专利名称：：新的核酸转移试剂,含有它们的组合物及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于向细胞中转移核酸的新的有效化合物。这些新化合物更具体地属于脂多胺类，含有至少一个环脒官能团。它们可用于在体外、离体或体内在不同类型细胞中转染核酸。随着生物技术的发展，在细胞中有效转移核酸日益变得必不可少。例如为了生产重组蛋白，或在实验室对基因表达调控、基因克隆的研究，或任何其他牵涉DNA的操作，都可能涉及体外细胞中的核酸转移。再例如在产生转基因动物、实现免疫接种、研究标记或治疗方法中，也可能涉及在体内细胞中的核酸转移。在骨髓移植方法、免疫治疗方法或涉及在从器官取出的细胞中转移基因以便随后回输的其他方法中，也可能涉及在离体细胞中的核酸转移。为了改善细胞中的核酸转移，曾研制不同类型的合成载体。在这些载体中，阳离子脂类具有有益的性质。这些载体由与核酸作用的阳离子极性部分、和有利于细胞渗透的疏水脂类部分构成。阳离子脂类的特定实例具体地是单阳离子脂类(DOTMALipofectin)、某些阳离子去污剂(DDAB)、脂多胺，特别是双十八烷基氨基甘氨酰基精胺(DOGS)或棕榈酰基磷脂酰乙醇胺的5-羧基精胺基酰胺(DPPES)，例如在专利申请EP394111中描述过它的制备方法。另一类脂多胺以如在专利申请WO97／18185(该专利申请作为参考文献列于本文)中所描述的化合物为代表，它们示于图1中。但是直到现在，为了有利于DNA进入细胞中，经常使用非配制的DNA注入组织中，特别是注入肌肉中，与合成载体结合得到的复合物尺寸太大不便它们进入细胞中。这正是本发明提出要解决的基本问题。事实上，本发明化合物具有的意外优点是在体内肌肉中的转染水平至少与采用非配制DNA所达到的水平相当，无论如何在其他组织中具有非常好的转染水平。与本发明化合物的结合可保护DNA不受核酶降解和／或防止DNA在冻干过程中被破坏，这样可以显著改善核脂类配方的稳定性。此外，这种结合使得可以缓慢控制释放核酸。另外，本发明化合物属于阳离子脂类，它们带有新颖的阳离子区域，该区域使所述化合物具有改善的性质，特别是与现有技术中阳离子载体相比具有较低的细胞毒性。这个阳离子部分事实上更确切地可用一个或多个特定多胺表示，这些胺带一个或多个环脒官能团，其非常可能的作用是使正电荷《不定位》，因此使该化合物总体上较小阳离子性，由此得到在毒性方面的有益效果。因此，本发明的第一个目的涉及呈D、L或DL形式的通式(Ⅰ)新化合物CA-Rep-R(Ⅰ)其中①CA代表具有下述通式(Ⅱ)的环脒基团及其内消旋体式中·m和n彼此独立地是整数0-3，m+n大于或等于1，·R1代表下述通式(Ⅲ)的基团其中p和q彼此独立地是整数0-10，Y代表羰基、氨基、甲基氨基或亚甲基，Y在不同的基团〔(CH2)p-Y〕中可以有不同的意义，(*)代表氢原子，或者是与基团Rep键合的地方，其中R1可以与通式(Ⅱ)任何原子相连，包括Z，并且在式(Ⅱ)中只有一个基团R1，·X代表NR2基团或CHR2基团，R2是氢原子，或者如前面所定义的与R1基团连接的键，·基团代表*第一种情况通式(Ⅳ)基团其中W′代表CHR或NR，R″和R彼此独立地代表氢原子、甲基或如前面所定义的与R1基团连接的键，或*第二种情况通式(Ⅴ)基团其中W＇代表CHR或NR，R＇和R彼此独立地代表氢原子、甲基或如前面所定义的与R1基团连接的键，②Rep不存在或是通式(Ⅵ)的间隔基根据情况其氮原子与X、V、W或Z原子相连，或与基团R1的取代基Y相连，以及·t是0-8的整数，·r是0-10的整数，r在不同-NR4-(CH)r-基团中可以有不同的意义，·R3在不同-NR4-(CH)rR3-基团中可以有不同的意义，它代表氢原子、甲基或下述通式(Ⅶ)基团其中u是0-10的整数，s是2-8的整数，在不同基团-(CH2)sNR5-中可以有不同的意义，R5是氢原子，如前面所定义的CA基团，这些CA基团彼此独立并可以不同，或是通式(Ⅶ)基团，这些通式(Ⅶ)基团彼此独立并可以具有不同的意义，·R4与R3定义相同，或代表如前面定义的CA基团，这些CA基团彼此独立并且可以不同，③R与通式(Ⅵ)Rep基团的羰基官能团相连，或如果Rep基团不存在，R直接与CA基团相连，并代表*式NR6R7基团，其中R6和R7彼此独立地代表氢原子或含有1-22个碳原子、选择性地含有氟的饱和或未饱和的直链或支链脂族基团，并且R6和R7两个取代基中至少一个基不是氢，另一个含有10-22个碳原子，*或者类固醇衍生物*或者下述通式(Ⅷ)基团其中x是1-8中的整数，y是1-10中的整数，Q代表C(O)NR6R7基团，式中R6和R7如前面所定义，或者Q代表C(O)R8基团，其中R8代表下述式(Ⅸ)基团式中z是2-8中的整数，R9是含有8-22个碳原子、选择性地含有氟的饱和或未饱和的脂族基团，或类固醇衍生物，两个取代基R6彼此独立地如前面所定义，或R8代表-O-R9基团，其中R9如前面所定义。根据本发明的一种实施方案，基团R1与Z或者与V相连，另一方面通过Y与Rep基团相连。有利地，式(Ⅱ)环脒基团CA包含5、6、7或8个环原子。另外，在本发明的另一种实施方案中，Rep是有1、2或3个“臂”的间隔基。例如可以列举下述间隔基根据本发明第二个实施方案，R3代表氢原子或甲基，R4如前面所定义，或在式(Ⅵ)中的R3与R4代表氢原子，或者R4是氢原子，而R3是式(Ⅶ)基团，其中R5代表CA基团。优选地，在式(Ⅴ)中，p和q彼此独立地选自2、3或4。一般地，R基团含有至少一个疏水片段。在本发明中，“疏水片段”应当理解是有利于细胞渗透的脂类基团。具体地，基团R含有至少一个脂族链或至少一个类固醇衍生物。根据一个优选实施方案，基团R代表式NR6R7基团，R6和R7如前面所定义，或代表通式(Ⅷ)基团，其中Q代表C(O)NR6R7基团，R6和R7如前面所定义，优选地，R6和／或R7彼此独立地代表含有10-22个碳原子的饱和或未饱和直链脂族链，优选含12、14、16、17、18或19个碳原子，例如(CH2)11CH3、(CH2)13CH3、(CH2)15CH3、(CH2)17CH3、油基等基团。在一个特定的实施方式中，R6和R7基团相同或不同，它们每个代表如前段所定义的含有10-22碳原子、选择性地含氟的饱和或未饱和的直链或支链脂族链。当R代表类固醇衍生物时，它有利地选自胆固醇、胆甾烷醇、3-α-5-环-5-α-胆甾烷-6-β-醇、胆酸、甲酸胆甾醇酯、甲酸胆甾烷酯、甲酸3α，5-环-5α-胆甾烷-6β-醇酯、胆甾烯基胺、6-(1，5-二甲基己基)-3a，5a-二甲基-十六氢环戊〔a〕环丙烯并〔2，3〕环戊二烯并〔1，2-f〕萘-10-基胺或胆甾烷基胺。这些通式(Ⅰ)新化合物可以是无毒的药学上可接受的盐形式。这些无毒的盐包括与无机酸生成的盐(盐酸、硫酸、氢溴酸、磷酸、硝酸)，或与有机酸生成的盐(乙酸、丙酸、琥珀酸、马来酸、羟基马来酸、苯甲酸、富马酸、甲磺酸或草酸)，或与无机碱生成的盐(氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙)，或与有机碱生成的盐(叔胺如三乙胺、哌啶、苄胺)。作为说明本发明优选化合物的实例，可以列举下述式的化合物化合物(1)N-双十八烷基氨基甲酰基甲基-2-{3-〔4-(2-亚氨基-四氢嘧啶-1-基)-丁基氨基〕丙基氨基}-乙酰胺化合物(2)N-双十四烷基氨基甲酰基甲基-2-{3-〔4-(2-亚氨基-四氢嘧啶-1-基)-丁基氨基〕丙基氨基}-乙酰胺化合物(3)2-(3-{4-〔3-(4，，5-二氢-1H-咪唑-2-基氨基)-丙基氨基〕-丁基氨基}-N-双十四烷基氨基甲酰基甲基-乙酰胺化合物(4)2-(3-{双-〔3-(4，5-二氢-1H-咪唑-2-基氨基)-丙基〕-氨基}-丙基氨基)-N-双十四烷基氨基甲酰基甲基-乙酰胺化合物(5)N-双十四烷基氨基甲酰基甲基-2-{3-〔3-(1，4，5，6-四氢嘧啶-2-基氨基)-丙基氨基〕-丙基氨基}-乙酰胺化合物(6)N-双十八烷基氨基甲酰基甲基-2-{3-〔3-(1，4，5，6-四氢嘧啶-2-基氨基)-丙基氨基〕-丙基氨基}-乙酰胺本发明的化合物可以采用不同的方式制备得到。根据第一种方法，首先合成脂多胺类似物(即具有同样的结构，但没有环脒基团)，其次环化成环脒基团，这样可以得到本发明的化合物。脂多胺类似物可以采用本领域的技术人员已知的任何方法得到，特别是根据在专利申请WO97／18185中描述的方法或采用类似的方法得到。脒端成环例如可如下进行，让一种或多种脂多胺的伯胺与如硫酸O-甲基异脲硫的硫酸氢盐〔J．Med．Chem．，1995，38(16)，第3053-3061页〕或S-甲基异硫脲半硫酸盐〔Int．J．Rept．Prot．Res．，1992，40，第119-126页〕之类的反应剂反应。优选地，在含水介质中在热碱存在下操作〔J．Med．Chem．，1985，第694-698页和J．Med．Chem．，1996，第669-672页〕。作为优选的溶剂，可以列举水／醇或二甲基甲酰胺混合物。作为碱，可以使用三乙胺、N-乙基二异丙胺、氢氧化钠、氢氧化钾等。温度优选地是40-60℃，更优选地，该反应在50℃进行。另一种方法是合成带环脒官能团的部分，然后将这些部分接枝在有间隔基的脂类上。这种方法的优点是可以得到大量不同的产品。在本发明中，“部分”应当理解是任何分子官能团片段。例如，如在通式(Ⅱ)中定义的环脒基团CA、Rep或R构成了在本发明中彼此不同的部分。作为实例，例如可以以如下方式进行1)R部分的合成a)当R代表-NR6R7时，它或者可从市场上购买到，或者按照下述方法中的一种合成得到*采用带R6基团的胺与带R7基团的醛之间进行的烷基化还原。优选地在含氯溶剂(例如二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷等〔有机化学杂志(J．Org．Chem．)，1996，第3849-3862页〕中或在与该反应相容的任何有机溶剂(例如四氢呋喃)中，在三乙酸基硼氢化钠、氰基硼氢化钠或其衍生物(例如氰基硼氢化锂)〔美国化学学会杂志(J．Am．Chem．Soc．)