鉴定抗原基因序列的方法

专利名称：鉴定抗原基因序列的方法
技术领域：
本发明涉及鉴定潜在疫苗抗原的基因序列的方法。本发明还包括基因序列和基因序列编码的多肽，以及这些序列在动物体内诱导保护性免疫应答的用途。具体而言，本发明涉及支原体，特别是猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)的潜在抗原基因序列的鉴定。
序言针对病原体的疫苗的成功之处在于鉴定宿主免疫系统易于接受的合适病原体抗原。一旦完成鉴定，就形成了针对病原体的防护的基础。
最近几年，大量的疫苗已经可以由Animal Health公司购买。许多疫苗以灭活的全细胞菌苗为基础。虽然这些疫苗提供了合理水平的功效，但是仍然非常需要改进。因此当前可获得的疫苗可以通过发展不以全细胞或全细胞级分为基础的疫苗得到改进。
产生针对病原体的疫苗的其他方法包括使用各种蛋白质的粗制灭活抗原混合物。然而这些方法的问题在于，虽然它们向宿主呈递多种抗原，但是没有哪一种可以提供合适的全面防护，原因在于宿主免疫系统最易于接受的蛋白质淹没于其它抗原中。此外，由于某些病原体对培养条件的要求苛刻，培养这些病原体是困难的且昂贵的。某些病原体还可能对操作人员有害。因此，不需要培养细胞或细菌生长和加工全细胞或全细胞级分的疫苗将提供更安全、更便宜、且可能更有效的疫苗。
实现更清洁且更特异的疫苗的一种方法是使用重组保护性抗原。通过提供特异抗原，只有那些宿主免疫系统易于接受的抗原可以使用。
这种方法存在鉴定潜在抗原的问题。一种方法是建立基因文库。然而，由文库确定那些可能包含潜在保护性抗原的序列很费时间。
为了对大量的潜在抗原基因高效筛选其提供一定水平疾病防护的功效，首先将它们克隆成表达克隆。在这种方法中，避免了对沉闷且费时的克隆分析和随后的表达亚克隆的需要。加快了发现抗原的整个过程。本申请人现在提供了确保最初调查的克隆表达重组蛋白质的新方法。
先前已经使用对感兴趣蛋白质特异或加富的抗体来对表达文库筛选表达完整或部分特异蛋白质的克隆。
编码蛋白质的DNA序列的鉴定，还使得使用适当表达载体形成重组DNA分子并用那些重组DNA分子转化适当宿主(如原核或真核宿主)成为可能。然后培养经转化宿主，使得宿主能够表达DNA序列并产生期望蛋白质。
以足以引发保护性免疫应答的量施用(如通过注射)产生且随后分离的蛋白质、活性成分或其组合，提供了针对感染的一种免疫方法。已经可以由Animal Health公司购买其疫苗的一种病原体是猪肺炎支原体。此病原体在猪中引起地方性动物肺炎。它很少引起死亡，但是常常导致严重的发病率和降低的生长特性，表现为饲料转变效率显著降低，导致猪体重增加下降。动物出现咳嗽和发烧症状，而且常常有通过机会性微生物而继发感染的倾向。
以提供针对猪肺炎支原体的疫苗为目的的大量尝试还没有取得太大的成功。具体而言，已经证明使用热灭活的或存活的支原体或其提取物在提供防护方面是无效的。以灭活的全细胞菌苗为基础的某些疫苗展示一定水平的功效，但是仍然需要改进。
另外，由于猪肺炎支原体对培养条件的要求苛刻，培养猪肺炎支原体是困难的且昂贵的。因此当前可获得的疫苗可以通过发展不以全细胞或全细胞级分为基础的疫苗得到改进。
相应的，本发明的目的之一是克服或至少减轻先前技术的某些问题。
发明概述在本发明的一个方面，提供了鉴定由表达载体中核苷酸序列翻译得到的表达蛋白质的方法，该方法包括与由核苷酸序列翻译得到的蛋白质共表达的标记物的使用。
在本发明的优选实施方案中，提供了将聚His标签用于鉴定由表达载体中核苷酸序列编码的表达蛋白质的用途，其中所述聚His标签与所述蛋白质共表达。
在本发明的另一个方法，提供了由核苷酸序列混合物鉴定由核苷酸序列编码的表达蛋白质的方法，该方法包括下列步骤提供包含标记物的表达载体；将来自混合物的核苷酸序列导入表达载体；并通过测定包含与表达蛋白质共表达的标记物之融合蛋白质的存在，来鉴定由表达载体表达的表达蛋白质。
在一个优选的实施方案中，标记物是聚His标签。
在另一个优选的实施方案中，用表达载体转染用于表达包含表达蛋白质的标记物-融合蛋白质之宿主细胞。优选的标记物融合蛋白质是包含聚His标签和表达蛋白质的聚His标签-融合蛋白质。将表达载体集合导入宿主细胞可以构建基因组或cDNA文库(可以对其进行筛选)。
在另一个优选的实施方案中，所述方法包括使用在融合蛋白质中表达的标记物来纯化表达蛋白质的步骤。优选的标记物是聚His标签。
在另一个方面，提供了由上述方法鉴定的纯化重组蛋白质。优选的重组蛋白质是表达蛋白质。
在另一个方面，提供了编码由上述方法鉴定的重组蛋白质的纯化核苷酸序列。
在本发明的另一个方面，提供了包含标记物，优选用于鉴定由核苷酸序列编码的表达蛋白质的聚His标签的表达载体。
在本发明的还有一个方面，提供了包含表达载体的宿主细胞，该载体包含标记物，优选用于鉴定表达蛋白质的聚His标签。
在本发明的另一个方面，提供了由核苷酸序列样品鉴定编码抗原蛋白质的基因序列的方法，该方法包括下列步骤提供包含标记物的表达载体；将来自样品的核苷酸序列导入表达载体；通过测定融合蛋白质的存在，来鉴定由表达载体表达的蛋白质的表达，所述融合蛋白包含与由核苷酸序列翻译得到的表达蛋白质共表达的标记物；并鉴定抗原性表达蛋白质。
优选的标记物是聚His标签。
在优选的实施方案中，所述方法进一步包括测定由表达载体编码的抗原蛋白质的基因序列。
在本发明的另一个方面，提供了一种筛选核苷酸序列文库的方法，该方法包括下列步骤提供核苷酸序列来源；提供包含标记物的表达载体；通过将核苷酸序列导入表达载体来构建文库；通过测定融合蛋白质的存在，来鉴定由表达载体表达的表达蛋白质，所述融合蛋白质包含与由核苷酸序列翻译得到的表达蛋白质共表达的标记物；并测定表达蛋白质的核苷酸序列。
优选的标记物是聚His标签。
在另一个方面，提供了一种筛选以鉴定表达文库中表达克隆的方法，该方法包括下列步骤提供核苷酸来源；提供包含标记物的表达载体；将核苷酸序列导入表达载体；用表达载体转化宿主以构建表达文库；并通过检测融合蛋白质的表达来找出表达克隆，所述融合蛋白质包含与表达蛋白质共表达的标记物(优选聚His标签)。
在本发明的另一个方面，提供了从核苷酸样品中鉴定编码疾病治疗性抗原蛋白质的治疗性抗原基因序列的方法，该方法包括下列步骤提供包含标记物的表达载体；将来自样品的核苷酸序列导入表达载体；通过测定融合蛋白质的存在，来鉴定由表达载体表达的抗原表达蛋白质，所述融合蛋白质包含与由核苷酸序列翻译得到的表达蛋白质共表达的标记物；用表达抗原性表达蛋白质的表达载体接种动物；用疾病攻击动物；鉴定可提供由接种疫苗诱导的治疗性效果的表达载体和表达蛋白质；并测定由表达载体编码的抗原的表达蛋白质的基因序列。
优选的标记物是聚His标签。
在本发明的另一个优选实施方案中，提供了对核苷酸序列文库筛选编码支原体(优选猪肺炎支原体)多肽的核苷酸序列的方法，该方法包括下列步骤由支原体样品提供核苷酸序列来源；提供包含标记物的表达载体；将核苷酸序列导入表达载体；通过测定融合蛋白质的存在，来鉴定由表达载体表达的支原体表达蛋白质，其中所述融合蛋白质包含与由核苷酸序列翻译得到的表达蛋白质共表达的标记物(优选聚His标签)；并测定支原体(优选猪肺炎支原体)表达蛋白质的核苷酸序列。
优选的标记物是聚His标签。
在优选的实施方案中，基因序列编码支原体，优选猪肺炎支原体的抗原多肽。
在本发明的还有一个方面，提供了编码支原体(优选猪肺炎支原体)多肽的核苷酸序列，或其突变体、类似物、衍生物、或其功能活性片段，该核苷酸序列由上述方法鉴定。优选的核苷酸序列包含依照

图1-42任一项的序列，或其突变体、类似物、衍生物、或其功能活性片段。更具体的说，核苷酸序列依照SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQID NO23、SEQ ID NO25、SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ ID NO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37、SEQ ID NO39、SEQ ID NO41、SEQ ID NO43、SEQ ID NO45、SEQ ID NO47、SEQ ID NO49、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55、SEQ ID NO57、SEQ ID NO59、SEQ ID NO61、SEQ ID NO63、SEQ ID NO65、SEQ ID NO67、SEQ ID NO69、SEQ ID NO71、SEQ ID NO73、SEQ ID NO75、SEQ ID NO77、SEQ ID NO79、SEQ ID NO81、SEQ ID NO83，或其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段的序列的序列。
在本发明的还有一个方面，提供了由编码支原体(优选猪肺炎支原体)多肽的核苷酸序列，或其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段编码的多肽，该核苷酸序列由上述方法鉴定。优选的多肽由依照图1-42任一项的序列，或其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段编码的核苷酸序列编码。更具体的说，多肽具有依照SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36、SEQ ID NO38、SEQ ID NO40、SEQ ID NO42、SEQ ID NO44、SEQ ID NO46、SEQ ID NO48、SEQ ID NO50、SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQ ID NO56、SEQ ID NO58、SEQ ID NO60、SEQ ID NO62、SEQ ID NO64、SEQ ID NO66、SEQ ID NO68、SEQ ID NO70、SEQ ID NO72、SEQ ID NO74、SEQ ID NO76、SEQ ID NO78、SEQ ID NO80、SEQ ID NO82、SEQ ID NO84的氨基酸序列，或其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段。
在本发明的另一个方面，包括了包含上述多肽或核苷酸序列的组合物。此外，在另一个方面，包括了上述多肽或核苷酸序列的药用组合物和疫苗组合物。
本发明的其它方面包括针对多肽产生的单克隆抗体。
本发明的另一个方面还包括治疗支原体感染的方法，该方法包括施用有效量的由核苷酸序列编码的支原体抗原多肽或编码由上述方法鉴定的多肽的核苷酸序列。优选的抗原多肽由依照图1-42任一项的核苷酸序列，或其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段编码。更具体的说，核苷酸序列依照SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ IDNO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ IDNO23、SEQ ID NO25、SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ IDNO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37、SEQ IDNO39、SEQ ID NO41、SEQ ID NO43、SEQ ID NO45、SEQ IDNO47、SEQ ID NO49、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ IDNO55、SEQ ID NO57、SEQ ID NO59、SEQ ID NO61、SEQ IDNO63、SEQ ID NO65、SEQ ID NO67、SEQ ID NO69、SEQ IDNO71、SEQ ID NO73、SEQ ID NO75、SEQ ID NO77、SEQ IDNO79、SEQ ID NO81、SEQ ID NO83的序列，或其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段。
贯穿此说明书的描述和权利要求，术语“包含”及其变化，诸如“包括”，并非意欲排除其它添加剂、成分、组分、或步骤。
附图简述图1显示克隆pAD612所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO1)和氨基酸(SEQ ID NO2)序列。
图2显示克隆pAD633所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO3)和氨基酸(SEQ ID NO4)序列。
图3显示克隆pAD639所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO5)和氨基酸(SEQ ID NO6)序列。
图4显示克隆pAD640所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO7)和氨基酸(SEQ ID NO8)序列。
图5显示克隆pAD641和pAD1033所述的支原体的核苷酸(SEQ IDNO9)和氨基酸(SEQ ID NO10)序列。
图6显示克隆pAD653所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO11)和氨基酸(SEQ ID NO12)序列。
图7显示克隆pAD657和pAD964所述的支原体的核苷酸(SEQ IDNO13)和氨基酸(SEQ ID NO14)序列。
图8显示克隆pAD659和pAD910所述的支原体的核苷酸(SEQ IDNO15)和氨基酸(SEQ ID NO16)序列。
图9显示克隆pAD662所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO17)和氨基酸(SEQ ID NO18)序列。
图10显示克隆pAD681所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO19)和氨基酸(SEQ ID NO20)序列。
图11显示克隆pAD700所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO21)和氨基酸(SEQ ID NO22)序列。
图12显示克隆pAD711所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO23)和氨基酸(SEQ ID NO24)序列。
图13显示克隆pAD721所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO25)和氨基酸(SEQ ID NO26)序列。
图14显示克隆pAD727所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO27)和氨基酸(SEQ ID NO28)序列。
图15显示克隆pAD742所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO29)和氨基酸(SEQ ID NO30)序列。
图16显示克隆pAD760所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO31)和氨基酸(SEQ ID NO32)序列。
