基础的载体更容易操纵。Ⅳ通常是由克隆到大肠杆菌衍生的质粒载体(如pBR322)的T-DNA产生的载体。Ⅳ通常是接合缺陷型的，因此可以采用精通接合的质粒(例如pRK2013)来移动Ⅳ，从而使它能转移到土壤杆菌接受者中。然后在土壤杆菌中会发生体内同源重组，以使Ⅳ插入一个残留的、拆除的Ti质粒中，以便产生一个在土壤中能自主复制的共合体。
另一种变化方案是采用双元Ti载体。这里，可以在大肠杆菌(如pRK252)中复制的小质粒上提供携带外来DNA的修饰的T-DNA区。然后，通过三亲交配，将该质粒(有时称为微小Ti(mini-Ti或micro-Ti))偶联转移到含有相容vir基因的根癌农杆菌(以反式提供vir功能)中。
甚至还可采用没有Ti序列的双元载体。在这里可以用细菌mob和oriT功能来促进质粒转移。同样，可以反式提供vir功能。
上述载体系统可用Horsch等人(Science 227，119-31(1985))的方法或其变化方案来将基因转移到植物。在这里，可以从双子叶植物叶片上冲下小圆片，对它们进行表面消毒，然后放在包含根癌农杆菌的培养基中，该根癌农杆菌含有重组T-DNA，在T-DNA中待转移的外来基因伴有一个可选择标记(例如neo基因)。然后培育这些圆片2天，然后转移到培养基中筛选可选择的标记。(对于neo可选择标记，可以用含卡那霉素的培养基进行培养来实现)。用含有羧苄青霉素的培养基杀死根癌农杆菌。芽苗通常在2-4周后从胼胝体发育。然后将它们切下，在大到足以移植到土壤中时，移植到诱导生根的培养基中。
(ⅱ)基于发根土壤杆菌的载体系统这些系统包括Ri衍生的质粒。通常认为Ri T-DNA是无害的，因此这些质粒可认为与拆除的Ti质粒等效。现已建立了基于Ri质粒的Ⅳ共合体系统。
(ⅲ)基于转化系统的植物原生质体适用的技术在H.Jones编辑的《植物基因转移和表达方法》Human Press Methodsin Molecular Biology，49，1995中有所描述。
植物的转化可通过除去植物细胞壁提供原生质体来实现。细胞壁可用任何合适的方法来除去，这些方法包括机械破碎或用溶解细胞和分解果胶的酶进行处理。然后可通过离心将原生质体与其它组分分离，然后用诸如电穿孔的技术用异源DNA转化原生质体。在合适的培养条件下，转化的原生质体将长出新的细胞壁并且同样分裂。然后可以诱导茎干和根，形成小植株。
(ⅳ)生物溶解素的转染可用携带DNA或RNA的高速微粒将该DNA或RNA输送入植物细胞中。这种技术可以产生各种各样的转基因植物，并且适合单子叶植物和双子叶植物。例如，可以采用包被了DNA或RNA的金或钨颗粒。发射微粒的合适装置包括火药为基础的装置、电荷为基础的装置和风动装置。
(ⅴ)病毒为基础的系统DNA植物病毒载体包括花椰菜花叶病毒(它感染一定范围的双子叶植物)和双粒病毒组(它们感染各种双子叶植物和单子叶植物)。RNA植物病毒占多数，它们包括雀麦草花叶病毒(它感染许多禾本科植物，包括大麦)和烟草花叶病毒(它感染烟草植物)。
从前文描述的内容可以理解，编码本发明多肽的核酸分子可以在各种生物中克隆和表达。
除了编码本发明多肽的核酸分子(在文中称为“编码性”核酸分子)外，本发明还包括与其互补的核酸分子。因此，例如双链核酸分子的两条链均包括在本发明的范围内(无论它们彼此是否相互结合)。本发明还包括了mRNA分子和互补的DNA分子(例如cDNA分子)。
本发明还包括了能与上述的一个或多个核酸分子杂交的核酸分子。这些核酸分子在本文中称为“杂交性”核酸分子。
本发明的杂交性核酸分子在其长度上与上述范围a)或b)中的核酸分子可能有高度的序列相同性(例如至少50％，至少75％，或至少90％的序列相同性)。
