专利名称：含有肿瘤细胞和提取物的组合物及其使用方法
技术领域：
本发明涉及含有经半抗原修饰的肿瘤细胞及其提取物的组合物，和通过给需要治疗的受试者施用治疗有效量的组合物以治疗癌症的方法，所述组合物含有肿瘤细胞或肿瘤细胞提取物。本发明还涉及可用于诱导癌症患者的抗肿瘤反应的有效免疫接种方案。
Fujiwara等，免疫学杂志，1984,132,1571表明只要首先在缺乏半抗原-特异性的抑制性T细胞时用半抗原致敏小鼠，某些半抗原化的肿瘤细胞，即与半抗原三硝基苯基(TNP)缀合的肿瘤细胞即能在鼠系统中诱导针对未经修饰的肿瘤细胞的全身性免疫力。得自经治疗小鼠的脾细胞能完全和特异性地防止未经治疗的受体动物中的肿瘤生长。Flood等，免疫学杂志，1987,138,3573表明用与TNP-缀合并经紫外光-诱导的“消退性”肿瘤免疫的小鼠能排斥与TNP-缀合的，原本为非免疫性的“进行性”肿瘤。另外，这些小鼠随后能抗未缀合的“进行性”肿瘤的攻击。在另一个实验系统中，Fujiwara等，免疫学杂志，1984,133,510阐明经环磷酰胺预治疗之后被三硝基氯苯(TNCB)致敏的小鼠能通过肿瘤细胞的原位半抗原化来消除大(10mm)肿瘤；随后，这些动物能特异性地抗未缀合的肿瘤细胞的攻击。
因包括下列方面的几个原因，Fujiwara等人的教导与本发明的有所不同A.Fujiwara所述组合物中所用的细胞得自经诱导的可移植鼠肿瘤，而不是自发性的人肿瘤；B.Fujiwara所述组合物用于免疫预防，本发明用于免疫治疗；C.Fujiwara所述组合物作为局部治疗被施用，本发明的组合物通过全身性接种被施用；和D.Fujiwara所述组合物不会导致肿瘤消退，本发明的组合物能导致肿瘤消退和/或能使接受治疗的至少大部分患者的生存期延长。
最近已阐明了能与未经修饰的组织发生交叉反应的T细胞的存在。Weltzien及其同事阐明用经TNP-修饰的同系淋巴细胞免疫的小鼠所产生的Ⅰ类MHC-限制的T细胞克隆能与MHC-相关的，经TNP-修饰的“自身”肽反应。Ortmann,B等，免疫学杂志，1992,148,1445。另外，已证实用经TNP-修饰的淋巴细胞免疫小鼠会导致产生脾T细胞，所述细胞在体外表现出针对经TNP-修饰之细胞的细胞毒应答和再次增殖。Shearer,G.M.欧洲免疫学杂志，1974,4,527。用经DNP-或TNP-修饰的自身细胞进行免疫所产生的淋巴细胞应答未经修饰的自身细胞的潜力相当重要，因为它与两个临床难题相关1)药物-诱导的自身免疫病，和2)癌症免疫治疗。关于前者，有人建议将摄取的药物用作半抗原，该药物与正常的组织蛋白质联合形成能由T细胞识别的免疫原性复合物，Tsutsui,H等，免疫学杂志，1992,149,706。随后，会产生诸如全身性红斑狼疮的自身免疫病，甚至在停止服用令人不舒服的药物之后仍会继续发病。也就是暗示最后产生了与未经修饰的组织交叉反应的T淋巴细胞。
这些实验的共同特征是在抑制性细胞未被诱导的环境中用半抗原致敏。得自用环磷酰胺预治疗并经TNCB-致敏之小鼠的脾细胞表现出抗辐射的“放大辅助细胞功能”，即它们能特异性增强体外抗-TNP细胞毒性的产生。另外，一旦这些放大的辅助细胞通过体外暴露于与TNP缀合的自身淋巴细胞而被激活，它们也能增强针对不相关的抗原(包括肿瘤抗原)的细胞毒性(Fujiwara等，1984)。Flood等(1987)，文献同上表明该放大辅助细胞活性是由具有Lyt-1+,Lyt-2-,L3T4+,I-J+表型的T细胞介导的，该文献认为这些细胞是一类新的免疫调节性T细胞，即反抑制细胞。
对黑素瘤患者的免疫治疗表明施用高剂量(1000mg/M2)或低剂量(300mg/M2)的环磷酰胺，3天后用初始抗原匙孔嘁血蓝蛋白致敏，可显著增强针对该抗原的迟发型超敏反应的获得(Berd等，癌症研究，1982,42,4862；癌症研究，1984,44,1275)。低剂量环磷酰胺预治疗使转移型黑素瘤患者对注射的自身黑素瘤疫苗作出反应，针对自身黑素瘤细胞产生了迟发型超敏反应(Berd等，癌症研究，1986,46,2572；Cancer Invest.,1988,6,335)。施用环磷酰胺导致外周血淋巴细胞非特异性T抑制功能降低(Berd等，癌症研究，1984,44,5439；癌症研究，1987,47,3317)，这可能是通过耗尽CD4+,CD45R+抑制型诱导性T细胞来实现的(Berd等，癌症研究，1988,48,1671)。这一免疫治疗方式的抗肿瘤效果似乎受开始施用疫苗至产生针对肿瘤细胞的迟发型超敏反应之间过长的时间间隔所限制(Berd等，美国癌症研究协会进展(Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.),1988,29,408(#1626))。因此，仍需要增强上述疫苗的治疗效力，使其免疫原性更强。
目前，大多数肿瘤免疫学家同意下列观点，即免疫系统破坏肿瘤的前提条件是负责肿瘤免疫力的T淋巴细胞白细胞浸润至肿瘤块。因此，大量注意力集中于由Stephen Rosenberg博士在NCI开创的“TIL”疗法。Rosenberg博士和其他研究人员从人转移癌中提取到一些天然存在的T淋巴细胞，通过在体外用T淋巴细胞生长因子白介素2(IL-2)培养，所述细胞的数目大大提高，Topalian等，临床肿瘤杂志(J.Clin.Oncol.),1988,6,839。然而，由于注射的T细胞“定居”于肿瘤位点的能力有限，此疗法不是非常有效。
已在多项研究中治疗性地利用了高浓度的IL2将淋巴细胞诱导成为非特异性细胞毒杀伤细胞的能力(Lotze等，生物反应杂志，1982,3,475；west等，新英格兰医学杂志，1987,316,898)。然而，高剂量静脉内IL2的严重毒性使得该方法具有局限性。人们很少注意到下列观察结果即较低浓度的IL2能通过诱导能抗原激活的T细胞的扩展而用作免疫佐剂(Talmadge等，癌症研究，1987,47,5725；Meuer等，柳叶刀，1989,1,15)。因此，仍需要了解并尝试利用IL2作为免疫佐剂的用途。
据信，人黑素瘤能表达独特的表面抗原，所述抗原可被T淋巴细胞识别，Old,L,癌症研究，1981,41,361；Van der Bruggen,P等，科学，1991,254,1643；Mukherji,B等，免疫学杂志，1986,136,1888；和Anichini,A等，免疫学杂志，1989,142,3692。然而，体内诱导针对该抗原的有效的T细胞-介导之反应的困难限制了在本发明人所做工作之前的免疫治疗方法。
人们提出几个模型用于解释什么情况下对人肿瘤-相关抗原似乎具有耐受性，它们包括1)下调早期抗肿瘤反应的肿瘤抗原-特异性抑制细胞，Mukherji等，文献同上；Berendt,M.J和R.J.North.,实验医学杂志，1980,151,69。
2)人肿瘤细胞无法引发T辅助细胞或为所述T细胞提供共刺激信号，Fearon,E.R等，细胞，1990,60,397；Townsend,S.E和J.P.Allison,科学，1993,259,368；和3)肿瘤细胞上主要组织相容性产物的表面表达减少，从而限制T细胞对它们的识别，Ruiter,D.J.,癌症生物学研讨会，1991,2,35,上述假说无一在临床系统中被证实。
对肿瘤进行活性免疫治疗的目的是产生生产性的全身性T细胞介导的肿瘤特异性免疫力。肿瘤特异性的免疫力可在原发性的肿瘤位点起作用，也可用于清除远离位点的小转移病灶。已证实T细胞免疫力的产生是受高度调节的反应，所述反应需要细胞-细胞相互作用和产生大量细胞因子。最近，对大量人和鼠系统的研究表明T细胞反应可分为两类，即Ⅰ和Ⅱ型(Mossman等，免疫学杂志，1986,136:2348)。Ⅰ型反应是产生迟发型超敏反应(DTH)所必需的，并与巨噬细胞激活和γ-干扰素(IFNγ)的产生相关，已证实Ⅰ型反应与人麻风病(Yamamura,M等，科学，1991,254:277-279)和鼠利什曼原虫病(Scott,P等，免疫学评论，1989,112:161-182)的消除相关。Ⅱ型反应与IL4和IL10的产生相关，主要支持抗体反应，并与麻风病(Yamamura,M等，文献同上)和利什曼原虫病(Yamamura等，文献同上；和Scott,P等，文献同上)的渐进形式相关。除了产生DTH外，预期Ⅰ型反应还能通过上调MHC和肿瘤相关抗原以及增强抗原呈递(其继发于局部IFNγ的产生)来增强肿瘤特异性CTL的产生。最近，已证实Ⅰ型和Ⅱ型反应能够交叉调节IFNγ抑制Ⅱ型反应，而IL4和IL10抑制Ⅰ型反应(Scott，免疫学杂志，1991,147:3149-3155；和Fiorentino等，免疫学杂志，1991,146:3444-3451)。在利什曼原虫属系统中，损害位点处细胞因子的调制能使Ⅱ型转变为Ⅰ型反应，因此，从渐进性感染变为能根除疾病(Scott,1991，文献同上)。
Pisa等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)199289:7708-7712在卵巢癌活检样品而不是卵巢癌细胞系中检测到IL10mRNA；他们认为IL10来源于肿瘤浸润淋巴细胞。Gastl等，国际癌症杂志，1991,55:96-101发现48个肿瘤细胞系中有16个将IL10释放至培养上清液；只有3-8个黑素瘤细胞系为阳性。最后，据Chen等，国际癌症杂志，1994,56:755-760报道，得自转移黑素瘤的9个细胞系中有6个表达IL10mRNA。然而，据本发明人所知，本发明首次报道了转移黑素瘤活检样品中的IL10mRNA。
不知道这些观察结果是否适用于人肿瘤-宿主关系，即T细胞浸润肿瘤产生细胞因子的模式是否是免疫应答有效性的指征。用自身性的，经DNP修饰之疫苗治疗的转移黑素瘤患者在肿瘤位点产生了炎症反应，Bred等，1991，文献同上。从组织学上看，这些发炎损害的特征在于有时与肿瘤细胞破坏相关的T细胞浸润。本发明发现经DNP-疫苗治疗的患者的肿瘤含有Ⅰ型T淋巴细胞，而在施用疫苗之前切下的肿瘤中未检测到这种细胞。
治疗人类癌症的常规尝试尚未成功或仅仅部分成功，经常有不合乎需要的副作用。基于多种免疫学理论治疗癌症的尝试也尚未成功。尽管申请人使用与半抗原缀合的黑素瘤细胞成功地治疗了某些黑素瘤患者，但癌症治疗领域仍需要其它的和改良的诱导抗肿瘤反应的方法。目前，申请人发现了使用经半抗原修饰的肿瘤细胞或提取物的有效免疫接种方案。
发明简述本发明涉及含有经半抗原修饰的肿瘤细胞和肿瘤细胞提取物的组合物，和通过施用本发明的组合物在癌症患者中诱导抗肿瘤反应的方法。
本发明一方面涉及分离的经半抗原修饰的哺乳动物，优选为人的肿瘤细胞或肿瘤细胞提取物。
另一方面，本发明涉及含有经半抗原修饰的哺乳动物肿瘤细胞或提取物的组合物。
另一方面，本发明提供了含有治疗有效量的经半抗原修饰的哺乳动物，优选为人的肿瘤细胞或提取物的疫苗组合物。
另一方面，本发明涉及治疗癌症的方法，所述方法包括给哺乳动物，优选为人施用含有治疗有效量的经半抗原修饰的人肿瘤细胞或提取物的组合物，其中所述哺乳动物患有与所述肿瘤细胞膜相同类型的恶性肿瘤。
另一方面，本发明涉及根据每周一次的接种时间表治疗癌症的方法。
附图简述
图1显示了针对经DNP-修饰的自身PBL和黑素瘤细胞产生DTH的动力学。用经DNP-修饰的PBL(LY)或经DNP-修饰的解离于转移肿瘤块的黑素瘤细胞(MEL)对经DNP-疫苗治疗的转移黑素瘤患者进行一系列皮肤检测。每个条形表示患者组在各个时间点的平均DTH反应；误差条形=标准误差。在第119天仅测定了对PBL的反应。样品规模第0,14,63天，N=84；第119天，N=57；第175天，N=42；第231天，N=35。
图2显示出对DNP的抗体反应。使用ELISA检测在不同时间点所得血清中的抗DNP抗体(总免疫球蛋白)。滴度被定义为(样品的OD峰值)×(稀释度的倒数)，所述稀释度给出的OD值等于阳性对照OD峰值的一半。
