专利名称：肝素辅助因子Ⅱ制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及高纯度肝素辅助因子Ⅱ(以下称作“HCⅡ”)制剂及其制备方法。更详细地说，本发明涉及基本上不含低分子化因子特别是蛋白酶，进而不含低分子化HCⅡ的含高纯度HCⅡ的制剂及其制备方法。
背景技术：
HCⅡ是由SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)得到的分子量约72 KDa的单链血浆糖蛋白，其cDNA的碱基序列也已经鉴定(J.Biol.Chem.，257，2162-2169，1982；Nucleic Acids Res.，14，1073～1088，1986)。HCⅡ的生理功能尚未完全阐明，但它是一种特异性抑制凝血酶的抗凝物质。在血中具有抗凝血酶作用的蛋白质人们知道的主要是抗凝血酶Ⅲ(以下称作“ATⅢ”)。但认为HCⅡ与ATⅢ的作用部位不同，作为血管内皮细胞下的血管中膜的凝血酶抑制物质起作用，而非存在于血管内皮细胞上。(Thromb.Res.，62，409-419，1991)HCⅡ可用于预防及治疗引起血流异常的各种疾病、败血症和各种脏器功能损害及各种炎症等(特开平9-176040号公报)。
HCⅡ是从全血浆、血浆级分或重组宿主细胞培养物等纯化而成。在纯化时除去其中的杂物，例如HCⅡ以外的血浆成分和宿主细胞内成分。除此之外还有多聚化及片段化(低分子化)HCⅡ。多聚化HCⅡ没有活性，而且一般情况下，施用蛋白多聚体时能引起休克，血压降低等不希望出现的副作用。据报道，低分子化的HCⅡ是在以人血浆为原料纯化时混入的(J.Biol.Chem.，260，2218～2225，1985)。而且，在肝素或硫酸皮肤素存在下，缺少N末端67残基的HCⅡ可大幅度降低凝血酶抑制速度(Thoromb.Haemost.，74，1209-1214，1995)。也就是说，低分子化的HCⅡ活性低。进而就低分子化蛋白的一般性质来看，低分子化HCⅡ可能具有抗原性，并且因为其半衰期短，不可能显示长期效果。
基于以上报道及发明人的预备知识，导致HCⅡ低分子化的最重要因素(即低分子化因子)，是血浆或宿主细胞内的蛋白酶。例如，从人血浆的Cohn’s乙醇分级分离法得到级分Ⅰ上清液和级分Ⅱ+Ⅲ上清液，以此为原料纯化HCⅡ时，除72 KDa分子之外混入了66 KDa和60 KDa的低分子化HCⅡ片段。因为是HCⅡ分子内赖氨酸残基的羧基侧肽键被切断，所以推断这些低分子化HCⅡ片段是由于血浆中特异性肽链内切酶的作用生成的。
即使将低分子化HCⅡ从完整HCⅡ中分离除去，如果在最后的制剂中夹杂了蛋白酶的话，在保存期间也会进一步发生HCⅡ的低分子化。也有在制剂中添加蛋白酶抑制剂的手段，但是，从临床使用的角度考虑，还是希望尽可能将蛋白酶除掉。而且，从抗原性这一因素考虑，也有必要把来自于重组宿主细胞的蛋白酶除掉。然而，以往的HCⅡ纯化法是不能够将HCⅡ与蛋白酶完全分离的。
因此，本发明的目的就是提供基本上不含蛋白酶等低分子化因子的HCⅡ制剂及其制备方法。进而提供基本上不含低分子化HCⅡ的HCⅡ制剂及其制备方法。本发明的另一个目的是提供基本上不含多聚化HCⅡ或着色剂的HCⅡ制剂。进而，本发明的另一个目的是提供纯度在98％以上。优选超过99％的纯化HCⅡ制剂及其制备方法。另外，本发明的另一个目的是提供基本上不含具有感染力病毒的上述各HCⅡ制剂及其制备方法。
发明公开本发明基于以下的发现，即使用疏水性层析分离、水溶性多聚体处理、盐析以及用碱性氨基酸为配体的亲和性层析分离技术中的一种或两种以上的处理法，处理含HCⅡ和蛋白酶等低分子化因子的溶液，能高效率地分离HCⅡ和低分子因子。进而，在上述步骤前或后，进行经肝素固定的亲和性层析分离及阴离子交换层析分离，并接着进行超微过滤及/或凝胶过滤层析分离等项处理，能够得到基本上不含低分子化因子、多聚化或低分子化HCⅡ及着色剂并且纯度超过98％，最优选为超过99％的HCⅡ溶液。该HCⅡ溶液经除病毒或灭活处理能够制备出对制剂中HCⅡ无不良影响并且不含具有感染力病毒的HCⅡ制剂。
