专利名称：蛋白质制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及包括人甲状旁腺激素(PTH)的药物制剂，其对于骨相关疾病如骨质疏松症的治疗是有效的。
背景技术：
甲状旁腺激素人甲状旁腺激素为一种84个氨基酸的蛋白，参与钙和磷的体内平衡以及骨生长和骨密度的控制。对甲状旁腺激素的等同的术语为PTH，而较少用parathyrin和parathormone。
通过组织提取、肽合成或从遗传工程改造的酵母、细菌或哺乳动物细胞宿主中可以获得人PTH。基本上纯的人PTH公开于US5,208,041中。PTH在大肠杆菌中的重组制备公开于例如US5,223,407、US5,646,051以及US5,629,205中。重组人PTH在酵母中的制备公布于EP-B-0383751中。合成的人PTH由Bachem Inc.,Bubendorf,瑞士出售。
哺乳动物中，在几种骨影响疾病，例如骨质疏松症中一方面与成骨细胞活性相关的骨形成和另一方面与破骨细胞活性相关的骨丢失之间的平衡被打乱。甲状旁腺激素被表明在骨质疏松症中具有潜在的治疗作用。Dempster,D.W.等在内分泌综述(Endocrine reviews)14卷(6),690-709,1993中综述了甲状旁腺激素对骨的合成代谢作用。
对于很多蛋白，提高蛋白质的浓度使蛋白质特异或非特异凝集和沉淀的倾向增加是很常见的。此类反应可以很快或缓慢进行，因此凝集可能并非总是很明显。另外，高的蛋白浓度可能显示微小但显著的自我催化活性，其增加了蛋白质的降解。无论怎样，凝集和沉淀不仅影响有效蛋白质药物浓度，而且影响制剂的物理和生物制药学特性。根据制药学的观点，这是非常不利的。因此，一个共同的偏见是保持蛋白质的浓度较低。
已知PTH在浓度增加时形成凝集物。克服该问题的一个策略是调整pH至很低或很高的值。然而，这通常刺激蛋白质的化学降解，而且进一步增加给药，如皮下注射过程中的不适。
稀释的制剂需要更大的体积以获得在例如肠道外制剂中的同等剂量。这不仅导致注射器和包装更大，而且导致给药过程中的不适和更高的生产费用。由于此原因，遵从蛋白质制剂应该尽可能地浓缩的原则。此外，非肠道外剂型的研制有利于蛋白质浓度的尽可能高。因此，需要一种制剂，其能够允许蛋白质的高浓度而不发生凝集。
PTH制剂与其他已经成功配制的蛋白不同，PTH对于各种形式的降解非常敏感。例如，氧化可以发生于8号和18号位点的蛋氨酸残基处，产生氧化的PTH品种ox-M(8)-PTH和ox-M(18)-PTH，而脱氨基可以发生于16号位点的天冬酰胺处，产生d16-PTH。通过在N-和C-末端肽键的断裂可以使多肽链截断。此外，PTH还可以被吸收至表面，形成非特异的凝集和/或沉淀，因此降低药物的有效浓度。所有这些降解反应以及这些反应的联合导致PTH生物活性的部分或完全丧失。因此，PTH的制剂必需防止这些降解反应。
WO95/17207(Holthuis等)公开了包括一种如甘露醇的赋形剂和一种如柠檬酸盐来源的非挥发性缓冲剂的PTH制剂，所述的赋形剂与PTH共同冻干形成一种无定形的块。根据该公开内容，以25至250μg/ml的浓度，优选50至150μg/ml的浓度将PTH按所需加入一种水溶液中。
US5,563,122(Endo等)公开了一种包括PTH(1-34)、氯化钠和糖的冻干组合物。将PTH(1-34)的冻干样品在+40℃保存3个月时，发现同时含有氯化钠和糖的制剂比只含有氯化钠或只含有糖的对照制剂更稳定。在这些实验中，每一样品中含有36μgPTH(1-34)与5到10mg糖和0.1到1mg NaCl。
附图简述
图1在不同蛋白质浓度下PTH的稳定性。
图2在不同pH值下PTH的稳定性。
图3在NaCl存在下PTH的稳定性。