图17显示克隆pAD774所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO33)和氨基酸(SEQ ID NO34)序列。
图18显示克隆pAD784所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO35)和氨基酸(SEQ ID NO36)序列。
图19显示克隆pAD789所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO37)和氨基酸(SEQ ID NO38)序列。
图20显示克隆pAD908、pAD981、pAD1013、和pAD1049所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO39)和氨基酸(SEQ ID NO40)序列。
图21显示克隆pAD913所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO41)和氨基酸(SEQ ID NO42)序列。
图22显示克隆pAD920所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO43)和氨基酸(SEQ ID NO44)序列。
图23显示克隆pAD922所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO45)和氨基酸(SEQ ID NO46)序列。
图24显示克隆pAD923和pAD925所述的支原体的核苷酸(SEQ IDNO47)和氨基酸(SEQ ID NO48)序列。
图25显示克隆pAD950所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO49)和氨基酸(SEQ ID NO50)序列。
图26显示克隆pAD951所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO51)和氨基酸(SEQ ID NO52)序列。
图27显示克隆pAD977所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO53)和氨基酸(SEQ ID NO54)序列。
图28显示克隆pAD983所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO55)和氨基酸(SEQ ID NO56)序列。
图29显示克隆pAD984所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO57)和氨基酸(SEQ ID NO58)序列。
图30显示克隆pAD994所述的支原体序列30的核苷酸(SEQ ID NO59)和氨基酸(SEQ ID NO60)序列。
图31显示克隆pAD1005所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO61)和氨基酸(SEQ ID NO62)序列。
图32显示克隆pAD1016所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO63)和氨基酸(SEQ ID NO64)序列。
图33显示克隆pAD1020所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO65)和氨基酸(SEQ ID NO66)序列。
图34显示克隆pAD1027所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO67)和氨基酸(SEQ ID NO68)序列。
图35显示克隆pAD1037所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO69)和氨基酸(SEQ ID NO70)序列。
图36显示克隆pAD1038所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO71)和氨基酸(SEQ ID NO72)序列。
图37显示克隆pAD1040所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO73)和氨基酸(SEQ ID NO74)序列。
图38显示克隆pAD702所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO75)和氨基酸(SEQ ID NO76)序列。
图39显示克隆pAD763所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO77)和氨基酸(SEQ ID NO78)序列。
图40显示克隆pAD766所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO79)和氨基酸(SEQ ID NO80)序列。
图41显示克隆pAD957所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO81)和氨基酸(SEQ ID NO82)序列。
图42显示克隆pAD996所述的支原体的核苷酸(SEQ ID NO83)和氨基酸(SEQ ID NO84)序列。
发明详述在本发明的一个方面，提供了一种鉴定由表达载体中核苷酸序列翻译得到的表达蛋白质的方法，该方法包括与由核苷酸序列翻译得到的蛋白质共表达的标记物的使用。
在优选的实施方案中，标记物是可以检测的任何标记物。检测可以通过单克隆抗体或特异性多克隆抗血清进行。标记物优选小的，优选少于30个氨基酸。最优选的标记物是聚His标签。但是标签还可以是下列任一项，诸如(a)可以由Sigma-Aldrich公司(美国)的质粒载体获得的8个氨基酸的FLAG标签，(b)可以由Amrad有限公司(澳大利亚)的载体获得的6个氨基酸的I-SPY表位标签，(c)9个氨基酸的血凝素表位标签(Clontech Laboratories公司，美国)，和(d)12个氨基酸的c-Myc表位标签(Clontech Laboratories公司，美国)。
当标记物是聚His标签时，组氨酸残基的数目优选4-8个组氨酸残基，最优选6个组氨酸残基。假设总共有至少10个氨基酸，且有至少4-8个连续组氨酸残基，则至少4个氨基酸位于聚His标签之前。
为了对大量的潜在抗原基因高效筛选其提供一定水平疾病防护的功效，首先将它们克隆成表达克隆。在这种方法中，避免了对费力且费时的克隆分析和随后的表达亚克隆的需要。加快了发现抗原的整个过程。本申请人现在提供了确保最初调查的克隆表达重组蛋白质的新方法。
当处理基因文库时，情况尤其如此。在任何随机文库中，多数克隆的取向对于表达是不正确的，而且处于表达蛋白质的错误读码框中。在表达载体中使用标记物(优选聚His标签)使得能够有效鉴定表达标记物(优选聚His标签融合蛋白质)的表达克隆。
在不产生重组标记物-融合蛋白质或优选聚His融合蛋白质或仅仅一小段重组蛋白质的克隆中，编码的小标记物或聚His蛋白质在宿主细胞中迅速降解，残余的任何标记物或聚His蛋白质非常微弱的结合在用于菌落筛选的膜上。非生产性克隆由此在筛选中给出阴性结果，而产生含较大标签的重组蛋白质的克隆能够给出阳性信号。由此可以显著降低一般性基因组表达文库的复杂性，并因此能够更快且更有效的筛选并随后利用期望的克隆。
这些表达蛋白质的克隆被认为是潜在的保护性抗原，而且由于用于构建和筛选克隆的策略，最初分离的克隆可以直接用于疫苗，形式可以是用于遗传免疫接种的纯化质粒DNA或纯化标记物-融合重组蛋白质，优选聚His纯化重组融合蛋白质。
当标记物是聚His标签区时，它可以由包含该区的任一来源衍生得到。例如，可以使用编码聚His标签的载体pQE30、pQE31、和pQE32(QiagenPty.公司，澳大利亚)区段。聚His标签的其它来源可以由Novagen公司(美国，pET-1.9-22)获得，或者人工合成聚His标签。
在本发明的另一个方面，提供了由核苷酸序列混合物鉴定由核苷酸序列翻译得到的表达蛋白质的方法，该方法包括下列步骤提供包含标记物的表达载体；将来自混合物的核苷酸序列导入表达载体；并通过测定包含与表达蛋白质共表达的标记物的融合蛋白质的表达，来鉴定由表达载体表达的表达蛋白质。
优选的标签是聚His标签。下列特定实施例涉及聚His标签标记物和聚His标签融合蛋白质。然而，可以使用可被检测并在表达克隆中与蛋白质共表达的任何标记物。相应的，本发明并不限于聚His标签。该标记物仅仅是例示性的，而不应当以任何方式限制所述发明的通用性。
如上所述，表达蛋白质的鉴定，特别是来自由基因文库衍生的克隆，可以加快编码病原体潜在抗原的核苷酸序列的鉴定。
核苷酸序列混合物可以衍生自任何来源，诸如组织样品、微生物、细胞、或含核酸的任何成分。核酸优选基因组的、线粒体的、重组的、或mRNA。首先可以对DNA样品进行任何方法的片段化处理，诸如超声处理或酶消化(诸如限制酶消化)。或者，核苷酸序列可以衍生自上述DNA序列的片段的PCR。这些序列可以是开放读码框(ORF)。表达载体优选包含聚His标签。如上所述，聚His标签可以衍生自包含聚His标签的任何来源。
聚His标签优选由标准载体(诸如pQE30、pQE31、和pQE32，QiagenPty.有限公司，澳大利亚)衍生得到。这些载体可以编码T5启动子、Lac操纵子、和聚His标签区。可以将该区域克隆到能够表达由核苷酸序列编码的蛋白质的表达载体中。或者，可以人工合成聚His标签。
优选将标记物(优选聚His标签区)克隆到真核表达载体中。最优选的载体是pCI(Promega公司，澳大利亚)，且优选产生克隆pCI30、pCI31、和pCI32。
该系列的载体能够克隆在所有3种读码框中位于聚His标签区下游的片段。这些例示性克隆中的巨细胞病毒(CMV)立即早期增强子/启动子、嵌合内含子、和SV40晚期多腺苷酸化信号使得载体能够在细胞培养系统和使用纯化质粒DNA的遗传免疫接种中作为真核表达载体使用。T5启动子能够在原核生物中表达克隆的插入片段。由于这些载体的构建物使得我们能够筛选文库以鉴定表达重组蛋白质的大量克隆，所以它们是重要的。
可以通过技术人员知道的任何方法将来自混合物(诸如基因组DNA的消化物)的核苷酸序列导入或克隆到表达载体中。表达载体可以用于在宿主细胞中表达蛋白质。
在优选的实施方案中，用表达载体转染宿主细胞以表达包含聚His标签和表达蛋白质的聚His融合蛋白质的表达蛋白质。将表达载体导入宿主细胞可以构建基因组或cDNA文库。
宿主细胞可以是有能力接受表达载体的任何细胞。细胞优选是原核的。最优选是大肠杆菌。可以通过测定聚His标签融合蛋白质上聚His标签的存在，来鉴定表达该蛋白质的表达蛋白质(和随后任何克隆或宿主细胞)。
本发明的载体使得能够根据聚His标签一般性筛选所有表达克隆。
聚His标签可以用抗聚His抗体或金属螯合物缀合探针(诸如镍树脂)来鉴定，其中聚His信号通过加入发色底物而显色。
在不产生重组聚His融合蛋白质或仅有短的重组蛋白质的克隆中，编码的小的聚His蛋白质在宿主细胞内快速降解，残余的任何聚His蛋白质非常微弱的结合在用于菌落筛选的膜上。非生产性克隆由此在聚His菌落筛选中给出阴性结果，而产生含较长聚His标签的重组蛋白质的克隆能够给出阳性信号。由此可以显著降低一般性基因组表达文库的复杂性，并因此能够更快且更有效的筛选并随后利用期望的克隆。
在另一个优选实施方案中，本方法包括使用在融合蛋白质中表达的聚His标签纯化表达蛋白质的步骤。
一旦使用聚His标签鉴定了由表达克隆表达的表达蛋白质，则该标签还可以用于纯化任何表达蛋白质。可以使用技术人员知道的任何纯化方法。可以使用亲和层析中含抗聚His抗体的亲和柱。一般而言，借助聚His标签鉴定的表达蛋白质可以通过利用聚His标签的任何方法进行分离。
在另一个方面提供了由上述方法鉴定的纯化重组蛋白质。
一旦分离得到蛋白质，它可以以任意多种方式(包括疫苗试验)以纯化蛋白质的形式使用。蛋白质可以立即鉴定作为潜在抗原。优选地它们是保护性抗原。
在另一个方面，提供了编码由上述方法鉴定的重组蛋白质的纯化核苷酸序列。
由不连续的核苷酸序列(优选重组序列)表达由上述聚His方法鉴定的蛋白质。通过鉴定蛋白质，可以鉴定包含核苷酸序列、表达蛋白质的克隆。
这些克隆可以提供纯化质粒DNA，特别是质粒DNA可能代表潜在的保护性抗原。
在本发明的另一个方面，提供了包含标记物(优选用于鉴定由核苷酸序列编码的表达蛋白质的聚His标签)的表达载体或重组载体。
表达载体可以是产生表达蛋白质的表达的任何载体。它可以是质粒或粘粒。可以将它导入克隆以进一步扩增表达蛋白质，以获得蛋白质用于疫苗接种或鉴定目的。
在本发明的还有一个方面，提供了包含表达载体的宿主，该载体包含标记物，优选用于鉴定由核苷酸序列编码的表达蛋白质的聚His标签。
宿主细胞可以是能够接受表达载体的任何感受态细胞。宿主细胞优选原核的或真核的。
在本发明的另一个方面，提供了由核苷酸序列样品鉴定编码抗原蛋白质的基因序列的方法，该方法包括下列步骤提供包含标记物(优选聚His标签)的表达载体；将来自样品的核苷酸序列导入表达载体；通过测定融合蛋白质的存在，来鉴定由表达载体表达的蛋白质的表达，所述融合蛋白质包含与由核苷酸序列翻译得到的表达蛋白质共表达的标记物；鉴定抗原蛋白质；并优选测定由表达载体编码的抗原蛋白质基因的核苷酸序列。
抗原蛋白质的鉴定可以包括鉴定并优选地分离具有聚His标签的融合蛋白质，测定融合蛋白质是否能够引发并非由聚His标签产生的免疫应答。免疫应答的测定可以通过标准体外免疫学测试，使用来自免疫动物的抗血清，进行ELISA或抗体/抗原反应来进行。它们也可以在针对进一步攻击的动物中体内防护试验中进行测试。
在本发明的另一个方面，提供了一种筛选核苷酸序列文库的方法，该方法包括下列步骤提供核苷酸序列来源；提供包含标记物(优选聚His标签)的表达载体；通过将核苷酸序列导入表达载体来构建文库；通过测定融合蛋白质的存在，来鉴定由表达载体表达的表达蛋白质，所述融合蛋白质包含与由核苷酸序列翻译得到的表达蛋白质共表达的标记物；并测定表达蛋白质基因的核苷酸序列。
在另一个方面，提供了筛选以鉴定文库中表达克隆的方法，该方法包括下列步骤提供核苷酸来源；提供包含标记物(优选聚His标签)的表达载体；将核苷酸序列导入表达载体；用表达载体转化宿主以构建表达文库；并通过检测包含与表达蛋白质共表达的标记物(优选聚His标签)的融合蛋白质的表达来找出表达克隆。
由表达克隆转录得到的具有聚His标签的表达蛋白质的鉴定进一步鉴定了那些表达开放读码框(ORF)的克隆(宿主细胞)。
相应的，该方法能够鉴定核苷酸序列混合物中的ORF。这种方法有效加速了鉴定编码作为抗原潜在有用的蛋白质的有用核苷酸序列的过程。它快速鉴定可以立即扩增以提供足够核苷酸序列(或质粒DNA或重组蛋白质)样品的克隆，用于诸如遗传疫苗接种或产生针对重组蛋白质的抗体的任一用途。
在本发明的另一个方面，提供了由核苷酸序列样品鉴定编码疾病治疗性抗原蛋白质的治疗性抗原基因序列的方法，该方法包括下列步骤提供包含标记物的表达载体；将来自样品的核苷酸序列导入表达载体；通过测定融合蛋白质的存在，来鉴定由表达载体表达的抗原表达蛋白质，所述融合蛋白质包含与由核苷酸序列翻译得到的表达蛋白质共表达的标记物；用表达抗原表达蛋白质的表达载体接种动物；用疾病攻击动物；鉴定提供由接种疫苗诱导的治疗性效果的表达载体和表达蛋白质；并测定由表达载体编码的抗原表达蛋白质的基因序列。