也就是说，本发明提供基本上不含低分子化因子、低分子化HCⅡ、多聚化HCⅡ及着色剂中至少一种的HCⅡ制剂。优选基本上不含有低分子化因子及低分子化HCⅡ的HCⅡ制剂，更优选基本上不含多聚化HCⅡ及/或着色剂的HCⅡ制剂。而且，本发明提供HCⅡ纯度超过98％；优选超过99％的HCⅡ制剂。进而，本发明提供基本上不含具有感染力病毒的上述各HCⅡ制剂。
另外，本发明的其他部分是HCⅡ制剂的制备方法。这种造法包含由HCⅡ及低分子因子的溶液中分离HCⅡ和低分子因子的步骤，特别是由下述一种或两种以上处理法组成的步骤。这种处理法包括疏水性层析分离处理、水溶性多聚物分离处理、盐析及以碱性氨基酸为配体的亲和性层析分离处理。本发明还包括除去低分子化HCⅡ的步骤，特别是包括凝胶过滤处理步骤的HCⅡ制备法。另外，本发明是上述HCⅡ制剂的制备方法。它包括通过过滤处理，加热处理或表面活性剂处理中至少一种方法除去病毒或失活处理的步骤，优选包含用多孔性中空纤维进行过滤处理的步骤。
附图简述
图1显示的是含有HCⅡ级分的凝胶过滤层析图。其中该HCⅡ级分是经固相化肝素处理及阴离子交换层析分离得到的。
图2显示的是凝胶层析分离设计的有效HCⅡ纯化部分的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图(1，3道分子量标记，2道非还原HCⅡ，道4还原HCⅡ)。
图3显示的是凝胶层析分离得到的有效HCⅡ纯化级分的高效液相层析分析图。
实施发明的最佳方式本发明HCⅡ制剂中所含的HCⅡ指的是一种蛋白质。该蛋白质须SDS-PAGE分离时，在分子量72 KDa的位置上用肉眼观察显示一个单一的条带，并且在高效液相层析图中给出一个单一的峰，等电点约为5，具有抑制凝血酶、糜蛋白酶及组织蛋白酶的作用。因此，本发明的HCⅡ(以下为区分多聚化及低分子化HCⅡ，有时特意称作“有效HCⅡ”)只需满足上述各性质即可，而并不限定于具有全长的氨基酸序列的分子(完整分子)。
本发明的HCⅡ制剂的原料-含有HCⅡ的溶液，只要是含有适当量的与上述各项性质相符的HCⅡ即可，而并不特殊限定其来源，可以包括来自于天然血浆的或经基因技术重组宿主细胞产生的HCⅡ。作为来源于血浆的HCⅡ，例如从全血浆、高活性HCⅡ的血浆级分得到。优选Cohn’s乙醇分级分离上清液Ⅰ、上清液Ⅱ+Ⅲ或上清液Ⅳ得到。而且，对于血浆的生物起源也不作限制，例如从人或牛得到，但最好使用人的血浆。
来源于重组宿主细胞的HCⅡ溶液，可以从培养宿主细胞的培养物中获得，例如，培养液、细胞提取液、培养液上清部分。上述培养宿主细胞已经用编码天然血浆中HCⅡ的基因进行转化得到的。宿主细胞没有特别限制。较优选的有大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌等细菌、酵母等真菌、动植物细胞、昆虫细胞等。另外，也有以自组入编码HCⅡ基因的转基因动物的体液得到。
在本发明中，低分子化因子指的是能引起HCⅡ片段化的化学及酶的因素，而不包括高温、低温、物理性切割力等物理性因素。具体而言，如蛋白酶、糖链或者是唾液酸分解酶及强酸，强碱等。在以含HCⅡ溶液作为原料来源时，主要的低分子化因子是蛋白酶。
本发明的制备方法的特点是包含一种从HCⅡ及低分子化因子混合液中分离该两者的步骤。该步骤包括疏水性层析分离、水溶性多聚物分离处理、盐析或以碱性氨基酸为配体的亲和性层析分离。这些方法既可单独使用，也可组合起来使用。
疏水性层析分离处理是在pH6～9的条件下，将含有HCⅡ及低分化因子的溶液与疏水性层析用载体接触，进行分离。疏水性层析用载体典型例子有碳数为4～18的烷基型(例如，丁基型、辛基型、辛癸基型等)、苯基型。丁基型有丁基琼脂糖、丁基聚乙烯(商品名Bytyl-Toyopearl，Tosoh产)等。辛基癸基型有辛基癸基琼脂糖。苯基型有苯基纤维素(商品名Phenyl celofine，生化学株式会社)等。使用该处理法，HCⅡ在未吸附部分被回收，低分子化因子则吸附到载体上。
水溶性多聚分离处理是将水溶性多聚物加入到HCⅡ及低分子化因子的混合液中，进行分离处理。其中水溶性多聚物的浓度为1～30％(w/v)，优选浓度为3～20％(w/v)，更优选的浓度为6～12％(w/v)。通过该法处理，HCⅡ留在溶液中，低分子化因子被沉淀。将处理液离心分离或过滤，回收上清液，即可将低分子化因子从HCⅡ中分离除去。在此所指的水溶性多聚物是指聚乙二醇(PEG)和非离子性表面活性剂。PEG的平均分子量以4000～6000为好。另外表面活性剂有聚氧乙烯(160)聚丙(30)二醇、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯等。