，1971，第2897-2904页〕和乙酸存在下操作。*或采用由带有R7基团的胺取代由R6带有的离去基团。作为离去基团实例，可以列举卤素原子(Br、Cl、I)或甲苯磺酰基、甲磺酰基取代基等。优选地在例如碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、三乙胺等之类的碱性反应剂存在下，在醇(例如乙醇)中，进行回流操作〔美国化学学会杂志，1996，第8524-8530页〕。*或采用脂肪酸(或例如像脂肪酸酰氯之类的衍生物)与脂肪胺之间的偶合作用。得到的酰胺可采用氢化物、例如氢化锂铝或本领域的技术人员已知的任何其他氢化物，在醚(例如四氢呋喃(THF)、叔丁基甲基醚(TBME)、二甲氧基乙烷(DME)等)中进行还原。b)当R代表通式(Ⅷ)基团时，在Q基团与H-[NH-(CH2)x]yCOOH之间进行肽偶合。根据本领域的技术人员已知的经典方法〔BodanskiM．，肽合成原理与实践(PrinciplesandPracticesofpeptideSynthesis)，Springe-Verlag编〕，或采用任何已知的类似方法进行肽偶合。具体地，在非亲核碱存在下，在适当的非质子溶剂(如氯仿、二甲基甲酰胺、甲基吡咯烷酮、乙腈、二氯甲烷等)中，在温度0-100℃下进行该反应，同时pH调节到9-11。Q是可从市场上买到的，或者当Q代表C(O)R8基团，而R8为式(Ⅸ)时，可以采用下述方法合成市售的或根据本领域的技术人员已知经典方法使用市售氯代甲酸盐得到的氯代甲酸酯(例如胆甾烯基氯代甲酸酯)，与市售的或根据本领域的技术人员已知经典方法得到的二胺(例如N-乙二胺)进行反应。优选地，在含氯溶剂(例如二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷等)中或在与该反应相容的有机介质如二甲基甲酰胺、二甲基砜、乙腈等中操作。H-[NH-(CH2)x]yCOOH基团在y等于1时是一种有商业供应的氨基酸，当y大于1时，可根据下面描述的在合成Rep中的方法，采用一个或多个氰基乙基化反应得到。2)合成Rep部分Rep基团制备方法如下式HOOC-(CH2)r-NH2氨基酸经氰基乙基化反应或二氰基乙基化反应(根据希望获得的直链或支链Rep的结构)后，再将乙腈官能团还原成胺优选地，在碱性含水介质中操作。例如，在如水、醇(例如甲醇、乙醇等)之类的溶剂中，在如氢氧化钠、氢氧化钾、三乙胺等之类的碱存在下进行该反应。在单氰基乙基化反应的情况下，优选地在冷却条件下进行该反应〔美国化学学会杂志，1950年，第2599-2603页〕。在二氰基乙基化反应的情况下，优选地在加热条件下使用过量的丙烯腈进行该反应〔美国化学学会杂志，1951年，第1641-1644页〕。b)在碱性介质中采用催化氢化反应或采用本领域的技术人员已知的任何其他方法进行将腈官能团还原成胺的反应。作为实例，可以使用氧化铂或Raney镍作为催化剂〔有机化学杂志，1988年，第3108-3111页〕。优选地，在例如氢氧化钠、氢氧化钾等之类的碱存在下，使用醇溶剂(例如甲醇、乙醇等)。3)Rep-R部分的合成Rep-R部分是在前面步骤中得到的酸Rep和胺R经肽偶合得到的。肽偶合是根据本领域的技术人员已知的经典方法进行的(BodanskiM．，肽合成原理与实践，Springe-Verlag编)或采用任何已知的类似方法进行的。具体地，在非亲核碱存在下，在适当的非质子溶剂(如氯仿、二甲基甲酰胺、甲基吡咯烷酮、乙腈、二氯甲烷等)中，在温度0-100℃条件下进行该反应，其pH调节到9-11。4)本发明化合物CA-Rep-R的合成本发明化合物可采用多种可能的方法得到a)根据本领域的技术人员已知的经典方法，在碱性介质中让在前面步骤得到的在Rep-R上的末端胺与CA-S-CH3之间进行偶合。优选地，在含氯溶剂(例如二氯甲烷、氯仿等)或在与该反应相容的其他有机溶剂如水、醇、二甲基甲酰胺等中，在碱(例如三乙胺、氢氧化钠、氢氧化钾、N-乙基二异丙胺等)存在下，在室温(约20℃)条件下操作。CA-Rep-CH3部分可从市场购买到(例如2-甲硫基-2-咪唑啉氢碘化物便是这种情况)，或者让二硫化碳与适当的二胺(即根据希望得到的环脒基团选择)作用，接着进行甲基化反应得到。例如，可以下述方式说明反应流程优选地，在醇(例如乙醇)中实施该反应方法。通过卤代甲基作用进行甲基化步骤，卤素原子例如可以是碘原子〔美国化学学会杂志，1956年，第1618-1620页和Bioorg．Med．Chem．Lett．，1994年第351-354页〕。b)使Rep-R上存在的氨基官能团，通过O-甲基异脲硫酸氢盐或S-甲基异硫脲半硫酸盐的作用，进行环脒基团的内部成环。优选地，在含水介质中，在碱存在下加热进行合成〔J．Med．Chem．，1985年，第694-698页和J．Med．Chem．，1996年，第669-672页〕。作为优选溶剂，可以使用水／醇混合物或二甲基甲酰胺。作为碱，可以使用三乙胺、N-乙基二异丙胺、氢氧化钠、氢氧化钾等。温度优选地是40-60℃，更优选地是在50℃进行该反应。c)根据本领域的技术人员已知的经典方法，CA-COOH与Rep-R的肽偶合作用，如前面所描述的。部分CA-COOH可以采用下述不同方式得到●根据本领域的技术人员已知的方法，或采用任何其他类似的方法〔美国化学学会杂志，1956年，第1618-1620页〕，让部分CA-S-CH3与氨基酸或多聚氨基酸作用。部分CA-S-CH3是采用与前面所述的同样方式得到的，氨基酸或多聚氨基酸可根据本发明所要求的化合物进行选择，或●根据本领域的技术人员已知的方法，或采用任何其他类似的方法〔有机化学杂志，1971年，第46-48页〕，让S，S-二甲基-甲苯磺酰基-iminothiocarbonimidate或其一种衍生物与多聚氨基酸作用。优选地，在乙醇介质中，在碱存在(例如氢氧化钠)下，在混合物回流温度下进行操作。作为采用上述其中一种方法可以得到的CA-COOH部分的实例，列举下述部分在上面公开的所有反应中，当在不同基团中存在的氨基取代基干扰这些所进行的反应时，最好采用能被置换或被除去的相容基团预先对这些氨基取代基加以保护，而不涉及该分子的其余部分。作为实例，保护基团可以选自T．W．GREENE在《有机合成中的保护基团》(ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis)，J．Wiley-IntersciencePublication(1991)中或McOmie在《有机化学中的保护基团》(ProtectiveGroupsinOrganicChemistry)，PlenumPress(1973)中描述的基团。本发明另外一个主题涉及含有至少一种如前面定义的式(Ⅰ)化合物的组合物。具体地，本发明另外一个主题包括如前面定义的式(Ⅰ)化合物和核酸。当本发明化合物和核酸接触时，通过本发明化合物在生理学pH条件下具有的正电荷与核酸负电荷之间相互作用而生成复合物。这种复合物在全文称之“核脂复合物”。优选地，本发明化合物与核酸的量是化合物正电荷与核酸负电荷之比是0．1-50，优选地是0．1-20。本领域的技术人员根据所使用的化合物、核酸和所要进行的应用(特别是待转染细胞类型)很容易调整这个比例。在本发明中，“核酸”应该理解是脱氧核糖核酸或核糖核酸。可能涉及天然或人工的序列，特别是基因组DNA(gDNA)、互补DNA(eDNA)、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、杂合序列或合成或半-合成序列、修饰或未修饰的寡核苷酸。这些核酸可以来自人、动物、植物、细菌、病毒等。采用本领域技术人员已知的任何技术，特别是采用文库筛选、化学合成，或采用混合方法，其中包括化学修饰或酶修饰采用筛选文库所得到的序列，可以得到这些核酸。这些核酸可以采用化学方法进行修饰。更特别地涉及脱氧核糖核酸，它们可以是单链或双链脱氧核糖核酸，以及短的寡核苷酸或较长的序列。特别是，这些核酸有利地由质粒、载体、附加体、表达盒等组成。这些脱氧核糖核酸可以带有在靶细胞中有功能或非功能性复制起点、一个或多个标记基因、转录或复制调控序列、有治疗意义的基因、修饰或未修饰的反义序列、与其他细胞组分结合的区域等。优选地，核酸含有一个表达盒，该盒由在靶细胞中有活性的一个或多个启动子和转录终止子控制下的一个或多个有治疗意义的基因构成。在本发明中，关于“有意义的基因表达盒”应该理解为一种DNA片段，它可以在特定限制位点插入载体中。该DNA片段含有编码目标RNA或多肽的核酸序列，还含有表达所述序列所必需的序列(一个或多个增强子、一个或多个启动子、聚腺苷酸化序列等)。设计该表达盒和限制位点保证表达盒插入转录和转译所适合的阅读框架。还涉及带一个或多个有治疗意义基因的质粒或附加体。作为实例，可以列举在专利申请WO96／26270和WO97／10343中描述的质粒，这些参考文献列于本文中。在本发明中，关于“有治疗意义的基因”尤其应该理解为任何编码具有治疗作用的蛋白质产品的基因。在专利EP140308中描述过这种产品。有治疗意义的基因还包括核酶编码序列，它们能够选择性地破坏靶RNA(EP321201)。如前面所指出的，核酸还可以含有一个或多个编码抗原性肽的基因，这种肽在人体或动物中能够造成免疫应答。在这种特定实施方式中，本发明因此使得可能制备用于人体或动物的疫苗或进行免疫治疗，尤其是用于抗微生物、病毒或癌的疫苗。特别地涉及对E-B病毒、HIV病毒、乙型肝炎病毒(EP185573)、伪狂犬病病毒、“合包体形成病毒”、其他病毒特异的抗原性肽、或对肿瘤特异的抗原性肽(EP259212)。优选地，核酸还含有允许有治疗意义的基因和／或抗原肽编码基因在细胞或所希望的器官中表达的序列。这可以涉及天然地负责表达所考虑的基因的序列，只要这些序列在感染的细胞中能够起作用。还涉及不同来源的序列(负责表达其他的蛋白质，或甚至是合成的)。具体地，可以涉及真核细胞或病毒基因的启动子序列。例如，可以涉及来自人们希望感染的细胞基因组的启动子序列。同样地，可以涉及来自病毒基因组的启动子序列。为此，例如可以列举基因ElA、MLP、CMV、RSV等的启动子。