图3是针对经DNP修饰的自身淋巴细胞的PBL增殖反应图。在接受DNP-疫苗的4个患者的DTH反应达到峰值时，从患者体内得到PBL。以未经修饰的自身PBL为对照(autol LY)，检测细胞对经DNP修饰的自身PBL的增殖能力(autol LY-DNP)。在第6天用125IUDR脉冲标记培养物。
图4显示了针对经DNP修饰的淋巴细胞的增殖反应动力学。从接受DNP疫苗的患者DM2体内连续收集PBL。深低温保藏所述PBL，然后同时检测所有样品对经DNP修饰的自身PBL的增殖反应(autolLY-DNP)。在第6天用125IUDR脉冲标记培养物。
图5显示了针对经DNP修饰的细胞的增殖反应特异性。检测得自两个患者的PBL针对未经修饰的(autol LY)，经DNP修饰的(autolLY-DNP)，或经TNP修饰的(autol LY-TNP)的自身性PBL的增殖反应，和针对未经修饰的(MEL)或经DNP修饰的(MEL-DNP)经培养自身黑素瘤细胞的增殖反应。在第6天用125IUDR脉冲标记培养物。
图6是扩展的T细胞的特异性分析。在IL2中扩展患者DM2的PBL，并重复地用自身性的经DNP修饰的B类淋巴母细胞进行刺激。检测它们针对未经修饰的(autol LY)，经DNP修饰的(autol LY-DNP)，或经TNP修饰的(autol LY-TNP)的自身性PBL的增殖反应；针对未经修饰的(MEL)或经DNP修饰的(MEL-DNP)经培养自身黑素瘤细胞；和同种异体PBL(Allo LY)的增殖反应。在第6天用125IUDR脉冲标记培养物。
图7显示了针对经DNP修饰的自身细胞的CD8+和CD4+T细胞反应。通过正淘选将扩展的T细胞分为富含CD8或富含CD4的群体。然后检测它们针对未经修饰的(autol LY)，经DNP修饰的(autol LY-DNP)的自身性PBL的增殖反应，和针对未经修饰的(MEL)或经DNP修饰的(MEL-DNP)经培养自身黑素瘤细胞的增殖反应。在第6天用125IUDR脉冲标记培养物。
图8显示了DNP-反应性T细胞的细胞因子产生情况。将通过以有限稀释的方式铺板得到的DNP-反应性T细胞系(“亲代”)和3个传代培养物(2F8,1D7,1C2)与自身性的经DNP修饰的B类淋巴母细胞保温18小时；收集上清液并检测其中的γ干扰素(IFN)和IL4。
图9显示了通过抗-MHCⅠ类单克隆抗体封闭T细胞反应。用自身性的经DNP修饰的B类淋巴母细胞刺激扩展的CD8+T细胞，18小时后检测培养物中的γ干扰素。将刺激细胞与下列之一预保温无抗体(无)，非特异性小鼠IgG(非-特异性)，单克隆抗体W6/32(Ⅰ类)，或单克隆抗体L243(Ⅱ类)。
图10显示出MHC对T细胞反应的限制。检测扩展的CD8+T细胞(HLA-A1,A2,B8,Bw6)对经DNP修饰的自身性PBL，和得自其它4个患者并经DNP修饰的同种异体PBL作出反应而获得的增殖能力。如图所示，同种异体刺激细胞中的3个在一个或多个Ⅰ类位置处匹配，而第4个完全不匹配(A24,A26,B44,B63)。在第6天用125IUDR脉冲标记培养物。
图11显示了DNP-反应性T细胞的细胞毒性图。在6-小时“Cr分析试验中将自身性的(autol)或同种异体Ⅰ类-不匹配(allo)的黑素瘤细胞用作靶。效应细胞是扩展的CD8+,DNP-反应性T细胞。图11A-用不同浓度的DNBS或TNBS使靶细胞半抗原化。效应细胞靶细胞的比例为20∶1。图11B-以一系列效应细胞靶细胞(E∶T)的比例，将用2.5mg/ml DNBS或TNBS半抗原化的靶细胞与效应细胞混合。
图12图示了在手术后的月份里，经DNP疫苗和非-半抗原化的对照疫苗治疗后肿瘤消失的患者所占的百分比。
图13显示了HPLC级分，所述级分被合并为各为10个级分的5组。在第2组中，得自经二硝基苯基修饰的黑素瘤细胞(DNP-MEL)或经二硝基苯基修饰的B细胞(DNP-LY)的肽具有刺激性。
图14A-14B显示了得自经DNP-疫苗免疫之患者的发炎的皮下黑素瘤结节能表达IFNγ和IL10的mRNA。图14A显示出经RT-PCR测定的细胞因子mRNA(泳道1=大小标记物；2=β-肌动蛋白；3=IFNγ；4=IL4；5=IL10)；图14-B是皮下损害经H&E染色的切片(400×)。
图15A-15B显示出得自未经免疫之患者的淋巴结转移表达IL10mRNA而不是IFNγ mRNA。图15A显示出经RT-PCR测定的细胞因子mRNA(泳道1=大小标记物；2=β-肌动蛋白；3=IFNγ；4=IL4；5=IL10)；图15-B是淋巴结转移经H&E染色的切片(400×)。
图16是人黑素瘤转移中表达的IL10 mRNA凝胶。经RT-PCR测定细胞因子mRNA(泳道1=大小标记物；C=IL10 cDNA对照；1-7=患者样品)。
图17是黑素瘤细胞表达的IL10 mRNA凝胶。图17通过RT-PCR显示了代表性的肿瘤活检样品和衍生细胞系中的IL10 mRNA表达(泳道1=大小标记物；2=IL10 cDNA；3=肿瘤活检样品；4=肿瘤细胞系)。
图18A-18B是未发炎的黑素瘤活检样品的石蜡切片的原位RT-PCR(A=100×,B=400×)。
发明详述本发明涉及癌症免疫治疗。本发明范围中包括肿瘤组合物和治疗癌症的方法。本发明还涉及根据每周一次的接种时间表诱导抗肿瘤反应的方法。本发明意义上的抗肿瘤反应指的是下述中的至少一个肿瘤坏死，肿瘤消退，肿瘤炎症，肿瘤被激活的T淋巴细胞浸润，迟发型超敏反应和患者生存期的延长。本发明的肿瘤细胞和提取物及其组合物能引发T淋巴细胞，该T淋巴细胞具有浸润哺乳动物肿瘤的特性；能引发针对哺乳动物肿瘤的炎性免疫应答；引发针对哺乳动物肿瘤的迟发型超敏反应和/或在体外刺激T淋巴细胞。
由根据本发明的治疗引起的抗肿瘤反应可以是转移性肿瘤或稳定疾病的部分或完全消退。“完全”消退指的是在至少1个月内，更优选在至少3个月内约100％消退。“部分”消退指的是在至少1个月内，更优选在至少3个月内约50％以上的肿瘤消退。“稳定”疾病指的是经疫苗治疗之后没有显著肿瘤生长的病症。经本发明的治疗之后可以观察到的另一个抗肿瘤反应是生存期的延长。
根据本发明可以治疗任何恶性肿瘤，其中包括转移的和原发性癌症以及实体和非实体肿瘤。实体肿瘤包括癌，非实体肿瘤包括血液恶性肿瘤。癌包括但不限于腺癌和上皮细胞癌。血液恶性肿瘤包括白血病，淋巴瘤和多发性骨髓瘤。以下是根据本发明的方法可用分离的经修饰肿瘤细胞膜治疗之癌症的非限制性例子卵巢癌，包括晚期卵巢癌，白血病，包括但不限于急性骨髓性白血病，结肠癌，包括已转移至肝脏的结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，黑素瘤，乳腺癌，肺癌，肾癌和前列腺癌。卵巢癌可以是腺癌或上皮细胞癌。结肠癌和前列腺癌是腺癌。白血病可源自髓样骨髓或淋巴结。白血病可以是急性的，其表现为初级发展阶段的成熟抑制，也可以是慢性的，其表现为成熟淋巴样或髓样细胞的过量增长。根据本发明可以治疗Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ或Ⅳ期癌症，优选Ⅲ和Ⅳ期，甚至更优选Ⅲ期癌症。根据本发明可治疗任何哺乳动物，优选可治疗人。
可由肿瘤细胞或肿瘤细胞提取物制备本发明的组合物。肿瘤细胞可以是任一癌症类型的恶性细胞或恶变前的细胞。根据本发明，“恶变前细胞”指的是具有癌细胞迹象，但尚不是癌细胞的任何异常细胞；例如但不限于最终会导致颈癌的颈细胞发育异常变化，和发育异常的痣，所述痣是导致黑素瘤的异常皮肤细胞。优选肿瘤细胞和提取物源自欲被治疗的癌症类型。例如，使用黑素瘤细胞或细胞提取物治疗黑素瘤类癌症。肿瘤细胞和提取物可以是，但不限于解离于活检样品或组织培养物的自身细胞和同种异体细胞，以及干细胞和得自这些来源的提取物。在一个优选的实施方案中，细胞和提取物是自身性的。然而，可使用任何非-同种异体的细胞，包括分离自患者肿瘤的自身性细胞培养物中产生的肿瘤细胞。在基因水平上，肿瘤细胞不需要与接受治疗的患者的肿瘤细胞或非-肿瘤的体细胞完全(即100％)相同。肿瘤细胞和患者之间MHC分子的基因同一性一般是足够的。另外，黑素瘤细胞上的特定抗原和患者肿瘤细胞上存在的抗原之间具有基因同一性。根据本领域已知的方法可测定基因同一性。对本发明来说，一种通过(使用例如重组DNA技术)改变基因后，使之在例如患者的特定MHC分子和/或患者癌细胞上的特定抗原方面遗传上相同肿瘤细胞属于“非-同种异体”的细胞，包括在本发明的范围中。这种细胞也被称为“MHC-相同的”或“MHC-相容的”细胞。
本发明的肿瘤细胞提取物可以是分离自经半抗原修饰的癌细胞的肽，或者是分离自经半抗原修饰的癌细胞的细胞膜。提取物也可以首先分离自肿瘤细胞，然后再对其进行半抗原修饰。
对本发明而言，肽是含有两个或多个氨基酸的化合物，包括蛋白质。优选肽为低分子量，约为1,000kD至约10,000kD，更优选约为1,000至约5,000，所述肽分离自半抗原化的肿瘤细胞，并可刺激T细胞淋巴细胞以产生γ干扰素。T细胞是淋巴细胞，它可介导两种类型的免疫功能，即效应子和调节功能，能分泌蛋白质(淋巴因子)并杀死其它细胞(细胞毒性)。效应子功能包括反应性，例如迟发型超敏，同种异体移植排斥，肿瘤免疫力，和移植物-抗-宿主反应性。由T细胞效应子功能表现淋巴因子的产生和细胞毒性。T细胞的调节功能表现在它们能放大由其它T细胞所发挥的细胞介导性细胞毒性，和B细胞产生的免疫球蛋白。调节功能也需要淋巴因子的产生。T细胞对包括但不限于促分裂原，抗原或凝集素的诱导刺激物作出反应而产生γ干扰素(IFNγ)。除了优选肽为半抗原化的肽外，还优选肽约为8至约20个氨基酸。肽可分离自细胞表面，细胞内部或这两个部位的任意组合。提取物可以是癌细胞(与正常细胞相对)类型所特定的提取物。本发明的肽包括但不限于与主要组织相容性复合体结合的肽，细胞表面-相关蛋白，由癌症癌基因或突变的抗-癌基因编码的蛋白质。
本发明的癌细胞膜可以是分离自半抗原化癌细胞膜的全部或部分。根据本发明所述癌细胞膜的定义，可分离癌细胞膜然后使其半抗原化，或者，可使癌细胞半抗原化，随后分离其细胞膜。
细胞提取物能刺激T细胞，本发明意义上的刺激指的是对细胞提取物反应所致的T细胞增殖以及由T细胞产生细胞因子。分离自经半抗原修饰的肿瘤细胞和蛋白质的膜和蛋白质各自独立地具有刺激T细胞的能力。通过T细胞对经修饰的核酸，例如但不限于3H胸苷，125IUDR(碘化脱氧尿苷)；和染料，例如染色活细胞的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)的摄取观察到T细胞增殖。另外，还产生了细胞因子，例如但不限于IFNγ，肿瘤坏死因子(TNF)和IL-2。所产生细胞因子的量优选大于15pg/ml，更优选约为20至约30pg/ml，甚至更优选约为50pg/ml。
优选地，肿瘤细胞提取物含有细胞材料，所述材料是特定癌症类型所特有的，或者基本上特异于所述癌症类型。本发明的肿瘤细胞可以是活细胞。在一个优选的实施方案中，本发明的肿瘤细胞和提取物在注射后不能在患者体内生长。防止细胞生长的方法是本领域技术人员所熟知的。例如，使用前可照射肿瘤细胞。在一个实施方案中，以约2500cGy的量照射肿瘤细胞或提取物以防止细胞在注射后生长。
本发明的组合物可单独或与其它化合物联合用于本发明的方法中，所述化合物包括但不限于本发明的其它组合物。因此，癌细胞和癌细胞提取物可以单独或者共同使用。本发明意义上的共同使用包括一起和连续施用。另外，癌细胞膜可以与肽共同使用。另外，癌细胞和/或提取物可以与其它化合物共同使用，所述化合物包括但不限于细胞因子，例如白介素2，白介素-4，γ干扰素，白介素-12,GM-CSF。本发明的肿瘤细胞和提取物也可与其它癌症疗法联合使用，所述疗法包括但不限于化学疗法，放射，抗体，寡核苷酸序列和反义寡核苷酸序列。