本发明的一个优点是提供筛选核苷酸序列文库并将经鉴定的克隆用于DNA疫苗试验以立即评价克隆的疫苗潜力的有效方法。方便的使用经鉴定克隆进行接种疫苗试验的这个方面大大改进了目前可获得的方法。
在本发明的另一个优选实施方案中，提供了对核苷酸序列文库筛选编码支原体(优选猪肺炎支原体)多肽的核苷酸序列的方法，该方法包括下列步骤由支原体样品提供核苷酸序列来源；提供包含标记物(优选聚His标签)的表达载体；将核苷酸序列导入表达载体；通过测定包含与由核苷酸序列翻译得到的表达蛋白质共表达的标记物(优选聚His标签)的融合蛋白质的存在，来鉴定由表达载体表达的支原体表达蛋白质；并测定支原体(优选猪肺炎支原体)表达蛋白质基因的核苷酸序列。
来自支原体样品的核苷酸序列来源可以是基因组、线粒体、重组体、或mRNA来源。当来源是基因组时，基因组DNA可以通过技术人员知道的任何方法由支原体分离得到。
支原体优选猪肺炎支原体。鉴定聚His标签-支原体融合蛋白质的方法如上所述。
核苷酸序列优选编码抗原蛋白质。相应的，有进一步的步骤以确定蛋白质是否引发免疫应答。抗原蛋白质优选支原体抗原蛋白质，更优选猪肺炎支原体抗原蛋白质。
术语“免疫应答”指由免疫系统进行的选择性应答，其中特异性抗体和/或细胞毒性细胞是针对外来成分的侵入产生的，一般而言诸如微生物、寄生虫、移植组织、蛋白质、或抗原。
术语“免疫系统”包括能够进行针对外来成分(一般而言诸如微生物、寄生虫、移植组织、蛋白质、或抗原)侵入的特异性防护应答、保护身体免于感染、并在某些情况中引起针对再感染的长期特异性免疫的任何细胞和组织。
在本发明的还有一个方面，提供了编码支原体(优选猪肺炎支原体)多肽的核苷酸序列，及其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段，该核苷酸序列由上述方法鉴定。优选的核苷酸序列包含依照图1-42任一项的序列，或其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段。更具体的说，它包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23、SEQ ID NO25、SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ ID NO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37、SEQ ID NO39、SEQ ID NO41、SEQ ID NO43、SEQ ID NO45、SEQ ID NO47、SEQ ID NO49、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55、SEQ ID NO57、SEQ ID NO59、SEQ ID NO61、SEQ ID NO63、SEQ ID NO65、SEQ ID NO67、SEQ ID NO69、SEQ ID NO71、SEQ ID NO73、SEQ ID NO75、SEQ ID NO77、SEQ ID NO79、SEQ ID NO81、SEQ ID NO83，或其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段。
在另一个实施方案中，提供了包含上述核苷酸序列或其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段的重组载体。核苷酸序列优选依照图1-42任一项，或其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段。更具体的说，它包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23、SEQ ID NO25、SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ ID NO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37、SEQ ID NO39、SEQ ID NO41、SEQ ID NO43、SEQ ID NO45、SEQ ID NO47、SEQ ID NO49、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55、SEQ ID NO57、SEQ ID NO59、SEQ ID NO61、SEQ ID NO63、SEQ ID NO65、SEQ ID NO67、SEQ ID NO69、SEQ ID NO71、SEQ ID NO73、SEQ ID NO75、SEQ ID NO77、SEQ ID NO79、SEQ ID NO81、SEQ ID NO83，或其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段。
术语“突变体、类似物、或衍生物”指那些可能包含删除、添加、或替换的序列。当这些术语用于蛋白质时，变化基本上不改变蛋白质的活性。当它用于改变的核酸分子时，变化不导致蛋白质编码区读码框的变化，并优选编码无变化、或者生物学功能仅略微降低或升高的蛋白质。
术语“片段”指氨基酸或核酸序列的一部分，比全长少，但是能够与全长序列杂交，并且能够被识别为能够编码氨基酸全长序列的一部分的部分核酸序列。
由于遗传密码的简并性，编码相同或功能等同的氨基酸序列的其它核酸序列包括于本发明的范围的之内。核苷酸序列的这些变化可能包含产生相同或功能上等同的基因产物的不同核苷酸的替换。本发明的范围还包括具有产生功能上等同的基因产物的删除和/或添加的核酸序列。另外，基因产物可能在序列中包含导致变化但仍产生功能活性产物的氨基酸残基的删除、添加、或替换。
在另一个实施方案中，提供了包含上述重组载体的宿主细胞。宿主细胞可以是有能力接受重组载体的任何细胞。优选的宿主细胞是原核生物，更优选大肠杆菌。
在本发明的另一个方面，提供了编码由上述方法鉴定的多肽的氨基酸序列。多肽可以是表达载体的产物，或者是鉴定为与标记物(优选聚His标记物)共表达的表达蛋白质。优选的氨基酸序列由用上述方法鉴定的核苷酸序列翻译得到。
在优选的方面，氨基酸序列编码支原体(优选猪肺炎支原体)多肽。氨基酸序列更优选地包含依照图1-42任一项的序列，或其突变体、类似物、衍生物、或功能片段。更具体的说，它包含SEQ ID NO2、SEQ IDNO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36、SEQ ID NO38、SEQ ID NO40、SEQ ID NO42、SEQ ID NO44、SEQ ID NO46、SEQ ID NO48、SEQ ID NO50、SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQ ID NO56、SEQ ID NO58、SEQ ID NO60、SEQ ID NO62、SEQ ID NO64、SEQ ID NO66、SEQ ID NO68、SEQ ID NO70、SEQ ID NO72、SEQ ID NO74、SEQ ID NO76、SEQ ID NO78、SEQ ID NO80、SEQ ID NO82、SEQ ID NO84，或其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段。
在本发明的还有一个方面，提供了由上述氨基酸序列突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段编码的多肽。序列优选编码支原体(优选猪肺炎支原体)多肽，该氨基酸序列由上述方法鉴定。多肽优选由依照图1-42任一项的氨基酸序列，或其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段编码。更具体的说，它包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36、SEQ ID NO38、SEQ ID NO40、SEQ ID NO42、SEQ ID NO44、SEQ ID NO46、SEQ ID NO48、SEQ ID NO50、SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQ ID NO56、SEQ ID NO58、SEQ ID NO60、SEQ ID NO62、SEQ ID NO64、SEQ ID NO66、SEQ ID NO68、SEQ ID NO70、SEQ ID NO72、SEQ ID NO74、SEQ ID NO76、SEQ ID NO78、SEQ ID NO80、SEQ ID NO82、SEQ ID NO84，或其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段。
可以通过技术人员知道的任何方法分离并纯化多肽。分离方法优选利用用于由核苷酸序列文库鉴定表达蛋白质或表达克隆的聚His标签。
在另一个实施方案中，提供了一种包含上述多肽或核苷酸序列的组合物。组合物可以是包含至少一种上述多肽或核苷酸序列和制药学可接受载体的药用组合物。组合物还可以是包含至少一种上述多肽或核苷酸序列的疫苗组合物。疫苗组合物可能能够引发免疫应答，其中多肽是抗原蛋白质或核苷酸序列，优选支原体的，更优选猪肺炎支原体的。
在本发明的另一个方面，提供了针对上述多肽或由上述方法鉴定的多肽的抗体。抗体优选单克隆抗体。
本领域知道多种方法可以用于产生针对上述多肽表位的抗体。多种宿主动物可以用于在用多肽免疫接种之后产生这些抗体，包括(但不限于)兔、小鼠、山羊、等等。根据宿主物种，可以使用佐剂以提高免疫学应答，包括(但不限于)弗氏(完全和不完全)佐剂。可以使用能够在体外通过细胞系连续产生抗体分子的技术制备单克隆抗体。这些技术包括(但不限于)杂交瘤技术(Kohler和Milstein，自然(Nature)256495，1975)。针对多肽的抗体可以用于在多种组织、体液、和细胞系中检测抗原性多肽，例如抗原的筛选实验和多肽(优选抗原多肽)的亲和纯化。
疫苗组合物包含纯化的质粒DNA，该DNA分子包含上述核苷酸序列。
本发明的还有一个方面，提供了一种治疗感染的方法，该方法包括施用有效量的由氨基酸序列编码的抗原多肽，该多肽由上述方法鉴定。感染优选支原体感染，更优选猪肺炎支原体感染。
同样优选的是，编码多肽的氨基酸序列由依照图1-42任一项的核苷酸序列，或其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段编码。更具体的说，序列包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ IDNO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ IDNO23、SEQ ID NO25、SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ IDNO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37、SEQ IDNO39、SEQ ID NO41、SEQ ID NO43、SEQ ID NO45、SEQ IDNO47、SEQ ID NO49、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ IDNO55、SEQ ID NO57、SEQ ID NO59、SEQ ID NO61、SEQ IDNO63、SEQ ID NO65、SEQ ID NO67、SEQ ID NO69、SEQ IDNO71、SEQ ID NO73、SEQ ID NO75、SEQ ID NO77、SEQ IDNO79、SEQ ID NO81、SEQ ID NO83，或其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段。
同样优选的是，多肽具有依照图1-42任一项的氨基酸序列，或其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段。更具体的说，它包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36、SEQ ID NO38、SEQ ID NO40、SEQ ID NO42、SEQ ID NO44、SEQ ID NO46、SEQ ID NO48、SEQ ID NO50、SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQ ID NO56、SEQ ID NO58、SEQ ID NO60、SEQ ID NO62、SEQ ID NO64、SEQ ID NO66、SEQ ID NO68、SEQ ID NO70、SEQ ID NO72、SEQ ID NO74、SEQ ID NO76、SEQ ID NO78、SEQ ID NO80、SEQ ID NO82、SEQ ID NO84，或其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段。
本发明还有一个方面，提供了一种治疗感染的方法，该方法包括给需要的动物施用有效量的包含由上述方法鉴定的核苷酸序列的DNA分子。感染优选支原体感染，更优选猪肺炎支原体感染。
核苷酸序列优选依照图1-42任一项，或其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段，更具体的说，SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ IDNO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23、SEQ ID NO25、SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ ID NO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37、SEQ ID NO39、SEQ ID NO41、SEQ ID NO43、SEQ ID NO45、SEQ ID NO47、SEQ ID NO49、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55、SEQ ID NO57、SEQ ID NO59、SEQ ID NO61、SEQ ID NO63、SEQ ID NO65、SEQ ID NO67、SEQ ID NO69、SEQ ID NO71、SEQ ID NO73、SEQ ID NO75、SEQ ID NO77、SEQ ID NO79、SEQ ID NO81、SEQ ID NO83，或其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段。
可以通过使得细胞能够吸收DNA的注射或局部应用来施用DNA。DNA优选皮下或肌肉内注射到皮肤层中。
在本发明的另一个方面，提供了治疗感染的方法，该方法包括施用有效量的对由上述方法鉴定的多肽特异的抗体。
感染优选支原体感染，更优选猪肺炎支原体感染。
