专利名称：粒细胞刺激因子提取的方法及其多糖复方胶囊的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种粒细胞刺激因子提取的方法及其多糖复方胶囊，属于人类生活需要中的保健品类领域。
牛膝是我国的一种传统中药，据医书记载具有“补肝肾，强筋骨，止腰膝酸麻，散恶血，破症结，治痛疽恶疮”的功效。羊胚胎源自受精卵的生成和发育，随着胚胎细胞不断分化，最终发育成为成熟的个体，羊胚胎具有特定的功能器官分化和发育的能力，其含有表达成熟机体全部生命信息的特征。粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子，其特征功能表现为在极微量(10-11M)情况下，粒细胞就能生存，特别是在软琼脂培养基上能促进粒细胞和单核、巨噬细胞的集落形成，基因重组粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子已广泛用于肿瘤、白血病的放疗或化疗所致的白细胞减少，在再生障碍性贫血及粒细胞缺乏症病人以及骨髓移植病人中可起到抗感染作用，对于纠正多种原因所致的粒细胞减少有切实的疗效。迄今在临床医学领域中的应用都使用基因重组的粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子，该产品成本很高，生产技术也很复杂，生产投资费用相当昂贵。根据对现有技术的分析以及对文献的检索，至今尚未发现有组分由牛膝多糖、冻干羊胚胎粉、羊胚胎水解物、羊胚胎组织培养冻干粉构成的保健品以及也未发现有以羊胚胎为原料、运用组织细胞培养的生物技术提取粒细胞—巨噬细胞刺激因子的方法。
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种多糖及粒细胞刺激因子复方保健胶囊。为具有调节免疫水平、抗疲劳和抗氧化、延缓衰老提供一种有效、安全的保健品。
本发明的技术方案如下本发明根据我国国情的实际情况，以牛膝多糖和羊胚胎为原料，制作出一种天然的、口服型的、成本低廉的、又具有与基因重组粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子同样特点和功能的产品，并提供一种运用组织细胞培养生物技术提取粒细胞刺激因子新的方法。
本发明采用从生药牛膝中分离、提取得到的一种天然多糖化合物(牛膝多糖)，研究表明，牛膝多糖具有明显的增加机体免疫功能的作用，例如，它能升高血清溶血素和脾脏内抗体形成细胞素，提高血清免疫球蛋白IgG水平，激活吞噬细胞的吞噬功能，增加血清补体C3含量，促进白细胞介素1、2生成，增强T、B细胞免疫功能，还能抑制小鼠S-180肉瘤和升高白细胞的作用。造血干细胞培养研究表明，牛膝多糖具有粒细胞刺激因子样作用效果，在粒细胞刺激因子参于下，能增加粒系造血祖细胞的集落形成能力三倍以上。被认为是一种有效的粒系造血祖细胞的动员剂，对因放疗、化疗的毒性作用所引起的骨髓抑制所致外周血白细胞减少，或因多种原因所致的继发性白细胞减少，具有良好的提升作用。
羊胚胎具有含有表达成熟机体全部生命信息特征。经多种生物化学技术和组织细胞培养技术，提取其中生物活性物质，包括下列组分1、羊胚胎粉羊胚胎经消毒、捣碎、去脂、冻干、球磨等工艺制成＞200目的粉末。口服容易吸收。该成品含生物生长所需的核酸、蛋白质、羊胚胎特征蛋白、氨基酸、微量元素等。对改善机体的营养状况、平衡机体内环境、促进新陈代谢，改善免疫力有良好作用。
2、羊胚胎水解物羊胚胎组织经酶解，75％乙醇沉淀，无水乙醇脱水，60℃真空干燥后制得。该水解物包含18种人体所必需的氨基酸，如色氨酸、丝氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、门冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸，用以增强人体迅速吸收。
3、羊胚胎组织细胞培养物羊胚胎生成发育过程需要大量细胞因子作用，细胞因子在体内组成的网络，对人体的免疫、造血调控、创伤修复、血管形成、细胞分化、抗感染等具有实际功效。它们的表达与人的健康息息相关。本发明系将新鲜的羊胚胎组织，在无菌、饱和湿度、5％CO2条件下进行组织培养，使胚胎组织中各生发中心的细胞分泌刺激因子，而后经浓缩、冻干，使之便于人体直接吸收利用。研究表明，这种培养物中含有丰富的粒细胞刺激因子，在体外条件下，也能刺激人体骨髓造血干细胞的增殖、分化。粒细胞刺激因子来源具多样性，材料来源虽较丰富，但其制作和分离、精制较复杂，应用基因重组技术虽可制取粒细胞刺激因子，但投资费用相当昂贵。