本发明的组合物可以与药物可接受的载体混合施用，可根据想用的给药途径和标准的药学实践来选择这些载体。剂量可根据患者的体重和临床病症来确定。活性成分与载体的比例一般取决于组合物的化学特性，溶解性和稳定性以及所期望的剂量。本发明的肿瘤细胞和提取物的使用量取决于化合物与癌细胞的亲和力，所存在的癌细胞量和组合物的溶解性。
本发明的组合物可以与免疫佐剂和/或药物可接受的载体混合。任何已知可用于药物传递的含水载体，例如但不限于盐水都可用作本发明的载体。另外，本领域技术人员已知的任何佐剂都可用于本发明的传递。佐剂具有增强针对本发明肿瘤细胞制品的免疫应答的特性。代表性的佐剂例子是BCG，或合成佐剂，含有纯化自Quillaja saponaria树皮的均质皂苷的QS-21，小棒杆菌(Corynebacterium parvum)(McCune等，癌症，1979,43:1619)，一般的皂苷，解毒的内毒素和细胞因子，例如白介素-2，白介素-4，γ干扰素(IFN-γ)，白介素-12，白介素-15,GM-CSF及其组合。
当细胞和细胞提取物被辐照和半抗原化时，可使细胞与半抗原缀合，然后再辐照。或者，可辐照细胞然后再与半抗原缀合。在任一种情况下，随后可纯化提取物，然后再进行照射和/或半抗原化。为了辐照和半抗原化提取物，首先可进行其中一种方法，接着再进行另一种方法。
或者，可在抗原呈递细胞中加入肿瘤细胞或肿瘤细胞提取物。可同时使用癌细胞提取物和另一种细胞类型的抗原呈递细胞来治疗癌症，所述抗原呈递细胞选自自身性的经培养巨噬细胞和自身性的经培养树突状细胞。不用究其来源，巨噬细胞是任何大的阿米巴样单核细胞，诸如但不限于组织细胞和单核细胞，所述细胞吞噬，即吞食和破坏其它细胞，死组织，退化细胞等。巨噬细胞是抗原呈递细胞，它将抗原，包括肿瘤抗原呈递至包括T细胞的细胞。树突状细胞也是抗原呈递细胞，它似乎与巨噬细胞密切相关，然而，相对于巨噬细胞而言，树突状细胞是更加有效的抗原呈递细胞。它们是强有力的T细胞刺激物，可分离自多个身体器官和组织，包括但不限于血液，皮肤(其中树突状细胞指的是朗氏细胞)，淋巴样组织。
可使用例如，其上结合有肽或膜的抗原呈递细胞免疫患者。得到患者的血液，从中提取巨噬细胞或树突状细胞。将高浓度的肽(约为1ng/ml至约1μg/ml，优选约为10ng/ml至约100ng/ml)或膜(约105至约107个细胞当量(c.e.)，细胞当量与起始细胞数目相关，是得自所示数目之细胞的细胞提取物的量)与细胞保温过夜或保温约8小时。当与膜保温时，膜被巨噬细胞或树突状细胞吞噬。使用吞噬膜的巨噬细胞或树突状细胞免疫患者，Grabbe,S等，今日免疫学，1995,16:117-121,其全文列入本文作为参考。
每个剂量的本发明疫苗组合物可含有例如至少104个肿瘤细胞或等细胞当量的肿瘤细胞提取物(例如分离的膜或肽)，优选含有至少105个细胞/细胞当量提取物，最优选含有至少106个细胞/细胞当量提取物。剂量是单次给药所施用疫苗组合物的量。在一个实施方案中，每剂量疫苗组合物含有约105至约2.5×107个细胞/细胞当量提取物，更优选含有约5×106个细胞/细胞当量。在一个优选的实施方案中，疫苗组合物最多含有7.5×106个细胞/细胞当量提取物。本发明所用肿瘤细胞和肿瘤细胞膜的量一般取决于化合物与癌细胞的亲和力，所存在的癌细胞量和组合物的溶解性。剂量可根据患者的体重和临床病症来确定。
本发明的疫苗组合物可包装成适于真皮内，静脉内，腹膜内，肌内和皮下给药的剂量形式。或者，剂量形式可含有本发明的制品(例如肿瘤细胞，膜，肽)，给药时可用例如适当的稀释剂重建该制品。
可通过任何适当的途径施用本发明的肿瘤细胞，肿瘤细胞提取物及其组合物，所述途径包括接种和注射，例如真皮内，静脉内，腹膜内，肌内和皮下给药。每次疫苗治疗有多个给药位点，例如，每次给药可通过真皮内注射至少2个，优选为3个邻接的位点以施用疫苗组合物。在本发明的一个实施方案中，将疫苗组合物施用于上臂或腿。
在施用本发明的疫苗组合物之前，通过在皮肤上使用半抗原而用其免疫受试者，所述半抗原将用于修饰肿瘤细胞和膜。例如，可使用二硝基氟苯(DNFB)。在本发明的一个实施方案中，在施用疫苗之前未用半抗原免疫患者。随后(例如，大约2周后)，用肿瘤细胞或提取物组合物注射受试者。在总共至少3次，优选为至少6次的治疗中(通过例如再次注射)施用组合物。在一个实施方案中，给药的总数(包括最初的给药)可以是8次，而在另一个实施方案中可以是10次。主管医生可设计接种时间表以适合特定受试者的病症。疫苗注射的间隔可以是例如4周，优选为2周，最优选为1周。在一个优选的实施方案中，每周注射一次疫苗，总共注射6次。可交替使用半抗原化的和非半抗原化的疫苗。在一个优选的实施方案中，所有疫苗都含有经半抗原修饰的肿瘤细胞或提取物。可以施用加强疫苗，优选施用一种或两种加强疫苗。可在初次给药后约6个月或约1年之后施用加强疫苗。
可在每次施用疫苗的前几天(约3天)施用药物环磷酰胺(CY)以增强针对肿瘤细胞的免疫应答。在一个优选的实施方案中，仅在首次注射疫苗之前施用CY。
本发明的疫苗可以是半抗原化的或非-半抗原化的。疫苗的半抗原化或化学-连接的形式包括例如与二硝基苯基(DNP)半抗原化的肿瘤细胞。其它半抗原包括但不限于三硝基苯基，N-碘代乙酰基-N’-(5-磺酸-1-萘基)乙二胺，三硝基苯磺酸，异硫氰酸荧光素，异硫氰酸砷酸苯，三硝基苯磺酸，对氨基苯磺酸，对氨苯基砷酸，二硝基苯-S-芥。也可使用半抗原组合。类似地，可使肿瘤细胞提取物疫苗半抗原化。对半抗原化的癌细胞提取物而言，提取物，肽和癌细胞膜分离自半抗原化的癌细胞。本发明还包括肿瘤细胞和/或细胞提取物的非-半抗原化疫苗。
在本发明的一个实施方案中，治疗被怀疑患有癌症之患者的方法可包括，施用药物可接受量的环磷酰胺和药物可接受量的组合物，所述组合物选自活的肿瘤细胞，肿瘤细胞提取物，和肿瘤细胞和肿瘤细胞提取物的混合物。当组合物是癌细胞提取物时，提取物可以是分离自半抗原化癌细胞的肽或膜。组合物可与免疫佐剂和/或药物可接受的载体混合。施用半抗原化疫苗之后，任选再施用药物可接受量的非-半抗原化疫苗。也可根据本发明的方法施用非半抗原化的疫苗。
在本发明的另一个实施方案中，每周施用本发明的组合物，总共达至少6周，首次给药之前先施用药物可接受量的环磷酰胺。优选组合物最多含有约7.5×106个细胞或细胞当量提取物。在施用疫苗之前不必用半抗原免疫患者。
本发明的疫苗组合物可含有肿瘤细胞和/或肿瘤细胞提取物。可按下述制备本发明所用的肿瘤细胞按Berd等(1986)，文献同上(全文列入本文作为参考)所述处理肿瘤块。通过用胶原酶和DNA酶酶促解离并通过机械解离提取细胞，在控速冻干仪中冻干，储存于液氮中待用。在患者接受皮肤检测或治疗的当天，融化，洗涤细胞，并用约2500R照射。再次洗涤细胞，然后悬浮于不含酚红的Hanks平衡盐溶液中。通过Miller和Claman，免疫学杂志，1976,117,1519(全文列入本文作为参考)的方法使制备的细胞与DNP缀合，所述方法包括在无菌条件下将肿瘤细胞与DNFB保温30分钟，接着用无菌盐水洗涤细胞。
通过分离膜并修饰膜或在首先不分离膜的情况下使细胞与半抗原缀合而使患者的癌细胞与半抗原缀合。
通过从患者未经修饰的癌细胞制品中分离膜来制备癌细胞膜。将细胞悬浮于约5倍体积的约30mM碳酸氢钠缓冲液中，所述缓冲液中含有约1mM苯甲基磺酰氟，用玻璃匀浆器破碎细胞。在约1000g下离心以除去残留的完整细胞和核。通过在100,000g下离心90分钟以沉淀膜。将膜重新悬浮于约8％蔗糖中，在约-80℃下冷冻待用。在膜悬浮液(约5,000,000个细胞当量/ml)中加入约0.5ml 1mg/ml二硝基氟苯(DNFB)维持约30分钟。类似地，也可使用其它半抗原，例如但不限于三硝基苯基和N-碘代乙酰基-N’-(S磺酸-1-萘基)乙二胺。通过使膜对着约0.15M PBS透析约3天以除去过量的DNP。使膜沉淀下来。
或者，通过用诸如二硝基苯基的半抗原修饰患者的癌细胞，然后由所述细胞制备膜，即可制备出癌细胞提取物，肽或膜。在活检过程中得到患者的癌细胞，冷冻待用。将约100mg DNFB(Sigma Chemical公司,St.Louis,MO)溶解于约0.5ml 70％乙醇中。加入约99.5ml PBS。DNFB的浓度应为约152mg/0.1ml。在37℃水浴中搅拌溶液过夜。溶液的货架寿命约为4周。融化细胞，将细胞沉淀物重新悬浮于5×细胞/ml Hanks平衡盐溶液中。在每ml细胞中加入约0.1ml DNFB溶液，室温下保温约30分钟。类似地，也可使用其它半抗原，例如但不限于三硝基苯基，N-碘代乙酰基-N’-(5-磺酸-1-萘基)乙二胺，三硝基苯磺酸，异硫氰酸荧光素，异硫氰酸砷酸苯，对氨基苯磺酸，对氨苯基砷酸，二硝基苯-S-芥及其组合。然后用Hanks平衡盐溶液将细胞洗涤2次。将细胞悬浮于约5倍体积的约30mM碳酸氢钠缓冲液中，所述缓冲液中含有约1mM苯甲基磺酰氟，用玻璃匀浆器破碎细胞。在约1000g下离心以除去残留的完整细胞和核。通过在100,000g下离心90分钟以沉淀膜。将膜重新悬浮于约8％蔗糖中，在约-80℃下冷冻待用。
从经DNP修饰的细胞中提取肽，其中的一些肽因修饰细胞的结果而被DNP修饰。可在本领域技术人员已知的蛋白质提取技术之后进行抗原分析以分离能对患者进行有效治疗的抗原。分离细胞提取物的方法是本领域技术人员众所周知的。简单地说，从肿瘤中分离出癌细胞并在体外培养。根据上述方法在经培养的细胞中加入二硝基苯基。根据Rotzschke等，自然,1990,348,252(其全文列入本文作为参考)建立的技术从细胞中分离肽。用弱酸处理细胞，然后离心得到上清液，通过HPLC得到含有小肽的级分，浓缩并冷冻。通过使级分与自身性B类淋巴母细胞结合，然后检测所述细胞刺激黑素瘤-特异性T淋巴细胞的能力即可筛选所述级分的免疫活性。
用例如但不限于三氟乙酸(TFA)的弱酸处理细胞，然后离心细胞得到上清液。通过凝胶过滤(G25 Sepharose,Pharmacia)从上清液中除去分子量大于5,000的化合物。在处于0.1％三氟乙酸(TFA)中的反相HPLC柱(Superpac Pep S,Pharmacia LKB)上，使用浓度渐增的乙腈梯度分离其余上清液；流速=1ml/分钟，级分大小=1ml。根据Sambrook等，分子克隆实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989)的方法，通过HPLC得到含有小肽的级分，浓缩并冷冻级分。通过使级分与自身性B类淋巴母细胞结合，然后检测所述细胞刺激肿瘤(黑素瘤)-特异性T淋巴细胞的能力即可筛选所述级分的免疫活性。
在培养中的B类淋巴母细胞中加入EB病毒(EBV,ATCC CRL-1612,B95-8 EBV转化的白细胞，棉顶绒猴，Saguinus oedipus)。将B类淋巴母细胞转化至得自患者自身淋巴细胞的B细胞肿瘤。在RPMI1640+10％胎牛血清或10％合并的人血清中培养转移的黑素瘤。用RPMI培养基洗下未贴壁的细胞。当细胞长至铺满时，用0.1％EDTA使其脱附并分成两瓶。持续该过程，其中不断地将铺满的细胞分瓶。为了检测T细胞产生γ干扰素的情况，得到患者血液中的淋巴细胞。将经半抗原(例如DNP)修饰的患者自身肿瘤细胞与淋巴细胞混合以刺激T细胞。每隔7天加入白介素-2。通过按上述进行分瓶来扩展T细胞。然后用经半抗原修饰的细胞重新刺激T细胞。产生了富集的T细胞群体，该细胞群体对经半抗原修饰的细胞发生反应。
很多研究人员研制并检测了人类癌症疫苗。尽管他们有时诱导了针对患者之癌症的微弱免疫力，但很少能导致肿瘤消退。令人惊奇地是，本发明的DNP-疫苗可在转移肿瘤中引起炎症反应。肿瘤发红，变得温暖而柔软。最终，在某些情况下，在肉眼和显微镜下看来，肿瘤消退到消失的程度。在显微镜下观察到T淋巴细胞浸润至肿瘤块。因此，能增强炎症反应和增加进入肿瘤的淋巴细胞数目和能力的此方法是本领域中的显著进步。