盐析处理是将0.05M～0.25M的盐类加入到HCⅡ及低分子化因子的混合液中进行处理。其中盐类为钠、钾、钡、铵等的盐类，例如盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐等。优选盐析处理法可举例表示为加入0.05～0.2M的氯化钡溶液。通过该法处理，HCⅡ留在溶液中，低分子化因子被沉淀。经离心分离或过滤该处理液，回收上清液，可将低分子化因子从HCⅡ中分离除去。
以碱性氨基酸为配体的亲和性解说分离是在pH 6-9的条件下，将HCⅡ及低分子化因子的混合液与固相化的解说载体接触进行的分离方法。其中，固相化的层析载体是以赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸作配体，但是，最好用赖氨酸、该载体为多糖类、硅胶、纤维等构成的不溶性支持物。详细地讲它们为琼脂、琼脂糖、交联琼脂糖，纤维素、二氧化硅、尼龙、亲水性乙烯聚合物等。通过该处理，HCⅡ在未吸附级分被回收，低分子化因子吸附到载体上。
为使低分子化HCⅡ的生成限制在最小程度，并使其后的纯化更容易进行。同时提高HCⅡ的回收率，分离HCⅡ与低分子化因子的步骤在纯化的早期阶段进行最优选。
本发明的优选实施方案为，HCⅡ及低分子化因子的混合液先接触固相化肝素。使HCⅡ结合到肝素上。固相化肝素是结合到固相上的单体肝素。其中，固相为多糖类、硅胶、纤维素等不溶性支持物。举例说明有琼脂、琼脂糖、交联琼脂糖、纤维素、二氧化硅、尼龙、亲水性乙烯聚合体以及在该领域内众所周知的其他物质。进行固相化肝素处理并不限于分离HCⅡ与低分子化因子的步骤之前，在分离之后也可以进行。经该项处理，一部分多聚体HCⅡ及低分子化HCⅡ可与单体HCⅡ(有效HCⅡ)分级分离并被除去。在本发明中，多聚化HCⅡ指的是无生理活性、对肝素的亲和力低的HCⅡ的聚合体。更具体地说，是二聚体或多聚体。
HCⅡ先用盐浓度0.05～0.2M的缓冲溶液清洗后，再用不同浓度的缓冲溶液将HCⅡ从固相化肝素中洗脱出。其中盐的浓度为0.05～1.0M，优选为0.1～0.5M，更优选为0.1～0.2M。另外，用缓冲溶液清洗HCⅡ时，较优选的是逐级提高盐浓度，反复清洗几次。用于配制离子强度的盐的成分有氯化钠、氯化钾、硫酸铵、硫氰酸钠、硫酸钠等。优选的是氯化钠。另外，该缓冲溶液的pH调整到6～9。
本发明更优选的实施方案是将含有HCⅡ的溶液进一步用阴离子交换层析分离进行处理。所用的阴离子交换体可举例说明为DEAE系列[DEAE-Sephadex、DEAE-纤维素、DEAE-Sepharose、DEAE-聚乙烯(例如DEAE-Toyopearl)]，QAE系列[QAE-Sephades、QAE-纤维素、QAE-Sepharose、QAE-聚乙烯(例如QAE-Toyopearl)等]。
在用阴离子交换层析分离处理时，阴离子交换体的平衡及清洗用缓冲液进行。该缓冲液为0.005～0.1M的柠檬酸缓冲液(pH6-8)、0.005～0.1M的磷酸缓冲液(pH6-8)、0.005～0.1M的Tris盐酸缓冲液(pH7-9)。另外，HCⅡ从阴离子交换物中的洗脱使用含0.05～0.5M。优选为0.2～0.25M的氯化钠进行。其中该缓冲液也被用于阴离子交换物的平衡及清洗。
上述进行的HCⅡ与低分子化因子的分离处理，使用固化肝素处理及阴离子交换层析分离处理二种方法，无顺序上的限制，可任意选择。另外，在纯化步骤中为防止HCⅡ的多聚化及低分子化，只要没有特别的条件限制，上述各项处理均在pH6～9、4～20℃的条件下进行。另外为防止多聚物的生成，上述各步骤中使用的全部缓冲溶液中，最好都含有0.001％～1.0％(w/v)的水溶性多聚物(例如PEG4000等)。
在上述各纯化处理中得到的HCⅡ活性部分有可能混入低分子化HCⅡ。在本发明中，低分子化HCⅡ指的是用高效液相层析法分离时出现一个有别于有效HCⅡ峰的片段化HCⅡ肩峰(HPLC的分离条件在后提到)。因此，为分离除去低分子化HCⅡ，上面得到的HCⅡ活性部分需进一步进行超微过滤及/或凝胶过滤层析分离等分离步骤。其中这种分离是基于分子量的大小进行的。