多肽优选由依照图1-42任一项的氨基酸序列，或其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段编码，更具体的说，SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36、SEQ ID NO38、SEQ ID NO40、SEQ ID NO42、SEQ ID NO44、SEQ ID NO46、SEQ ID NO48、SEQ ID NO50、SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQ ID NO56、SEQ ID NO58、SEQ ID NO60、SEQ ID NO62、SEQ ID NO64、SEQ ID NO66、SEQ ID NO68、SEQ ID NO70、SEQ ID NO72、SEQ ID NO74、SEQ ID NO76、SEQ ID NO78、SEQ ID NO80、SEQ ID NO82、SEQ ID NO84，或其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段。
现在本发明将由所附实施例和图更全面的描述。应当这样理解，下面的描述仅仅是例示性的，而不应当以任何方式限制所述发明的通用性。
实施例实施例1在pCI30、pCI31和pCI32中构建基因组文库通过超声处理或部分限制酶消化，将由猪肺炎支原体分离得到的基因组DNA断裂成合适大小的片段。然后将DNA在琼脂糖凝胶上进行电泳，并由凝胶切下选定大小的部分回收。将载体DNA(pCI30、pCI31和pCI32)用适当的限制酶(SmaI或BamHI)消化，用虾碱性磷酸酶处理除去末端磷酸，然后在琼脂糖凝胶上电泳。切下线性条带并回收DNA。以1∶1和5∶1之间的摩尔比将基因组DNA片段与经切割载体DNA混和，并使用标准连接条件进行连接。将连接混合物用于转化大肠杆菌感受态细胞，并由此产生许多不同的基因组文库实施例2基因组文库的筛选将基因组文库铺在含氨苄青霉素(100ug/ml)的Luria-Bertoni(LB)肉汤琼脂上，并于37℃培养过夜。通过将干燥的、无菌硝酸纤维素膜置于菌落上面，然后立即揭下，以菌落面朝上置于含氨苄青霉素和IPTG(1mM)的LB平板上，并于37℃温育4小时，由此完成平板的滤膜复制。然后通过常规方法处理滤膜，以裂解细菌、中和膜、并使蛋白质结合在膜上。然后用抗聚His抗体或用缀合的镍树脂探查干膜，加入发色底物后产生聚His信号。将显色的膜映射回最初的平板，并将阳性菌落转接装有加富生长培养基(添加氨苄青霉素)的96孔深孔板。然后于37℃培养克隆。取出这些板的复制品，对于长期保存置于-70℃。实施例3选定克隆的序列分析由每个文库选择一些聚His阳性克隆。制备质粒DNA，并通过自动化双脱氧测序使用与恰好位于载体中插入位点上游的区域同源的引物由插入片段产生DNA序列信息。将产生的序列数据与公开的GenBank数据库进行比较。注意到我们的阳性序列和数据库条目之间的同源性，而且在许多情况中这种信息指示克隆的基因片段可能的功能。根据这种同源性信息，选择有可能代表编码在猪肺炎支原体感染过程中宿主免疫系统易于接受的蛋白质的基因，或由于其它原因被认为有可能提供一定水平的防护作用的一组阳性克隆。这些选定的阳性克隆编码候选保护性抗原。
选择用于进一步研究的某些克隆代表相同基因的不同区段。实施例4候选保护性抗原的筛选进行了一系列动物试验以调查所鉴定的基因的治疗性应用。所有试验遵循相似方案。对来自无猪肺炎支原体群的猪进行3次接种，间隔2周，由6周龄开始。每次接种使用500μg质粒DNA，平均的分成2次注射，每只耳背基部的组织注射1次，使用Biojector 2000无针注射装置和2号注射器。第3次接种后1-2周，通过气管内滴注5ml 0.45μM经过滤的来自患有活性猪肺炎支原体感染的猪的肺匀浆来攻击猪。攻击后3-4周，对猪进行安乐死，切除肺用于肺炎损害评分。通过对受影响肺叶数目的计数和通过估计每个肺叶受疾病影响的百分比来对肺炎损害进行评分。这种评分系统给出疾病状态的两种测量值，叶得分和损害得分。对于每组试验，展示每组的平均结果。展示了具有阳性治疗性效果的那些克隆组的试验结果。没有展示未得出阳性治疗性效果的其它克隆组及其结果。试验1用包含克隆pAD612-789的一组克隆免疫接种。处理 叶得分损害得分未接种，未攻击0 0未接种，攻击 4.4 120接种，攻击3.25 72.5含克隆pAD612-789的疫苗具有治疗性效果。经接种的猪中的叶得分比对照低26％，而损害得分低40％。试验2测试作为疫苗的两个不同组。
第1组pAD662、774、784、922、和964第2组pAD612、633、639、640、641、653、657、659、681、700、711、721、727、742、760、789、908、910、911、913、920、923、925、950、951、966、967、977、981、983、984、994、1001、1005、1013、1016、1020、1027、1033、1037、1038、1040、和1049。处理 叶得分损害得分未接种，未攻击 0 0接种的载体，攻击 3.4 67接种的第1组，攻击1.6 38接种的第2组，攻击2.2 51在试验2中诱导的疾病的总体严重性比试验1低，指示较温和的攻击。两组克隆都具有治疗性效果。第1组疫苗将叶得分降低了53％，将损害得分降低了43％。第2组疫苗将叶得分降低了35％，将损害得分降低了24％。上述数据是与接种空载体质粒DNA的组进行比较。试验3第1组与试验2中第1组的克隆相同在用biojector(如详述的)标准方法中或通过基因枪递送DNA。对于基因组递送，使用1.6微米的金颗粒，每只猪注射4次，在3次接种时间点每针1.25μg DNA。在耳后和后腿内侧进行接种。递送压力是500psi。处理叶得分损害得分未接种，未攻击 0 0接种载体，攻击 4.2 109biojector接种第1组，攻击2.5 67基因枪接种第1组，攻击2.2 48.5这组试验再一次证明，当以裸露DNA递送时，第1组中的5种克隆产生治疗性效果。biojector递送的疫苗将叶得分降低了40％，将损害得分降低了39％。通过基因组递送克隆的相同集合将叶得分降低了48％，将损害得分降低了56％。试验4在这组试验中使用了试验2中克隆的其它组合。
第3组pAD653、711、727、920、951、和965第4组pAD612、639、640、1005、1020、和1038第5组pAD742、760、923、925、994、984、和1037还包括先前没有用于试验的一组5种其它克隆。
第6组pAD702、763、766、957、和996处理 叶得分 损害得分未接种，未攻击 0 0接种载体，攻击 5.0 106接种第3组，攻击 2.8 54基因枪接种第3组，攻击2.6 87接种第4组，攻击 3.0 79接种第5组，攻击 3.6 74接种第6组，攻击 2.7542.5所有这些克隆组产生治疗性效果，即它们降低了肺炎损害的严重性。第3组的克隆，当通过biojector递送时，将叶得分降低了44％，将损害得分降低了49％，当通过基因枪递送时，将叶得分降低了48％，将损害得分降低了18％。其它3种实验性疫苗只通过biojector递送。第4组疫苗将叶得分降低了40％，将损害得分降低了25％。第5组疫苗将叶得分降低了28％，将损害得分降低了30％。第6组疫苗将叶得分降低了45％，将损害得分降低了60％。
这一系列试验证明，与未接种或接种空载体的猪相比，本发明中详述的克隆基因的集合能够通过在接种各种重组质粒组合的组中降低肺损害的严重性而产生治疗性效果。根据由此证明的治疗性效果，本发明要求保护42种基因的集合。实施例5筛选基因组文库以回收完整基因实施例4中所列克隆只含部分基因序列。由于完整基因有可能编码对设计疫苗有用的其它表位，需要鉴定完整基因的核苷酸序列。通过筛选两个基因组文库来回收实施例4中克隆代表的基因的完整编码区。通过将用限制酶EcoRI和BgIII消化产生的片段连接到用EcoRI和BamHI消化的pUC18载体中来构建基因组文库。通过用连接混合物转化XL2-BlueMRF’感受态细胞(Stratagene)，并铺在含100μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertoni琼脂平板上来回收连接产物。将菌落转接到装有丰富生长培养基的96孔板中培养过夜，然后制备各自的质粒DNA。将来自各个菌落的质粒DNA变性，并转到尼龙膜上。然后用洋地黄毒苷标记的、由实施例4中各个克隆中插入的DNA产生的PCR产物探查各个膜。通过限制酶消化、使用基因特异性引物的PCR、和核苷酸测序，鉴定并分析杂交克隆。产生的基因序列详细记录于图1-42。这些序列中的许多代表基因的完整编码序列，但是许多基因只获得了部分序列。
最后，应当这样理解，可以在不偏离此处所述本发明精神的前提下进行各种其它修饰和/或变化。
序列表<210>1<211>1125<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述克隆pAD612<400>1atggcaaaac aagattttta taaaattctg ggagttgaaa aatcagcatc actaacagaa 60ataaaaaaag cttatcgaaa tttagtaaat atttatcatc ctgataaaaa tacaaaaaaa 120tcagctgaag aacaaaaaca agctgaggcc aaatttaaag aaatccagga agcctacgaa 180attttatctg atgaaacaaa gcgaaaacag tacgataaat tcggtcatgc cgcttttgat 240cagcaatttg gtggtgggtc tagtggcttt tcaggatttg attttggcga tattttttca 300agttttacct ctggttttgg ttttggcggc tcacaagaac aaaaatatag tcgtccttta 360aagggcgaaa attttcaagc taaaatttat atcagtttta tcgagtcaat tctcggaaaa 420gaaatctccc agaaattaac aaaatacgat caatgtgata actgtaaggg ttcaggcgct 480aattcttctt ctgatattac aacttgctat aattgtcaag gtcggggaat gcaaactgag 540gtcttaaata tcccgggatt tggtcgggtt cagaacaaaa caacttgttc agtttgttta 600ggttccggga aaaacattac aaaaattgca aagaagtgcc atggaaaaac tatagttgag 660acaaaagagg aagtaactat taaaattccg gccggaatcc aggatggaat gtttatccgc 720gtggccggat ttggtggacc gggacacaaa ggcgggcctt ctggagatct tcatcttgag 780attaatgttc gtcagcataa acattttact agatccggaa atgatattca tgtgaatatg 840ccagtttcaa taattgatat tatcaaccaa aatactgtcg aagttcccaa cccaaccggt 900ttgaaaaaag ttagacttta tgattattat aaatccggtc caattgttaa tgttcttcct 960gctggggctc ctgatccaaa aaatccaaga attattggcg atctcaaggt tcatttaatt 1020ttttatatcc ccgaatttag tccccgtcaa aaagatgagc tcaaccaggt ttttgctcaa 1080atcaatgata aaacaaaggc aaaatgacta aaagaatttc aataa 1125<210>2<211>368<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述克隆pAD612的推定的蛋白质序列<400>2Met Ala Lys Gln Asp Phe Tyr Lys Ile Leu Gly Val Glu Lys Ser Ala1 5 10 15Ser Leu Thr Glu Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Asn Leu Val Asn Ile Tyr20 25 30His Pro Asp Lys Asn Thr Lys Lys Ser Ala Glu Glu Gln Lys Gln Ala35 40 45Glu Ala Lys Phe Lys Glu Ile Gln Glu Ala Tyr Glu Ile Leu Ser Asp50 55 60Glu Thr Lys Arg Lys Gln Tyr Asp Lys Phe Gly His Ala Ala Phe Asp65 70 75 80Gln Gln Phe Gly Gly Gly Ser Ser Gly Phe Ser Gly Phe Asp Phe Gly85 90 95Asp Ile Phe Ser Ser Phe Thr Ser Gly Phe Gly Phe Gly Gly Ser Gln100 105 110Glu Gln Lys Tyr Ser Arg Pro Leu Lys Gly Glu Asn Phe Gln Ala Lys115 120 125Ile Tyr Ile Ser Phe Ile Glu Ser Ile Leu Gly Lys Glu Ile Ser Gln130 135 140Lys Leu Thr Lys Tyr Asp Gln Cys Asp Asn Cys Lys Gly Ser Gly Ala145 150 155 160Asn Ser Ser Ser Asp Ile Thr Thr Cys Tyr Asn Cys Gln Gly Arg Gly165 170 175Met Gln Thr Glu Val Leu Asn Ile Pro Gly Phe Gly Arg Val Gln Asn180 185 190Lys Thr Thr Cys Ser Val Cys Leu Gly Ser Gly Lys Asn Ile Thr Lys195 200 205Ile Ala Lys Lys Cys His Gly Lys Thr Ile Val Glu Thr Lys Glu Glu210 215 220Val Thr Ile Lys Ile Pro Ala Gly Ile Gln Asp Gly Met Phe Ile Arg225 230 235 240Val Ala Gly Phe Gly Gly Pro Gly His Lys Gly Gly Pro Ser Gly Asp245 250 255Leu His Leu Glu Ile Asn Val Arg Gln His Lys His Phe Thr Arg Ser260 265 270Gly Asn Asp Ile His Val Asn Met Pro Val Ser Ile Ile Asp Ile Ile275 280 285Asn Gln Asn Thr Val Glu Val Pro Asn Pro Thr Gly Leu Lys Lys Val290 295 300Arg Leu Tyr Asp Tyr Tyr Lys Ser Gly Pro Ile Val Asn Val Leu Pro305 310 315 320Ala Gly Ala