另外，这些表达序列可以通过加入活化序列、调控序列等进行修饰。也可以涉及可诱导的或可抑制的启动子。另外，核酸特别在有治疗意义的基因上游还可以含有指导合成的治疗产品至靶细胞分泌通道中的信号序列。这种信号序列可以是治疗产品的天然信号序列，但也可以涉任何其他功能性信号序列或人工信号序列。核酸还可以含有将合成的治疗产品引导向特定的细胞室的信号序列。本发明的组合物还可以含有能够与本发明化合物与核酸所形成复合物结合并能够改善其转染能力的一种或多种添加剂。在另外一种实施方式中，本发明因此涉及含有核酸、如前面定义的式(Ⅰ)化合物以及一种或多种能够与由(Ⅰ)／核酸组成的核脂复合物结合并能够改善其转染能力的添加剂的组合物。这类添加剂(例如脂类、肽或蛋白质)对增加化合物转染能力可以很有利。在这种选择中，本发明的组合物可以含有一种或多种中性脂作为添加剂。这样一些组合物是特别有利的，当电荷比R很低时尤其如此。事实上，已表明加一种中性脂能够改善核脂颗粒的生成，还通过使膜失稳定而有利于颗粒穿透细胞。更优选地，在本发明范围内使用的中性脂是具有两个脂肪链的脂类。特别有利地，使用在生理条件下为两性离子或无离子电荷的天然或合成脂类。更具体地，它们可以选自二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、油酰基棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基-、二棕榈酰基-、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺以及它们的1-3次N-甲基化衍生物、磷脂酰基甘油、二酰基甘油、糖基二酰基甘油、脑苷脂(具体如半乳糖脑苷脂)、鞘脂(具体如鞘磷脂)，或脱唾液酸神经节苷脂(具体如脱唾液酸GM1和GM2)。这些不同的脂类采用本领域的技术人员熟知的经典技术通过合成方法，或者从器官(例如脑)或蛋提取的方法得到。特别是，采用有机溶剂的方法可以提取天然脂类(也可参见Lehninger，Bioehemistry)。最近，申请人已证明，使用干预或非直接地干预所述核酸浓集(condensation)的化合物作为添加剂，也是特别有利的(WO96／25508)。在本发明组合物中，这样一种化合物的存在，能够降低式(Ⅰ)化合物的量，在毒理学方面由此获得有益结果，对所述组合物的转染活性不会带来任何损害。关于干预核酸浓集的产品，应该定义为直接或非直接地压紧核酸的化合物。更确切地，这种产品或者直接作用于待转染核酸，或者干预直接参与这种核酸浓集作用的辅助化合物。优选地，直接作用于核酸。例如，预致密(precompactant)产品可以是任何多阳离子物，例如聚赖氨酸。根据一种优选实施方式，干预核酸浓集作用的这种产品完全或部分地从鱼精蛋白、组蛋白、核仁蛋白和／或它们的衍生物得到。这样一种产品还可以全部或部分地由肽基元(KTPKKAKKP)和／或(ATPAKKAA)构成，基元数可以是2-10。在本发明化合物结构中，这些基元可以连续地或不连续地重复。因此它们可以通过生物化学性质的连接(例如一个或多个氨基酸)隔开，例如通过一个或多个氨基酸隔开，或通过化学性质的连接隔开。优选地，本发明的组合物含有每一核酸当量为0．01-20当量的一种或多种添加剂(摩尔／摩尔)，更优选地是0．5-5。在一种特别优选的实施方式中，本发明的组合物还可以使用一种靶向元件，这些元件能够使核酸转移定向。这种靶向元件可以是细胞外靶向元件，该元件能够使DNA向一些细胞类型或一些希望的组织结构转移(肿瘤细胞、肝细胞、生血细胞)。还可以涉及细胞内靶向元件，该元件能够使核酸向一些特别有利的细胞室转移(线粒体、核等)。靶向元件可以与本发明化合物连接也可与核酸连接，如以前详细描述过的。在本发明范围内可使用的靶向元件中，可以列举糖、肽、蛋白质、寡核苷酸、脂类、神经递质、激素、维生素或它们的衍生物。优选地，涉及糖、肽或蛋白质，如抗体或抗体片段、细胞受体的配体或它们的片段、受体或受体片段等。特别地，可以涉及生长因子受体配体、细胞因子受体配体、细胞凝集素受体配体或具有RGD序列并与如整联蛋白之类粘附蛋白的受体有亲合力的配体。还可以列举转铁蛋白、HDL和LDL的受体，或叶酸盐转运蛋白。靶向元件还可以是能够靶向于整联蛋白的糖，例如靶向脱唾液酸糖蛋白或唾液酸化衍生物(syalydes)如syalydeLewisX的受体，或抗体Fab片段，或单链抗体(ScFv)。可以采用本领域的技术人员已知的任何技术，例如通过与本发明通式(Ⅰ)化合物的疏水部分或与核酸作用部分偶合的方法，或与本发明通式(Ⅰ)化合物作用的基团偶合的方法，将靶向元件与本发明核脂复合物结合。根据一种优选方式，所述相互作用可以是离子或共价的性质。根据另外一种实施方案，本发明的组合物中还可以加入至少一种非离子表面活性剂，其量足以使由通式(Ⅰ)／核酸组成的核脂复合物微粒的尺寸稳定。加入非离子表面活性剂防止形成聚集体，这样使得该组合物更特别地适合体内使用。本发明组合物中加入这样一些表面活性剂具有安全方面的优点。考虑到核脂复合物组成总电荷降低这种情况，它们还有一个附加优点，即它们降低了其他蛋白质的干扰危险。表面活性剂有利地由至少一种疏水部分和至少一种亲水部分组成。优选地，疏水部分选自脂族链、聚氧化烯烃、亚烷基聚酯、具有多苄醚和胆固醇头的聚乙二醇，亲水部分有利地选自聚氧化烯烃、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或糖。这样一些非离子表面活性剂在专利申请WO98／34648中描述过。本发明还有一个目的是如前面定义的通式(Ⅰ)化合物在制备用于通过在初级细胞中或在已建的细胞系中转移核酸用来治疗疾病的药物中的用途。这可以涉及成纤维细胞、肌肉细胞、神经细胞(神经元、星形细胞、神经胶质细胞)、肝细胞、生血细胞(淋巴细胞，CD34、树状细胞等)、上皮细胞等，它们呈已分化形式或多潜能形式(前体)。这种应用是特别有利的，因为本发明通式(Ⅰ)化合物的细胞毒性比现有技术中阳离子脂类低。本申请人特别证明了，当电荷比非常高时，通常导致连续转染的动物死亡，因此显示出明显的细胞毒性。本发明这些化合物具体可以用于体外、离体或体内核酸转染。对于体内的应用，例如治疗方面的应用，或为了研究基因的调节或建立动物疾病模型，本发明的组合物经配制可以采用局部、皮肤、口、直肠、阴道、肠胃外、鼻内、静脉内、肌肉内、皮下、眼内、皮内、气管内、腹膜内等方式用药。优选地，本发明的组合物含有下述药学上可接受的赋形剂，该赋形剂适用于注射剂，尤其是用于在所希望器官中直接注射的注射剂，或适于用局部方式(皮肤和／或粘膜上)用药。特别涉及等渗的无菌溶液，或干的尤其是冻干的组合物，这些组合物可根据情况加入无菌水或生理盐水配制成注射溶液。注射使用的核酸剂量以及用药次数可以根据不同的参数而变化，特别是根据用药方式、涉及的疾病、待表达基因或所进行治疗的时间长短而变化。更具体地对于用药方式，可以涉及在组织中，例如在肿瘤中，或循环通路中直接注射，或者处理培养细胞接着采用注射或移植方法将它们再植入体内。在本发明范围内涉及的组织例如是肌肉、皮肤、脑、肺、肝脏、脾、骨髓、胸腺、心脏、淋巴、血液、骨、软骨、胰、肾脏、膀胱、胃、肠、卵巢、直肠、神经系统、眼、淋巴结、结缔组织等。有利地，转染的组织是肌肉和肺。本发明还涉及在细胞中转移核酸的方法，该方法包括下述步骤(1)让核酸与如前面定义的通式(Ⅰ)化合物接触，以便生成核脂复合物，(2)让细胞与(1)中生成的核脂复合物接触。细胞与核脂复合物的接触可以通过细胞与所述复合物一起培养(体外或离体使用)，或给生物体注入复合物(体内使用)来实现。优选地，例如106个细胞可在0．01-1000微克核酸存在下进行培养。体内使用时，可以使用的核酸剂量例如为0．01-10毫克。在本发明组合物还含有一种或多种如前面定义的添加剂的情况下，一种或多种添加剂预先与本发明通式(Ⅰ)化合物混合，或与核酸混合。本发明因此提供了一种使用编码蛋白质的或可以转录成能缓解所述疾病之核酸的核酸治疗疾病的特别有利的方法，在前面确定的条件下，所述的核酸与前面定义的通式(Ⅰ)化合物结合。更具体地，这种方法可用于因蛋白质或核酸产品缺陷而引起的疾病，使用的核酸可编码所述的蛋白质产品或转录成核酸产品或构成所述的核酸产品。本发明涉及本发明通式(Ⅰ)化合物在体内、离体或体外细胞转染中的任何应用。除了前面的描述，本发明还包括由下述实施例和附图得出的其他特点和优点，这些实施例和附图应该认为是说明本发明而不是限制其保护范围。具体地，申请人非限制性地提出各种操作方案，以及可用于制备本发明通式(Ⅰ)化合物的反应中间体。当然，本领域的技术人员在这些方案和／或中间体的启示下能够找到类似的方法，以便得到本发明通式(Ⅰ)的其他化合物。附1在本发明中命名为脂A、脂B、脂C和脂D的合成载体的结构，这些载体在专利申请WO97／18185中描述过，该申请作为参考文献列于本文。图2质粒pXL2774的示意图。图3化合物(Ⅰ)／DNA核脂复合物的相图。根据溴化乙锭(EtBr)荧光降低率(以％表示，100％是裸DNA的荧光)确定化合物(Ⅰ)与DNA的结合(符号●，实线)，如位于右边y轴所描绘的。复合物微粒尺寸(以纳米表示)示于位于左边的y轴上。x轴表示转移剂／DNA电荷比。实线上符号■表示无辅助脂类的核脂复合物的尺寸。用虚线上符号□表示含有25％胆固醇的核脂复合物的尺寸。用在虚线上符号◆表示含有40％DOPE的核脂复合物尺寸。该方法不能测定超过3微米的微粒尺寸。图4与裸DNA相比，含有本发明化合物(Ⅰ)和无辅助脂类(深灰色条)、有25％胆固醇(左边中灰色条)及40％摩尔DOPE(右边浅灰色条)的核脂复合物在细胞Hela中体外基因转移活性。仅使用其中DNA以本发明化合物完全饱和并且尺寸为100-300纳米的核脂复合物。图5在HeLa细胞中，用化合物(3)制得的核脂复合物的体外基因转移活性。图纵轴表示每个转染孔中萤光素酶的表达，以皮克表示。横轴表示化合物(3)／DNA电荷比，以纳摩尔／微克表示。每次测定无辅助脂类(微团)、有DOPE和有胆固醇的配制品的表达。图6在HeLa细胞中，用化合物(5)制得的核脂复合物的体外基因转移活性。