对于超滤的滤膜的孔径大小不作特别限制，只要能使有效HCⅡ通不过，而只让低分子化HCⅡ通过即可。例如常用的有乙酰纤维素、丙烯腈共聚物、芳香族尼龙、聚砜、聚氟化乙烯、聚亚胺、树脂膜等。其形状可选择使用管状膜、扁平膜、螺旋组件(module)、中空纤维组件等。由于超滤膜的孔径不是某一固定的值，当被除去的低分子化HCⅡ与有效HCⅡ分子量相差不大时，最好先通过超滤将HCⅡ浓缩后，再进行凝胶层析分离。
用于凝胶层析分离的凝胶有交联葡聚糖珠(例如，交联葡聚糖)、交联聚丙烯酰胺珠(如BioGel)、琼脂糖胶(例Sepharose)、葡聚糖丙烯酰胺(例如Sephacryl)等。在进行凝胶过滤时，使用柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液(pH6～9)洗脱。其中缓冲液中含有0～0.5M最好为0.1～0.2M的氯化钠。
为尽可能防止HCⅡ的多聚化及低分子化、上述超滤及凝胶过滤希望在pH6～9，4-20℃进行。另外，上述各步骤中使用的所有缓冲液最好都含有0.001％～1.0％(w/v)的水溶性多聚物(例如PEG 4000等)，以预防多聚体的生成。
在上述各项处理后得到的HCⅡ，其纯化程度，以蛋白量及HCⅡ的比活性为指标进行监测。其中蛋白量是在波长280nm测得的吸光度(A280)。HCⅡ的活性是以抑制凝血酶的活性作用为指标进行测定的。其方法在下文的实施例中详述。
经上述各处理得到的纯化HCⅡ溶液，通过制剂，可以制备出高纯度的HCⅡ制剂。制剂时，根据需要可添加药学上可接受的载体、添加剂的及通过加热、灭菌、除菌过滤、病毒灭活，分散、冷冻干燥等进行制剂。这些制剂方法均为药学上可接受的常规方法。
本发明的纯化HCⅡ溶液为了达到基本上不合有感染力病毒的这一目的，希望进一步进行病毒灭活及/或除病毒的处理步骤。这里的“基本上不含病毒”指的是灭活病毒使病毒感染效价(TC1 D50)控制在检出界限以下或者是除去病毒使病毒基因量限制在1 PCR单位以下(按照Transfusion，32，824～828，1992报道的PCR测定法，检出的最小核酸量)。
病毒灭活法，可使用众所周知的任何一种方法。例如液体加热处理、干燥加热处理、表面活性剂处理等。不过希望选择一种方法尽可能对HCⅡ的生理活性无不利影响。其中不利影响物有HCⅡ的变性、低分子化、多聚化等。由于HCⅡ对热不稳定、希望在有适当稳定剂(例如酸性氨基酸等)存在的条件下，进行液体加热处理、干燥加热处理、表面活性剂处理。病毒除去方法，最好用病毒除去滤膜进行滤过处理。这种滤膜的孔径大小能使HCⅡ分子通过，但病毒粒子通不过。该病毒除去膜的开头有管状膜、扁平膜、中空纤维等各种形状。最好使用多孔性中空纤维的那种。
多孔性中空纤维是管状丝、在其周壁自由向外有许多贯通的孔，该同壁可作为过滤膜。在本发明中使用的多孔性中空纤维的周壁孔径是1nm～100nm。优选为10nm～50nm，最优选为15±2nm。在此范围内，可以从HCⅡ溶液中将夹杂的病毒除去。另外，多孔性中空纤维的内径，优选为330±30μm。周壁厚度优选为27±3μm。
多孔性中空纤维的制备原料没有特别限制，但希望使用再生纤维素。由再生纤维素构成的多孔中空纤维希望在纤维素铜氨溶液中，用微相分离法(Am.Chem.Soc.，9，197-228，1985)进行制备。
多孔中空纤维优选以组件形式使用。例如，很多多孔中空纤维平行捆在一起，包在一个盒子中(cartridge)通过粘合剂形成载体。
过滤时，HCⅡ溶液的温度是4℃～50℃。优选温度为4℃～20℃。滤过压力是0.1 kgf/cm2～1 kgf/cm2，优选0.4 kgf/cm2～0.9kgf/cm2。HCⅡ的浓度优选为0.01～10％(w/v)，更优选为0.1～4％(w/v)，在此浓度时HCⅡ溶液的过滤效率高。
过滤法有循环式过滤与非循环式过滤，均在加压空气下进行。前者是在给溶液一个倾斜速度下进行的过滤。后者则不给予倾斜速度。
上述病毒灭活处理和除病毒处理，分别单独使用就可以达到除去有感染力病毒的目的，但最好还是将两种方法组合使用。其应用顺序无特别限制但优选病毒灭活处理后进行除病毒处理。