Pro Asp Pro Lys Asn Pro Arg Ile Ile Gly Asp Leu Lys325 330 335Val His 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atcgaaaaag cgaaaattga ctccccattt 720atctataaaa tttccagcgc acttaaatta gttagtccaa cttatgacga aaatgaattg 780ctagagcaac tatgaaaatt aaagcaaaaa acatcgtaa819<210>4<21l>272<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述克隆pAD633的推定的蛋白质序列<400>4Met Ile Lys Val Ser Asp Val Cys Phe Ser Tyr Thr Asn Asn Met Asp1 5 10 15Gln Leu Val Leu Lys Asn Ile Asn Val Val Phe Glu Lys Gly Lys Tyr20 25 30Tyr Ala Ile Leu Gly His Asn Gly Ser Gly Lys Ser Thr Phe Ser Lys35 40 45Ile Leu Ser Gly Ile Phe Lys Pro Gln Lys Gly Ser Ile Glu Val Asp50 55 60Gly Val Leu Leu Asn Lys Glu Asn Leu Thr Lys Ile Arg Lys Lys Ile65 70 75 80Gly Ile Ile Phe Gln Asn Pro Asp Asn Gln Phe Val Gly Ala Thr Val85 90 95Glu Asp Asp Ile Ala Phe Ser Leu Glu Asn Ile Asn Glu Asp Pro Lys100 105 110Lys Met Set Gln Ile Ile Ala Asn Leu Ala Ala Lys Val Gln Met Glu115 120 125Ser Tyr Leu Asp Arg Glu Pro Gln Phe Leu Ser Gly Gly Gln Lys Gln130 135 140Lys Val Ala Ile Ala Ser Val Leu Ala Leu Asn Pro Glu Ile Ile Ile145 150 155 160Phe Asp Glu Ile Thr Ser Met Leu Asp Pro Arg Gly 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aattagaatg ttttttgctt 420tcaaacttat tttttgtcag cctgagtcta actaatcata tcagaagtct agcccatcca 480gatttaaata attcaactat ttatttaaat gaattatgcc ttgatgatct tagtcaaaaa 540gaaactttag ctctaaaaag tcttggaaat tatgattttg acgatcaaga aaaggaactt 600ttagagatc 609<210>6<211>203<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述克隆pAD639的推定的蛋白质序列<400>6Met Phe Ser Gln Thr Ile Tyr Lys Trp Lys Ser Glu Asn Leu Glu Arg1 5 10 15Val Val Val Pro Glu Lys Gly Leu Ser Cys Glu Tyr Asn Gly Leu Phe20 25 30Ser Ile Arg Thr Gly Lys Ser Leu Tyr Gly Leu Leu Gln Asn Leu Asp35 40 45Asn Asp Tyr Phe Ile Ala Tyr Leu Arg Ser Ser Val Leu Ile Phe Thr50 55 60Ser Ser Ala Ser Ser Ala Leu Val Arg Ala Lys Ser Tyr Cys Glu Asn65 70 75 80Asp Phe Trp Leu His Lys Asn Asn Phe Leu Val Gly Leu Ile Val Phe85 90 95Ser Ala Gly Ile Phe Lys Ile Met Asp Gly Arg Trp Glu Asn Thr Tyr100 105 110Leu Val Lys Ser Gly Asp Gly Phe Asn Arg Phe Leu Gln Glu Leu Lys115 120 125Ser Lys Lys His Tyr Lys Leu Glu Cys Phe Leu Leu Ser Asn Leu Phe130 135 140Phe Val Ser Leu Ser Leu Thr Asn 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ggaaatggtt atgaaattat atccccatga gctttcagga 840ggtatgattc aaagaattgt gatctcagca attttatcac ttgaacctaa aattatcgtt 900atggatgaac caacaacagc tttggataca accgtgcaag ctttagttct tgatattatc 960cgcgatctcc aaaaaagact aaaaattaca attattttca ttactcacga ccttggagtt 1020gtcgcttctc ttgcaactta tatctcaatc atgtatgctg gtcaagttgt cgaggaaggt 1080acaagagatg aaattctttt aaatccaaga catccatata cttgagggct aattacttca 1140atgcctgatg tcaataaagg cgaacgactt cagtcaattc gcggggttgt tccttcttct 1200ttaaattcaa ttgttggcga tgcttttgca gttagaaacg attatgcctt agaacaagat 1260ttttttattg aacctaaatt ttacagaata agtccaactc accgagtcaa atcagcttta 1320cttgatccaa aagcaccaaa agttgtccca ccaaaaatta tttaccaaaa atgactgcaa 1380tttgcaaaga tgaggcaaga aaatggaaga 1410<210>14<211>470<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述克隆pAD657和pAD964的推定的蛋白质序列<400>14Met Ile Ser Tyr Phe Tyr Ser Lys Ser Ala Pro Gln Cys Leu Lys Thr1 5 10 15Glu Asn Pro Arg Phe Cys Tyr Lys Leu Asn Lys Asn Leu Val Lys Phe20 25 30Gln Lys Glu Leu Asp Leu Leu Lys Gln Lys Lys Leu Ala Pro Lys Glu35 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Ala Asn Pro Glu Met Val Met Lys260 265 270Leu Tyr Pro His Glu Leu Ser Gly Gly Met Ile Gln Arg Ile Val Ile275 280 285Ser Ala Ile Leu Ser Leu Glu Pro Lys Ile Ile Val Met Asp Glu Pro290 295 300Thr Thr Ala Leu Asp Thr Thr Val Gln Ala Leu Val Leu Asp Ile Ile305 310 315 320Arg Asp Leu Gln Lys Arg Leu Lys Ile Thr Ile Ile Phe Ile Thr His325 330 335Asp Leu Gly Val Val Ala Ser Leu Ala Thr Tyr Ile Ser Ile Met Tyr340 345 350Ala Gly Gln Val Val Glu Glu Gly Thr Arg Asp Glu Ile Leu Leu Asn355 360 365Pro Arg His Pro Tyr Thr Trp Gly Leu Ile Thr Ser Met Pro Asp Val370 375 380Asn Lys Gly Glu Arg Leu Gln Ser Ile Arg Gly Val Val Pro Ser Ser385 390 395 400Leu Asn Ser Ile Val Gly Asp Ala Phe Ala Val Arg Asn Asp Tyr Ala405 410 415Leu Glu Gln Asp Phe Phe Ile Glu Pro Lys Phe Tyr Arg Ile Ser Pro420 425 430Thr His Arg Val Lys Ser Ala Leu Leu Asp Pro Lys Ala Pro Lys Val435 440 445Val Pro Pro Lys Ile Ile Tyr Gln Lys Trp Leu Gln Phe Ala Lys Met450 455 460Arg Gln Glu Asn Gly Arg465 470<210>15<211>1332<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述克隆pAD659和pAD910<400>15atgaaaaata ttgaaaaaag tgaaataatt atctcccttg ttgatgttga taaagaattt 60ggtgataaaa aagttttaga tcaaataaat ttggacatta aacgaggaga ttttgtcaca 120cttttagggc cctcagggtc cgggaagaca acaattttac gtttaattgg tggttttgaa 180tgaactactc gcggcgaaat caaatttaat ggcatcgata taaaagacgt tccggcacat 240aaacgtgata cagctacaat ttttcaagat tatgcacttt ttccacattt atcagttcgt 300ggaaatattg aatttggtct taaattaaaa agaattaaaa aaaaggcaga agaaattccg 360gatgtagtct ggaaaaaatt tgagcactta aagaaaaaat gacaggataa gcaaaagcga 420aagattaaag agttaaaaat tttacaggct catttagaaa aactgcttga aaatccacag 480ttagatatta aaaaacgtaa aaaattacag gataaattag atgattctga ttttagatat 540tcaaattgag aaaattatct aacatccaaa tcagaaagtt ttaaaaaaaa atacctaacc 600cgaaagatca caaaacagga aattaataaa gaaattaccg atattattga ccttgttggt 660ctaactggaa atgaaaatcg agcaatttcg gaattatcag gaggaatgaa acaacgcgta 720gcacttgcaa gatcgcttgt aattgagcct gaaattgtcc tacttgatga acctttatca 780gctttagata caaaaattag gcaaaaaatg caagtttttc taaaaaaaat tcaacaaaaa 840cttggcctaa cttttatttt tgttactcat gatcaagatg aagccttgca attatcagat 900aaaatcgcca taatccgtaa tggaaaaatc gcccaatacg atgaaccaaa acaaatttat 960gactatccag ttaataaatg ggtggctaat tttattggtg attctaattt ttttcaggca 1020aaatacatta aaaaaaatca ggtcgaaatt cttggtctta aattatatac aattcatgat 1080gagtttatcc caggccaaaa attagattgc ctgattcgtc cagaagatat cgatattgac 1140ctaaattcag gctattttaa aggaaaagtt atccaaaata tttataaagg ttcatactat 1200tcacttgata tcaaagtaga aaatacaata attaatgtcg aaactaacga tttttatgac 1260ctcgagactc aagtttttct aaaatgagat gatgatgcta ttcatttaat ggagatggaa 1320aatgctgaaa tt 1332<210>16<211>444<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述克隆pAD659和pAD910的推定的蛋白质序列<400>16Met Lys Asn Ile Glu Lys Ser Glu Ile Ile Ile Ser Leu Val Asp Val1 5 10 15Asp Lys Glu Phe Gly Asp Lys Lys Val Leu Asp Gln Ile Asn Leu Asp20 25 30Ile Lys Arg Gly Asp PheVal Thr Leu Leu Gly Pro Ser Gly Ser Gly35 40 45Lys Thr Thr Ile Leu Arg Leu Ile Gly Gly Phe Glu Trp Thr Thr Arg50 55 60Gly Glu Ile 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cttttaaaaa ttttatcagg agtgattcct 180gctggacaat atgaaggtga tctaattttt gaagataaaa ttatggcttt tgcaaataca 240aaagcctccg aacgtgtcgg aattgcaata attcatcaag aactttcaat ttcaccttat 300ttatcaattt gcgagaacat gtatatcggt aattatccga ctaaatttgg caaagttaac 360tgaaataaga tgatttccga atgcaaaaaa tatctagaaa tggtcggtct tgatgaagat 