本发明采用平均分子量为1300-1500的小分子牛膝多糖，从羊胚胎组织水解得到18种人体必需的氨基酸成分，由羊胚胎组织经组织细胞培养技术获取集落刺激因子，冻干羊胚胎粉组分组成，由该组分制作的每粒胶囊250mg内含牛膝多糖125mg，冻干羊胚胎粉119mg，羊胚胎水解物5mg，羊胚胎组织培养冻干粉1mg。
本发明应用组织细胞培养技术，系将新鲜羊胚胎经消毒后，分别取其肺、肾、皮肤肌肉、肝、胎盘等制成1.0cm×1.0cm组织块，置含有PMI1640培养液中，置5％CO2、饱和湿度环境中，培养7天后取出，收集培养液，经无菌超滤、冷冻干燥备用。为检验证实其活性，可应用骨髓造血干细胞体外软琼脂培养法进行造血干细胞集落培养，方法是用含有10％胎牛血清的培养基，制备0.3％软琼脂，接种骨髓单个核细胞2×105/ml，同时将0.1ml培养上清浇注于1.0ml软琼脂的无菌平皿中，在37℃、5％CO2和饱和湿度中培养12-14天，在制置显微镜下计数≥40个细胞集落的形成数。
粒细胞刺激因子的提取方法如下1)将重量50-200g/只的新鲜羊胚胎，经碘酒与酒精消毒后，用手术剪切开胚胎皮肤，暴露胚胎实质器官，分别将各脏器切成1.0cm×1.0cm组织块；2)组织块置于组织(细胞)培养瓶中，每瓶子10g，内含RPMI1640培养液和胎牛血清，置二氧化碳培养箱内，37℃、5％CO2和饱和湿度环境下进行培养，每24小时轻轻摇动培养瓶；3)7-10天后取出，经3000rpm/30′离心、弃沉淀，超滤除菌后置4℃保存，此为羊胚胎组织制得的天然粒细胞刺激因子粗制品。
4)粗制品用XHP-1超滤膜在SS-3超滤器上纯氮正压过滤，使之浓缩至原液的1/4体积，用0.02mol/L，pH6.4的醋酸缓冲液透析48h，透析后逐滴加入冰醋酸，调pH至4.0，3000rpm离心15分钟，收集上清液；5)羧甲基纤维素CM52常规处理后置于pH4.0的缓冲液(含0.2g/L NaN3和0.05g/L PEG6000)平衡24h，装压2.6cm×30cm层析柱，用同种缓冲液平衡10h，将上清液装柱，分别用pH4.0、pH5.0及pH6.0的醋酸铵缓冲液(含0.2g/L NaN3和0.05g/L PEG6000)阶段洗脱，流速为60mL/h；6)在pH5.0及pH6.0的缓冲液洗脱时，分别出现一个蛋白峰，收集蛋白峰，测活性，将上述活性峰浓缩，上Sephaclex G-75柱，(已用pH7.4 0.01mol/L，PBS平衡，柱大小为1.6cm×90cm)，用平衡缓冲液洗脱，洗速为12ml/h，可各得粒细胞刺激因子蛋白峰；7)活性检测应用骨髓细胞集落形成试验，即首先用含有10％FCS的RPMI-1640培养液，制备0.3％-1.4％的软琼脂，铺在无菌平皿内，再用淋巴细胞分层液分离正常人骨髓单个核细胞，以2×105/ml细胞接种于软琼脂中，37℃、5％CO2和饱和湿度中培养12-14天，在显微镜下计数≥40个细胞集落形成数，按下列集落刺激活性(CSA)
本发明具有实质性特点和显著的效果，经过羊胚特征蛋白的测定、氨基酸的分析测定、羊胚胎培养液刺激因子活性检测、功效成分检测、稳定性实验、毒理学安全性评价、兴奋剂和激素检测、保健功能评价以及临床实例均得到良好性能和评价。
1、每粒胶囊功效成分每粒胶囊内含功效成分氨基酸态氮≥2.75mg；多糖(以葡聚糖计)≥5/mg；蛋白质≥72.5mg(内含羊胎特征蛋白≥16.75mg)。
2、卫生学与化学检验大肠菌群NPN(100g)＜30；菌落总数(CFU/g)、酵母菌计数(个/g)、霉菌计数(个/g)均＜10；致病菌未检出。水份(％)6.2-7.41，氨基酸态氮(％)1.1；砷(mg/kg)、汞(mg/kg)未检出；铅(mg/kg)0.27-0.37；蛋白质(％)29-30；多糖(以葡聚糖计％)23.8-27.2；羊胚特征蛋白(％)7.1-7.6。
3、稳定性试验将本发明产品置于温度37-40℃和相对湿度75％的条件下，每月检测一次，连续检测3个月，共4次，所有卫生学和化学检测指标均无明显差别。