本领域技术人员应理解，一给定单链核酸分子与另一单链核酸分子的序列相同性程度越高，则它在合适条件下与另一单链核酸分子之互补的单链核酸分子杂交的可能性就越大。
本发明杂交分子需要的长度至少为10个核苷酸，较佳的至少为25个、至少为50个、至少为100个或至少为200个核苷酸。
较佳的杂交性分子能在严谨杂交条件下杂交。严谨杂交条件的一个例子是在约35℃至65℃的温度下用约0.9摩尔的盐溶液进行尝试性杂交。然而，本领域技术人员能适当地改变这些参数，以便将探针长度、碱基组成、存在的离子的类型等变量考虑在内。
最佳的，本发明的杂交性核酸分子与具有图1所示编码序列的DNA分子或其等价的RNA杂交、或与上述任一分子的互补序列杂交。
杂交性核酸分子例如可用作探针或引物。
探针可用来纯化和/或鉴别核酸。例如，它们可用来鉴别所有或部分去饱和酶基因的存在，因此可用于诊断。
引物可用于核酸或其部分的扩增，例如用PCR技术进行扩增。
除了用作探针或引物外，本发明的杂交性核酸分子还可用作反义分子，通过与互补的核酸分子结合来改变本发明多肽的表达。(通常，这可通过提供与通常被翻译的RNA分子结合的核酸分子并因形成双链体而防止翻译来实现。)还可以核酶形式提供杂交性分子。通过结合并切割包含被该核酶识别的特定靶序列的RNA分子，核酶也可用来调节表达。
从前述讨论可以理解，有许多核酸均在本发明的范围内。因此，除非上下文另有表示，本发明的核酸分子可以具有下列特征中的一个或多个1)它们可能是DNA或RNA(包括天然存在的DNA或RNA结构的变体，这些变体具有非天然存在的碱基和/或非天然存在的骨架)。
2)它们可能是单链或双链。
3)它们可能以重组体形式提供，即与异源5′和/或3′侧接序列共价连接，从而提供了一个非天然存在的嵌合分子(例如载体)。
4)它们可能没有天然存在的5′和/或3′侧接序列。
5)它们可以基本上纯的形式提供，例如用探针来分离具有所需靶序列的克隆的分子，或采用化学合成技术。因此，它们提供的形式可以是基本上不含污染性蛋白质和/或其它核酸的形式。
6)它们可能具有内含子(例如全长基因)或不具有内含子(例如cDNA)。
现在将仅仅以实施例并参照附图来描述本发明，在图1至6中图1显示了全长C.elegans cDNA pCeD6.1的DNA序列和推导的氨基酸序列。N端细胞色素b5结构域以及变异的第三个组氨酸盒的位置用下划线表示。该cDNA推导的氨基酸序列与W08D2.4的残基1-38和68-473所预计的相同。
图2A显示了C.elegans cDNA CeD6.1的推导的氨基酸序列与C.elegans预计蛋白W08D2.4的序列的比较(MywormD6=CeD6.1；cew08d2=ORF W08D2.4)。
图2B显示了琉璃苣Δ6去饱和酶(Sayanova O等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，4211-4216)与C.elegans cDNA CeD6.1(Boofd6=琉璃苣Δ6去饱和酶；ceeld6=CeD6.1)的推导氨基酸序列的比较。
图3显示了在诱导条件(亚油酸盐和半乳糖)下生长的酿酒酵母总脂质的甲酯。
图4显示了在携带pYCeD6.1的酵母中鉴定出的新的峰的GC-MS分析。
图5显示了n-6必需脂肪酸在哺乳动物中的代谢的流程简图。
图6显示了转化的拟南芥菜植物(A)(对照)或表达C.elegansΔ6去饱和酶的转化的拟南芥菜植物(B)的叶片物质的脂肪酸和甲酯。
实施例1-Δ6去饱和酶基因的分离和在酵母中的表达用已知的琉璃苣Δ6脂肪酸去饱和酶(Sayanova O等人(1997)同上)在NCBI EST序列数据库中搜索氨基酸序列，将搜索限制在含有变异的组氨酸盒Q-X-X-H-H的序列。