图纵轴表示每个转染孔中萤光素酶的表达，以皮克表示。横轴表示化合物(5)与DNA电荷比，以纳摩尔／微克表示。每次测定无辅助脂类(微团)、有DOPE和有胆固醇的配制品的表达。图7在HeLa细胞中，用化合物(6)制得的核脂复合物的体外基因转移活性。图纵轴表示每个转染孔中萤光素酶的表达，以皮克表示。横轴表示化合物(6)与DNA电荷比，以纳摩尔／微克表示。每次测定无辅助脂类(微团)、有DOPE和有胆固醇的配制品的表达。图8与裸DNA相比，含有本发明化合物(Ⅰ)或式H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)17CH3]2化合物(以下称之“脂A”)，并无辅助脂类(深灰色条)、有25％胆固醇(中灰色条)或40％摩尔DOPE(浅灰色条)的复合物直接注射肌肉后的体内基因转移活性。仅用其中DNA在脂类中被完全饱和并且尺寸为100-300纳米的核脂复合物。图9通过比较两种不同脂类(本发明化合物(Ⅰ)与脂A)的基因转移活性，和通过两种给药方法(静脉内(iv)和肌肉内途径(im)使用裸DNA的转移活性，说明本发明的重要性。仅使用其中DMA在类脂中被完全饱和且其尺寸是100-300纳米的复合物。图10与裸DNA相比，在im注射核脂复合物48小时后的体内基因转移活性，该复合物含有本发明化合物(5)或(6)，无辅助脂类，电荷比为0．25／1。以每毫升萤光素酶皮克数表示该表达。从左边开始，这些条表示(a)负调控；(b)裸DNA；(c)化合物(5)；和(d)化合物(6)。材料与方法A材料-氨基酸、多聚氨基酸(或它们的衍生物)原料可从市场上购买，例如N-(3-氨基丙基)甘氨酸、N-(2-氰基乙基)甘氨酸，或2，4-二氨基丁酸便是这种情况，或者采用本领域的技术人员已知的经典方法合成得到。-环异硫脲也是商品，例如2-甲硫基-2-咪唑啉氢碘化物，或者采用本领域技术人员已知的经典方法合成得到。-用一个或多个脂取代的胺是商品，或可以用相应的胺和醛通过烷基化还原合成。-如三乙胺、三氟乙酸、苯并三唑-1-氧基三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)、二甲基氨基吡啶(DMAP)、氯代甲酸苄酯、二碳酸二叔丁酯之类的产品都是商品。氯化钠与碳酸钠溶液是饱和溶液。硫酸钾溶液的浓度是0．5M。B方法1)物理测量用Bruker400波谱仪以600MHz记录了质子NMR谱。用API-MS／Ⅲ测定了质谱。2)纯化与分析方法a)正相色谱条件-用厚度0．2毫米的Merck硅胶板进行薄层色谱(TLC)分析。它们在U．V．(254纳米)下显色，用茚三酮显色，在150℃加热蒸发(轻微喷洒)茚三酮乙醇溶液(40毫克／100厘米3乙醇)使胺或酰胺显色；用荧光胺显色，蒸发溶液(40毫克／100厘米3丙酮)使伯胺显色；用溴甲酚绿显色，蒸发溶液(0．1％丙-2-醇溶液)使酸显色；用香草醛显色，蒸发(轻微喷洒)香草醛乙醇溶液(3％)，其中含有3％硫酸，接着在120℃加热；或用碘显色，用碘粉覆盖该板。-用粒度0．063-0．2000毫米Merck60硅胶进行柱色谱分析。b)制备性HPLC(高效液相色谱)纯化条件该装置是一套能够进行U．V．测定的梯度模式液相色谱装置。这种制备性流水线由下述元件组成泵AGILSON305型，配备SC50头，泵BGILSON303型，配备SC50头，注射回路5毫升，压力组件GILSON806型，混合器GILSON811C型，配备23毫升头，UV检测器GILSON119C型，配备制备室，馏分收集器GILSON202型，配备21号架，10毫升玻璃试管，积分仪SHIMADZUC-R6A型，柱长25厘米、直径2．2厘米不锈钢柱C4(10毫米)，214TP1022型，VYDAC公司销售。待纯化产品溶液通过注射回路加到柱中，洗脱液以30秒一支管子收集多份。将检测器调节到波长220纳米和254纳米。移动相定义如下溶剂A溶剂B软化水2500厘米3HPLC用乙腈2500厘米3三氟乙酸2厘米3三氟乙酸2．5厘米3梯度<tablesid="table1"num="001"><table>时间，分钟％溶剂A％溶剂B流量，厘米3／分钟090l01810901018110010018120010018</table></tables>c)分析性色谱技术-HPLC分析(高效液相色谱)使用Merck-Hitachi装置，它配置了HITACHID2500计算积分仪、AS-2000A自动进样器、L-6200A智能泵、UV-visL-4000检测器，波长可调节到220纳米。分析性分离柱是APPLIEDBIOSYSTEMS销售的柱，用不锈钢制成，长为3厘米，直径为0．46厘米。固定相由7微米AquaporeBuryl构成，流动相是水(含三氟乙酸)和乙腈(含三氟乙酸)。注射量是20微升约1毫克／厘米3溶液，回路阀为0．1厘米3。分析时流量调节到1-4厘米3／分。压力是约180巴。分离条件汇集如下溶剂A溶剂B软化水2500厘米3HPLc用乙腈2500厘米3三氟乙酸2厘米3三氟乙酸2．5厘米3梯度<tablesid="table2"num="002"><table>时间，分钟％溶剂A％溶剂B流量，厘米3／分钟0604013604012001001</table></tables><tablesid="table3"num="003"><table>350100135．16040436．16040436．2604024460402</table></tables>实施例A本发明化合物的合成实施例1合成化合物(1)(N-双十八烷基氨基甲酰基甲基-2-{3-〔4-(2-亚氨基-四氢嘧啶-1-基)-丁基氨基〕-丙基氨基}-乙酰胺)，从下面称之“脂B”的式H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)17CH3]2阳离子脂类合成化合物(其制备方法在专利申请WO97／18185中描述过，其结构示于图1)制备)。在配备磁棒的烧瓶中，将0．784毫摩尔脂B溶于25厘米3甲醇中，添加10．21毫摩尔三乙胺。然后往该混合物缓慢地(5分钟)倒入O-甲基异脲和硫酸(1．173毫摩尔)在水(9厘米3)中的溶液。混合物在50℃油浴中保持二十小时。然后，将混合物在旋转蒸发器中浓缩至干。用水(4厘米3)、乙醇(4厘米3)和三氟乙酸(1厘米3)溶液溶解干提取物。将这种溶液分两次注入制备性HPLC柱中。收集有用的馏分(采用分析性HPLC测定)，冷却并冻干。这样得到194毫克(0．163毫摩尔)成盐产品。产率20．8％。HPLC分析Rt=15．99分。1HNMR谱(400MHz，(CD3)2SO，δ，以ppm表示)0．88(t，J=6．5Hz，6H脂肪链的CH3)；1．24(mt，60H脂肪链中心CH2)；1．35-1．70(mt，4H每个脂肪链的1CH2)；1．57(mt，4H丁基中心的(CH2)2)；1．88和1．96(2mt，每个2H丙基中心CH2和环的中心CH2)；2．85-3．35(2mt，共16H8NCH2)；3．81(宽s，2HNCH2CON)；4．03(d，J=5Hz，2H甘氨酰基的CONCH2CON)；7．25-7．84(分别s和宽s，每个1H环的2NH)；8．61(t，J=5．5Hz，1HNHCO)；8．70和9．02(2mf，每个1H2NH)。MH+=846。实施例2合成化合物(2)(N-双十四烷基氨基甲酰基甲基-2-{3-〔4-(2-亚氨基-四氢嘧啶-1-基)-丁基氨基〕-丙基氨基}-乙酰胺)，从下面用称之“脂C”的式H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)13CH3]2化合物(其制备方法在专利申请WO97／18185中描述过，其结构示于图1)合成)。在配备磁棒的烧瓶中，将1．036毫摩尔脂C溶于30厘米3甲醇中，添加13．13毫摩尔三乙胺。然后往该混合物缓慢地(5分钟)倒入O-甲基异脲和硫酸(1．554毫摩尔)在水(9厘米3)中的溶液。该混合物在50℃油浴中保持二十小时。然后，将混合物在旋转蒸发器中浓缩至干。用水(3厘米3)、乙醇(2厘米3)和三氟乙酸(0．5厘米3)溶液溶解干提取物。将这种溶液注入制备性HPLC柱中。收集有用的馏分(采用分析性HPLC测定)，冷却并冻干。这样得到218毫克(0．2022毫摩尔)成盐产品。产率19．5％。HPLC分析Rt=10．76分。1HNMR谱(400MHz，(CD3)2SO，δ，以ppm表示)0．88(t，J=7Hz，6H脂肪链的CH3)；1．15-1．40(mt，44H脂肪链中心(CH2)11)；1．45和1．50-1．65(2mt，每个2H每个脂肪链的1CH2)；1．59(mt，4H丁基中心的2CH2)；1．91和1．97(2mt，每个2H丙基中心CH2)；2．85-3．10(mt，10H丁基的2NCH2-2个丙基之一的2NCH2-另一个丙基的2NCH2的一个)；3．23和3．30-3．50(2mt，分别5H和1H另一丙基的另一个NCH2和脂肪链的NCH2)；3．79(mf，2HNCH2CON)；4．03(d，J=5Hz，2H甘氨酰基的CONCH2CON)；7．27和8．40-9．30(分别宽s和mf，2H和4HNH2+CF3COO-，NH+CF3COO-和=NH)；7．88和8．61(分别s和宽s，每个1H分别NHC=N和CONH)。MH+=734。实施例3合成化合物(3)(2-(3-{4-〔3-(4，5-二氢-1H-咪唑-2-基氨基)-丙基氨基〕-丁基氨基}-丙基氨基)-N-双十四烷基氨基甲酰基甲基-乙酰胺)，从下面的脂C(参见实施例2，其结构参见图1)合成)。在配备计泡器和磁棒的烧瓶中，将0．36毫摩尔2-甲基巯基-2-咪唑啉鎓碘化物溶于0．36厘米31N氢氧化钠溶液中，往这种溶液添加0．36毫摩尔预先溶于1．44厘米31N氢氧化钠溶液的脂C、5厘米3水和4厘米3乙醇。混合物保持搅拌直到停止放出甲基硫醇(24小时)。然后混合物在旋转蒸发器中浓缩至干。用水(4厘米3)、乙醇(4厘米3)和三氟乙酸(0．5厘米3)溶液溶解干提取物。这种溶液分两次注入制备性HPLC中。收集有用的馏分(采用分析性HPLC测定)，冷却与冻干。