经上述步骤制备的循环式过滤制剂中，基本上至少不含低分子化因子、低分子化HCⅡ、多聚化HGⅡ及着色剂中的一种，这是该制剂的特征。本发明所指的着色剂是指在410nm处显示特异吸收的夹杂物，例如可举出转铁蛋白、触珠蛋白等物质。这里所说的“基本上不含低分子因子”指的是在0.1M磷酸钠缓冲溶液以pH8、25℃的条件下培养48～120小时后，用HPLC(G 3000 SWXL)检测时也检不出低分子化HCⅡ。“基本上不含低分子化(或多聚化)HCⅡ”指的是用HPLC(G 3000 WXL)检不出低分子化(或多聚化)HGⅡ的峰(这里的HPLC条件如下所示)。
分离柱G 3000 S WXL(中7.8mm×30cm；TOSOH公司制备)流动相0.1M醋酸钠，0.3M氯化钠，0.1％叠氮化钠(pH 6.5)流速 1.0 mL/分检出波长 280nm样品进样量50μl(A280=约为1(在最小0.2～最大2的范围内))。
进而，基本上不含着色物质“指的是着色度(C.I.)为50以下。着色度在后记的实例中加以定义。
本发明的HCⅡ制剂，优选为不合低分子化因子及低分子化HCⅡ，更优选为进一步不含多聚化HCⅡ及着色物质中的一种或两种者不含的制剂。
特别优选的实施方案为，本发明的HCⅡ制剂含有纯化到98％以上，最好99.9％，以上的有效HCⅡ。其中该纯度百分率是HCⅡ对于总蛋白量的百分率。
通过以下实施例，详述本发明。但本发明并不限定于实施例。并且，为防止HCⅡ的多聚化，在以下实施例中各纯化步骤所用的全部缓冲液的含有0.01或0.1％(w/v)的水溶性多聚物(例如PEG 4000等)。
比较例1．从人血浆中纯化HCⅡ(Ⅰ)(1)固相化肝素处理Cohn’s分级分离的上清液Ⅱ+Ⅲ加到使用了肝素凝胶亲和性层析分离柱，再用含0.4M NaCl的缓冲液洗脱，得到纯度约1％的HCⅡ部分(以下称作粗制品)，将此部分在4℃条件下通过用20mM磷酸缓冲液(pH8.0)洗净的肝素凝胶柱(φ5×2.5cm)，接着用含有0.1～0.15M NaCl的20mM磷酸缓冲液(pH8.0)洗脱吸附到柱上的部分，可以得到比粗制品的比活性高7.5～9.6倍的HCⅡ级分。HCⅡ的活性按下述方法测定。即，在被检样品烯释液中加入50μL含有60mMEDTA、0.2％HSA及50μl 0.1mg/ml硫酸皮肤素的Tris缓冲液(pH8.56)、另外再加入100μL 0.93mg/ml二盐酸H-D-苯丙氨酰基-L-甲基哌啶-L-精氨酰基-对硝基苯甲酰胺，在37℃培养5分钟。加入1mL柠檬酸使反应停止，测定405nm处的吸光度(A405)、按照以往的方法，将制备的部分纯化品作为标准品〔由吸收系数E1％=5.93(Arch.Biochem.Biophys.，259，331-340，1997)和吸光度A280求出的蛋白浓度0.1mg/ml，作为1 U作标准曲线，算出HCⅡ的活性。
(2)阴离子交换层析在(1)中得到的含HCⅡ的级分，在4℃通过(12[A280]/ml胶)QAE-聚乙烯柱(φ5×2.5cm)，其中该柱预先用40mM磷酸缓冲液(pH8.0)平衡，接着用含有0.15～0.4M NaCl的40mM磷酸缓冲液洗脱。其中NaCl的浓度的0.05M的速度逐级升高。最终，在含0.20～0.25MNaCl的缓冲液洗脱部分得到比活性为15.4 U/A280的HCⅡ，收率为92％。
按粗纯化品计算，回收部分HCⅡ的比活性上升到69-91倍，收率为71％。将得到的含HCⅡ的部分，用10-20％梯度凝胶(第一化学制)以及SDS-PAGE(20mA/凝胶，约1.5小时)进行分析。凝胶的染色用快速染色盒(和光纯药制)进行。结果在相当于有效HCⅡ的72 KDa位置检出了主带，此外还检出了66 KDa及未知的35 KDa的两个带。其中66 KDa相当于N末端缺少42个氨基酸的低分子化HCⅡ。将该含HCⅡ的级分置于冷室时，HCⅡ的低分子化会进一步进行，最终将检不出72 KDa的分子。由此可知，依靠固相化肝素处理及阴离子交换层析分离处理不能够除去HCⅡ低分子化因子，特别是蛋白酶。
(3)凝胶过滤层析将(2)得到的含HCⅡ的部分用10 KDa截断超滤膜进行浓缩。浓缩后的蛋白浓度为20mg/ml，将该浓缩蛋白加到凝胶过滤层析柱Superdex 200 pg(φ1.6×60cm；Pharmacia制备)上。所加体积约为柱体积的1％(1.2ml)，按下述条件洗脱。