鉴定出C.elegans EST，搜索C.elegans EST工程数据库(Prof.Y.Kohara实验室(National Institute of Genetics，Mishima，Japan)；日本DNA数据库)对其作进一步特性分析，以鉴定相关的粘粒克隆。
通过这些搜索鉴定，从C.elegans EST工程获得命名为yk436b12的部分448碱基对的cDNA克隆，用它来筛选C.elegans cDNA文库(混合阶段；也由Prof Kohara提供)。这表明克隆yk436b12与形成染色体Ⅳ一部分的粘粒W08D2(Genbank登录号Z70271)上存在的部分基因同源。用蛋白质预测程序Genefinder(Wilson R等人(1994)Nature 368 32-38)预计粘粒W0D2的碱基21-2957编码了473个残基的ORF，该ORF被5个内含子间隔断。Wilson，R.等人公开了C.elegans染色体Ⅲ的部分序列。鉴定出许多阳性物，并作进一步纯化，通过测序确认全长克隆编码了一个转录物，通过对C.elegans基因组工程测序的基因进行数据库搜索确定，该转录物可能转录自粘粒W08D2上命名为W08D2.4的基因。
检查该预计的多肽(由Sanger Centre Nematode Sequencing Project，Hinxton，UK命名为W08D2.4)，揭示它具有许多特征使人会联想起微粒体脂肪酸去饱和酶，包括三个组氨酸盒。然而，该预计蛋白序列表明N-端结构域的存在与细胞色素b5类似，含有在细胞色素b5蛋白中发现的诊断性H-P-G-G基序(Lederer F(1994)Biochimie.76，674-692)。由于我们从琉璃苣中分离出的Δ6去饱和酶也含有N端b5结构域，因此这表明W0D2.4可能编码了一个Δ6去饱和酶。
更仔细地检查该序列，结果揭示存在变异的第三个组氨酸盒，H被Q置换(再次与琉璃苣Δ6去饱和酶中观察到的相同)。W08D2.4和琉璃苣Δ6去饱和酶之间的相似程度小于52％，因此该相似程度低。获得的低于31％的相同性程度也是低的。
因为W08D2.4由含有许多(6)内含子的基因编码，因此需要分离出一个全长cDNA来验证用Genefinder程序预计的序列，另外使ORF表达来确定编码的功能。
用EST插入物yk436b12(由Prof Y.Kohara慷慨赠与)来筛选cDNA文库，鉴定出许多阳性噬斑。将它们纯化至均一，切割，对所得拯救噬菌粒的最大插入物(约1450bp)进行测序。结果确认我们分离的cDNA确实与W08D2.4同源，cDNA的5′和3′端与粘粒W08D2序列的碱基9至3079等价。由于Genefinder程序预计为基因产物W08D2.4开始的ATG起始密码子确实是cDNA克隆中的第一个甲硫氨酸，我们有理由认为我们已经真正地分离出全长cDNA。图1中显示了一个典型cDNA克隆(命名为pCeD6.1；长度为1463 bp)的DNA序列和推导的氨基酸序列；推导出的氨基酸序列在该蛋白质的大部分中与W08D2.4所预计的相同。N-端细胞色素b5结构域以及变异的第三个组氨酸盒的位置用下划线表示。该cDNA的推导的氨基酸序列与W08D2.4的残基1-38和68-473所预计的相同。
然而，编码W08D2.4预计的残基38-67(Y-S-I……L-Y-F)的DNA序列不存在该cDNA克隆中。这意味着CeD6.1的推导氨基酸序列实际上长443个氨基酸，这与W08D2.4预计的长473个残基不同。这两个氨基酸序列之间的仅有的另一个区别是残基401发生M→V替代，这是由A→G碱基(碱基1211)变化而产生的。象琉璃苣Δ6去饱和酶以及CeD6.1的推导氨基酸序列(图2B)那样，在图2A中比较这两个序列。W08D2.4预计的额外序列可能产生于内含子-外显子边界的不正确预计。