通过加入多种生物反应修饰剂可改善疫苗的效力。这些修饰剂通过直接或间接刺激免疫应答来发挥作用。本发明的生物反应修饰剂包括但不限于白介素-12和γ干扰素。在此实施方案中，可在每次注射疫苗之后施用IL12。据信，给具有炎症反应的患者施用IL12能导致肿瘤块中的T淋巴细胞增殖，并且更具活性。增加的T细胞数目和功能性导致对肿瘤的免疫破坏。可根据上述剂量指示确定IL12的剂量。
使用具有下列成分的免疫治疗方案治疗转移性黑素瘤患者1)由与DNP缀合的自身性肿瘤细胞组成的疫苗；和2)预先用低剂量的环磷酰胺治疗。评价患者以确定是否发生肿瘤消退，监测肿瘤炎症反应，和测定针对自身性黑素瘤细胞，DNFB(用于致敏皮肤的DNP形式)，DNP-缀合的自身性淋巴细胞，稀释剂(Hanks溶液)，纯化的蛋白质衍生物(PPD)，和回忆抗原(念珠菌，发癣菌和腮腺炎病毒)的迟发型超敏反应。让据认为已从治疗中获取(临床或免疫学)好处的患者继续接受免疫治疗，随后施用不含环磷酰胺的疫苗。在类似的实验中，发现与聚乙二醇连接的白介素2无效。
在另一个实施方案中，使用的疫苗含有与半抗原缀合的癌细胞化学提取物，其中混合有免疫佐剂，如卡介菌(BCG)。
在本发明中，使用RT-PCR检查人转移性黑素瘤活检样品中细胞因子mRNA的表达。在施用DNP疫苗之后的发炎转移中发现了IFNγ的mRNA，而在治疗前的转移，甚至在含有大量残留淋巴结淋巴细胞的转移中很少发现IFNγ的mRNA。另外，在几乎所有的黑素瘤转移中都发现了Ⅱ型细胞因子IL10，它们似乎是由黑素瘤细胞自身产生的。
用自身性的经DNP修饰的疫苗治疗的转移性黑素瘤患者在肿瘤位点产生了炎症反应。从组织学上看，这些发炎损害的特征在于T细胞浸润，所述浸润有时与肿瘤细胞破坏相关。在本发明中，有8个皮下转移经疫苗治疗之后产生炎症，检测其活检样品中IFNγ,IL4,TNF和IL10的mRNA表达情况。施用疫苗之后发炎的活检样品含有IFNγ(5/8),IL4(4/8)或这两者(3/8)和TNF(4/7)的mRNA。相反，在对照样品(治疗前的淋巴结转移或未发炎的皮下转移)中，仅在1/17中检测到IFNγmRNA,2/16中检测到TNF mRNA。在24/25黑素瘤转移中检测到具有抗炎症特性的细胞因子IL10的mRNA，它不依赖于淋巴内容物；原位PCR证实黑素瘤细胞是主要来源。这些发现提供了新的参数，通过这些新参数可测定癌症免疫治疗的效果。
本发明的目的在于分析新近得到的转移性黑素瘤活检样品中是否存在与肿瘤位点生产性免疫应答相关的细胞因子mRNA。IFNγ或IL4mRNA的表达是黑素瘤转移的特征，所述黑素瘤转移在施用经DNA修饰的自身性疫苗之后产生了炎症反应。另一方面，IL10 mRNA的表达不依赖于炎症反应，在几乎所有的黑素瘤活检样品中都能观察到其表达。检查得自黑素瘤活检样品的细胞系并进行原位PCR分析，结果表明IL10的来源是黑素瘤细胞自身而不是相关的淋巴细胞。
此项工作最重要的发现可能是相反的结果在未经治疗的患者的黑素瘤转移中一般未发现IFNγ和IL4的mRNA，在含有大量淋巴结淋巴细胞的转移肿瘤块中也未发现上述mRNA。这提供了低背景的原位细胞因子生产活性，籍此对抗通过免疫治疗其T细胞群体已经改变的黑素瘤组织。另外，它强调了重要的生物学论点提取自黑素瘤结节转移的T细胞可能代表着原始淋巴结群体的残留，而不是实际上已通过对黑素瘤抗原的识别而浸润至肿瘤的淋巴细胞。由于它们不是抗原-激活的，它们未接受产生IFNγ或IL4的刺激物。
相反，施用DNP-疫苗之后得到的活检样品一般能表达IFNγ的mRNA。然而，DNP-疫苗-诱导的炎症反应不能被鉴定为Ⅰ型，因为其中一些样品也含有IL4。如果基于PCR的mRNA分析的敏感性较好，通过主要产生IFNγ的T细胞浸润液当中的一小片产生IL4的T细胞可产生上述模式。另一方面，IFNγ和IL4 mRNA的存在能预示产生这两种细胞因子的T细胞(所谓的THo细胞)的存在(Lee等，欧洲免疫学杂志，1992,22:1455-1459)。解决这一问题需要分析mRNA表达与形态学(例如原位PCR)的相关性。不论结果如何，这些发现都表明肿瘤内细胞因子的产生是测定接受免疫治疗之患者的重要参数。
本发明特别提出IL10 mRNA来源于黑素瘤细胞自身，而不是相关的淋巴细胞。在24/25活检样品中检测到强的IL10 mRNA带，其表达不依赖于相关淋巴细胞的数目或DNP-疫苗-诱导的炎症的存在。另外，原位PCR清楚地表明黑素瘤细胞中的IL10 mRNA。得自活检材料的细胞系表达IL10 mRNA，通过ELISA测定，它能产生IL10。
黑素瘤组织中产生IL10的生理学意义尚不清楚。已知IL10是抗炎症细胞因子，它可能通过降低巨噬细胞的共刺激功能来抑制T细胞增殖和IL12的产生(Jinquan,T等，免疫学杂志，1993,151:4545-4551)以及迟发型超敏反应(Lee，文献同上)。因此，IL10能抑制已浸润至肿瘤位点的黑素瘤-反应性T细胞的激活和增殖。然而，最近已阐明IL10是CD8+T细胞的化学吸引剂(Jinquan，文献同上)；这一特性即为经DNP-疫苗-诱导之淋巴浸润液中CD8+细胞占优势的原因所在。在任一种情况下，调制肿瘤位点的IL10产生将对肿瘤-宿主关系产生重要后果。
本发明的范围还包括筛选肿瘤的细胞因子产生以确定自身性的，经照射的，与半抗原缀合的细胞组合物在怀疑患有癌症之患者中的效力的方法，所述方法包括给所述患者施用所述的与半抗原缀合的组合物；得到含有患者组织样品之核酸的样品；扩增特异于细胞因子的核酸或扩增通过使探针特异性地与所述组织样品中的细胞因子特异性核酸杂交而产生的信号；检测扩增核酸或扩增信号的存在，其中扩增核酸或扩增信号的存在表示癌症，其中得自所述患者组织样品的扩增核酸或扩增信号的存在表示所述的与半抗原缀合的组合物的效力。
组织样品可以是恶性或恶变前的肿瘤，例如黑素瘤肿瘤，或皮下炎性转移的黑素瘤。另外，组织样品可以是实体或液体组织样品，例如但不限于怀疑患有癌症之患者的全部或部分肿瘤，唾液，痰，粘液，骨髓，血清，血清，血液，尿液，淋巴或眼泪。
核酸，如DNA(包括cDNA)和RNA(包括mRNA)得自患者组织样品。优选RNA得自组织样品。通过本领域已知的任何方法，例如Sambrook等，分子克隆实验室手册(冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989)(其全文列入本文作为参考)所述的方法提取总RNA。
提取核酸之后，可通过本领域已知的任何技术扩增该核酸。扩增步骤包括使用至少一个引物序列，所述序列与细胞因子特异性序列部分互补。本发明意义上的细胞因子特异性序列包括(但不限于)编码IFNγ,TNF,IL-2,IL-12和IL-13之序列的全部或部分。一般说来，引物序列的长度约为21个核苷酸至约33个核苷酸，优选约为21个核苷酸，约为31个核苷酸，32个核苷酸和约为33个核苷酸。
用于扩增方法的引物序列包括但不限于β肌动蛋白，SEQ ID NO:1和2；IFNγ,SEQ ID NO:3和4；IL4,SEQ ID NO:5和6；IL10,SEQ IDNO:7和8；和TNF,SEQ ID NO:9和10。
当依赖于模板的扩增方法使用一对引物时，引物对中的一个引物可含有与编码细胞因子特异性蛋白质的核酸序列互补的寡核苷酸。引物对中的一个引物可选自SEQ ID NO:1至10。
或者，引物对中的两个寡核苷酸都特异于编码细胞因子的核酸序列。引物可被设计成与例如细胞因子序列分开的区域互补。分开的区域指的是第一个引物与细胞因子序列的3’区域互补，第二个引物与细胞因子序列的5’区域互补。优选引物与不同的分开的区域互补，并且彼此不互补。引物SEQ ID NO:1至10仅是可用于本发明的引物的例子。
当扩增方法包括使用两个引物，例如聚合酶链反应，第一个引物可选自SEQ ID NO:1,3,5,7和9，第二个引物可选自SEQ ID NO:2,4,6,8和10。根据本发明的方法，可使用任何引物对，所述引物对可互相转录核酸并且特异于细胞因子。
优选进行总RNA提取。本文所用术语“扩增”指的是依赖于模板的方法和载体-介导的增殖，它可导致特异性核酸分子浓度相对于其初始浓度而言有所增加，或者导致可测信号浓度的增加。本文所用术语“依赖于模板的方法”指的是包括依赖于模板延伸引物分子的方法。术语“依赖于模板的方法”指的是RNA或DNA分子的核酸合成，其中新合成的核酸链的序列遵守众所周知的互补碱基配对规则(例见Watson,J.D等，基因分子生物学，第4版，W.A.Benjamin公司，MenloPark,Calif(1987)，全文列入本文作为参考)。通常，载体介导的方法学包括将核酸片段导入DNA或RNA载体，克隆扩增载体，回收扩增的核酸片段。所述方法学的例子由Cohen等(美国专利4,237,224),Maniatis,T等，分子克隆(实验室手册)，冷泉港实验室，1982提供(皆全文列入本文作为参考)。
多种依赖于模板的方法可用于扩增样品中存在的所需靶序列，一个最著名的扩增方法是聚合酶链反应(PCR)，其详细描述于美国专利4,683,195,4,683,202和4,800,159和Innis等，PCR方法，Academic出版公司，San Diego CA,1990(皆全文列入本文作为参考)。简单地说，在PCR中，制备的两个引物序列与靶序列相反互补链上的区域互补。在反应混合物中加入过量的脱氧核苷三磷酸以及DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)。如果靶序列存在于样品中，引物会与靶结合，通过添加核苷酸，聚合酶会导致引物沿着靶序列延伸。通过提高和降低反应混合物的温度，延伸的引物会从靶上解离下来以形成反应产物，过量的引物会与靶和反应产物结合而重复上述过程。优选进行逆转录酶PCR扩增以确定所扩增的mRNA量。聚合酶链反应的方法学是本领域众所周知的。
另一种扩增方法是连接酶链反应(也称为LCR)，其公开于EPA320,308(其全文列入本文作为参考)。在LCR中，制备了两个互补的探针对，当存在靶序列时，每对与靶的相反互补链结合以使它们邻接。当存在连接酶时，两个探针对会连接形成单个单位。通过温度循环(例如PCR中的温度循环)，结合的连接单位从靶上解离，然后用作“靶序列”以连接过量的探针对。美国专利4,883,750(全文列入本文作为参考)中描述了另一种扩增方法，该方法类似于使探针对与靶序列结合的LCR。
PCT申请PCT/US87/00880(全文列入本文作为参考)中描述的Qβ复制酶也可用作本发明的另一种扩增方法。在此方法中，在RNA聚合酶的存在下在样品中加入RNA的复制序列，所述序列具有与靶序列互补的区域。聚合酶会拷贝复制序列，然后检测该复制序列。
本发明也可使用等温扩增方法扩增核酸，所述方法中使用限制性内切核酸酶和连接酶扩增靶分子，所述靶分子在限制性位点的一条链上含有核苷酸5’-[α-硫代]三磷酸(Walker,G.T等，Proc.Natl.Acad.Sci(U.S.A.)1992,89:392-396，全文列入本文作为参考)。
链置换扩增(SDA)是另一种等温扩增核酸的方法，所述方法包括多轮链置换和合成，即切口平移。被称为修复链反应(RCR)的类似方法是另一种可用于本发明的扩增方法，所述方法包括贯穿扩增所靶向的区域退火几个探针，接着进行修复反应，所述反应中仅存在4个碱基中的两个。其它两个碱基可作为生物素化的衍生物被加入以易于检测。SDA中也使用了类似的方法。
也可使用循环探针反应(CPR)检测细胞因子特异性序列。在CPR中，具有非-细胞因子特异性DNA的3’和5’序列和细胞因子特异性RNA的中间序列的探针与样品中存在的DNA杂交。杂交后，用RNA酶H处理反应，探针的产物被鉴定为不同的产物，所述不同的产物能产生消化后被释放的信号。使最初的模板与另一个循环探针退火并重复反应。因此，CPR包括扩增通过使探针与细胞因子特异性核酸杂交而产生的信号。