发明的公开与已确定的认识相反，我们发现可以将相对高浓度的PTH用于一种可药用的制剂。所述的制剂可以为液体形式，但也可以将其冻干，并在单次或多次给药前复原。该制剂由于注射体积小而降低了在给药过程中的不适，而该制剂还具有降低给药疼痛的pH和缓冲能力。高浓度PTH的应用还提供了研制非胃肠道外剂型的可能性，例如鼻腔、吸入以及口服制剂或者穿皮制剂。高的PTH浓度的可能性还使适于如自我给药的一种安全而经济的多剂量制剂成为可能。
因此，本发明在一个方面提供了一种包括浓度为0.3mg/ml或更高，如0.3到10mg/ml的人甲状旁腺激素(PTH),pH为4到6的可药用缓冲液；以及至少一种渗透压调节剂的药物制剂。
术语“甲状旁腺激素”(PTH)包括天然存在的人PTH，以及合成的或重组的PTH(rPTH)。
此外，术语“甲状旁腺激素”包括全长PTH(1-84)以及PTH片段。因此，可以理解如果需要可以将PTH变体的片段以提供与PTH(1-84)同等生物活性的数量加入到根据本发明的制剂中。PTH的片段至少包括对于与完整PTH生物活性相似所需的PTH氨基酸残基。此类片段的实例为PTH(1-31)、PTH(1-34)、PTH(1-36)、PTH(1-37)、PTH(1-38)、PTH(1-41)、PTH(28-48)和PTH(25-39)。
术语“甲状旁腺激素”还包括PTH的变体和功能类似物。本发明因此包括包含此类PTH变体和功能类似物的药物制剂，所述的变体和功能类似物携带有如置换、缺失、插入、倒位或环化的修饰，但基本上具有甲状旁腺激素的生物学活性。稳定性提高了的PTH变体为本领域已知，如WO92/11286和WO93/20203。PTH变体例如可以包括改善PTH稳定性和半衰期的氨基酸置换，例如8号和/或18号位点上蛋氨酸的取代以及在16号位点处天冬酰胺的取代。环化的PTH类似物公开于如WO98/05683中。
在本说明中，可以将术语“生物学活性”理解为在PTH活性的生物试验如在大鼠骨肉瘤细胞上进行的PTH刺激产生的腺苷酸环化酶的检测中，引发足够的反应(见Rodan等。(1983)临床研究杂志(J.Clin.Invest.)72,1511；以及Rabbani等。(1988)内分泌学(Endocrinol.)123,2709)。
在根据本发明的药物制剂中将使用的PTH优选为重组人PTH，例如全长的重组人PTH。
在本发明的优选形式中，所述的人甲状旁腺激素的浓度可以为0.3-5mg/ml或0.3-3mg/ml；或者超过1mg/ml，例如1-10mg/ml；1-5mg/ml；1-3mg/ml；或1-2mg/ml。
所述的可药用缓冲液可以为例如乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐或者碳酸盐缓冲液。缓冲液优选为浓度5到20mM的柠檬酸盐缓冲液。所述的可药用缓冲液优选具有5到6，最优选5.5左右的pH。
所述的渗透压调节剂可以为例如山梨醇、甘油、蔗糖或者优选为氯化钠和/或甘露醇。
在本发明的一个优选形式中，PTH制剂可以包括1到3mg/ml的甲状旁腺激素、2到5mg/ml的NaCl、20到50mg/ml的甘露醇、5到10mM的pH4到6的柠檬酸盐缓冲液，而且可选含有一种防腐剂，例如苯甲醇或间甲酚。
根据本发明的药物制剂在治疗或预防骨异常，特别是骨质疏松症中是有效的。
本发明在另一方面还提供了一种用于制备上述药物制剂的方法，所述的方法包括使人甲状旁腺激素溶于pH 4到6的可药用缓冲液中，浓度为0.3到10mg/ml，并包含至少一种渗透压调节剂。
本发明另一方面提供浓度为0.3-10mg/ml的甲状旁腺激素在用于治疗或预防骨异常，尤其骨质疏松症的药用制剂的制备中的应用，所述药用制剂还包含一种pH4-6的可药用缓冲液以及至少一种渗透压调节剂。