注意N端存在H-P-G-G细胞色素b5基序(由碱基96-108编码)以及第三个组氨酸盒中的HQ替换(由碱基1157-1172编码)。
通过PCR方法，将W08D2.4的编码序列导入酵母表达载体pYES2中。利用具有5′突出端的寡核苷酸在5′和3′端分别引入KpnI和SacI位点。用TnT系统(Promega)进行体外转录和翻译，检查构建物的保真性。
具体地说，然后用克隆pCeD6.1作为模板来PCR扩增整个预计的编码序列(长度为443个氨基酸残基)，并克隆到酵母表达载体pYES2(Invitrogen)中，产生pYCeD6。利用pYES2中存在的T7 RNA聚合酶启动子，进行该质粒的体外转录/翻译，检查PCR-产生的序列的保真性。
利用Promega TnT偶联的转录/翻译系统，产生翻译产物，用SDS-PAGE进行分析，并按照生产商说明书进行放射自显影。结果揭示(数据未显示)质粒pYCeD6产生了一个约55kD的产物，而对照(pYES2)没有产生任何蛋白产物，这表明该构建物是正确的。
用乙酸锂方法(Guthrie c，Fink GR(1991)Meths Enz.194)将所得质粒导入酵母(酿酒酵母)中，加入半乳糖诱导转基因表达。在1％tergitol洗涤剂NP-40存在下向酵母中加入0.2 mM亚油酸盐(钠盐)。
利用pYES2携带的URA3可选择标记转化并选择能在尿嘧啶缺陷型培养基上生长的酵母，结果揭示酵母菌落携带重组质粒pYCeD6。通过诱导pYES2中存在的GAL启动子获得了pYCeD6表达。这在细胞以棉子糖作为碳源生长过夜后进行，在低水平洗涤剂存在下，在培养基中添加亚油酸盐(18∶2)。后一添加是必需的，因为Δ6去饱和酶的通常底物为18∶2脂肪酸，它并不天然存在于酿酒酵母中。
通过甲酯的GC分析酵母总脂肪酸。用GC-MS确认GLA的存在(Sayanaova等人(1997)同上)。
更详细地说，在诱导后使培养物继续生长，并取出等份进行GC分析。当用GC分析从携带质粒pYCeD6并在半乳糖和亚油酸盐存在下生长的酵母中分离出的总脂肪酸的甲酯时，观察到有一个额外的峰(图3)。在图3中，A图是对照(空)载体pYES2转化的酵母，B图用pYCeD6.1来转化酵母。常见的脂肪酸-甲酯鉴定为16∶0(峰1)、16∶1(峰2)、18∶0(峰3)、18∶1(峰4)、18∶2(峰5；外源提供)。B图中额外的峰(6)对应于18∶3 GLA，其用箭头表示。这与真实的GLA标准品的滞留时间相同，表明转基因酵母能Δ6-去饱和亚油酸。在任何一个对照样品(用pYES2转化)中均未发现有这样的峰。用GC-MS确认该额外峰的身份，结果为阳性，鉴定出该化合物为GLA(图4)。在图4实验中，如前所述(Sayanova O等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，4211-4216)用质谱法分析样品，用所得数据来搜索概貌库。鉴定出该样品为GLA。显示新峰(A)与真实的GLA(B)的质谱比较；肉眼和计算机为基础的检查揭示它们是相同的。这确证CeD6.1编码了一个C.elegansΔ6去饱和酶，而该cDNA可能由预计编码ORF W08D2.4的基因转录得到，但是CeD6.1的推导氨基酸序列比W08D2.4的推导氨基酸序列短30个残基。