缓冲液含0.15M NaCl的20mM磷酸缓冲液(pH8.0)流速 10小时/柱温度 4℃其结果，HCⅡ活性峰出现在相当于72 KDa分子的主要级分(有效HCⅡ级分)，并且与低分子级分(低分子化HCⅡ级分)得到分离。有效HCⅡ纯化部分的比活性是11.1 U/A280。SDS-PAGE分析的结果，在72 KDa位置给出了一个单一的带，进而用HPLC(G 3000 SWXL)进行分离，也检出一个单一的峰。由此可知，该纯化级分基本上不含低分子化及多聚化HCⅡ分子。另外，该纯化级分的着色度〔定义为C.I.=A410/A280×1000〕是12.3。并且基本上不含触珠蛋白与转铁蛋白。然而，当该有效HCⅡ纯化级分在冷室或室温放置时，与上述(2)的情况相同会发生低分子化。由此可知，低分子化因子(蛋白酶)用凝胶过滤也不能除去。
比较例2．从人血浆纯化HCⅡ(Ⅱ)(1)固相化肝素处理按比较例1-(Ⅰ)同样的方法，进行固相化肝素处理。只需将该法中的缓冲液变为20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)，加到柱上的粗纯化品量变为30〔A280〕/mL凝胶，将洗脱液改为含0.1M NaCl的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.5)即可。结果，与粗纯化品相比，经过上述处理，HCⅡ级分的比活性升高了13.6～19.3倍。
(2)阴离子交换层析层析用含有0.1 5～0.45M NaCl的40mM磷酸缓冲液(pH8.0)洗脱吸附在载体上的部分，其中，NaCl的浓度以每次0.05M的速度逐级升高。其他操作均与比较例1-(2)相同。其结果，在含有0.20～0.25MNaCl的缓冲液洗脱部分，得到了比活性为17.4 U/A280的HCII，回收率为95％。
由粗纯化品计算，含HCⅡ级分的比活性上升了76～102倍，回收率为66％。将此含有HCⅡ的级分按比较例1-(2)的方法进行SDS-PAGE分析，在相当于有效HCⅡ的72 KDa的位置检出了主带，但除此之外，在66 KDa及未知的35 KDa处还检出两个带。其中66 KDa相当于N末端缺少42个氨基酸残基的低分子化HCⅡ。当把该含有HCⅡ的级分放置于冷室时，也发生HCⅡ的低分子化最终将检不出72KDa的分子。
(3)凝胶过滤层析在(2)中得到的含有HCⅡ的部分，进一步用截断量为10 KDa超滤膜使蛋白质浓缩至20mg/ml，将浓缩部分加至凝胶过滤层析Superdex 200 pg(φ1.6×60cm)上，按下述条件洗脱。其中加样量约为柱体积的1％(1.2 mL)。
缓冲液含0.15M NaCl的20mM磷酸缓冲液(pH8.0)流速10小时/柱温度4℃结果，HCⅡ活性峰出现在相当于72 KDa分子的主要分离部分(有效HCⅡ纯化级分)，与低分子分离部分(低分子化HCⅡ级分)得以分离。有效HCⅡ纯化级分与A280的最大峰一致(图1)。有效HCⅡ纯化级分的比活性是17.1 U/A280、在SDS-PAGE的分析结果中，72 KDa处给出了单一的带。由此表明，该纯化级分基本上不含低分子化及多聚化HCⅡ分子。另外，该纯化级分的着色度〔定义为C.I.=A410/A280×1000〕是4.2，基本上不含触珠蛋白与转铁蛋白。另外在获得的HCII纯化级分中，HCⅡ占总蛋白量的99.9％以上。与比较例1一样，会发生低分子化。
实施例1以疏水性层析法除去低分子化因子取一部分在比较例2-(2)得到的含HCⅡ的级分，在4℃条件下，通过Butyl Toyopearl(Tosoh公司制)后，在25℃培养48小时以上。其中Butyl Toyopearl预先用含1.5M以上NaCl的40mM磷酸缓冲液(pH7.1)平衡。用HPLC测定该溶液，未发现低分子化HCⅡ的含有率增高。因此，证明了用上述疏水性层析分离处理，可除去低分子化因子。
实施例2以疏水性层析除去低分子化因子(Ⅱ)疏水性层析载体使用苯基琼脂糖(Pharmacia公司制)，载体的平衡使用含0.1M以上NaCl的磷酸缓冲液(pH8)。其他均按实施例1进行操作。未吸附部分也按实施例1的方法处理，测定有无HCII的低分子化。结果显示没有发生低分子化。接着进行凝胶过滤层析。结果显示在SDS-PAGE上的72 KDa位置。有一个单一的带，用HPLC分析时，也只出现一个单一的峰(图3)。因此表明在该纯化部分不仅不含低分子化因子，基本上也不含低分子化及多聚化HCⅡ。