根据本发明，可使用另一种扩增方法，其描述于GB申请2202328和PCT中请PCT/US89/01025(皆全文列入本文作为参考)。在前一申请中，在PCR类依赖于模板和酶的合成中使用了“经修饰的”引物。可通过用捕获组成成分(如生物素)和/或检测组成成分(如酶)标记来修饰引物。在后一申请中，在样品中加入过量的经标记探针。当存在靶序列时，探针与之结合，并被催化裂解。裂解之后，靶序列被完整地释放以与过量的探针结合。经标记探针的裂解是靶序列存在的信号。
其它核酸扩增方法包括基于转录的扩增系统(TAS)(Kwoh D等，美国国家科学院院报1989,86:1173,Gingeras T.R等,PCT申请WO88/10315，全文列入本文作为参考)，包括基于核酸序列的扩增(NASBA)和3SR。在NASBA中，可通过标准的苯酚/氯仿提取，热变性临床样品，用裂解缓冲液和微型自旋柱处理以分离DNA和RNA，或用盐酸胍提取RNA来制备扩增所用的核酸。这些扩增技术包括退火具有前列腺特异性序列的引物。聚合化之后，用RNA酶H消化DNA/RNA杂合体，并且再次热变性双链DNA分子。在任一种情况下，通过加入第二个前列腺特异性引物，接着进行聚合化而使单链DNA完全变为双链。然后通过诸如T7或SP6的聚合酶成倍转录双链DNA分子。在等温循环反应中，RNA被逆转录成双链DNA，使用诸如T7或SP6的聚合酶再次转录双链DNA。所得产物无论是截短的还是完整的都表示前列腺癌特异性序列。
Davey,C等，欧洲专利申请329,822(全文列入本文作为参考)中公开了一种核酸扩增方法，所述方法包括循环合成单链RNA(“ssRNA”),ssDNA和双链DNA(dsDNA)，根据本发明可使用该方法。ssRNA是第一个引物寡核苷酸的第一个模板，通过逆转录酶(依赖于RNA的DNA聚合酶)可使其延长。然后通过核糖核酸酶H(RNA酶H，特异于DNA-RNA或RNA-RNA双链体中的RNA的RNA酶)的作用从所得DNA:RNA双链体中除去RNA。所得ssDNA是第二个引物的第二个模板，它也包括位于其模板同源序列之5’方向的RNA聚合酶启动子序列(例如T7 RNA聚合酶)。然后通过DNA聚合酶(例如大肠杆菌DNA聚合酶I的大“Klenow”片段)延伸该引物，导致产生双链DNA(“dsDNA”)分子，所述分子在引物之间具有与原始RNA相同的序列，在一个末端还另外具有启动子序列。适当的RNA聚合酶可使用此启动子序列制备出DNA的很多RNA拷贝。这些拷贝可重新进入循环，导致很迅速的扩增。选择适当的酶之后，可以进行等温扩增而不必在每个循环中加入酶。由于这一方法的循环特性，可以选择DNA或RNA形式的起始序列。
Miller,H.I等，PCT申请WO89/06700(全文列入本文作为参考)中公开了一种核酸序列扩增方案，该方案基于启动子/引物序列与单链靶DNA(“ssDNA”)的杂交以及随后转录出序列的很多RNA拷贝。该方案不是循环的；即新的模板不由所得RNA转录物产生。其它扩增方法包括“race”(其描述于Froman,M.A.:PCR方法方法和应用指南，1990,Academic出版社，纽约)，和“one-Sided PCR11”(Ohara,O等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)1989,86:5673-5677)(全文皆列入本文作为参考)。
在本发明的扩增步骤中也可使用基于下述的方法，即两个(或多个)寡核苷酸在具有所得“双-寡核苷酸”之序列的核酸存在下进行连接，籍此扩增双-寡核苷酸(Wu,D.Y等，基因组学1989,4:560，全文列入本文作为参考)。
扩增之后，可检测扩增产物的存在或缺乏。可通过本领域已知的任何方法测定扩增产物的序列，所述方法包括但不限于Maxam和Gilbert法，例见Sambrook，文献同上。然后将经测序的扩增产物与在用疫苗治疗之前切下的组织所得的结果相比较。接受疫苗治疗之前所得的组织样品应该不含细胞因子序列，尤其是IFNγ,TNF,IL2,IL12和IL13。可使核酸片段化以形成不同大小的不连续片段。例如，可通过例如但不限于经琼脂糖凝胶基质电泳的方法，根据分子量分离DNA片段。然后通过Southern杂交分析凝胶。简单地说，将凝胶中的DNA转移至杂交底物或基质上，例如但不限于硝酸纤维素膜和尼龙膜。在选定的杂交条件下将经标记的探针应用于基质以与位于基质上的互补DNA杂交。探针的长度应能形成稳定的双链体。探针长度的大小范围约为200至约10,000个核苷酸，优选长度约为200个核苷酸。一旦拥有此处公开的内容，例如但不限于具有类似亲水性和疏水性之序列的错配将是本领域技术人员已知的。观察或检测所用的多种标记物是本领域技术人员已知的，例如但不限于荧光染色，例如溴化乙锭染色，亲和素/生物素，放射性标记，如32P标记等。优选在琼脂糖凝胶上电泳产物，例如PCR产物，并使用染色，例如溴化乙锭染色观察产物。例见Sambrook等，文献同上。然后通过放射自显影分析基质以定位与探针杂交的特定片段。
筛选自身性的，经照射的，与半抗原缀合的细胞组合物的诊断试剂盒在一个或多个容器中含有一对引物，其中所述引物对中的一个引物与细胞因子特异性序列互补，其中所述引物选自SEQ ID NO:1,SEQID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10，所述试剂盒中还含有观察扩增DNA所用的工具；所述试剂盒可用于测定所述组合物的效力。
利用下列实际实施例1-8和11以及预测实施例9-10和12-14可进一步阐明本发明，提供所述实施例仅为了阐明本发明而不是将本发明限制于这些特定的实施方案。
施用环磷酰胺之后，治疗的毒性局限于注射位点的局部炎症反应和轻度恶心和呕吐。有40个可评价的具有可测转移的患者；其中5个有反应，其中4个是完全反应，1个是部分反应。出现反应的中间时限是10个月(7-84+月)。一个患者的病情在11年内持续减轻。肿瘤消退不仅发生在皮肤和结节转移，也发生在肺和肝脏转移。在其它6个患者中，观察到抗肿瘤反应，所述反应看上去象是该疫苗治疗所特有的，即转移性损害的消退似乎在免疫治疗开始之后才出现。在3个患者中，这一“延迟型”消退出现在两个或多个肿瘤中。
治疗前，仅在16％的患者中检测到针对自身性的，经机械-解离的黑素瘤细胞的迟发型超敏反应(DTH)，而在治疗49,161和217天之后，分别在46％,56％和73％的患者中检测到DTH。经非-独立的t-试验证实，免疫治疗之后迟发型超敏反应的增强具有显著的统计学意义；第0天对第49天，p＜0.001；第0天对第161天，p＜0.001；第0天对第217天，p=0.021。总的说来，26/43患者(61％)在某些时间点表现出针对自身性黑素瘤细胞的阳性迟发型超敏反应(≥5mm)。患者也对制备肿瘤细胞悬浮液所用的酶产生了强的迟发型超敏反应在两次疫苗治疗之后，用胶原酶和DNA酶(各为1mg/ml)的混合物检测24个患者的迟发型超敏反应，其中的21(88％)个患者具有＞5mm的反应。针对疫苗的抗肿瘤反应与针对经机械解离的自身性黑素瘤细胞的迟发型超敏反应密切相关，这一点可由下列3个观察结果所证实1)8/10表现出肿瘤消退的患者具有阳性迟发型超敏反应；2)在手术后的用含佐剂的疫苗治疗的患者中，针对自身性黑素瘤细胞的迟发型超敏反应的强度与肿瘤复发的时间之间具有很显著的相关性(r=0.680,p＜0.001)；3)针对最初的疫苗中的自身性黑素瘤细胞(“老”肿瘤)产生迟发型超敏反应的9个患者体内出现新的转移(“新”肿瘤)，所述新肿瘤未能引发迟发型超敏反应或只能引发很小的反应。将患者的病症与用疫苗治疗之前的病症相比较。在开始疫苗研究之前的1至2个月，从治疗中剔除在疫苗研究之前已经治疗过的患者。因此，在开始疫苗研究时，患者尚未经过治疗。
在3种情况下，我们能切下消退的肿瘤以进行组织学检查；这种肿瘤的特征在于淋巴细胞的大量浸润。相反，从免疫治疗前的患者体内切下的肿瘤由均匀的恶性细胞块组成，而不存在显著的淋巴细胞浸润。
这一研究表明使用环磷酰胺能在患有癌症的患者体内产生针对黑素瘤-相关抗原的免疫应答。
图12比较了在手术后的月份里，经DNP疫苗和非-半抗原化的对照疫苗治疗后肿瘤消失的患者所占的百分比。此项研究检查的是DNP-疫苗对经手术切除转移且未表现出转移疾病之临床症状的患者的治疗效果。使所有患者对半抗原DNFB(二硝基氟苯)致敏，然后皮内注射自身性的，经照射的与DNP缀合的黑素瘤细胞以治疗患者。每过28天再注射1次疫苗，总共进行8次治疗。周期性地检测所有患者对自身性黑素瘤细胞，与DNP缀合的自身性淋巴细胞和微生物抗原的迟发型超敏反应，DTH。用经深低温保藏的，提取自黑素瘤肿瘤和/或分离自外周血的淋巴细胞进行体外研究。
表黑素瘤的DNP-疫苗治疗
CY(环磷酰胺)=仅在施用前2次疫苗之前静脉内施用环磷酰胺大丸剂300mg/M2疫苗=与BCG混合的5×106到20×106自身性的，经照射的黑素瘤细胞DNFB SENS=10mg DNFB溶于0.1ml丙酮-玉米油中，用于腹侧上臂DNFB CHALL=200微克DNFB溶于0.1ml丙酮-玉米油中，用于前臂进行皮试=自身性的黑素瘤细胞，外周血淋巴细胞(PBL)，与DNP缀合的外周血淋巴细胞(PBL-DNP)，纯化的蛋白质衍生物(PPD)(结核皮肤试验)，微生物回忆抗原*第0天仅施用PBL,PBL-DNP
读出皮试结果=硬块的平均直径得到PBL=100cc肝素化的血液常规实验室分析=完全血液计数(CBC)，示差血液计数(diff)，血小板计数(血小板)，SMA-12(一系列常规的实验室试验，血尿氮(BUN))针对DNP的致敏-最初使患者按照下述方式针对DNP致敏在第-17天，快速静脉内灌注施用环磷酰胺，300Mg/M2。三天后，在第-14和-15天，用DNFB(二硝基氟苯)致敏将1mg DNFB溶解于丙酮-玉米油，在2cm直径的钢环范围内以0.1ml体积局部应用。两周后，局部应用200pg DNFB和真皮内注射缀合有DNP的自身PBL，测试患者对DNP的反应性。将环磷酰胺在无菌水中重构，通过快速静脉内灌注施用适当剂量。
疫苗制备-处理肿瘤块。通过胶原酶和DNA酶酶解和机械解离提取细胞，在控速冷冻仪中冷冻，在液氮中储藏待用。到患者接受治疗的时候，使细胞解冻，漂洗，在2500R照射处理。然后再次清洗，悬浮于无酚红的Hanks平衡盐溶液。
使黑素瘤细胞和DNP缀合。该步骤包括将肿瘤细胞与二硝基氟苯(DNFB)在无菌条件下保温30分钟，然后用无菌盐水冲洗。
疫苗由悬浮于0.2ml Hanks溶液中的5-20×106活肿瘤细胞组成。当加入BCG，它由0.1ml 1∶10稀释度的Tice BCG组成。每次疫苗治疗为在上臂或腿邻近部位的三次注射，不要在与淋巴结解剖同侧的肢体进行注射。
研究方法-在第0天，患者接受环磷酰胺300Mg/M2快速静脉内灌注。三天后，在+3天，给他们真皮内注射自身黑素瘤疫苗。以后每四周再次进行疫苗注射，总共治疗八次。环磷酰胺仅在前两次注射之前使用。所有疫苗均为DNP-缀合的，并与卡介菌(BCG)混合。BCG是从Organon Teknika Corporation,Durham,NC得到的Tice株系(Pasteur研究所株系的亚株系)。冷冻干燥材料用1ml无菌水重构，在磷酸盐-缓冲盐水，pH7.2中以1∶10稀释；然后吸取0.1ml，与疫苗混合，然后注射。所有疫苗在同一部位(上臂或腿)注射。
免疫原性评价-在前臂真皮内注射0.1ml实验材料，进行皮肤试验，在48小时，通过测定硬化的平均直径评价迟发型超敏反应。将阳性反应拍照。下列材料接受测试1)1×106照射的自身黑素瘤细胞；2)3×106与DNP缀合和不缀合的自身外周血淋巴细胞，；3)Hanks溶液；4)PPD-中等强度；和5)微生物回忆抗原-假丝酵母，毛癣菌，和腮腺炎病毒。给上臂皮肤应用200μg,48小时检查硬化区的面积，测试针对DNFB的接触致敏性。