本发明在另一方面还提供了一种治疗或预防骨相关异常，特别是骨质疏松症的方法，其包括以向需要此类治疗或预防的哺乳动物，包括人施予有效量的上述药用PTH制剂。
实验方法通过已知的方法从大肠杆菌的一个菌株中制备和分泌在制剂研究中所用的全长人PTH(1-84)(见例如US5,223,407、US5,646,015和US5,629,205)。简言之，将质粒pJT42上的人甲状旁腺激素基因同大肠杆菌外膜蛋白A(ompA)的分泌信号DNA相融合。在质粒上还存在一个乳糖抑制子基因(lacIq)。ompA-rhPTH mRNA的翻译和内源性肽酶的进一步加工导致产生成熟的84个氨基酸的人甲状旁腺激素，从细菌培养肉汤中对其进行回收。
重组表达后将PTH纯化成基本上没有污染物的制剂。所述的纯化方法涉及本领域已知的方法(见例如US5,208,041)，包括细胞分离、过滤、超滤、离子交换层析、疏水性相互作用层析、制备性反相HPLC以及再一次的离子交换层析，随后脱盐产生大容量的液体产品。通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)和十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)进行检测，所获的制剂通常纯度为95％或者更高。
通过RP-HPLC在流动相中利用三氟乙酸和乙腈对PTH溶液进行分析以评价PTH的浓度、纯度和氧化的PTH的形成。通过阳离子交换HPLC利用K+梯度测定脱氨基的PTH。利用适当的参比标准确定PTH、ox-M(8)-PTH、ox-M(18)-PTH和d16-PTH的保留时间和量。
在一种方法中温度对速率的效应可以通过术语Q10进行描述Q10=(R2R1)10T2-T1]]>其中R1和R2分别为在温度T1和T2下所观察的速率(cf Chang,R物理化学在生物学系统中的应用。纽约，Macmillan Publishing Co.,Inc.,1977；Schmidt-Nielsen K.动物生理学适应和环境。第三版。剑桥，剑桥大学出版社，1983)。如果Q10=2，那么在温度升高10度时速率便增加一倍；如果Q10=3，那么温度每升高10度速率便增加2倍。已知对于一个温度间隔的活化能相当恒定，大部分的反应和方法具有在2到3之间的Q10。
在白色或黑色背景下通过对药瓶的视觉观察或者通过与一种适当的参比溶液的比较来确定凝集和沉淀。利用在大鼠骨肉瘤细胞(UMR106)上进行的PTH刺激产生腺苷酸环化酶的检测对PTH的生物活性进行检测(Rodan等，临床研究杂志，1983,72:1511；Rabbani等，内分泌学，1988,123:2709)。
实施例1-蛋白质浓度对PTH稳定性的影响在10mM柠檬酸盐缓冲液中配制不同浓度的PTH。在一个系列实验中，将不同制剂的等份试样冻干，并保存于+37℃到+40℃之间。在另一个系列中，将等份试样以液体的形式保存于+4℃。在不同的时间点(至少3个)，通过rp-HPLC测定PTH的纯度。将结果表示为面积％。然后通过将在0时间点的PTH纯度设为100％，对代表不同PTH浓度的每个时间系列的数据进行标准化，以便可以在系列之间进行比较。将PTH损失率表示为每月的百分率，利用公式b=nΣxy-(Σx)(Σy)nΣx2-(Σx)2,]]>由％PTH对时间的线性回归曲线的斜率对其进行计算。其中，x对应于时间(月)，而y对应于从启始保持的％PTH纯度。
如在图1以及表Ⅰ和Ⅱ中所示，当PTH的浓度增加时，对于冻干(表Ⅰ)和液体(表Ⅱ)制剂，PTH的稳定性均显著增加。对于冻干和液体制剂，稳定性都是在PTH浓度超过0.3mg/ml时较高。
实施例2-pH稳定性制备了由PTH(0.2mg/ml)、pH分别为4、4.5、5、5.5、6和6.5的柠檬酸钠/柠檬酸(10mM)以及甘露醇(50mg/ml)所组成的6种不同的制剂。将等份试样(1ml)在氮气下封于2ml的玻璃药瓶中，并通过RP-HPLC分析PTH的纯度。