实施例3使用以赖氨酸为配体的亲和性层析除去低分子化因子将一部分在比较例2-(2)得到的含HCⅡ的级分，4℃下通过以赖氨酸为配体的交联琼脂糖载体、所得到的未吸附部分按实施例1相同的方法处理，检测有无HCⅡ的低分子化。同样未观察到低分子化发生。由此可知，上述亲和性层析处理能除去低分子化因子。
实施例4用水溶性多聚物除去低分子化因子取一部分比较例2-(2)的含HCⅡ的级分，再加入PEG 4000或聚氧乙烯(160)聚丙(30)二醇(商品名Pluronic F68)，放置一定时间后，离心回收上清液。该上清液按比较例2-(3)的步骤处理后，再按实施例1的方法处理，检测有无低分子化HCⅡ，同样未观察到HCⅡ的低分子化。由此可知，用上述水溶性多聚物或非离子性表面活性剂进行分级分离，能除去低分子化因子。
实施例5通过盐析除去低分子化因子在一部分来自于比较例2-(2)的含HCⅡ的级分中，加入1M氯化钡溶液，使其浓度为5～20％(v/v)，放置一定时间后，离心分离，回收上清液。将该上清液按比较例2-(3)步骤处理后，再以实施例1同样的方法进行处理，检测有无HCⅡ的低分子化，同样未观察到HCⅡ的低分子化。由此可知，通过上述盐析处理能除去低分子化因子。
实施例6通过用多孔性中空纤维的过滤处理除去病毒多孔性中空纤维使用BMM(Bemberg Microporous Membrane(微孔膜)、旭化成株式会社)的组件。BMM是多孔性中空纤维，其制备原料为再生纤维素，并以铜氨法制成。BMM组合使用Planova15(旭化成株式会社制)。其中，Planova15是由150层以上的多层构造形成的膜壁。组合内的多孔性中空纤维的尺寸如下。
平均孔径 15nm±2nm中空纤维内径 330±30μm膜厚 27±3μm该组合是由上述多孔性中空纤维和耐高压湿热灭菌的聚碳酸酯制成的塑料容器以及使之粘合在一起的聚氨酯类粘合剂构成。该组合经高压灭菌。其中注满注射用蒸馏水。对于各种Planova构成材料的安全性，均按日本药局方规定的方法进行了确认(摘自BMM商品说明书)。
在实施例1获得的基本上不含低分子化因子、低分子化HCⅡ、多聚化HCⅡ及着色物的纯化HCⅡ级分中，加入HCV阳性血浆，以0.22μm的滤膜(Millpore制)过滤后，再根据交叉流过液法用BMM组件过滤。过滤条件HCⅡ溶液温度4～10℃、过滤压力0.8Kgf/cm2。在该过滤步骤中，HCⅡ在滤液中的回收率为97％。过滤处理结束后，调整HCⅡ溶液的效价并进行除菌过滤。得到的HCⅡ溶液分装后制成液体制剂。
实验例1确认除病毒效果在实施例6得到的制剂中，丙型肝炎病毒基因组量用PCR法测定。
(1)提取样品中的RNA在该制剂中加入胍、硫氰酸胍及十二烷苯肌氨酸钠、进一步加入酚。氯仿，除蛋白。其次，以异戊醇沉淀RNA。各反应均在室温进行。
(2)用反转录酶制备cDNA从(1)得到的RNA与随机六聚体退火，用逆转录酶在42℃反应1小时，得到cDNA。
(3)用巢式PCR法增幅cDNA用HCV引物〔自HCV基因组的5’末端非编码区，5’-GTGAGTACACCGGAATTGCC-3’(序列号1)和5’-CACGGTCTACGAGACCTCCC-3’(序列号2)用作正义引物链，5’-ACGACCGGGTCCTTTCTTGG-3’(序列号3)和5’-GCACTCGCAAGCACCCTATC-3’(序列号4)用作反义引物〕和Taq聚合酶、扩增HCV cDNA。在94℃，30秒热变性、在55℃ 2分钟退火。cDNA的扩增，在72℃进行2分钟。该项操作循环20次以上，得到反应产物。
(4)PCR反应产物的分析对于在(3)得到的反应产物，进行聚丙酰胺电泳(PAGE)6％(w/v)。其中使用了溴化乙锭。
实验结果，过滤处理前HCⅡ溶液中HCV基因组量是103 PCR单位/ml，而过滤处理后降低到检出限度(1PCR单位/ml)以下。
工业上使用的可能性因为按本发明的HCⅡ制剂制备法能除去低分子化因子，所以在HCⅡ保存过程中不会发生分解(低分子化)。因而，可以提供更高纯度的安全有效的HCⅡ制剂。