4、毒理学安全性评估按GB15193-94有关规定进行的毒理学安全性评价的试验，结果对雌雄小白鼠的经口LD50均＞10g/kg，微核试验、精子畸形试验和Ames试验结果均为阴性，未见有致突变性；30天喂养试验结果，实验动物生长情况、血液学检查、生化学检查、主要脏器比及组织学检查结果与对照相比，均无异常。
5、兴奋剂和激素检测未发现国际奥委会规定禁用的药物(刺激剂、麻醉剂、β阻断剂、利尿剂和激素类药物)，对6种人体激素(睾酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雌二醇、孕酮和甲基睾酮)检测均呈阴性。
6、保健功能评价按人体推荐剂量为每日1g/60kg的实验结果表明本发明产品能提高小鼠NK细胞活性、巨噬细胞的吞噬％和吞噬指数及细胞免疫水平；能降低血中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)含量，增高血中超氧化物歧化酶(SOD)活力，可明显延长动物负重游泳时间，降低运动后血乳酸和尿素氮水平，减少肝糖元的消耗。上述检测表明，本发明产品具有免疫调节作用；具有抗氧化与延缓衰老作用；具有抗疲劳作用。
以下结合临床进一步提供实例描述实例一80例恶性肿瘤患者，包括Wilms瘤、精原细胞瘤、急性白血病等，所有患者均由病理和临床诊断。年龄6-67岁。患者服用前均接受放疗，全部病例均有不同程度白细胞减少，最低1800/mm3。全部病人均服用本发明产品(配方组成牛膝多糖125mg，羊胚胎119mg、羊胚胎水解5mg、羊胚胎组织培养提取物1mg)，每次2粒，每天4粒。部分病人因白细胞过低，服用量增1-3倍。服用1-2个月。多数患者在服药7-10天后白细胞升高，全部病例在服药3-4周后达到或接近正常水平。
典型病例介绍1、徐××，男性，34岁。因患精原细胞瘤，需作复主动脉旁大面积照射。放疗二周后，白细胞下降至2000/mm3，无法继续进行放疗。经服用该产品，每日3次，每次3粒。一周后白细胞下降程度明显改善，二周后白细胞升至3800/mm3，以后一直持续于4000/mm3左右，顺利完成放疗。
2、王××，男性6岁，患Wilms瘤。由于肿块面积大，不能手术，需术前全身放疗，因肿块已过中线，照射野面积大，骨髓产生抑制，白细胞明显减少，多次化验白细胞数均＜2000/mm3。服用该产品，每日2次，每次3粒。至治疗结束，白细胞维持在正常水平。放疗结束后即于手术治疗。
3、丁××，女性，33岁。右鼻腔坏死性肉芽肿，放疗前3周用过抗癌药物CCNU120mg，血象下降，白细胞数1800/mm3，无法放疗。使用本品每日2次，每次2粒，3周后白细胞计数维持3200/mm3以上，继而继续接受放疗，完成治疗计划。
4、司徒××，男性7岁，Ewings肉瘤。放疗后血象白细胞数下降至2100/mm3，应用本品每天2次，每次2粒，2周后白细胞恢复至4000/mm3，完成放疗计划。
5、董××，男性9岁，急性淋巴细胞白血病，骨髓缓介后作全脑预防性放疗。治疗中出现高热、上感症状，白细胞下降至2800/mm3，经用本品1周，症状消失，白细胞数恢复至正常水平。
实例二本发明的产品是一种确有实效的造血祖细胞动员剂和免疫调节剂。在应用于白血病化疗过程中和化疗后骨髓抑制期缩短骨髓抑制时间，达到增加化疗的安全性，减少化疗并发的继发感染，还用于MDS白细胞减少时提升白细胞及病毒感染所致的白细胞减少症和免疫性白细胞减少症均有满意的临床疗效。
用于儿童急性白血病(ALL和ANLL)，化疗和放疗后病人60例。服用量一般为4-8粒/日不等，每天2，3次，在维持化疗中为防止白细胞过低，一般用量为4粒/天。这60例均取得良好效果，骨髓抑制期由原来3周左右平均缩短4-7天，从而减少了感染发生率。在巩固、强化治疗时期可使白细胞数升至3000/mm3以上。在已有白细胞减少者加大使用剂量10-12粒/天，5天后白细胞迅速上升到4700/mm3。表明本产品升高白细胞作用明显，其作用与剂量呈正相关，但无一例发生不良副作用。
典型病例介绍1、3例造血紊乱综合症(MDS)患者，WBC1700-2500/mm3，用本发明4-8粒/天，7天后WBC上升至3500-5000/mm3，并且保持不受感染(MDS在临床上一般均见反复感染)。