最后得到213毫克(0．1727毫摩尔)成盐产品。产率48％。HPLC分析Rt=8．90分。1HNMR谱(400MHz，(CD3)2SOd6，加几滴CD3COODd4，δ，以ppm表示)0．87(t，J=7Hz，6H脂肪链的CH3)；1．15-1．40(mt，44H脂肪链中心(CH2)11)；1．45和1．55(2mt，每个2H每个脂肪链的1CH2)；1．65(Mt，4H丁基中心的2CH2)；1．80-1．95(mt，4H丙基中心CH2)；2．80-3．05(mt，10H丁基2NCH2-2个丙基之一的2NCH2-另一个丙基2NCH2的一个)；3．24(mt，6H另一个丙基的另一个NCH2和脂肪链的NCH2)；3．56(s，2HNCH2CON)3．62(S，4HNCH2CH2N)；4．02(d，J=5Hz，2H甘氨酰基的CONCH2CON)。MH+=777。实施例4合成化合物(4)(2-(3-{双-〔3-(4，5-二氢-1H-咪唑-2-基氨基)-丙基〕-氨基}-丙基氨基)-N-双十四烷基氨基甲酰基甲基-乙酰胺)，采用“部分”合成方法合成。Ⅰ)合成BOG-GLY-双十四烷基胺(a)将以Boc基团保护胺基团的Gly(10毫摩尔)和双十四烷基胺(10毫摩尔)加入250毫升烧瓶中，并加入100厘米3二氯甲烷。搅拌混合物直到完全溶解。然后加入30毫摩尔N-乙基二异丙胺(DIEA)和11毫摩尔苯并三唑-1-氧基三-二甲基胺磷鎓(BOP)。用DIEA将pH保持在10，其混合物搅拌2小时。当完成反应(用TLC和／或HPLC跟踪)，蒸去二氯甲烷，将得到的固体溶于乙酸乙酯(300厘米3)中／有机相用硫酸钾(4次，每次100厘米3)、碳酸钠(4次，每次100厘米3)和氯化钠(4次，每次100厘米3)溶液洗涤。有机相再用硫酸镁干燥，过滤并在真空下蒸发。得到产物(a)，产率是93％。TLCRf=0．9(CHCl3／MeOH，9∶1)MH+567。Ⅱ)Z-NH(CH2)3〕2-N-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH的合成(b)1)NC-(CH2)2-NH-Boc-CH2-COOH的合成(c)把N-(氰基乙基)-甘氨酸(0．1摩尔／胺，商品)溶解于1N氢氧化钠(200厘米3／胺)和二噁烷(200厘米3)中。将该溶液在冰浴中搅拌，然后滴加O-(叔丁氧基羰基)2或对氯苄氧基羰基(CIZ，0．14摩尔／胺)在200厘米3二噁烷中的溶液。其pH值保持高于9。然后，将混合物在约20℃搅拌一夜。在真空下蒸去二噁烷，然后用硫酸钾溶液将混合物酸化到pH3。用乙酸乙酯提取不溶物(3次，每次100厘米3)，然后用氯化钠溶液洗涤(2次，每次100厘米3)。有机相用硫酸镁干燥，过滤，再在真空下蒸发。得到式NC-(CH2)2-NH-Boc-CH2-COOH产物(c)，产率是98％。TLCRf=0．66(CHCl3／MeOH，8∶2)MH+229。2)NH2-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH的合成(d)在一升不锈钢压力釜中加入50毫摩尔式NC-(CH2)2-NH-Boc-CH2-COOH产物(c)，同时在烧杯中制备10厘米3乙醇(95％)和3．3克氢氧化钠(80毫摩尔)的溶液。氢氧化钠溶解后，加入2厘米3炭载raney镍。关闭压力釜。开始氢化压力是约52巴，在室温(20℃)下一夜后，其压力降到约48．5巴。用纸过滤悬浮液，滤饼用乙醇洗涤(4次，每次25厘米3)，滤液在真空下浓缩至干。得到产物(d)，这种产物无需进行其他的纯化便可以继续使用。TLCRf=0．12(CHCl3／MeOH，6∶4)MH+233。3)〔NC(CH2)2〕2-N-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH的合成(e)在烧瓶中将式NH2-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH产物(d)(0．05摩尔)和氢氧化钠(0．1摩尔)溶于150厘米3水中。将该溶液在冰浴中冷却。在激烈搅拌下，缓慢地倒入丙烯腈(0．12摩尔)，同时整个溶液温度保持低于20℃。反应混合物在室温(20℃)下保持一夜。再让混合物在50℃下保持2小时。然后在真空下蒸去溶剂，其后用硫酸钾溶液将混合物酸化到pH3。用乙酸乙酯提取不溶物(3次，每次200厘米3)，然后用氯化钠溶液洗涤(2次，每次100厘米3)。有机相用硫酸镁干燥，然后过滤，再在真空下蒸发。任选地用硅胶柱纯化“粗产物”。得到产物(e)，产率是50％。TLCRf=0．75(CHCl3／MeOH，6∶4)MH+339。4)〔Z-NH-(CH2)3〕2-N-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH的合成(b)在1升不锈钢压力釜中，加入式〔NC(CH2)2〕2-N-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH产物(e)(50毫摩尔)。同时在烧杯中制备10厘米3乙醇(95％)和3．3克氢氧化钠(80毫摩尔)的溶液。氢氧化钠溶解后，将这种溶液加到压力釜中。让氮气流通过压力釜，再加入2厘米3炭载raney镍。关闭压力釜。开始氢化压力是约52巴，在室温(20℃)下一夜后，其压力降到约48．5巴。用纸过滤悬浮液，滤饼用乙醇洗涤(4次，每次25厘米3)，滤液在真空下浓缩至干。得到白色固体产物，这种产物经TLC分析后无需进行其他的纯化便可使用。TLCRf=0．14(CHCl3／MeOH，6∶4)将前面得到的固体溶于1N氢氧化钠(200厘米3／胺)和二噁烷(200厘米3)中。将该溶液在冰浴中进行搅拌，然后滴加(叔丁氧基羰基)2O或对氯代苄氧基羰基(0．14摩尔／胺)在200厘米3二噁烷中的溶液。然后，反应混合物在室温(20℃)下搅拌一夜。在真空下蒸去溶剂，其后用硫酸钾溶液将混合物酸化到pH3。用乙酸乙酯提取不溶物(3次，每次100厘米3)，然后用氯化钠溶液洗涤(2次，每次100厘米3)。有机相用硫酸镁干燥，然后过滤，再在真空下蒸发。采用TLC和／或HPLC分析这些产物。用硅胶柱(二氯甲烷／甲醇，8∶2)纯化粗产物。得到产物(b)，其产率相对于产物(d)为66％。TLCRf=0．42(CHCl3／MeOH，6∶4)MH+615。Ⅲ)[Z-NH(CH2)3]2-N-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COGlyN[(CH)13-CH3]2的合成(f)将其中胺用基团Boc保护的产物(a)(1毫摩尔)加入配备磁棒的烧瓶中。再加入30厘米34℃三氟乙酸，然后搅拌该溶液1小时。完成反应后(用TLC和／或HPLC跟踪)，在真空下蒸去三氟乙酸，然后采用共蒸发干燥其产物，干燥3次，每次用30厘米3乙醚。HPLCRt=12．86分(H2O／MeCN3分钟〔40／60〕，3-20分钟〔0／100〕，35分钟〔0／100〕)。将得到的产物(Gly-双十四烷基胺，10毫摩尔)和产物(b)(10毫摩尔)加到250厘米3瓶中，再加入二氯甲烷(100厘米3)，该混合物搅拌直到完全溶解。然后，加入30毫摩尔N-乙基二异丙胺(DIEA)和11毫摩尔六氟磷酸BOP。用DIEA将pH保持在10，并且该混合物搅拌2小时。反应完成后(用TLC和／或HPLC跟踪)，蒸去二氯甲烷，将得到的固体溶于乙酸乙酯(300厘米3)中。有机相用用硫酸钾溶液(4次，每次100厘米2)、碳酸钠(4次，每次100厘米3)和氯化钠(4次，每次100厘米3)溶液洗涤。有机相再用硫酸镁干燥，过滤并在真空下蒸发。其产物无需另外进行纯化便可使用。得到的产物(f)经硅胶柱纯化(二氯甲烷／甲醇，8∶2)后达到的产率是75％。TLCRf=0．86(CHCl3／MeOH，8∶2)HPLCRf=17．44分(H2O／MeCN3分〔40／60〕，3-20分〔0／100〕，35分〔0／100〕)。Ⅳ)〔NH2(CH2)3〕2-N-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COGlyN〔(CH2)13-CH3〕2的合成(g)将胺被保护的产物(f)加入配备磁棒的烧瓶中，并按每克产物10厘米3甲醇溶于甲醇中。在室温下加入炭载钯(10％，每克产物为1克)和甲酸铵(每克产物为1克)。采用HPLC分析氢解反应。两小时后，反应完成，过滤混合物，滤饼用甲醇洗涤3次，每克产物每次用10厘米3甲醇。加入双蒸水，该溶液经冷却后冻干，或将滤液浓缩至干，固体溶于乙酸乙酯(300厘米3)中。有机相用碳酸钠溶液洗涤(2次，每次100厘米3)和用氯化钠溶液洗涤(2次，每次100厘米3)，再用硫酸镁干燥，然后过滤，在真空下蒸发。采用HPLC分析产物，它们无需另外进行纯化便可使用。得到的产物(g)产率相对产物(f)是40％。HPLCRf=9．62分(H2O／MeCN3分〔40／60〕，3-20分〔0／100〕，35分〔0／100〕)。MH+795。Ⅴ)化合物(4)的合成将含有待改性伯胺的产物(g)(1毫摩尔／胺)溶于二氯甲烷(10厘米3)中，然后添加2-甲硫基咪唑啉(1．2毫摩尔／胺)和三乙胺(1．3毫摩尔／胺)。该混合物在室温(20℃)下搅拌直到停止放出二甲硫醚。在反应结束后(用HPLC跟踪)，在真空下蒸去二氯甲烷。将胺用Boc基团保护的所得产物(1毫摩尔)加到配备磁棒的烧瓶中。加入30厘米34℃三氟乙酸，然后搅拌该溶液1小时。反应完成后(用TLC和／或HPLC跟踪)，在真空下蒸去三氟乙酸，然后采用共蒸发法干燥3次，每次用30厘米3乙醚。得到的产物用制备性HPLC进行纯化，馏分采用HPLC分析。这样得到本发明的化合物(4)，其产率为34％。HPLCRf=10．07分((H2O／MeCN3分〔40／60〕，3-20分〔0／100〕，35分〔0／100〕)。1HNMR谱(400MHz，(CD3)2SOd6，温度为383K，δ，以ppm表示)0．92(t，J=7Hz，6H脂肪链的CH3)；1．25-1．