序列表的单独文字说明序列号1
一种被设计好的寡核苷酸，将其作为扩增HCV基因组5’末端非编码区的正义引物。
序列号2设计的一种寡核苷酸，使其作为扩增HCV基因组5’末端非编码区的正义引物。
序列号3设计的一种寡核苷酸，使其作为扩增HCV基因组5’末端侧非编码区的反义引物。
序列号4设计的一种寡核苷酸，使其作为扩增HCV基因组5’末端侧非编码区的反义引物。
本专利申请是以在日本提出的平成9年专利申请第320349号为基础作成的，在上述专利申请中的内容全部包含在本说明书中。
另外，在本文述及的专利及专利申请说明书的所有公开物，通过引用的形式，将其全部内容编入到本说明书中。
样品序列表&#60110&#62吉富制药有限公司&#60120&#62肝素辅因子Ⅱ制剂及其生产方法&#60130&#6209276&#60150&#62JP 9-320349&#60151&#621997-11-05&#60160&#624&#60210&#621&#60211&#6220&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62设计用来扩增HCV基因组5’非编码区的正义引物&#60400&#621gtgagtacac cggaattgcc20&#60210&#622&#60211&#6220&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62设计用来扩增HCV基因组5’非编码区的正义引物&#60400&#622cacggtctac gagacctccc20&#60210&#623&#60211&#6220&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62设计用来扩增HCV基因组5’非编码区的正义引物&#60400&#623acgaccgggt cctttcttgg20&#60210&#624&#60211&#6220&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62设计用来扩增HCV基因组5’非编码区的正义引物&#60400&#624gcactcgcaa gcaccctatc20
权利要求
1．含肝素辅助因子Ⅱ的制剂，它基本上不含至少一种选自低分子化因子、低分子化肝素辅助因子Ⅱ、多聚化肝素辅助因子Ⅱ以及着色物的夹杂物。
2．基本上不含低分子化因子及低分子化肝素辅助因子Ⅱ的含肝素辅助因子Ⅱ的制剂。
3．权利要求2的肝素辅助因子Ⅱ制剂，它还基本上不含多聚化肝素辅助因子Ⅱ及/或着色物。
4．含肝素辅助因子Ⅱ的制剂，其中在制剂中所含有的肝素辅助因子的纯度在98％以上。
5．权利要求1-4任一项的含有肝素辅助因子Ⅱ的制剂，它基本上不含有有感染能力的病毒。
6．含肝素辅助因子Ⅱ的制剂的制备方法，其中该制法包含从含有肝素辅助因子Ⅱ及低分子化因子的溶液中分离两者的步骤。
7．权利要求6的制备方法，该步骤包括选自疏水性层析法，水溶性多聚物分级分离法、盐析以及以碱性氨基酸为配体的亲和性层析法的一或多种处理。
8．权利要求6或7的方法，它包括能进一步除去低分子化肝素辅助因子Ⅱ及/或着色物的步骤。
9．权利要求8的方法，其中该步骤为凝胶过滤层析。
10．权利要求6～9中的任一项的方法，它包括选自过滤处理，加热处理及表面活性剂处理中至少一种除病毒或灭活病毒的步骤。
11．权利要求10的方法，其中该步骤以多孔性中空纤维进行过滤处理。
全文摘要
含有肝素辅助因子Ⅱ(HCⅡ)的制剂,其中基本上不含有选自低分子化因子、低分子化杆素辅助因子Ⅱ(HCⅡ)、多聚化HCⅡ及着色物中的至少一种杂质,特别是一种基本上不含低分子化因子及低分子化HCⅡ的制剂。基本上不含有感染力病毒的上述任一制剂。以及上述制剂的制备方法。该方法包括选自如下步骤:疏水性分析法、用水溶性多聚物进行的分级分离、盐析及用碱的氨基酸作酸体的亲和性层析法,优选还有用多孔性中空纤维进行的过滤的步骤。
文档编号A61K38/00GK1284881SQ98812944
公开日2001年2月21日 申请日期1998年10月30日 优先权日1997年11月5日
发明者后藤节, 浅原尚美, 大水章正, 上村八寻 申请人:吉富制药株式会社