2、1例自身免疫性粒细胞减少症，白细胞1800/mm3，用本品6粒/天，一周后WBC＞3000/mm3，用本品的3个月期间保持3000-5000/mm3，但停用本品后又下降到2000-2500/mm3，再次用本品，一周后WBC又上升至3000/mm3以上。说明本品可通过调节免疫紊乱，提升粒细胞，刺激粒系干细胞增殖、分化与成熟。
3、2例病毒感染所致粒细胞减少，经用本品4-6粒/天，一周后WBC上升至3000/mm3以上，继续用本品4周，使白细胞维持在4000-6000/mm3。
本发明的产品另一用途还可用于化疗所致的药物性肝功能损害，可促使肝功能加快恢复，在上述病例中至少看到5个病人有这种作用。
权利要求
1.一种粒细胞刺激因子提取的方法及其多糖复方胶囊，其特征在于采用平均分子量为1300-1500的小分子牛膝多糖，从羊胚胎组织水解得到18种人体必需的氨基酸成分，由羊胚胎组织经组织细胞培养技术获取集落刺激因子，冻干羊胚胎粉组分组成，由该组分制作的每粒胶囊250mg内含牛膝多糖125mg，冻干羊胚胎粉119mg，羊胚胎水解物5mg，羊胚胎组织培养冻干粉1mg。
2.根据权利要求1所述的粒细胞刺激因子提取的方法及其多糖复方胶囊，其特征在于羊胚胎粉由羊胚胎经消毒、捣碎、去脂、冻干、球磨等工艺制成＞200目的粉末。
3.根据权利要求1所述的粒细胞刺激因子提取的方法及其多糖复方胶囊，其特征还在于羊胚胎水解物包含18种人体所必需的氨基酸，如色氨酸、丝氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、门冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸。
4.一种粒细胞刺激因子提取的方法，其特征在于提取的方法如下1)将重量50-200g/只的新鲜羊胚胎，经碘酒与酒精消毒后，用手术剪切开胚胎皮肤，暴露胚胎实质器官，分别将各脏器切成1.0cm×1.0cm组织块；2)组织块置于组织(细胞)培养瓶中，每瓶子10g，内含RPMI1640培养液和胎牛血清，置二氧化碳培养箱内，37℃、5％CO2、饱和湿度环境下进行培养，每24小时轻轻摇动培养瓶；3)7-10天后取出，经3000rpm/30′离心、弃沉淀，超滤除菌后置4℃保存，此为羊胚胎组织制得的天然粒细胞刺激因子粗制品。4)粗制品用XHP-1超滤膜在SS-3超滤器上纯氮正压过滤，使之浓缩至原液的1/4体积，用0.02mol/L，pH6.4的醋酸缓冲液透析48h，透析后逐滴加入冰醋酸，调pH至4.0，3000rpm离心15分钟，收集上清液；5)羧甲基纤维素CM52常规处理后置于pH4.0的缓冲液(含0.2g/L NaN3和0.05g/L PEG6000)平衡24h，装压2.6cm×30cm层析柱，用同种缓冲液平衡10h，将上清液装柱，分别用pH4.0pH5.0及pH6.0的醋酸铵缓冲液(含0.2g/L NaN3和0.05g/L PEG6000)阶段洗脱，流速为60mL/h；6)在pH5.0及pH6.0的缓冲液洗脱时，分别出现一个蛋白峰，收集蛋白峰，测活性，将上述活性峰浓缩，上Sephaclex G-75柱，(已用pH7.4 0.01mol/L，PBS平衡，柱大小为1.6cm×90cm)，用平衡缓冲液洗脱，洗速为12ml/h，可各得粒细胞刺激因子蛋白峰；7)活性检测应用骨髓细胞集落形成试验，即首先用含有10％FCS的RPMI-1640培养液，制备0.3％-1.4％的软琼脂，铺在无菌平皿内，再用淋巴细胞分层液分离正常人骨髓单个核细胞，以2×105/ml细胞接种于软琼脂中，37℃、5％CO2和饱和湿度中培养12-14天，在显微镜下计数≥40个细胞集落形成数，按下列集落刺激活性(CSA)
全文摘要
本发明由每粒胶囊250mg内含牛膝多糖125mg,冻干羊胚胎粉119mg,羊胚胎水解物5mg,羊胚组织培养冻干粉1mg。粒细胞刺激因子提取的方法为①取料切块②培养③离心、沉淀④透析、离心⑤洗脱⑥收集、洗脱⑦培养、激活。本发明经各项检测分析评价以及临床实例均得到良好性能和好评。
文档编号A61P37/00GK1251772SQ9911691
公开日2000年5月3日 申请日期1999年9月27日 优先权日1999年9月27日
发明者叶裕春, 钱光玉 申请人:上海健神生物工程有限公司