采集所有患者的血液，用于分离和低温贮藏淋巴细胞，对各时间皮肤试验血清进行实验(参见表1采血方案)。定期测试1)针对自身黑素瘤细胞的增殖性和细胞毒性应答；和2)针对DNP-结合的自身淋巴细胞的增殖反应。
研究时间1)用八个疗程的疫苗治疗患者，约需要八个月。然后停止治疗。监测这些患者，直到从他们最初手术后至少过去五年时间。
2)八次治疗完成之前，发生区域性复发或远距离转移的患者，取消该研究，接受如临床说明的治疗(化疗或手术)。
对照组由黑素瘤转移到区域淋巴结的22位患者组成。当无黑素瘤转移的临床迹象时，手术切除他们的病灶。然后，用非-半抗原化的自身疫苗对他们进行治疗。首先，给他们施用环磷酰胺，300Mg/M2。三天后，给他们真皮内注射疫苗，该疫苗为与BCG混合的10×106到25×106经照射的、自身黑素瘤细胞。每28天重复一次环磷酰胺疫苗治疗。总共治疗八次。每两个月患者接受临床评价。
到两年时，仅20％对照患者无癌症。相比较而言，用本发明DNP-疫苗治疗的患者无癌症生存期显著较长，如前面的阐述。
对于接受半抗原化疫苗的患者，其黑素瘤均转移到区域性淋巴结，但没有远距离转移的证据。在该状况下的患者一般接受患病淋巴结的手术切除。手术切除使患者临床上无疾病，但两年内他们有80-85％的机率形成转移性黑素瘤。
对照组中的患者，处于相同的临床状况，以与半抗原化疫苗组可比较。因此，对照组也由黑素瘤转移到区域淋巴结的患者组成，但无远距离转移的证据，他们也接受疾病淋巴结的手术切除。当用非-半抗原化疫苗开始治疗时，对照患者临床不表现疾病，但就象以前提到的，80％形成远距离转移。
手术不能治愈黑素瘤的患者不选择作为对照，因为这些患者痊愈速率接近0，他们比具有可切除的淋巴结转移的患者的生存时间甚至更短。而且，在这些患者中，不可能测定无疾病生存期，它是本发明的疫苗显著延长的指标。
如下对数据进行统计学分析描绘无疾病生存期和总生存期的Kaplan-Meir图。DNP-疫苗接种患者和对照患者之间的差异通过Mantel log-rank(级)实验分析。它们是分析这些数据的标准统计学方法。差异高度显著，p＜0.01。
另外十七位患者按照前面列出的方案接受随后治疗(按照前面阐述的理由，没有增加对照组的数量)。无疾病生存期和总生存期的结果存在统计学显著差异。
按照Berd.D.等(1986，同上，将其全文列入本文作为参考)的方法，从转移肿瘤块中酶法提取黑素瘤细胞，然后深低温保藏。从这些悬浮液得到细胞系，在含10％胎牛血清的RPMI-1640中维持。通过用从美国典型培养物保藏中心得到的一系列单克隆抗体(HB82=HLA-A2,HB122=HLA-A3,HB164=HLA-A1124)进行的流式细胞计量术分析确定的MHCⅠ类差异，区分由本研究所用患者得到的黑素瘤细胞系。半抗原缀合分别按照Miller,S.D.和H.N.Claman，免疫学杂志，1976,117,1519和Geczy,A.F.和A.Baumgarten，免疫学，1970,19,189(将其全文列入本文作为参考)的方法，将PBL与水性DNFB或DNBS保温30分钟，对PBL进行DNP-修饰；这两种方法得到相同的结果。对于特异性对照，分别按照Fujiwara,H.等，免疫学杂志，1980,124,863和Boerrigter,G.H.和R.J.Scheper,J.Invest.Dermatol.,1987,88,3(其全文列入本文作为参考)的方法，通过与TNBS，或与噁唑酮保温，用TNP修饰细胞。用黑素瘤细胞重复半抗原缀合。迟发型-超敏反应(DTH)将深低温保藏的PBL解冻，漂洗，重悬浮于Hanks平衡盐溶液。将细胞分成三组未修饰组、与DNP缀合组、和与TNP缀合组。漂洗后，将1×106黑素瘤细胞或3×106PBL悬浮于0.1ml Hanks溶液，在前臂真皮内注射。到48小时，通过测定硬化的平均直径，确定DTH。用黑素瘤细胞重复DTH分析。
所有患者均对DNP-修饰的自身PBL形成DTH(图1)。局部应用DNFB后两周(第14天)DTH反应明显，之后在每月疫苗给药期间的全过程保持稳定。与DNP-缀合的自身黑素瘤细胞悬浮液诱导比DNP-PBL更强的DTH(平均SE∶PBL=13.3mm±1.3mm，黑素瘤细胞=21.9 mm±3.6mm；p＜0.01)。DTH特异于经DNP-修饰的“自体”，因为缀合有TNP的自身PBL在50位受试患者中均未诱导应答。抗-DNP抗体用与DNP-缀合的PBL包被微滴板的孔，进行ELISA。发现该方法对于用与DNP-缀合的白蛋白包被平板是优选的，因为对于预免疫患者的血清，其产生较低的背景读数。将与DNP-缀合的PBL(5×105在0.1ml中)加入96孔平底平板的每个孔中。通过干燥，然后暴露于100％甲醇5分钟，来固定细胞。然后，用磷酸盐缓冲盐水+0.05％Tween-20冲洗平板五次。将连续稀释的实验血清加入孔中，在潮湿培养箱中于37℃保温平板1小时。保温后，清洗平板五次，然后加入预先确定的最佳稀释度的与辣根过氧化物酶-缀合的山羊抗-人免疫球蛋白(Cappel Laboratories,Malvern,PA)。为了检测IgG或IgM抗体，分别使用与过氧化物酶-缀合的山羊抗-人IgG或IgM。在37℃保温1小时后，清洗平板五次，向各孔中加入0.1ml底物(-苯二胺，SigmaChemical Co.,St.Louis,MO)，然后每孔中加入50pl,0.12Oi过氧化氢。在ELISA平板读数仪上读取平板。
用鼠抗-DNP单克隆抗体(克隆SPE-7；Sigma ImmunoChemicals)，和一种与过氧化物酶-缀合的抗鼠免疫球蛋白抗体作为第二步反应物，验证该分析的有效性。随后，由来自接受多次DNP-疫苗注射的患者的血清样品构成阳性对照。如下测定各血清样品的抗-DNP抗体滴度(样品的OD峰值)X(OD等于阳性对照OD峰值一半的稀释度的倒数)Butler,J.E.,酶学方法，1981,73,482。
在27位受试患者中，24位形成抗-DNP抗体。与DTH相比，DNFB局部应用(第14天)没有诱导抗体。在19位患者中，两次真皮内注射与DNP-缀合的黑素瘤细胞后(第63天)，滴度增加到预免疫水平以上；在另外5位患者中，到4至6次接种后，才发现明显的滴度。检测所有患者的IgG抗体；仅在三位患者中发现抗-DNP IgM。与TNP交叉反应的抗-DNP抗体，显示与TNP-修饰细胞结合，但不与无关半抗原，噁唑酮结合。T细胞系的形成将PBL(1×106)与自身性的，与DNP-缀合的B类淋巴母细胞(1×105)在24孔平底平板中在淋巴细胞培养基中混合。培养7天后，加入IL2 100U/ml(Cetus Oncology赠送，Emeryville,CA)。扩展的T细胞培养物在培养基+IL2中维持，然后按照需要分开，以维持在22mm直径孔中约2×106个细胞的浓度。每隔14天，加入自身性的，与DNP-缀合的B类淋巴母细胞，再次刺激培养物。用一系列单克隆抗体(Becton-Dickinson,San Jose,CA)通过流式细胞计量术确定表型。按照Wysocki,L.J.和V.L.Sato,(美国国家科学院院报1978,75,2844，其全文列入本文作为参考)的方法，利用标准技术，通过间接淘选分离CD8+和CD4+T细胞，其中被抗-CD8和抗-CD4单克隆抗体包被的T细胞粘附于被抗免疫球蛋白包被的平皿；分离粘附细胞，用DNP-修饰的刺激物和IL2进行扩展。
通过在圆底微滴板的孔的含2×105照射处理的同种异体饲喂细胞，200U/ml IL2，和植物凝集素的淋巴细胞培养基中进行有限稀释培养，得到表型均一的T细胞亚群。在生长淋巴细胞克隆的孔中筛选对DNP-修饰的B类淋巴母细胞应答的增殖能力。将阳性孔在IL2中扩展，用自身性的，与DNP-缀合的B类淋巴母细胞每隔14天重新刺激。淋巴细胞增殖反应-将PBL作为应答细胞进行测试。将它们悬浮于淋巴细胞培养基(RPMI-1640，10％合并人AB+血清，添加胰岛素-铁传递蛋白-亚硒酸盐介质(Sigma Chemical Co.)2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸，25mM HEPES缓冲液，青霉素+链霉素)，加入96孔、圆底微滴板，1×105个细胞/孔。刺激细胞包括；1)自身或同种异体PBL,2)用Epstein-Bar病毒转染制备的自身或同种异体B类淋巴母细胞系，3)自身的培养的黑素瘤细胞；将它们辐照(5000R)灭活。在大多数实验中，应答物刺激物的比值为1∶1。将平板在CO2培养箱中于37℃培养5天；然后用121I-标记的IUDR(ICNRadiochemical,Costa Mesa,CA)对孔脉冲标记6小时，用自动收获装置收获，在γ计数仪上计数。计算三个孔样本的平均值。也按照上述方法测试培养的T细胞的淋巴增殖反应。
从对DNP-修饰的自身细胞表现最大DTH反应时的四位患者中得到并低温保藏的PBL，解冻该PBL，测试体外增殖反应。来自所有四位患者的PBL对DNP-修饰细胞的刺激均表现增殖(图3)。其中一位患者(DM2)的增殖反应的发展动力学如图4所示。单独应用DNFB(第14天)不会产生可检测数目的循环应答细胞。两次注射DNP-疫苗后(第63天)检测到反应性PBL，在疫苗治疗期的8个月内始终能检测到。
对DNP-修饰细胞的增殖反应是特异性的，因为未缀合PBL或用TNP修饰的PBL均未诱导反应(图5)。接种后，当用来源于自身肿瘤组织的DNP-修饰黑素瘤细胞系刺激时，PBL也活动地增殖。当用同种异体淋巴细胞刺激时，PBL表现预期的混合淋巴细胞反应，其比DNP反应高3到5倍。
来自这些患者中的一位(DM2)的循环T淋巴细胞在体外在IL2中培养扩展，然后用自身DNP-修饰的B类淋巴母细胞重复刺激。扩展四周后，T细胞有70％CD3+,CD8+和30％CD3+,CD4+。当用DNP-修饰的自身B类淋巴母细胞或DNP-修饰的、培养的黑素瘤细胞刺激时它们增殖，但未结合的自身细胞刺激时不增殖(图6)。通过正淘选将它们分成富含CD8和富含CD4的群体，它们经流式细胞计量术分析确定纯度为98％。如图7所示，富含CD4-和富含CD8-T细胞均对DNP-修饰的自身B类淋巴母细胞表现增殖反应。然而，仅富含CD8+T细胞对经DNP-修饰的自身黑素瘤细胞应答。该结果可能因为黑素瘤细胞系的Ⅱ类MHC的低组成型表达(＜5％)造成。
当用自身的、DNP-修饰的B类淋巴母细胞刺激时，测试扩展的T细胞产生细胞因子的能力。如图8所示，它们产生γ干扰素，但不产生IL4。为了确定CD4+和CD8+T细胞是否都参与细胞因子应答，分析以限制稀释度的T细胞铺板增殖得到的亚系。这些培养物对于CD4和CD8的表达是相同的。测试了这些亚系中的三种(两种CD4+，一种CD8+)对DNP-修饰的B类淋巴母细胞的细胞因子应答。三种产生的全部是γ干扰素，但不产生IL4(图8)。细胞因子的产生-将T细胞以1×105个细胞/孔加入圆底微滴板。加入等量刺激物(经DNP-修饰的自身B类淋巴母细胞)，保温18小时后，收集上清液。使用商业提供的ELISA试剂盒测定γ干扰素(Endogen,Boston,MA；灵敏度=5 pg/ml)和IL4(R&G Systems,Minneapolis,MN；灵敏度=3pg/ml)。
为了检测MHC-依赖性反应，将刺激细胞与浓度为10μg/ml的抗Ⅰ类MHC(W6/32)或Ⅱ类MHC(L243)单克隆抗体预保温1小时，然后加入反应细胞。将同浓度的非-特异性小鼠免疫球蛋白作为阴性对照进行测试。