实施例2-C.elegansΔ6去饱和酶在植物中的表达将C.elegansΔ6去饱和酶的编码序列亚克隆到植物表达载体pJD330中，该载体含有病毒35S启动子和一个Nos终止子。然后将所得的盒或启动子/编码序列/终止子亚克隆到植物双元转化载体pBin19中，将所得质粒导入根癌农杆菌中。然后通过真空-渗入花序用该农杆菌菌株转化拟南芥菜。收获种子并接种到含有卡那霉素的选择性培养基中。由于pBin 19赋予对该抗生素的抗性，因此只有转化的植物材料才会生长。鉴定有抗性的株系，自体受精产生纯合的材料。用线虫去饱和酶在酵母中表达的相同方法分析叶片物质中的脂肪酸概貌。用GC分离脂肪酸甲酯，通过已知标准品和GCMS比较，鉴定图6中所示的新的峰。在(B)中可以看到两个新的峰，它们被鉴定为γ亚麻酸(峰1)和十八碳四烯酸(峰2)。这些分别是前体脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸的Δ6去饱和作用的产物。
本发明者已经表明，C.elegans cDNA(CeD6.1)编码一个Δ6去饱和酶，该序列与预计的ORF W08D2.4相同，只是在后一蛋白的N-端区域内存在一个30残基的插入物。还不清楚CeD6.1预计推导的氨基酸序列是代表了W08D2.4的一个剪接变体，还是Genefinder程序对内含子/外显子接头错误预计的结果。然而，CeD6.1显然编码Δ6去饱和酶。
该C.elegans序列编码的ORF看来与我们以前分离的高等植物Δ6脂肪酸去饱和酶(Sayanova O等人(1997)同上)有关，因为它们都含有显示出与细胞色素b5同源的N端结构域。已经证实，微粒体脂肪酸去饱和酶用游离的微粒体细胞色素b5作为它们的电子供体(Smith MA，等人(1990)Biochem.J.272，23-29，Smith MA等人(1992)Biochem.J.287，141-144)，而这些酶的绝大多数已经鉴定的序列看来不含此额外的细胞色素b5结构域(Okuley J等人(1994)Plant Cell 6，147-158，Aronel V.等人(1992)Science 258，1353-1355和Napier，J.A.等人(1997)Biochemical J，328717-8)。
在本发明之前只知道两个含有细胞色素b5结构域的去饱和酶例子，一个是琉璃苣Δ6去饱和酶，另一个是酵母微粒体Δ9(OLE1)去饱和酶(Napier JA等人(1997)Biochemical J，同上和Mitchell AG，Martin CE(1995)J.Biol.Cehm 270，29766-29772)。然而，OLE1含有C端细胞色素b5结构域(Napier J A等人(1997)Biochemical J.在版以及Mitchell AG，Martin CE(1995)J.Biol.Chem.270，29766-29772)。细胞色素b5的原因可能是该Δ6去饱和酶是“前端(front-end)型”去饱和酶。(“前端型”去饱和作用可以定义成脂肪酸链上最终的去饱和反应，通常在预先存在的键和羧基Δ端之间引入双键(Mitchell AG，Martin CE(1995)J.Biol.Chem 270，29766-29772和Aitzetmuller K，Tseegsuren，N(1994)J.Plant Physiol.143，538-543)。)无论如何，现在认为变异的组氨酸盒以及N端细胞色素b5结构域在动物和植物中均是保守的，其证据是它们存在于琉璃苣和线虫的Δ6去饱和酶中。
因此，本发明能鉴定其它Δ6去饱和酶，以及通过这些基序的存在来鉴定的其它“前端型”去饱和酶。
权利要求
1．一种具有去饱和酶活性的多肽，它a)具有图1所示的氨基酸序列；b)相对于上述a)中定义的多肽有一个或多个氨基酸缺失、插入或替换，但是与该序列的氨基酸序列相同性至少为32％；或c)是上述a)或b)中定义的多肽的片段，其长度至少为100个氨基酸。
2．根据权利要求1所述的多肽，它具有细胞色素结构域。
3．根据权利要求2所述的多肽，它具有细胞色素b5结构域。
4．根据前述任一权利要求所述的多肽，它具有至少一个组氨酸盒。