结果示于表Ⅲ和图2中。于对大多数反应所预期的一样，在较高的温度下降解加速。该温度效应的粗略计算显示在所有测试的pH值下，从+4℃至+25℃的温度间隔内Q10≈2，而从+25℃至+37℃的温度间隔内Q10≈3。该范围的Q10值与其他生物化学反应是一致的，而且证明对于加速的降解研究利用较高的温度是合理的。结果表明pH从4.5到5.5的制剂在PTH稳定性方面是有优势的。所有的制剂在储存后表现为一种无色的透明溶液。此外，这些制剂在4到6的pH下于+4℃是稳定的。
实施例3-离子强度对PTH稳定性的影响制备了由PTH(0.2mg/ml)、pH6的柠檬酸钠/柠檬酸(10mM)以及甘露醇(50mg/ml)所组成的制剂。加入NaCl至图3中所示的终浓度。加了NaCl的制剂除了具有增加的离子强度外，相对于血浆是高渗的。将等份试样(1ml)在氮气下封于2ml的玻璃药瓶中，并通过RP-HPLC分析PTH的纯度。
示于图3中的结果表明，在较高的温度下，离子强度的增加使稳定性略微升高。然而，在+4℃，制剂在PTH稳定性方面未受离子强度增加的影响。所有的制剂在储存后都表现为一种无色的透明溶液。
实施例4-渗透压调节剂对PTH稳定性的影响在渗透压调节剂(5％甘露醇或0.9％NaCl)存在下制备了包含PTH(0.2mg/ml)和pH为5.5的柠檬酸钠/柠檬酸(10mM)的制剂。将等份试样(0.7ml)在氮气下封于3ml的玻璃药瓶中。在指定温度下储存后，打破药瓶，并分析PTH制剂的纯度、氧化PTH(ox-M(8)-PTH和ox-M(18)-PTH)、脱氨基PTH(d16-PTH)，并利用腺苷酸环化酶检测分析生物活性。
示于表Ⅳ中的结果显示降解并未受到渗透压调节剂的影响。在所有研究温度下PTH的生物活性均保留。所有的制剂在储存后都表现为一种无色的透明溶液。在+4℃下放置18个月后，氧化的和脱氨基的PTH的形成以及PTH浓度的降低可忽略不计。
实施例5-氧化应激对预装填的注射器中PTH的影响制备了包括PTH(0.25mg/ml)、pH为5.5的柠檬酸钠/柠檬酸(10mM)以及NaCl(9mg/ml)的制剂。将0.4ml的等份试样装入配有带套针头的注射器中，并安装上橡胶活塞使其与溶液相接触。如在表Ⅴ中所示，将注射器保存于环境大气中或者保存于保护性氮气中。分析注射器的内容物中PTH的纯度、氧化和脱氨基。
示于表Ⅴ中的结果表明，空气的存在一点也不影响氧化、脱氨基，或者PTH的纯度。此外，PTH制剂于+4℃在产品容器中是稳定的。
实施例6-防腐剂对PTH稳定性的影响(a)制备了包含PTH(1.3mg/ml)、pH为5.51的柠檬酸钠/柠檬酸(10mM)以及甘露醇(50mg/ml)的制剂。部分制剂额外含有防腐剂(3mg/ml间甲酚或1mg/ml EDTA)。
将制剂的等份试样(0.5ml)在氮气下封于3ml的玻璃药瓶中，并储存于冰箱中(+2℃至+8℃)或者室温下(+20℃至+25℃)。两周后，通过RP-HPLC检测制剂的PTH纯度以及PTH的氧化形式。
示于表Ⅵ中的结果表明，制剂未受间甲酚或EDTA的影响。
(b)制备了由PTH(0.8mg/ml)、pH为5.5的柠檬酸钠/柠檬酸(10mM)以及NaCl(9mg/ml)所组成的制剂。向部分制剂中加入防腐剂间甲酚或苯甲醇至终浓度分别为3mg/ml或10mg/ml。
将0.5ml的等份试样在氮气下封于3ml的玻璃药瓶中，并倒置储存，使得液体可以与橡胶塞子相接触。在+4℃储存后，对制剂中的PTH、氧化的PTH和脱氨基的PTH进行检测。