45(mt，44H脂肪链中心(CH2)11)；1．57(mt，4H每个脂肪链的1CH2)；1．70-1．90(mt，6H丙基中心CH2)；2．50-3．40(mt，16H丙基的2NCH2和脂肪链的NCH2)；3．68(S，8H2NCH2CH2N)；3．72(宽s，2HNCH2CON)；4．06(s，2H甘氨酰基的CONCH2CON)。MH+=831。实施例5合成化合物(5)(N-双十四烷基氨基甲酰基甲基-2-{3-〔3-(1，4，5，6-四氢嘧啶-2-基氨基)-丙基氨基〕-丙基氨基}-乙酰胺)，采用“部分”合成方法合成。Ⅰ)BOG-GLY-双十四烷基胺的合成(a)如前述实施例同样方式操作。得到产物(a)，产率为93％。TLCRf=0．9(CHCl3／MeOH，9∶1)MH+567。Ⅱ)Z-NH(CH2)3-N-Boc-(CH2)3-N-Boc-CH2-COOH的合成(b)1)NC-(CH2)2-NH-Boc-CH2-COOH的合成(c)如前面实施例4同样方式操作。得到产物(c)，产率为98％。TLCRf=0．66(CHCl3／MeOH，8∶2)MH+229。2)NH2-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH的合成(d)如前面实施例4同样方式得到产物(d)TLCRf=0．12(CHCl3／MeOH，6∶4)MH+233。3)NC(CH2)2-N-Boc-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH的合成(e)在烧瓶中将产物(d)(0．05摩尔)和氢氧化钠(0．1摩尔)溶于150厘米3水中。将该溶液在冰浴中冷却。在激烈搅拌下，缓慢倒入丙烯腈(0．05摩尔)，同时整个溶液的温度保持低于20℃。将反应混合物保持在室温(20℃)下一夜。在真空下蒸去溶剂，然后该混合物用硫酸钾溶液酸化到pH3。用乙酸乙酯(3次，每次200厘米3)提取不溶物，然后，用氯化钠溶液洗涤(2次，每次100厘米3)。有机相用硫酸镁干燥，再过滤，并在真空下蒸发。任选地，得到的产物用硅胶柱进行纯化。将得到的产物(0．1摩尔／胺)溶于1N氢氧化钠(200厘米3／胺)和二噁烷(200厘米3)中。将该溶液在冰浴中搅拌，然后滴加(Boc)2O或对氯代苄氧基羰基(0．14摩尔／胺)在200厘米3二噁烷中的溶液。让pH值保持高于9。然后，将反应混合物在室温(20℃)下搅拌一夜。在真空下蒸去二噁烷，然后用硫酸钾溶液将混合物酸化到pH3。用乙酸乙酯提取不溶物(3次，每次100厘米3)，然后用氯化钠溶液洗涤(2次，每次100厘米3)。有机相用硫酸镁干燥，然后过滤，再在真空下蒸发。采用TLC和／或HPLC分析这些产物。用硅胶柱(二氯甲烷／甲醇，8∶2)纯化粗产物。这样得到产物(e)，其产率是93％。TLCRf=0．75(CHCl3／MeOH，8∶2)MH+386。4)Z-NH-(CH2)3-N-Boc-(CH2)3-N-Boc-CH2-COOH的合成(b)在1升不锈钢压力釜中，加入产物(e)(50毫摩尔)。同时在烧杯中制备10厘米3乙醇(95％)和3．3克氢氧化钠(80毫摩尔)的溶液。氢氧化钠溶解后，将这种溶液加到压力釜中。让氮气流通过压力釜，再加入2厘米3炭载Raney镍。关闭压力釜。开始氢化压力是约52巴，在室温(20℃)下一夜后，其压力降到约48．5巴。用纸过滤悬浮液，滤饼用乙醇洗涤(4次，每次25厘米3)，滤液在真空下浓缩至干。得到白色固体产物，这种产物经TLC分析后无需进行其他的纯化便可使用。TLCRf=0．14(CHCl3／MeOH，6∶4)将得到的产物(0．1摩尔／胺)溶于1N氢氧化钠(200厘米3／胺)和二噁烷(200厘米3)中。该溶液在冰浴中进行搅拌，然后滴加对氯代苄氧基羰基(0．14摩尔／胺)在200厘米3二噁烷中的溶液。让pH值保持高于9。然后，反应混合物在室温(20℃)下搅拌一夜。在真空下蒸去二噁烷，其后用硫酸钾溶液将混合物酸化到pH3。用乙酸乙酯提取不溶物(3次，每次100厘米3)，然后用氯化钠溶液洗涤(2次，每次100厘米3)。有机相用硫酸镁干燥，然后过滤，再在真空下蒸发。得到的产物用硅胶柱进行纯化(二氯甲烷／甲醇，9∶1)。采用TLC和／或HPLC分析这些产物。得到产物(b)，其产率相对产物(d)为32％。TLCRf=0．63(CHCl3／MeOH，9∶1)MH+523。Ⅲ)合成2-甲硫基-1，4，5，6-四氢嘧啶(f)在搅拌及氮气流下，往烧瓶中装3，4，5，6-四氢-2-嘧啶硫醇(0．0103摩尔)，再加入5厘米3甲醇和0．65厘米3碘甲烷(0．0105摩尔)。该混合物升温回流1小时，接着冷却到室温(20℃)。产物通过加5厘米3乙醚沉淀。沉淀过滤后，再用乙醚洗涤。然后产物在34毫巴压力下干燥一夜。得到1．5克(0．0041摩尔)产物(Ⅵ)，其产率是40％。TLCRf=0．25(CHCl3／MeOH，9∶1)MH+131。d)Z-NH(CH2)3-N-Boc(CH2)3-N-Boc-CH2-COGlyN〔(CH2)13-CH3]2的合成(g)将胺用基团Boc保护的产物(a)(1毫摩尔)加入配备磁棒的瓶中。再加入30厘米34℃三氟乙酸，然后该溶液搅拌1小时。完成反应后(用TLC和／或HPLC跟踪)，在真空下蒸去三氟乙酸，然后采用共蒸发干燥产物，干燥3次，每次用30厘米3乙醚。HPLCRt=12．86分(H2O／MeCN3分钟〔40／60〕，3-20分钟〔0／100〕，35分钟〔0／100〕)。将得到的产物(10毫摩尔)和产物(b)(10毫摩尔)加到250厘米3烧瓶中，再加入二氯甲烷(100厘米3)，该搅拌混合物直到完全溶解。然后，加入30毫摩尔DIEA和11毫摩尔BOP。用DIEA将pH保持在10，并且该混合物搅拌2小时。反应完成后(用TLC和／或HPLC跟踪)，蒸去二氯甲烷，得到的固体用乙酸乙酯(300厘米3)溶解。有机相用用硫酸钾溶液(4次，每次100厘米3)、碳酸钠(4次，每次100厘米3)和氯化钠(4次，每次100厘米3)溶液洗涤。有机相再用硫酸镁干燥，过滤并在真空下蒸发。产物无需另外进行纯化便可使用。经硅胶柱纯化(二氯甲烷／甲醇，8∶2)后得到产物(g)，其产率是85％。TLCRf=0．9(CHCl3／MeOH，9∶1)HPLCRf=19．79分(H2O／MeCN3分〔40／60〕，3-20分〔0／100〕，35分〔0／100〕)。Ⅴ)〔NH2(CH2)3〕2-N-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COGlyN〔(CH2)13-CH3]2的合成(h)将产物(g)加入配备磁棒的烧瓶中，并以每克产物10厘米3甲醇溶于甲醇中。在室温(20℃)下加入炭载钯(10％，每克产物为1克)和甲酸铵(每克产物为1克)。采用HPLC跟踪氢解反应。两小时后，反应完成，过滤混合物，滤饼用甲醇洗涤3次，每次每克产物用10厘米3甲醇。加入双蒸水，溶液经冷却后冻干，或将滤液浓缩至干，固体用乙酸乙酯(300厘米3)溶解。有机相用碳酸钠溶液洗涤(2次，每次100厘米3)和用氯化钠溶液洗涤(2次，每次100厘米3)，有机相再用硫酸镁干燥，然后过滤，在真空下蒸发。采用HPLC分析这些产物，它们无需另外进行纯化便可使用。得到的产物(h)相对产物(g)为93％。TLCRf=0．42(CHCl3／MeOH，6∶4)HPLCRf=14．66分(H2O／MeCN3分〔40／60〕，3-20分〔0／100〕，35分〔0／100〕)。MH+838。Ⅴ)化合物(5)合成将含有待改性伯胺的产物(h)(1毫摩尔／胺)溶于二氯甲烷(10厘米3)中，然后添加产物(f)(1．2毫摩尔／胺)和三乙胺(1．3毫摩尔／胺)。该混合物在室温(20℃)下搅拌直到停止放出二甲硫醚。在反应结束后(用HPLC跟踪)，在真空下蒸去二氯甲烷。得到的产物用制备性HPLC进行纯化，馏分采用HPLC分析。这样得到的化合物(5)，其产率为38％。HPLCRf=8．42分((H2O／MeCN3分〔40／60〕，3-20分〔0／100〕，35分〔0／100〕)。1HNMR谱(400MHz，(CD3)2SOd6，δ，以ppm表示)0．86(t，J=7Hz，6H脂肪链的CH3)；1．10-1．35(mt，44H脂肪链中心(CH2)11)；1．44和1．53(2mts，每个2H每个脂肪链的1CH2)；1．80-2．00(mt，6H丙基中心CH2和1，4，5，6-四氢-嘧啶的CH2)；2．80-3．10(mt，10H丙基的NCH2和1，4，5，6-四氢-嘧啶的NCH2)；3．15-3．45(mt相应于1，4，5，6-四氢-嘧啶=NCH2和脂肪链NCH2的6H)；3．81(mf，2HNCH2CON)；4．04(d，J=5Hz，2H甘氨酰基的CONCH2CON)；7．89-8．62-8．75和9．01(4mfs，共8H可交换，CF3COOH的OH)。MH+=720。实施例6化合物(6)的合成(N-双十八烷基氨基甲酰基甲基-2-{3-〔3-(1，4，5，6-四氢嘧啶-2-基氨基)-丙基氨基〕-丙基氨基}-乙酰胺)，采用“部分”合成方法合成。Ⅰ)合成BOG-GLY-双十四烷基胺(a)如前述实施例同样方式操作。得到产物(a)，产率为93％。TLCRf=0．9(CHCl3／MeOH，9∶1)MH+567。Ⅱ)Z-NH(CH2)3-N-Boc-(CH2)3-N-Boc-CH2-COOH的合成(b)1)NC-(CH2)2-NH-Boc-CH2-COOH的合成(c)如前面实施例5同样方式操作。得到产物(c)，产率为98％。TLCRf=0．66(CHCl3／MeOH，8∶2)MH+229。2)NH2-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH的合成(d)如前面实施例5同样方式得到产物(d)。TLCRf=0．12(CHCl3／MeOH，6∶4)MH+233。3)NC(CH2)2-N-Boc-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH的合成(e)如前面实施例5同样方式操作。