5．根据前述任一权利要求所述的多肽，它具有三个组氨酸盒。
6．根据前述任一权利要求所述的多肽，它是前端型去饱和酶。
7．根据前述任一权利要求所述的多肽，它是Δ6去饱和酶。
8．根据前述任一权利要求所述的多肽，它天然存在于不积累GLA的生物中。
9．根据前述任一权利要求所述的多肽，它天然存在于真核细胞中。
10．根据前述任一权利要求所述的多肽，它天然存在于动物中。
11．根据前述任一权利要求所述的多肽，它天然存在于线虫中。
12．根据前述任一权利要求所述的多肽，它天然存在于C.elegans中。
13．根据权利要求1所述的多肽，它含有图1所示的氨基酸序列或该序列的一部分。
14．一种多肽，它包含前述任一权利要求所述的多肽，该多肽与另一部分共价相连。
15．权利要求1至14任一所述的多肽在产生或筛选抗体中的应用。
16．权利要求1至14任一所述的多肽作为转化用标记的应用。
17．根据权利要求16所述的多肽的应用，该应用是作为植物转化的标记。
18．一种抗体或其衍生物，它与权利要求1至14任一所述的多肽结合。
19．权利要求18所述的抗体或其衍生物在诊断中的应用。
20．一种测定一种生物中是否具有权利要求1至14任一所述的多肽的方法，该方法包括测定该生物是否具有结合权利要求18所述的抗体或其衍生物的多肽。
21．根据权利要求20所述的方法，其中该生物是人。
22．根据权利要求20或21所述的方法，该方法宜在体外进行。
23．权利要求1至14任一所述的多肽在医药中的应用。
24．权利要求1至14任一所述的多肽在制备一种药剂中的应用，该药剂用来治疗涉及GLA缺陷或体内GLA衍生的代谢物缺陷的疾病。
25．根据权利要求23所述的多肽的应用，其中该代谢物是类二十烷酸。
26．根据权利要求23、24或25所述的应用，其中疾病是湿疹、乳腺痛、高胆固醇血症、动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病性神经病、病毒性感染、痤疮、肝硬化、高血压和癌症。
27．一种制备GLA的方法，该方法包括用权利要求1至14任一所述的多肽将亚油酸转变成GLA。
28．一种制备OTA的方法，该方法包括用权利要求1至14任一所述的多肽将α亚油酸转变成OTA。
29．一种核酸分子，它a)编码权利要求1至14任一所述的多肽；或b)与上文a)中定义的核酸分子互补；或c)与上文a)或b)中定义的核酸分子杂交。
30．一种载体，它包含权利要求29所述的核酸分子。
31．一种宿主，它包含权利要求27所述的核酸分子或权利要求30所述的载体。
32．根据权利要求31所述的宿主，它是植物或植物繁殖性物质。
33．根据权利要求31或32所述的宿主，它是油菜、向日葵、谷类包括玉米、烟草、荚果包括花生和大豆、红花、油棕、椰子和其它棕榈、棉花、芝麻、芥菜、亚麻籽、蓖麻、琉璃苣和月见草；或上述任一的繁殖性物质。
34．一种获得权利要求1至14任一所述的多肽的方法，该方法包括在使所述多肽表达的条件下培育权利要求31至33任一所述的宿主，然后纯化所述多肽。
35．权利要求29所述的核酸分子作为探针或引物的应用。
36．权利要求29所述的核酸分子或权利要求30所述的载体在制备某生物中的应用，该生物能在其体内积累GLA或从GLA衍生的代谢物。
37．权利要求29所述的核酸分子或权利要求30所述的载体在制备耐寒生物中的应用。
38．一种生产权利要求31至33任一所述的宿主的方法，该方法包括将权利要求29所述的核酸或权利要求30所述的载体插入一生物内。
全文摘要
编码C.elegans△
文档编号A61P9/10GK1285874SQ98812900
公开日2001年2月28日 申请日期1998年11月24日 优先权日1997年11月24日
发明者J·A·内皮尔 申请人:布利斯脱大学