420ccaacaacaa ttgctggctc tctttcgatt gcaaaacagc aaatggttga gatcgcaaaa 480gcactttcaa aaaatgcaaa actactaatt ttagatgaac cgacttcctc tttaaatgat 540gaaaatgctt ttcgcttact tgatattatg aaaagtttaa aaagtaaagg aattacttcg 600atttttgtct cccataaatt aaatgaagtc aaatatgtct ctgataatat tgttgtaatc 660cgcgatggta aattcatttc ccagtataat aaaaatgaag aaataattga tgaaaaccgg 720ctaattcagg acattgttgg ccggccttta aagtccaaat ttcctcctag ggatttagat 780cgaaaaatcg gggaaattat ttttgagatc aaagatatag ttattcctca tgctagtatt 840gcaaattata atgttgtcaa aaatgcttcc cttgatgtta aacaaggcga aattgtcgga 900atttccggac ttgttggatc gggtcgaacc gaattaatgc tttcactttt tgggcagtat 960tataacaaac cttcaagtgg caaagttttc tataaaggta aagaagtaaa atttactaac 1020acaaaacagg caatcaaatc gggaattatg tatgcttccg aagatcgaaa aaatgttggt 1080ctaatccaaa ttttttcgat tcaaaataat atcacttccg ccgctttgca tttattttca 1140aaatgaggaa ttctaaataa aaataaggaa ataattaatg cccaaaaact aaaaaaagat 1200gtaagtatta aaacaaaaaa tattctaaat aatgtcgaat ccctttctgg gggaaatcag 1260caaaaagttg taattgccaa agctttaagc accaaatttg accttctaat tatcgatgag 1320ccaacaaaag gtattgatgt tggctcaaaa tacgaaattt ataaaatttt actagacctt 1380tcatcacaag gtaaaacaat tattgtaatc tcttcggaaa ttgaagaact tttaggaatc 1440accgatcacc tttattttgt gactggaaaa ctttttggtc aaaatcaaga ctgactttcc 1500cagtttttgc atctttttta taactttttt gaccaaaagg attaccataa ggacttccaa 1560attttgagac ataatcttgg tgaagcgagt 1590<210>18<211>530<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述克隆pAD662的推定的蛋白质序列<400>18Asp Ile Lys Leu Lys Lys Thr Asn Ile Leu Ser Leu Lys Lys Ile Lys1 5 10 15Lys Val Tyr Gly Pro Val Ile Ala Leu Ser Asp Val Thr Phe Val Val20 25 30Pro Lys Gly Glu Ile Thr Ser Leu Val Gly Glu Asn Gly Ala Gly Lys35 40 45Ser Thr Leu Leu Lys Ile Leu Ser Gly Val 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515 520 525Ala Ser530<210>19<211>852<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述克隆pAD681<400>19atcgaaacca tcaaaattga gctgggtgag cagctcgaat tttttgaaaa aaataataaa 60ttagtcgaaa aacaacgact aaaagaccga gtcaataatg atattgactc gctttctgaa 120ttcggaattt gttcaggaat tgagaattat gcccgccata ttgacggacg ccaaaaaggc 180gaaaaaccat ttagtttact agattattta ccccaagacg gcctaatttt tattgatgaa 240tcccatatta tgatcagcca aattaagggc atgtatgaag gtgatcgaag ccgaaaacaa 300accttggttg actatggtta tcgactacct tcagctcttg ataatcggcc cttaaaactc 360agtgaatttg agaaatatca acaggcaaaa atttatgttt cagccacacc ggccagctat 420gaaattgata aaacaaatgg cgaaattgtc tcgcaaatta tcagaccaac tggactaatt 480gatccagaaa tagtaattga atctaccaaa aatcaaatgg agaaaatttt tcagtatttg 540ctaaaacaga aggaaaaaaa agaaagaagt ctcattttaa ctaccacaaa acgactggcc 600gaagaaatca gcaagtatct ccaggaagaa aaattacaaa atgtctatta tttgcactca 660gaaatgacga cttttgagcg cgatgaaatc ataattaagc ttcgaaaagg aatttatgat 720gcaattgtcg ggataaattt acttcgtgaa ggcgttgata tcccggaagt ttctttgatt 780tttgttcttg aagccggtct tgtttctttt ttgcgatccg catgcgagct cggtaccccg 840ggtcgacctg ca 852<210>20<211>284<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述克隆pAD681的推定的蛋白质序列<400>20Ile Glu Thr Ile Lys Ile Glu Leu Gly Glu Gln Leu Glu Phe Phe Glu1 5 10 15Lys Asn Asn Lys Leu Val Glu Lys Gln Arg Leu Lys Asp Arg Val Asn20 25 30Asn Asp Ile Asp Ser Leu Set Glu Phe Gly Ile Cys Ser Gly Ile Glu35 40 45Asn Tyr Ala Arg His Ile Asp Gly Arg Gln Lys Gly Glu Lys Pro Phe50 55 60Ser Leu Leu Asp Tyr Leu Pro Gln Asp Gly Leu Ile Phe Ile Asp Glu65 70 75 80Ser His Ile Met Ile Ser Gln Ile Lys Gly Met Tyr Glu Gly Asp Arg85 90 95Ser Arg Lys Gln Thr Leu Val Asp Tyr Gly Tyr Arg Leu Pro Ser Ala100 105 110Leu Asp Asn Arg Pro Leu Lys Leu Ser Glu Phe Glu Lys Tyr Gln Gln115 120 125Ala Lys Ile Tyr Val Ser Ala Thr Pro Ala Ser Tyr Glu Ile Asp Lys130 135 140Thr Asn Gly Glu Ile Val Ser Gln Ile Ile Arg Pro Thr Gly Leu Ile145 150 155 160Asp Pro Glu Ile Val Ile Glu Ser Thr Lys Asn Gln Met Glu Lys Ile165 170 175Phe Gln Tyr Leu Leu Lys Gln Lys Glu Lys Lys Glu Arg Ser Leu Ile180 185 190Leu Thr Thr Thr Lys Arg Leu Ala Glu Glu Ile Ser Lys Tyr Leu Gln195 200 205Glu Glu Lys Leu Gln Asn Val Tyr Tyr Leu His Ser Glu Met Thr Thr210 215 220Phe Glu Arg Asp Glu Ile Ile Ile Lys Leu Arg Lys Gly Ile Tyr Asp225 230 235 240Ala Ile Val Gly Ile Asn Leu Leu Arg Glu Gly Val Asp Ile Pro Glu245 250 255Val Ser Leu Ile Phe Val Leu Glu Ala Gly Leu Val Ser Phe Leu Arg260 265 270Ser Ala Cys Glu Leu Gly Thr Pro Gly Arg Pro Ala275 280<210>21<211>843<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述克隆pAD700<400>21atgcccaaat taaaccgact tagagcccga tttgtccaga ttcaaaacat tgaaaaaatg 60acaaatgtaa tggaaatgat tgcgaatgca aaaattccaa aaataaaaaa caagtttaaa 120attgttcaag aatattttga aaatttagat tatatttttc aaaatattct tgcaaattta 180tctaagaagg ttgaggaatt aactaatgct gattccaaaa aaaatcttta tattattttt 240ggatcaaatt taggtttttg tggtgccctt aataatttaa tcttaaaaaa tgttgtccca 300caacttcaga aaaatgatga aattatcgtc tttggtgaaa aaatttataa ttttttgtca 360ataaattact ctaatttaat tattaaattt tttctaaata ttgaagaaac taattttagt 420gaaccaattt tagaaatctc aaactttgta aatcaatcga tttttgagag aaaatataaa 480aaaattttta tttgttataa caaatttatc agtattatac attcaagccc agagatgcaa 540aatttatttg atttcaaaaa aaatactata aaatacggtg gttacgggat tgagtttgaa 600ccaaatgcta ctgaggtttt taaaaaatta atgccctttt atataaaatc catccttgaa 660aaacttttta tcgaatccaa attagttgag acttcaacta gacgaacatc aatggaaagt 720gcactgaaaa tgccagttga aattttgcat aagtttagaa acagaaataa ttccagtcgt 780ccagccatga ttaccccaga aattattgag attattagtg gtaaaatgtt gaaaaagtta 840ggt 843<210>22<211>281<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述克隆PAD700的推定的蛋白质序列<400>22Met Pro Lys Leu Asn Arg Leu Arg Ala Arg Phe Val Gln Ile Gln Asn1 5 10 15Ile Glu Lys Met Thr Asn Val Met Glu Met Ile Ala Asn Ala Lys Ile20 25 30Pro Lys Ile Lys Asn Lys Phe Lys Ile Val Gln Glu Tyr Phe Glu Asn35 40 45Leu Asp Tyr Ile Phe Gln Asn Ile Leu Ala Asn Leu Ser Lys Lys Val50 55 60Glu Glu Leu Thr Asn Ala Asp Ser Lys Lys Asn Leu Tyr Ile Ile Phe65 70 75 80Gly Ser Asn Leu Gly Phe Cys Gly Ala Leu Asn Asn Leu Ile Leu Lys85 90 95Asn Val Val Pro Gln Leu Gln Lys Asn Asp Glu Ile Ile Val Phe Gly100 105 110Glu Lys Ile Tyr Asn Phe Leu Ser Ile Asn Tyr Ser Asn Leu Ile Ile