这样得到产物(e)，产率是93％。TLCRf=0．75(CHCl3／MeOH，8∶2)MH+386。4)Z-NH-(CH2)3-N-Boc-(CH2)3-N-Boc-CH2-COOH的合成(b)如前面实施例5同样方式操作。这样得到白色固体产物，产物在经TLC分析后无需另外进行纯化便可使用。为了用苄氧基羰基保护末端胺，采用与前面相同的方式使用所得到的产物。这样所得到产物的产率相对产物(d)为32％。TLCRf=0．63(CHCl3／MeOH，9∶1)MH+523。Ⅲ)2-甲硫基-1，4，5，6-四氢嘧啶的合成(f)如前面实施例5同样方式操作。这样得到1．5克(0．0041摩尔)产物(f)，该产物的产率是40％。TLCRf=0．25(CHCl3／MeOH，9∶1)MH+131。Ⅳ)Z-NH(CH2)3-N-Boc(CH2)3-N-Boc-CH2-COGlyN〔(CH2)17-CH3〕2的合成(g)如前面实施例5同样方式操作。这样得到产物(a)，其Boc基团已被切下。HPLCRt=19．44分(H2O／MeCN3分钟〔40／60〕，3-20分钟〔0／100〕，35分钟〔0／100〕)。产物以与前面实施例5使用产物(b)同样方式使用。经硅胶柱纯化(二氯甲烷／甲醇，8∶2)后得到产物(g)，其产率是84％。TLCRf=0．9(CHCl3／MeOH，9∶1)HPLCRf=23．95分(H2O／MeCN3分〔40／60〕，3-20分〔0／100〕，35分〔0／100〕)。Ⅴ)NH2(CH2)3〕2-N-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COGlyN[(CH2)17-CH3]2的合成(h)如前面实施例5同样方式操作。所得到产物(h)的产率相对产物(g)为73％。TLCRf=0．28(CHCl3／MeOH，6∶4)HPLCRf=20．59分(H2O／MeCN3分〔40／60〕，3-20分〔0／100〕，35分〔0／100〕)。MH+838。Ⅵ)化合物(6)的合成如前面实施例5同样方式操作。这样得到的化合物(6)，产率是68％。HPLCRf=15．83分(H2O／MeCN3分〔40／60〕，3-20分〔0／100〕，35分〔0／100〕)。1HNMR谱(500MHz，(CD3)2SOd6，δ，以ppm表示)0．88(t，J=7Hz，6H脂肪链的CH3)；1．15-1．35(mt，60H脂肪链中心(CH2)15)；1．46和1．54(2mts，每个2H每个脂肪链的1CH2)；1．80-2．00(mt，6H丙基中心CH2和1，4，5，6-四氢-嘧啶的CH2)；2．85-3．05(mt，10H丙基的NCH2和1，4，5，6-四氢-嘧啶的NCH2)；3．15-3．45(mt相应于1，4，5，6-四氢-嘧啶=NCH2和脂肪链NCH2的6H)；3．81(mf，2HNCH2CON)；4．04(d，J=5Hz，2H甘氨酰基的CONCH2CON)；7．88-8．61-8．74和8．99(4mfs，共8H可交换，CF3COOH的OH)。MH+=832。B、本发明转染剂的应用实施例7核脂复合物的制备这个实施例说明本发明核脂复合物的制备方法。本实施例使用的化合物是化合物(1)的氯仿溶液。化合物(1)的用量是每微克DNA为10纳摩尔(即11．8微克)。在某些情况下，让中性辅助脂类、胆固醇或DOPE与该化合物预先混合。然后，先用轻氩气流蒸去氯仿，再在5％葡萄糖和20mM氯化钠混合物中在4℃条件下水合一整夜，这时生成了很薄的脂类膜。然后对这些试样进行超声处理5分钟，在65℃加热30分钟，最后再超声处理5分钟。这样得到脂类悬浮液，这些悬浮液可在4℃下储存，一直到使用。使用的DNA是pXL2774质粒(图2)在5％葡萄糖和20mM氯化钠混合物中的溶液，浓度为0．5毫克／毫升或1．0毫克／毫升。pXL2774质粒具有下述特征-内毒素水平小于50EU／毫克，-超缠绕DNA率高于60％，-RNA，即mRNA、tRNA和核糖体RNA含量(用HPLC测定)小于5％，-染色体DNA比率小于1％，-蛋白质含量小于1％，-渗透压小于15mosmol／千克。快速地将等体积的DNA溶液与前面描述的脂类悬浮液混合，可以制备出本发明核脂复合物。与DNA复合的化合物量是0．5-12纳摩尔／微克DNA。实施例8具有不同电荷比的复合物的性能这个实施例说明了具有不同电荷比的本发明核脂复合物的性能。还说明了添加中性辅助脂类的致密作用。首先，使用CoulterN4plus装置，采用光动力学散射(动力学激光光散射)方法测量流体动力学直径，分析所得复合物的尺寸，将这些试样稀释在含5％葡萄糖和20mM氯化钠的溶液中，稀释20倍，以便避免多重散射。研究了环脒基团、脂类组成、电荷比对核脂复合物尺寸的影响。当本发明化合物(1)与DNA的电荷比增加时，可分成三种可能的相。这三种相决定了化合物(1)的治疗效能。图3说明了化合物(1)的这三种相。可以观察到本发明其他的化合物具有相同的性能。低电荷比时，DNA没有被化合物(1)饱和。还有裸DNA，这些复合物总体上为负电荷。微粒尺寸较小(100-300纳米)。这个相称为“相A”。DNA没有完全被化合物(1)饱和的事实，意味着DNA没有被该化合物完全保护。因此，DNA可以受到酶(DNA酶)的降解作用。另外，因为这些复合物总体上是负电荷，所以它们通过细胞膜是很困难的。由于这些原因，相A核脂复合物的转染效率低得多。中等电荷比时，DNA被化合物(1)饱和，这些复合物总体上为中性或略带正电荷。这种相是不稳定的，因为离子排斥作用最小，可能出现“交联”现象。采用光动力学散射方法测定，微粒尺寸在检测限以下(大大低于3微米)。这种不稳定相称为“相B”。这种复合物的尺寸不适合在注射中使用。但是，这并不因此意味着这些复合物处在相B无活性，而只是这些复合物不适合为治疗目的而注射它们。电荷比较高时，DNA被化合物(1)过饱和，这些复合物总体上为正电荷。由于正电荷之间很强的排斥作用，这种相是稳定的。这种相以“相C”表示。与相A相比，核脂复合物呈这样一种形式，DNA非常好地防止酶的作用，它们总体上的正电荷有利于它们通过具有阴离子性质的细胞膜。因此，处在相C的这些复合物在细胞中转染核酸的应用方面是特别合适的。除了本发明化合物的环脒基团外，使用中性辅助脂类对复合物稳定性具有很强的冲击作用，如图3所说明的那样。添加的辅助脂类或者是DOPE(阳离子脂类／DOPE=3／2)，或者胆固醇(阳离子脂类／胆固醇=3／1)。一般地，添加中性辅助脂类增加复合物的不稳定性，这样造成为达到相C而增加所需要的化合物的量。在有或没有辅助脂类的情况下，对达到相C的电荷比进行比较时，图3非常清楚地说明这一点。应该指出，分成三种相A、B和C的电荷比值取决于使用的化合物。因此，这些值从一种化合物到另外一种化合物变化非常大。最后，研究了化合物对DNA的亲合性随电荷比的变化关系。为此，测定过在添加3微克溴乙锭(EtBr)后荧光的降低。事实上，用该化合物取代DNA溴乙碇是与DNA结合的指示。将使用的配制品稀释20倍，直到最后浓度为25微克DNA／毫升。测定的裸DNA相对荧光确定为100％。与化合物(1)结合比率可用试样相对荧光降低表示。图3表明了荧光随电荷比增加而降低的情况，这意味着较大量的化合物(1)用于与DNA结合(荧光降低越多，与DNA结合的化合物的量也越大，直到达到饱和)。因此，表明本发明化合物(1)对DNA的亲合性由环脒基团决定，而不由辅助脂类的加入决定。实施例9使用化合物(1)的体外转染这个实施例说明与非配制的DNA比较，本发明化合物(1)在体外细胞中转染DNA的能力。在24孔微板上接种HeLa细胞(ATCC)，每孔60000个细胞，随后转染24小时。将含有1微克DNA的复合物稀释在0．5毫升无血清的DMEM培养基(Gibco／BRL)中，然后加到每个孔中。这些细胞在37℃培育4小时。然后抽取含有复合物的培养基，用DMEM和10％胎牛血清的混合物更换。然后这些细胞再培养24小时。最后，使用萤光素酶检验盒(Promega)和DynexMLX荧光仪，溶解并检验这些细胞。图4列出的结果突出表明裸DNA性能与本发明完全饱和的化合物(1)／DNA复合物性能的差别在裸DNA体外转染后，未检测到任何萤光素酶活性(装置灵敏度小于每孔1皮克)，而本发明复合物基因转移活性是200-8000皮克／孔。这个实施例因此清楚地表明，本发明化合物(1)用于体外细胞转染很有利。实施例10使用化合物(3)、(5)与(6)的体外转染这个实施例说明与非配制的DNA比较，本发明化合物(3)、(5)与(6)在体外细胞中转染DNA的能力。根据前面实施例9的方案在HeLa细胞中进行转染。图5、6和7说明这些结果。因此观察到这3种化合物具有良好的体外转染水平。实施例11使用化合物(1)体内转染这个实施例说明了本发明化合物(1)在体内细胞中转染DNA的能力，与非配制DNA和式NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)17CH3]2脂A的能力进行了比较，脂A在专利申请WO97／18185中描述过，其结构如图1中所示。通过肌肉内与静脉内用药在Balb／C鼠上进行体内基因转移。进行比较的配制品是裸DNA配制品、含有脂A的配制品或含有本发明化合物(1)的配制品。在肌肉内注射的情况下，每只鼠在胫骨前部肌肉中注入30微升含有15微克DNA的配制品。在注射7天后取出这些组织，冷冻并储存在-80℃下，等待进行萤光素酶活性试验。如在实施例8中一样测量萤光素酶活性。在通过静脉内注射的情况下，每只鼠注射200微升含有50微克DNA的配制品。在这种情况下在注射24小时后取出这些组织，然后冷冻并以与前面相同的方式储存。体内基因转移的结果列于图8和图9。化合物(1)与DNA的比是10纳摩尔／DNA微克。脂类A与DNA的比是4纳摩尔／DNA微克。图8说明了与裸DNA和脂A相比本发明化合物(1)在肌肉中的体内活性。观察到萤光素酶活性水平在裸DNA与化合物(1)之间是相当的，后者的活性比脂A有非常大的改善。涉及的转移机制在裸DNA与使用本发明化合物(1)之间似乎不同。事实上，所使用的本发明复合物不含有游离DNA(相C)，此外，它们的体外结果大大高于裸DNA的结果。