结果示于表Ⅶ中。在间甲酚存在下PTH的稳定性与对照的稳定性相当。在苯甲醇的存在下，PTH的稳定性降低，主要可归因于PTH的M8和M18氧化形式的形成。储存后PTH的浓度并未受到防腐剂存在的影响(数据未示)。以前的实验已表明PTH的生物活性并未受到这些防腐剂存在的影响。此外，按照在美国药典和欧洲药典中所述的方法，在攻击后这些防腐剂提供了一种满意的抗微生物生长的保护作用(数据未示)。在所测试的制剂中，在有效的防腐剂存在下PTH是稳定的，因此使得在多剂量产品中可以使用该制剂。
表Ⅰ在冻干制剂中PTH的稳定性
n.d.=未确定表Ⅱ在液体制剂中PTH的稳定性
n.d.=未确定表Ⅲ在不同pH值下的PTH稳定性
n.d.=未确定表Ⅳ在渗透压调节剂存在下PTH的稳定性
n.d.未检测；M8=ox-M(8)-PTH；M18=ox-M(18)-PTH
表Ⅴ在空气存在下PTH的稳定性
＜d.l.=低于检测水平；n.d.=未确定；M8=ox-M(8)-PTHM18=ox-M(18)-PTH表Ⅵ在防腐剂存在下PTH的稳定性
Refr.=冰箱；RT=室温；M8=ox-M(8)-PTH；M18=ox-M(18)-PTH
表Ⅶ在防腐剂存在下PTH的稳定性
＜d.l.=低于检测水平；M8=ox-M(18)-PTH；M8=ox-M(18)-PTH
权利要求
1．一种药物制剂，其包括浓度为0.3mg/ml或其以上到10mg/ml的人甲状旁腺激素；pH从4到6的可药用缓冲液以及至少一种渗透压调节剂。
2．根据权利要求1的制剂，其中所述人甲状旁腺激素为人重组甲状旁腺激素。
3．根据权利要求1到2的制剂，其中所述人甲状旁腺激素为全长甲状旁腺激素。
4．根据权利要求1到3中任何一个的制剂，其中所述人甲状旁腺激素的浓度为从0.3mg/ml到5mg/ml。
5．根据权利要求4的制剂，其中所述人甲状旁腺激素的浓度为从1mg/ml到3mg/ml。
6．根据权利要求1到5中任何一个的制剂，其中所述可药用缓冲液为浓度从5到20mM的柠檬酸盐缓冲液。
7．根据权利要求1到6中任何一个的制剂，其中所述可药用缓冲液的pH在5到6之间。
8．根据权利要求1到7中任何一个的制剂，其中所述渗透压调节剂为氯化钠和/或甘露醇。
9．根据权利要求1到8中任何一个的制剂，其含有1到3mg/ml的甲状旁腺激素、2到5mg/ml的NaCl、20到50mg/ml的甘露醇、5到10mM的pH在4到6之间的柠檬酸盐缓冲液，并选择性地含有防腐剂。
10．液体形式的根据权利要求1到9中任何一个的制剂。
11．冻干形式的根据权利要求1到9中任何一个的制剂。
12．用于制备根据权利要求1到11中任何一个的药物制剂的方法，其包括在pH为4到6之间的可药用缓冲液中，溶解人甲状旁腺激素至浓度为0.3到10mg/ml并包含至少一种渗透压调节剂。
13．根据权利要求1到11中任何一个的药物制剂，其用于骨异常的治疗或预防。
14．根据权利要求1到11中任何一个的药物制剂，其用于骨质疏松症的治疗或预防。
15．在制造用于治疗或预防骨异常的药物制剂中，浓度为0.3到10mg/ml的甲状旁腺激素的应用，其中所述药物制剂额外包括pH在4到6之间的可药用缓冲液以及至少一种渗透压调节剂。
16．根据权利要求15的用途在骨质疏松症治疗或预防中的应用。
17．用于治疗或预防骨相关异常的方法，其包括对需要此类治疗或预防的哺乳动物包括人给予有效量的根据权利要求1到11中任何一个的制剂。
18．根据权利要求17的方法在骨质疏松症的治疗或预防中的应用。
全文摘要
本发明涉及包括浓度在0.3至10mg/ml之间的人甲状旁腺激素、一种pH在4到6之间的可药用缓冲液以及至少一种渗透压调节剂的药物制剂。所述的药物制剂对于骨相关疾病例如骨质疏松症的治疗是有效的。
文档编号A61K47/02GK1319003SQ99807362
公开日2001年10月24日 申请日期1999年4月26日 优先权日1998年4月28日
发明者马丁·比尔格, 迈克尔·布鲁尔斯 申请人:Nps阿尔利克斯公司