通过对大批量淘选得到的DNP-反应性CD8+T细胞，能够在含IL2的培养基中通过用DNP-修饰的自身B类淋巴母细胞重复刺激，维持长期培养(＞3个月)；它们保持稳定的表型，CD3+,CD8+。这两种细胞系的证据表明它们的反应是Ⅰ类MHC限制性的1)刺激细胞与抗-Ⅰ类构架抗体而不是与抗-Ⅱ类抗体的预培养，阻断γ干扰素的产生(图9)，和2)T细胞能够对在一个或两个HLA-A基因座上匹配的同种异体DNP-修饰的刺激物应答，但不能对HLA-A错配的刺激物产生反应。如图10所示，经对用DNP-修饰的自身PBL(HLA-A1、A2、B8+、Bw6)和表达A1或A2(或二者均表达)的DNP-修饰的同种异体PBL的刺激T细胞增殖；而对A1和A2阴性的DNP-修饰的同种异体刺激物不诱导反应。细胞毒性-用51Cr(Amersham Corp,Arlington Heights,IL)标记黑素瘤目的物两小时，将2500个细胞加入圆底微滴板的孔。然后加入效应细胞，获得一系列E∶T比值。37℃培养6小时后，除去上清液，在γ计数仪上计数。溶胞作用被定义为[CPM实验-CPM自发]/[CPM总量-CPM自发]*100。在51Cr-释放分析中，用自身黑素瘤细胞作为目的物，测试CD8+T细胞系的细胞毒性。为了使自发51Cr-释放最小化，用DNBS而不是用DNFB进行DNP修饰。T细胞裂解DNP-修饰的自身黑素瘤细胞，但不裂解同种异体(Ⅰ类-错配)黑素瘤细胞(图11a,11b)。在细胞裂解的易感性和DNP修饰程度之间存在直接关系，如使用的DNBS的浓度所确定。用TNP修饰的自身或同种异体目的物均未被裂解。
对于PCR扩增，将5μl各cDNA加入含有PCR反应缓冲液，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.2mM,1.25U AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elimer)，确定为各引物最适宜浓度的MgCl2(终浓度为15-6.0mM)，终体积为50μl的各适当引物对0.5mM的MicroAmp反应管(Perkin Elmer,Norwalk,CT)。该研究中应用的引物对包括β-肌动蛋白、TNF-α、IL-4、IFNγ(South San Francisco,CA)和IL10(Clontech,Palo Alto,CA)。将P-肌动蛋白作为比较样品间相对mRNA表达的标准品，以及RT和PCR反应的对照。应用GeneAmp System9600热循环仪(Perkin Elmer)扩增PCR样品。各样品在94℃变性37秒，55℃退火45秒，72℃延伸60秒，循环39次，然后在72℃延伸10分钟。
在20％琼脂糖凝胶(FMC BioProducts,Rockland,ME)中分离PCR产物和分子量标记(Novagen,Madison,WI)。用溴化乙锭染色凝胶，显色，在UV灯下照相。PCR产物的电泳显示了相应于各组引物的预期片段分子量的条带。使非逆转录RNA作为基因组DNA的污染物对照进行PCR扩增。
发现深低温保藏、酶分散的黑素瘤组织细胞悬浮液不适于RNA分析。这些样品通常表达所有待测细胞因子的mRNA，可能是解离过程激活的结果。组织学和原位RT-PCR-由病理学系(Department of Pathology)进行代表性样品的常规H&E染色。按照Bagasra,O.,等，免疫学方法杂志，1993 158:131-145的方法，用蛋白酶K渗透石蜡切片，用逆转录酶和应用上述相同引物扩增得到的IL10 DNA处理进行原位RT-PCR。免疫接种后发炎的活检样品中的细胞因子mRNA-当转移性黑素瘤的特征为少量淋巴细胞性浸润(Elder等，“皮肤恶性黑素瘤的外科病理学”，在:W.H.Clark,Jr.,等(编)，人恶性黑素瘤，pp.100,New York:GruRe和Stratton 1979)时，施用DNP疫苗诱导T细胞向转移肿瘤块浸润(Berd等，1991，同上)。对疫苗治疗后已形成炎症的八个(8)皮下转移性病灶(来自4位患者)进行研究，与从接种前切除的3个皮下转移性病灶和4个没有形成炎症反应的接种后转移病灶相比较。接种后、发炎的活检样品含有IFNγ(5/8)、IL4(4/8)或二者(3/8)的mRNA。相比较而言，在7个对照样品中，既没有检测到IFNγmRNA也没有检测到IL4mRNA。这15个组织中除了1个之外其余全部表达IL10mRNA。图14显示了代表性、T细胞-浸润的、接种后的活检样品的细胞因子mRNA的表达以及相应的组织结构。淋巴结转移-还研究了一组黑素瘤淋巴结转移的活检样品。从组织学上看，这些损伤的特征在于含有大量被认为是肿瘤浸润的淋巴结淋巴细胞的残留物的淋巴细胞(图15B)(Cardi,等，癌症研究，1989 49:6562-6565)。对于10个研究的淋巴结活检样品中，仅一个表达IFNγmRNA；该样品和另外一个样品含有ILA的mRNA。然后，所有10个样品均含有IL10的mRNA。图15显示了代表性淋巴结转移性病灶的细胞因子mRNA表达，以及相应的组织结构。黑素瘤转移性病灶和细胞系的IL10产生-如前面的说明，在24/25黑素瘤转移性病灶中看到IL10 mRNA表达(图16)。因为它独立于IFNγmRNA或IL4 mRNA的表达，而且与T细胞浸润不相关，因此可能是黑素瘤细胞而不是淋巴细胞产生IL10。应用两种方法验证该推测。首先，检查了来源于上述两个转移性肿瘤的细胞系。如图17A所示，该细胞系和其来源的组织均表达IL10mRNA。
两个细胞系均产生IL10，如72小时培养后的培养上清液的分析所确定(IL10的浓度分别为760pg/ml和10pg/ml)。接着，用原位RT-PCR研究了黑素瘤转移病灶的组织切片中的IL10mRNA表达。如图17B所示，IL10mRNA与黑素瘤细胞有关，而与非肿瘤成分无关。TNF mRNA在黑素瘤转移病灶中的表达-应用原位杂交(Naylor,M.S.等，癌症研究，1990 50:4436-4440)和TNF抗性发现人结肠癌活检样品中的TNF mRNA与体内肿瘤生长相关(Lattime,E.C.和Stutman,O.,免疫学杂志，1989 143:4317-4323)。在6/23黑素瘤样品中检查到TNF mRNA。它与DNP疫苗-诱导的炎症有关4/7 T细胞-浸润的疫苗接种后的活检样品是阳性的，而2/16疫苗接种前的样品或非浸润的疫苗接种后样品是阳性。
将Epstein barr病毒(EBV)加入培养中的B类淋巴母细胞。将B类淋巴母细胞转化至来自患者自身淋巴细胞的B细胞肿瘤。来自转移性病灶的黑素瘤在RPMI1640+10％胎牛血清或10％混合人血清中培养。用RPMI培养基冲洗出未-粘附细胞。当细胞铺满时，用0.1％EDTA使它们分离下来，传代到两个瓶中。该过程持续约10到约30代。为了检测T细胞产生的γ干扰素，从一位患者的血液得到淋巴细胞。将约1,000,000个淋巴细胞与DNP修饰的自身黑素瘤细胞混合，以刺激T细胞。每隔7天，加入100U/ml白介素-2。如前面的描述通过传代扩展T细胞。然后再次用DNP修饰的自身黑素瘤细胞刺激T细胞。产生大量T细胞，它们对DNP修饰的自身黑素瘤细胞有反应。通过T细胞产生的γ干扰素的量确定刺激作用。通常认为产生的γ干扰素大于15pg/ml。然后用这些T细胞检验肽。
从4种细胞中提取小肽，这些细胞均从一个患者中得到1)B类淋巴母细胞，2)二硝基苯基(DNP)修饰的B类淋巴母细胞，3)培养的黑素瘤细胞，4)DNP修饰的培养的黑素瘤细胞。将细胞悬浮于0.1％三氟乙酸，dounced，超声，然后在100,000xg离心90分钟。通过Centricon10滤器将上清液中分子量＞10,000的物质除去。将留下的物质在反相HPLC柱上分离。收集各级分，干燥，重悬浮于培养基，然后加入结合和呈递肽的自身B类淋巴母细胞。检验这些肽脉冲标记的B细胞刺激针对经DNP-修饰的自身黑素瘤细胞特异性致敏的T淋巴细胞系的能力。
前50个HPLC级分(每个样品10μ1)混合成5组，每组十个级分。如图13所示，仅来源于DNP修饰的黑素瘤细胞(DNP-MEL)或经DNP-修饰的B细胞(DNP-LY)的肽具有刺激性，仅#2汇合物为阳性。
通过对#2汇合物中各级分进行T细胞刺激实验，分析#2汇合物的各单独级分；仅#17和#18级分发现有活性，DNP-MEL肽刺激产生的γ干扰素是DNP-LY的二倍多。
这些结果表明低分子量肽产品的单一HPLC级分含有一种或多种刺激针对经DNP修饰的黑素瘤细胞致敏的T细胞的肽。
本实验与实施例8描述的实验相同，除了一点例外。在将肽加入B类淋巴母细胞后，和在加入反应的T细胞之前，将向不同样品中加入不同浓度(1-100μl/ml)的抗-DNP抗体。抗-DNP抗体可以从ATCC，杂交瘤#CRL-1968，或类似抗体得到。如果刺激是由DNP修饰的肽导致，那么该抗体将抑制它。期望级份17和18将被该抗体抑制。
本实验与实施例8描述的实验相同，除了一个例外。在将反应T细胞加入肽脉冲标记的B类淋巴母细胞之前，将反应T细胞分成亚组。这将通过将T细胞与用抗-CD4或抗-CD8抗体(从Immunotech,Inc.,Westbrook,Maine作为商品得到)包被的磁性小珠混合实现。然后用磁铁取出小珠和与它们结合的细胞。未-结合细胞在组织培养液(RPMI+10％混合人血清)中漂洗，计数，然后加入微滴板的孔中用于测定刺激作用。
按照Heike等，免疫治疗杂志(J.Immunotherapy)1994 15:165-174(其全文列入本文作为参考)的方法，从来自一位患者的培养的黑素瘤细胞制备细胞膜。按照Miller和Claman,免疫学杂志1976 117:1519-1526(其全文列入本文作为参考)的方法，使黑素瘤细胞缀合于二硝基苯基(DNP)。将该细胞悬浮于5体积含1mM苯基甲基磺酰基氟化物的30mM碳酸氢钠缓冲液，然后用玻璃匀浆器匀浆。残存的完整细胞和核通过1000g离心除去。然后通过100,000g离心90分钟使细胞膜沉淀。将细胞膜重悬浮于8％蔗糖中，在-80℃冷冻直到使用。同样制备黑素瘤细胞，用于结合二硝基苯。
检验这些DNP修饰的黑素瘤细胞膜刺激已针对DNP修饰的完整黑素瘤致敏的自身T淋巴细胞的能力。通过将约100,000个T淋巴细胞/孔与相当于约10,000-约100,000个细胞的DNP修饰的细胞膜/孔共同保温，然后检测产生的γ干扰素(大于15pg)实现该检验。将T淋巴细胞与经DNP修饰的黑素瘤细胞共同保温重复该过程。结果表明完整黑素瘤细胞和来自它们的细胞膜对刺激T细胞同样有效。
已经重复若干次的本实验(应用相同的患者样品)均具有相似结果，表明在诱导T细胞反应方面，经DNP修饰的黑素瘤细胞膜能够替代经DNP修饰的完整黑素瘤细胞。实施例12实施例12将确定附加自身单核细胞或树突状细胞是否增强T细胞对肿瘤细胞膜的反应。
自身单核细胞将如下分离。按照Boyum,A.,斯堪地那维亚临床实验室研究杂志(Scand.J.Clin.Lab.Invest),21,1968 Suppl.97:77-89(其全文列入本文作为参考)的方法，通过梯度离心从外周血中分离外周血淋巴细胞。将它们悬浮于组织培养基(RPMI-1640+10％混合人血清)，然后加入塑料微滴板的孔中保持2小时，以使单核细胞粘附。然后用培养基冲洗掉未粘附细胞。加入各种浓度的GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，从Immunex,Seattle,WA作为商品得到)，用来刺激单核细胞的生长。约2-3周后，单核细胞，现在认为是巨噬细胞，将被用0.1％EDTA从塑料微滴板的孔中转移出来，以分级数目(约100到约10,000/孔)加入新的微滴板的孔中。将分级数目的从DNP修饰的自身肿瘤细胞制备的细胞膜(定量为细胞数当量)加入粘附的巨噬细胞单层。约6到约24小时后，将DNP特定自身T细胞加入其中，再保温24小时。然后收集上清液，检验细胞因子的产生，例如但不限于γ干扰素、IL2、肿瘤坏死因子；或者检验T细胞的增殖或刺激，例如被胸腺嘧啶脱氧核苷，或用染料例如MTT。例如，将125IUDR加入其中，在一种自动收获装置上收集细胞，检验T细胞增殖。对照由未刺激的T细胞和用无巨噬细胞的细胞膜刺激的T细胞组成。以同样方式检验自身树突状细胞增强对细胞膜反应的能力。按照O’Doherty,U.等，实验医学杂志，1993 178:10678-1078(其全文列入本文作为参考)的方法，从外周血单核细胞中分离树突状细胞，然后在组织培养基中生长。