图9对通过肌肉内和静脉内使用本发明化合物(1)、裸DNA和脂A的活性进行了比较。观察到，采用静脉内方法，脂A与化合物(1)的转染效率几乎相同。相反，采用肌肉内方法，本发明化合物(1)转染效率非常明显地高于脂A。与裸DNA相比，采用肌肉内方法，本发明化合物(1)具有至少相当的转染能力，除此之外，采用静脉内方法该化合物也具有转染作用。因此，看来使用本发明化合物(1)体内核酸转染效率总体上高于使用脂A的转染效率(脂A是已知的阳离子脂类)，还高于非配制的DNA的转染效率。最后，与裸露DNA转染相比，本发明复合物的优点是防止核酶对DNA的降解，这样有利于大大改善这些配制品的稳定性。本发明的化合物还可以用于防止DNA在冻干过程中被破坏，因此改善了配制品的稳定性。实施例12化合物(5)和(6)体内转染这个实施例说明了化合物(5)和(6)的有效的体内核酸转染能力。使用与前面实施例相同方案。图10表明不用辅助脂类按照电荷比为0．25∶1与DNA配制时，肌内注射后48小时，化合物(5)和(6)的体内转染水平高于或等于裸DM。下表给出在不同配制品中使用化合物(5)和(6)所得到的结果<tablesid="table4"num="004"><table>化合物化合物／DNA电荷比辅助脂类RLU／肺皮克／肺给药方法化合物(5)6／1DOPE(1∶1)254．91611．3ⅰ．ⅴ．化合物(5)8／1DOPE(1∶1)535．23558．1ⅰ．ⅴ．化合物(5)0．5／1胆固醇(3∶1)209．61330．5ⅰ．m．化合物(5)0．5／1DOPE(1∶1)155．8974．6ⅰ．m．化合物(6)6／1-175．11098．7ⅰ．ⅴ．化合物(6)5／1DOPE(1∶1)407．72700．8ⅰ．ⅴ．化合物(6)0．5／1DOPE(1∶1)1768．713005．4ⅰ．m．</table></tables>权利要求1.呈D、L或DL形式的通式(Ⅰ)化合物CA-Rep-R(Ⅰ)其中①CA代表具有下述通式(Ⅱ)的环脒基团及其内消旋体式中·m和n彼此独立地是0-3的整数，m+n大于或等于1，·R1代表下述通式(Ⅲ)的基团其中p和q彼此独立地是0-10的整数，Y代表羰基、氨基、甲基氨基或亚甲基，Y在不同的基团〔(CH2)p-Y〕中可以有不同的意义，(*)代表氢原子，或者是与基团Rep键合的地方，其中R1可以与通式(Ⅱ)任何原子相连，包括Z，并且在式(Ⅱ)中只有一个基团R1，·X代表NR2基团或CHR2基团，R2是氢原子，或者如前面所定义的与R1基团连接的键，·基团代表*第一种情况通式(Ⅳ)基团其中W＇代表CHR或NR，R″和R彼此独立地代表氢原子、甲基或如前面所定义的与R1基团连接的键，或*第二种情况通式(Ⅴ)基团其中W＇代表CHR或NR，R＇和R彼此独立地代表氢原子、甲基或如前面所定义的与R1基团连接的键，②Rep不存在或是通式(Ⅵ)的间隔基根据情况其氮原子与X、V、W或Z原子相连，或与基团R1的取代基Y相连，以及·t是0-8的整数，·r是0-10的整数，r在不同-NR4-(CH)r-基团中可以有不同的意义，·R3在不同-NR4-(CH)rR3-基团中可以有不同的意义，它代表氢原子、甲基或下述通式(Ⅶ)基团其中u是0-10的整数，s是2-8的整数，在不同基团-(CH2)sNR5-中可以有不同的意义，R5是氢原子，如前面所定义的CA基团，这些CA基团彼此独立并可以不同，或是通式(Ⅶ)基团，这些通式(Ⅶ)基团彼此独立并可以具有不同的意义，·R4与R3定义相同，或代表如前面定义的CA基团，这些CA基团彼此独立并且可以不同，③R与通式(Ⅵ)Rep基团的羰基官能团相连，或如果Rep基团不存在，R直接与CA基团相连，并代表*式NR6R7基团，其中R6和R7彼此独立地代表氢原子或含有1-22个碳原子、选择性地含有氟的饱和或未饱和的直链或支链脂族基团，并且R6和R7两个取代基中至少一个基不是氢，另一个含有10-22个碳原子，*或者类固醇衍生物*或者下述通式(Ⅷ)基团其中x是1-8中的整数，y是1-10中的整数，Q代表C(O)NR6R7基团，式中R6和R7如前面所定义，或者Q代表C(O)R8基团，其中R8代表下述式(Ⅸ)基团式中z是2-8中的整数，R9是含有8-22个碳原子、选择性地含有氟的饱和或未饱和的脂族基团，或类固醇衍生物，两个取代基R6彼此独立地如前面所定义，或R8代表-O-R9基团，其中R9如前面所定义。2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于基团R1与Z，或者与V相连，另一方面通过Y与Rep基团相连。3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于式(Ⅱ)环脒基团CA包含5、6、7或8个环原子。4.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于R3代表氢原子或甲基，R4如权利要求1所定义，或在式(Ⅵ)中的R3与R4代表氢原子，或者R4是氢原子，而R3是其中R5代表CA基团的式(Ⅶ)基团。5.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于在式(Ⅴ)中，p和q彼此独立地选自2、3或4。6.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于R6和R7是相同或不同的，每个代表含10-22个碳原子、任选地含氟的、饱和或未饱和直链或支链脂族链。7.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于R6和R7是相同或不同的，每个代表含有12、14、16、17、18或19个碳原子、任选地含氟的饱和或未饱和直链或支链脂族链。8.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于当R是类固醇衍生物时，所述衍生物选自胆固醇、胆甾烷醇、3-α-5-环-5-α-胆甾烷-6-β-醇、胆酸、甲酸胆甾醇酯、甲酸胆甾烷基酯、甲酸3α，5-环-5α-胆甾烷-6β-基酯、胆甾烯基胺、6-(1，5-二甲基己基)-3a，5a-二甲基-十六氢环戊〔a〕环丙烯并〔2，3〕环戊二烯并〔1，2-f〕萘-10-基胺或胆甾烷胺。9.根据权利要求1所述的化合物，其为下式化合物化合物(1)化合物(2)化合物(3)化合物(4)化合物(5)化合物(6)10.根据权利要求1-9中任一项所述化合物的制备方法，其特征在于合成带一个或多个环脒官能的部分，然后在有间隔基的脂类上接枝这些部分。11.根据权利要求1-8中任一项所述化合物的制备方法，其特征在于首先合成脂多胺类似物，其次环化成环脒基团。12.组合物，其特征在于它含有至少一种通式(Ⅰ)化合物。13.根据权利要求12所述的组合物，其特征在于它含有一种通式(Ⅰ)化合物和一种核酸。14.根据权利要求12或13所述的组合物，其特征在于它还含有一种或多种添加剂。15.根据权利要求14所述的组合物，其特征在于添加剂是一种或多种具有两个脂肪链的脂类。16.根据权利要求15所述的组合物，其特征在于中性脂类是在生理条件下为两性离子或无离子电荷的天然或合成脂类，它们例如选自二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、油酰基棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基-、二棕榈酰基-、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺以及它们的1-3次N-甲基化衍生物、磷脂酰基甘油、二酰基甘油、糖基二酰基甘油、脑苷脂(具体如半乳糖脑苷脂)、鞘脂(具体如鞘磷脂)，或脱唾液酸神经节苷脂(具体如脱唾液酸GM1和GM2)。17.根据权利要求14所述的组合物，其特征在于添加剂是一种直接干预或非直接地干预核酸浓集的化合物。18.根据权利要求17所述的组合物，其特征在于所述的添加剂完全或部分地从鱼精蛋白、组蛋白、核仁蛋白和／或它们的衍生物得到，或所述的添加剂还可以全部或部分地由肽基元(KTPKKAKKP)和／或(ATPAKKAA)构成，基元数可以是2-10，这些基元可以连续地或不连续地重复。19.根据权利要求12-18中任一项所述的组合物，其特征在于该组合物还含有一种或多种非离子表面活性剂，其量足以使核脂复合物微粒的尺寸稳定。20.根据权利要求12-19中任一项所述的组合物，其特征在于该组合物含有用于可注射制剂的在药学上可接受的赋形剂。21.根据权利要求12-19中任一项所述的组合物，其特征在于该组合物含有用于皮肤和／或粘膜施用的药学上可接受的赋形剂。22.根据权利要求13所述的组合物，其特征在于所述的核酸是脱氧核糖核酸或核糖核酸。23.根据权利要求22所述的组合物，其特征在于所述的核酸含有一个表达盒，该盒由在靶细胞中有活性的一个或多个启动子和转录终止子控制下的一个或多个有治疗意义的基因构成。24.根据权利要求1-9中任一项所述化合物在制备用于治疗疾病的药物的应用。25.根据权利要求1-9中任一项所述化合物在生产采用肌内方法在细胞内转移核酸治疗疾病的药物的应用。26.在细胞中转移核酸的方法，该方法包括下述步骤(1)让核酸与如前面定义的通式(Ⅰ)化合物进行接触，以便生成核脂复合物，(2)让细胞与(1)中生成的核脂复合物接触。27.根据权利要求26所述的在细胞中转移核酸的方法，其特征在于所述的核酸和／或所述的化合物预先与一种或多种添加剂混合。28.用编码蛋白质或可以转录成能缓解疾病的核酸的核酸治疗疾病的方法，所述核酸与通式(Ⅰ)化合物结合。全文摘要本发明涉及用于向细胞中转移核酸的新的有效化合物。这些新化合物更具体地属于脂类多胺类并含有至少一个环脒官能团。它们可用于在体外、离体或体内在不同类型细胞中转染目标核酸。文档编号A61K48/00GK1294582SQ9980427公开日2001年5月9日申请日期1999年3月30日优先权日1998年4月2日发明者G·柏克,M·弗莱德里克,H·霍夫兰德,D·斯彻尔曼申请人:阿文蒂斯药物公司