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275 280<210>23<211>615<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述克隆pAD711<400>23tcaggtatgt caaaaaatat taaggaaatt tcaatcctac cccttaaatt aaatcctgct 60ggaattatgc ctgtaatttt tgccttaatt atcgtttcac tgccgacact ttttagcgga 120tttcttgata gaaatacctc agcagttcgg aattgaatag ataataatat gcaaatttat 180cacccaatcg gtcttatcat ttttattgtt tttaatgtct ccttttcaat aataatgtcc 240ttacaacaat cccgagttga taaaattgca caggattttg ccaaaaattc aacttttatc 300cctgggattc gcccaggaga acagactgaa gattatttaa tttcagtggt tttgcgactt 360tcagttttca gtgcgattta tcttaccttt ttaggaattc tccaacctgt tgaaattatg 420ttaggtcttc cttcggcaat cacaatttca ggaacttcga taataatttt agcaacaact 480acacttgaaa cgatttcgca gatcaaagcc cgttatgatg cacaaaaagt tctaaaacaa 540agtaaaaaga tccgcaaaaa tttacaagtt cgaaaaaatt ctccttctat tgattcaaat 600caggatcttt tatgg 615<210>24<211>205<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述克隆pAD711的推定的蛋白质序列<400>24Ser Gly Met Ser Lys Asn Ile Lys Glu Ile Ser Ile Leu Pro Leu Lys1 5 10 15Leu Asn Pro Ala Gly Ile Met Pro Val Ile Phe Ala Leu Ile Ile Val20 25 30Ser 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120gtactaagtt taccaaatga gctaatcaat aaattacttg atgaacttta tgttgatgaa 180attgtcgaac ttcttgatga agtccctgat aatgttgcca aaagaatttt gcgcaacatt 240gacattgata ctcgtaaaca aataaatcaa cttttgcagt ataccgacga tcaaattggc 300gcttttatgt cagttgatat cgtctatctt tttaaagatt cgacttgtca tcaagcactt 360gaaaaaatta gaaactataa agatatctcc gaattagtgc attattatta tgtcgttgat 420caaaacaaga aaataatcgg ggcaactact ttagaagata ttgtcttttc tgatcctaat 480actcagatca aagaaattgt ttttcaagtc ccttttcttg ttacactgat aaaaaagatt 540atgccgccga agtttttgcc caaaatgatt tttccagtac tcccggttgt taataccagc 600cagaaactaa tccgaatggt tccagttgat gatattatcc gatattgt 648<210>26<211>216<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述克隆pAD721的推定的蛋白质序列<400>26Ile Ala Glu Glu Val Ser Ser Phe Ser Pro Phe Asp Arg Leu Leu Phe1 5 10 15Phe Arg Met Leu Asp Thr Ala Thr Ala Gly Asp Ile Phe Thr Tyr Phe20 25 30Ser Pro Glu Ile Gln Thr Lys Leu Val Leu Ser Leu Pro Asn Glu Leu35 40 45Ile Asn Lys Leu Leu Asp Glu Leu Tyr Val Asp Glu Ile Val Glu Leu50 55 60Leu Asp Glu Val Pro Asp Asn Val 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aacaaaaatt 240gcctcattaa atacggcaat ccagaataat ttttctaata ttcgaatgac aaattattca 300atttcgaatg aagaagctca aaaattaatt ttcaatgcaa ttctttcagt tggaatcgca 360cttatttttg taactatttt tacgctaatt aggtttaaat ggactttttc gcttgcaata 420attttctcac ttctttttaa tgttttaatg gttttgctag caattattat tacacggatc 480gaaatatcgc agaatttagt tgttgcaatt cttactttaa ttggttatac agtaaatgat 540acaatcgtgg tttttgatag agtaaaagca agattttcag aaataaatca tgaaaatgtt 600tataaatttg ataaaattaa agaaatttcc ttacaagcaa ttagagaaac agcaaaaagg 660tcggtatata catccttgac aaccatttta acaattgttg ttttaatgat tttttatgaa 720tcaattgata ttgtctttag cctgacgatg ttaattggtg tgataattgg aacatattcc 780tccttattta tcgcaacccg catttggatt attcttgaat catcccgtaa tcgtaaa837<210>28<211>279<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述克隆pAD727的推定的蛋白质序列<400>28Ser Phe Gly Ser Gly Phe Asn Leu Ala Ile Asp Phe Ser Gly Gly Thr1 5 10 15Asn Phe Leu Ile Glu Ser Ser Asn Ser Ser Tyr Asp Leu Ile Thr Lys20 25 30Glu Lys Ala Glu Lys Ile Ile Ser Phe Leu Asp Ser Gln Asn Ile Asn35 40 45Lys Ser Asn 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ggacacaaaa gggtgaaatt 780gaaaggaatt tatacagtct aaattccgaa aaaattatta gtcaaactag aatctccgag 840ctaaaaaagt ccttagaatc aatgtctttt ttgccaaagg ggacaaaaat cattatcgaa 900aatagctttc tttttcctgg atattgtggg cttgtctctg atttaatcaa aattttccca 960aaatatacag gcgcaattga agccgcattg ggtccaactt taaaacaaat tgttgttgac 1020caacctgaaa ccgcagtttc agcaattaat tttctaaaga aaaattatgc aggaagcgca 1080acatttatcc ccctttcaac attaaaaccg cgatttattc ccgatttata tcttgaacat 1140ctaaattcac aaaaaggttt tataaattta gctagcaatt tagtcgattt tgaaaaaaaa 1200tacaagattt tagcggattt tttactagga gggattattg ttgctgatac aattgattca 1260gcaaatcgaa tcgcaaactt ccttaaccac aaaaacatga tcgtaacttt agacggcgat 1320gttattagaa ctagcgggat aatttctggg ggtcataaga taaaaaatga ttcttccttt 1380tcaattcagt ataaaatcga tgaactaaca aataatttga atttttttga agaaaaaatt 1440caagaattta aagttaaatc taatgaattt gaacagttaa ttacaagaga atctgtattt 1500ttacagcaaa ttaatattaa tcttaatgat ttagagcaaa aatttagtaa ttctgaaaat 1560gaattaatcg aaattaaagc tcaaaatgaa ggtcttgaag agagtctaaa tcaaaaagat 1620gacctaaatt taagtctaaa tcgaacttta aaagaaaaaa ttgaacttga aaatgtggtt 1680ttagaacttg aaaatcaatg caaaatttta aaaactgaaa aaaaacagct cgataatcaa 1740atttcagaac ttacagtttt agttcaagaa cttaaccaaa aacagcgaaa aatcaacgca 1800gatcttaacc aaaatcaaaa ttacaaagac aaatatgaat ttttaattac aaatttacga 1860aataatttat cccaaaaata cagtctaact tttgaaggcg cagctcaaaa atatgaactt 1920gaaattccag aaaaagatgc tcgcgaattt gttaatagtc taaatttaga gattaaagcg 1980cttggaaatg ttaatttaga tgcaattaat gactttgaaa caacgagtca aagactcgaa 2040aaactaaaaa aaagtcaaaa tgaacttgaa actgccaggt caaaaatttt agaagttatc 2100tcggatttag ataaaattat cattggaaaa acccaggaaa ttgtcgatct agttaattcc 2160gagtttaacc ttgttttcca gaatatgttt ggtgggggaa gtgcaaaaat ttattttagt 2220gataaaaacg atattttaaa ttcggggatt gaaataagtg cccaaccacc tggaaaaact 2280atcaaaaata ttaggctttt ttctgggggc gaaaaggcaa ttattgcaat ttcacttttg 2340ttttcaatta ttaaggcaag accaattccg ctttgcattc ttgatgaagt tgaagctgcc 2400cttgatgagt caaatgtgat cagatatgtg gaatttcgaa agcagttaaa acaaaaaacg 2460cagtttttga tcatcaccca tcggcacgga acgatgtccc gagttgatca acttttagga 2520atc 2523<210>30<211>84l<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述克隆pAD742的推定的蛋白质序列<400>30Met Lys Leu Ile Lys Ile Glu Ile Glu Gly Phe Lys Ser Phe Ala Glu1 5 10 15Pro Val Ser Ile Lys Phe Asp Gly Ser Ile Val Gly Ile Ile Gly Pro20 25 30Asn Gly Ser Gly Lys Ser Asn Ile Asn Asp Ala Ile Lys Trp Val Leu35 40 45Gly Glu Lys Ser Val Lys Gln Leu Pro Gly Pro Asn Met Asp Asp Gly50 55 60Ile Phe Ala Gly Ser Lys Thr Gly Met Ile Ala Ile Glu Lys Ile Glu65 70 75 80Ile Arg Thr Lys Glu Leu Glu Lys Gln Val Lys Gln Leu Glu Lys Gln85 90 95Ala Glu Asn Ala Lys Ile Tyr Leu Glu Lys Ser Lys Gln Leu Glu Ser100 105 110Val Glu Val Gly Leu Ile Val Ser Asp Ile Lys Lys Tyr Gln Thr Glu115 120 125Leu Asp Gln Val Gln Glu Lys Leu Asn Asp Leu Lys Phe Gln Glu Pro130 135 140Lys Phe Ile Ser Glu Ile Glu Ala Asn Glu Lys Ile Ile Ile Thr Asn145 150 155 160Thr Gln Lys Arg Ser Glu Ile Glu Ala Glu Ile Asn Thr Lys Asn Arg165 170 175Glu Ile His Arg Leu Lys Glu Gln Ile Asn Thr Leu Asn Leu 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aaaaaactgg aaaaaatcct 300tcaaaattag aaggatttaa caaaaatccg caaattgatg ctcaaattta tcagctgcac 360attcgagatt tttcatctat tagtaaaaaa acagaaaata aaggtacttt tatcggagcg 420ctagaaaatg atgtttttag ttatttaaat agcttaaaat ttaatttttt acaattatta 480ccaatccact cttgttataa tttcagccaa aaaaacgcta gcatcctcca caaaggggat 540ggaaacggtc attttagcac ttataattgg ggttatgacc caattggtta cttttcgata 600aattcaagtt attcaacaga tccaatggat ccatatctgc gaatttttga gtttaaaaaa 660tttgttgact ccgcccataa aaataagatc ggaattgttc ttgatgttga ttttagtcac 720acctttaaaa attcaattct tgaggatgta gctcacgggc atttttaccg ggatgaagca 780gctgttttac ctgccggatt tccgccactt gatacacgaa aaccaatggc atttaggcta 840attttggatt ccttaatttt ttttactaaa tattataaag ttgatggatt tcgctttaat 900ttagcatctt ttttagataa aaaagcaatt acagttattg ccagtgaact aaaaaaagtt 960aatccaaata ttcttttata tggtgatttt tcaaatccta gtgacctacc aagcagaaat 1020cgacttgaaa aagggaaaac aggaaatagt tttaactttg gatatttaaa cgatacaatc 1080caaacagcaa ttatcgggag cggaaatccg cgtgataaag gtttaatttt atcaaaaact 1140agtaaaaaat tcgctgctta tgtttcttca attccgggga acattgcaaa ttttgacttc 1200caaaatttgc catattcaaa aaaaaaatac