本研究的对象将是接受重复剂量的DNP修饰的黑素瘤疫苗的患者。将如上述从自身DNP修饰的黑素瘤细胞中制备细胞膜。将分级数目的细胞膜(相当于约100到约10,000个细胞)在PBS中清洗，重悬浮于PBS，然后注射到上臂真皮内。约48小时后，通过测定皮肤硬化区的直径确定DTH。对照由未结合的自身黑素瘤细胞膜和从自身血液淋巴细胞制备的细胞膜构成。
本方法将类似于实施例12描述的方法，除了由与DNP缀合的同种异体黑素瘤细胞制备刺激细胞膜。该推测为来自患者A的巨噬细胞或树突状细胞能够在体外加工从患者B的黑素瘤细胞制备的细胞膜。其导致对患者A的T细胞的刺激。该实验可能产生一种同种异体免疫的方法。从单一同种异体黑素瘤细胞系，或同种异体细胞系的汇合物制备的DNP修饰的细胞膜将在体外被患者的巨噬细胞加工或被树突状细胞加工。这些细胞将被用于免疫接种。
令人惊奇的是，与更强烈的方案B和C相比，剂量-方案A和D诱导显著较高的针对autol-MEL的DTH(p=0.001,Mann-Whiten U检验)。针对autol-MEL产生DTH反应(≥5mm)的患者的百分率如下方案A:45％(总共44位患者中22人产生反应，即20/44)，方案B:11％(3/27)，方案C:18％(4/22)，方案D:59％(16/27)(p＜0.01,x方)。相比较而言，所有四个剂量方案诱导类似的针对PPD的DTH反应。到目前为止的随访表明在诱导针对autol-MEL的DTH方面最有效的两个剂量方案(A和D)比免疫效果较差的两个方案(B和C)形成较长的无疾病复发的生存期，甚至在为适应标准预后症状变量作出调整之后仍然如此。因此，人肿瘤疫苗的给药剂量和方案可能对于诱导具有临床意义的免疫是重要的。
本文中引证或描述的每个专利、专利申请和专利公开文本的公开将其全文插入本文作为参考。
除了本文显示和描述的、其它各种对本发明的修改将对前面描述领域的技术人员是显而易见的。这些修改也将落入所附权利要求的范围内。
任何对图11的引用应认为不存在(见14条第2款)。
序列表(1)一般资料(ⅰ)申请人Berd,David；Eisenlohr,Lawrence；和Lattime,Edmund(ⅱ)发明名称含有肿瘤细胞提取物的组合物和使用该组合物的方法(ⅲ)序列数目10(ⅳ)通讯地址(A)联系人Woodcock Washburn Kurtz Mackiewicz & Norris(B)街道One Liberty Place-46th Floor(C)城市philadelphia(E)国家美国(F)邮政编码19103(ⅴ)计算机可读形式(A)介质类型3.5英寸软盘，容量1.44兆(B)计算机IBM PS/2(C)操作系统PC-DOS(D)软件WORDPERFECT 5.1(ⅵ)目前的申请资料(A)申请号未知(B)申请日1995年6月7日(C)分类号未知(ⅶ)在先申请资料(A)申请号08/203,004(B)申请日1994年2月28日(ⅷ)代理人/代理资料(A)姓名Lori Y.Beardell
(B)登记号34,293(C)资料/文档号T JU-1582(ⅸ)电讯资料(A)电话(215)568-3100(B)电传(215)568-3439(2)SEQ ID NO:1的资料(ⅰ)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型核酸(ⅲ)假设否(ⅳ)反义否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:ATGGATGATG ATATCGCCGC G21(2)SEQ ID NO:2的资料(ⅰ)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型核酸(ⅲ)假设否(ⅳ)反义是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2
CTAGAAGCAT TTGCGGTGGA CGATGGAGGG GCC33(2)SEQ ID NO:3的资料(ⅰ)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型核酸(ⅲ)假设否(ⅳ)反义否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3ATGAAATATA CAAGTTATAT C 21(2)SEQ ID NO:4的资料(ⅰ)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型核酸(ⅲ)假设否(ⅳ)反义是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4TTACTGGGAT GCTCTTCGAC CTCGAAACAG CAT 33(2)SEQ ID NO:5的资料(ⅰ)序列特征(A)长度21个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型核酸(ⅲ)假设否(ⅳ)反义否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5ATGGGTCTCA CCTCCCAACT G 21(2)SEQ ID NO:6的资料(ⅰ)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型核酸(ⅲ)假设否(ⅳ)反义是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6TCAGCTCGAA CACTTTGAAT ATTTCTCTCT CAT 33(2)SEQ ID NO:7的资料(ⅰ)序列特征(A)长度32个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型核酸(ⅲ)假设否(ⅳ)反义否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7AAGCTGAGAA CCAAGACCCA GACATCAAGG CG 32(2)SEQ ID NO:8的资料(ⅰ)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型核酸(ⅲ)假设否(ⅳ)反义是(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8AGCTATCCCA GAGCCCCAGA TCCGATTTTG(2)SEQ ID NO:9的资料(ⅱ)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型核酸(ⅲ)假设否(ⅳ)反义否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9ATGAGCACTG AAAGCATGAT C 21(2)SEQ ID NO:10的资料(ⅰ)序列特征(A)长度23个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型核酸(ⅲ)假设否(ⅳ)反义否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10TCACAGGGCA ATGATCCCAA AGT 2权利要求
1．在患有肿瘤的哺乳动物患者中诱导抗肿瘤反应的方法，所述方法包括给所述患者施用含有治疗有效量的肿瘤细胞或肿瘤细胞提取物的组合物，所述肿瘤细胞或肿瘤细胞提取物(ⅰ)与半抗原缀合；(ⅱ)其肿瘤类型与患者肿瘤的类型相同；(ⅲ)对所述患者而言，不是同种异体的，且(ⅳ)注射后不能在患者体内生长；且以每周为间隔重复给药。
2．权利要求1的方法，其中所述组合物至少给药3次。
3．权利要求1的方法，其中所述组合物至少给药6次。
4．权利要求1的方法，其进一步包括在施用所述组合物之前施用治疗有效量的环磷酰胺。
5．权利要求4的方法，其中仅在第一次施用所述组合物之前施用环磷酰胺。
6．权利要求4的方法，其中所述治疗有效量的环磷酰胺包括施用剂量约为300mg/M2的环磷酰胺。
7．权利要求1的方法，其中所述肿瘤细胞或提取物选自黑素瘤、肺癌、结肠癌、乳腺癌、肾脏癌、前列腺癌、卵巢癌和白血病肿瘤细胞或提取物。
8．权利要求7的方法，其中所述肿瘤细胞或提取物是黑素瘤肿瘤细胞或提取物。
9．权利要求1的方法，其中所述半抗原选自二硝基苯基、三硝基苯基、N-碘代乙酰基-N’-(5-磺酸-1-萘基)乙二胺、三硝基苯磺酸、异硫氰酸荧光素、异硫氰酸砷酸苯、三硝基苯磺酸、对氨基苯磺酸、对氨苯基砷酸、二硝基苯-S-芥及其组合。
10．权利要求9的方法，其中所述半抗原是二硝基苯基。
11．权利要求1的方法，其中所述组合物与佐剂一起施用。
12．权利要求11的方法，其中所述佐剂选自卡介菌，QS-21，脱毒内毒素和细胞因子。
13．权利要求1的方法，进一步包括在施用所述组合物之前用治疗有效量的半抗原致敏患者。
14．权利要求1的方法，其中在施用所述组合物之前未用所述半抗原致敏所述哺乳动物。
15．权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是人。
16．权利要求1的方法，其中每个剂量的所述组合物最多含有约7.5×106个肿瘤细胞或等细胞当量的提取物。
17．权利要求1的方法，其中所述抗肿瘤反应是下列中的至少一个肿瘤坏死、肿瘤消退、肿瘤炎症、肿瘤被激活的T淋巴细胞浸润、稳定的疾病和患者生存期的延长。
18．在患有肿瘤的哺乳动物患者中诱导抗-肿瘤反应的组合物，所述组合物含有治疗有效量的肿瘤细胞或肿瘤细胞提取物，所述肿瘤细胞或肿瘤细胞提取物(ⅰ)与半抗原缀合；(ⅱ)其肿瘤类型与患者肿瘤的类型相同；(ⅲ)对所述患者而言，不是同种异体的，且(ⅳ)注射后不能在患者体内生长；所述治疗有效量的肿瘤细胞或提取物的每个剂量最多含有约7.5×106个肿瘤细胞或等细胞当量的提取物。
19．权利要求18的组合物，其中所述肿瘤细胞或提取物选自黑素瘤、肺癌、结肠癌、乳腺癌、肾脏癌、前列腺癌、卵巢癌和白血病肿瘤细胞或提取物。
20．权利要求18的组合物，其中所述半抗原选自二硝基苯基、三硝基苯基、N-碘代乙酰基-N’-(5-磺酸-1-萘基)乙二胺、三硝基苯磺酸、异硫氰酸荧光素、异硫氰酸砷酸苯、三硝基苯磺酸、对氨基苯磺酸、对氨苯基砷酸、二硝基苯-S-芥及其组合。
21．权利要求20的组合物，其中所述半抗原是二硝基苯基。
22．权利要求18的组合物，其进一步含有佐剂。
23．权利要求22的组合物，其中所述佐剂选自卡介菌，QS-21，脱毒内毒素和细胞因子。
全文摘要
本发明涉及含有经半抗原修饰的肿瘤细胞及其提取物的组合物,以及通过给需要治疗的受试者施用治疗有效量的组合物以治疗癌症的方法,所述组合物含有肿瘤细胞或肿瘤细胞提取物。本发明的肿瘤细胞和提取物及其组合物能引发T淋巴细胞,该T淋巴细胞具有浸润哺乳动物肿瘤的特性;能引发针对哺乳动物肿瘤的炎性免疫应答;引发针对哺乳动物肿瘤的迟发型超敏反应和/或在体外刺激T淋巴细胞。本发明还涉及有效接种方案,该方案可通过诱导下列中的至少一个而用于诱导患有癌症的哺乳动物患者的抗肿瘤反应:肿瘤坏死,肿瘤消退,肿瘤炎症,肿瘤被激活的T淋巴细胞浸润,迟发型超敏反应和患者生存期的延长。
文档编号A61K39/385GK1309569SQ99807512
公开日2001年8月22日 申请日期1999年5月4日 优先权日1998年5月4日
发明者D·伯德 申请人:托马斯杰斐逊大学