gacctttttg caaacgatat cagcctaaat 1260cttgcctatc ttacttgtta taatggcccg actttagccg ataaaattct tagtgcgaca 1320acgcgaattg gaaaaagaga atttcttgaa atctaccggc aagccttaat gatggtcaat 1380tttgtccaag gaaaaatttc acttagtgct gggactgaat ttgctttttc aagaatttgt 1440gatttttctg ggggcagtta tcaaaattgc tatcctaatt taaacataaa aagaccgcct 1500ttttcgtttt tagcgggcaa atatcttgat tttcattctg ataaaaccac agatttcaca 1560aatggattga attttgaaat tcttaaaaac aatgaaatca aagagaaaat ctttgatttt 1620cttgccgaaa ttaatcaatt tcgccaaaat tctccatttt ttcggcttga tacaaaccaa 1680aaaatcaaaa aacagctaaa atttgaaact gttgataaca ataaaggatt aattatcttt 1740aaaattctgc taaaaataaa gtgattaaag ttattcataa tttttcacat ctttcttatg 1800aatatgattt taaaaatttt aatattcttt ttagctcaaa gattaaagtt attcctaatt 1860<210>34<211>620<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述克隆pAD774的推定的蛋白质序列<400>34Glu Phe Tyr Leu Trp Ser Pro Asn Ala Asn Arg Val His Phe Ala Ile1 5 10 15Tyr Lys Asp 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gtcaatgcaa aaaagatgcc agtttttaaa ggatgtttct 360gaaaaattag atttgaaatt caatttaatt tgcaaaccag ttcaagaaat taatccacaa 420aaatttgata taataactgc cagagcagtg gcaaatttgg aaaagcttga gaaaattaca 480aaaaaaattc attttccaaa aacgctttta gcttttatta aagggcccaa agtttttaat 540gaagttcaaa attgtaaaaa ttgtaattat aaaatcatta aagttaataa taatataaat 600aaaaaaattt ttatcgcatt taaacaagtt tct 633<210>60<211>211<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述克隆pAD994的推定的蛋白质序列<400>60Ile Lys His Phe Phe Lys Arg Phe Glu Met Tyr Lys Arg Leu Val Gln1 5 10 15Glu Phe Phe Pro Lys Leu Asp Phe Glu Asn Leu Glu Lys Tyr Val Asn20 25 30Leu Ile Glu Phe Ser Asn Lys Asn Phe Asn Leu Thr Ala Phe Ser Gly35 40 45Asp Ile Leu Trp Lys Glu Gly Ile Phe Glu Ser Ile Phe Thr Met Asn50 55 60Phe Ile Val Gly Leu Val Asn Asn Lys Glu Asn Lys Lys Leu Lys Ile65 70 75 80Leu Asp Ile Gly Ala Gly Ser Gly Phe Pro Ser Ile Pro Phe Leu Ile85 90 95Thr Asn Pro Glu Ile Glu Leu Thr Ile Ser Glu Ser Met Gln Lys Arg100 105 110Cys Gln Phe Leu Lys Asp Val Ser Glu Lys Leu Asp Leu Lys Phe 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atatggaaaa acatagtgtt 1140tcaaagctaa ttggggctcc tccgggttat attggttttg aacaaggtgg taatctaaca 1200aataaagtaa gactaaatcc ttattcgatt attttgcttg atgaaattga aaaagctcat 1260ccggaagtaa tcaacatttt tttacaaatt cttgataatg gtgaaattgt tgatagtaag 1320tcacaaaaag taaattttcg caatacaatt ataattatga cctcaaatat cggtgctaat 1380aaaattcttg agggtaaaaa gatgaatgaa attgaggcaa aaaaggaact tttaagatat 1440ttaaagccag aatttctcaa ccgaattgat gaaattatcg tatttaatcc tttaaattat 1500gatataattt ttgaaattat tgaacttgaa ctaaaggatt tgcaaaatcg tctaaaggaa 1560aataattttg agattgaatt tgaaaaatca gtcaaaaatt gaattttaga gtttggatat 1620gataaaaatt ttggtgccag gccaattaag cgctttatta agaaagaaat tgaaaatttt 1680gttgccaaaa aaatagtggc cgaagaaatt ttaaaagata aaaaatacaa tttatctttt 1740aaaaatgata aattgcatct taatgaaagc gaaaat 1776<210>72<211>592<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述克隆pAD1038的推定的蛋白质序列<400>72Glu Phe Glu Lys Arg Ile Lys Ala Ile Leu Gln Glu Ile Glu Gln Asn1 5 10 15Ser Asp Gln Val Ile Ile Phe Ile Asp Glu Ile His Leu Leu Ile Gly20 25 30Thr Gly Ser 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255Thr Leu Tyr Tyr Lys Asn Asn Asn Ser260 265<210>75<211>453<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述克隆pAD702<400>75tcttatgaga aaaaatattt acctttgcta atagtccctg gaatttttgg cgctatttta 60ttttttcttt ttattaaaac acttttagac tataaagcaa tcaaaaaatc tgttatttat 120tttcgttccc agttgcaaaa taatgcaaat cgacttgaaa tgccaccaat gattccatga 180cttgtaaaaa aagtgaatca aaaagaggta aatgctatct gacttagcgg ctttactttg 240tttgcaacaa ttatgatggg cttaacttac tgagtgttat taaaatatta tccggagaaa 300aatattcaaa attctgccga atatataact gcaatggcag taaatggcgc tttgtttata 360gttatgctaa tttatgattt aatgcttcgt cggcgtttgg gaaatattga agcaattttt 420ggtcccattt atcataaaag ttttgatata ggt 453<210>76<211>151<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述克隆pAD702的推定的蛋白质序列<400>76Ser Tyr Glu Lys Lys Tyr Leu Pro Leu Leu Ile Val Pro Gly Ile Phe1 5 10 15Gly Ala Ile Leu Phe Phe Leu Phe Ile Lys Thr Leu Leu Asp Tyr Lys20 25 30Ala Ile Lys Lys Ser Val Ile Tyr Phe Arg Ser Gln Leu Gln Asn Asn35 40 45Ala Asn Arg Leu Glu Met Pro Pro Met Ile Pro Trp Leu Val Lys Lys50 55 60Val Asn Gln 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Ser Lys Ser Glu Leu Ser Lys Ile Glu Ser Asn Ile20 25 30Phe Asn Phe Ile Ile Asn Glu Asn Glu Lys Asn Leu Thr Arg Phe Thr35 40 45Ala Thr Leu Val Lys Lys Thr Asn Asn Asn Leu Thr Phe Val Ser Thr50 55 60Phe His Ser Leu ASn Ser Ile Lys Asn Asn Ile Gln Gln Gln Val Phe65 70 75 80Asp Ile Phe Leu Gln Gln Phe Ser Val Lys Asn Leu Glu Thr Lys Leu85 90 95Lys Ser Lys Ile Arg Val Glu Tyr Glu Asn Lys Glu Lys Asp Ile Ile100 105 110Val Phe Ser Leu Asp Ile Lys Glu Pro Leu Leu Leu Arg Ile Ser Asp115 120 125Ser Ile Asp Phe Gln Val Leu Glu Asp Phe Thr Asn Thr Lys Asn Ser130 135 140Leu Phe Ser Leu Arg Phe Leu Thr Asp Leu Lys Arg Arg Phe145 150 155<210>83<211>123<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述克隆pAD996<400>83agctatctat taattatgat gccgcagggg gaacctatca cactactggt taaggtcatt 60acgctagcgg ttatgcactc agatgaaaat gctgaaaggt acataaactc tgatgatccg 120atc 123<210>84<211>41<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述克隆pAD996的推定的蛋白质序列<400>84Ser Tyr Leu Leu Ile Met Met Pro Gln Gly Glu Pro Ile Thr Leu Leu1 5 10 15Val Lys Val Ile Thr Leu Ala Val Met His Ser Asp Glu Asn Ala Glu20 25 30Arg Tyr Ile Asn Ser Asp Asp Pro Ile35 40
权利要求
1.一种鉴定由表达载体中核苷酸序列翻译得到的表达蛋白质的方法，该方法包括与由核苷酸序列翻译得到的蛋白质共表达标记物。
2.一种鉴定由来自核苷酸序列混合物的核苷酸序列翻译得到的表达蛋白质的方法，该方法包括下列步骤提供包含标记物的表达载体；将来自混合物的核苷酸序列导入表达载体；并通过测定包含与表达蛋白质共表达的标记物之融合蛋白质的存在，来鉴定由表达载体表达的表达蛋白质。
3.权利要求1或2的方法，其中标记物是可检测标记物。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中标记物少于30个氨基酸并选自下组(a)聚His标签；(b)FLAG标签；(c)I-SPY表位标签；(d)血凝素标签；和(e)c-Myc表位标签。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中标记物是聚His标签。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中聚His标签包含4-8个连续组氨酸残基。
7.权利要求6的方法，其中聚His标签包含6个连续组氨酸残基。
8.权利要求2-7任一项的方法，其中表达载体是真核表达载体。
9.权利要求2-8任一项的方法，其中进一步用表达载体转染宿主细胞以表达表达蛋白质。
10.权利要求1-9任一项的方法，其中表达蛋白质通过抗标记物抗体或金属螯合物缀合探针进行鉴定。
11.权利要求10的方法，其中抗标记物抗体是抗聚His抗体。
12.权利要求1-11任一项的方法，进一步包括通过利用与表达蛋白质共表达的标记物来纯化表达蛋白质，该方法包括通过标记物来选择表达蛋白质。
13.一种由权利要求1-12任一项的方法鉴定的纯化重组蛋白质。
14.一种编码权利要求13的重组蛋白质的纯化核苷酸序列。
15.一种筛选以鉴定文库中表达克隆的方法，该方法包括提供核苷酸序列来源；提供包含标记物的表达载体；将核苷酸序列导入表达载体；用表达载体转化宿主细胞以构建表达文库；并通过检测包含与表达蛋白质共表达的标记物之融合蛋白质的表达，来找出表达克隆。
16.一种筛选核苷酸序列文库以鉴定表达的核苷酸序列的方法，该方法包括下列步骤提供核苷酸序列来源；提供包含标记物的表达载体；通过将核苷酸序列导入表达载体来构建文库；通过测定包含与由核苷酸序列翻译得到的表达蛋白质共表达的标记物之融合蛋白质的存在，来鉴定由表达载体表达的表达蛋白质；并测定表达蛋白质的核苷酸序列。
17.一种由核苷酸序列样品鉴定抗原基因序列的方法，该方法包括下列步骤提供包含标记物的表达载体；将来自样品的核苷酸序列导入表达载体；通过测定包含与由核苷酸序列翻译得到的表达蛋白质共表达的标记物之融合蛋白质的存在，来鉴定由蛋白质载体表达的抗原表达蛋白质；鉴定抗原表达蛋白质；并测定由表达载体编码的抗原表达蛋白质的基因序列。
18.一种由核苷酸样品鉴定编码疾病治疗性抗原蛋白质的治疗性抗原基因序列的方法，该方法包括下列步骤提供包含标记物的表达载体；将来自样品的核苷酸序列导入表达载体；通过测定包含与由核苷酸序列翻译得到的表达蛋白质共表达的标记物之融合蛋白质的存在，来鉴定由表达载体表达的抗原表达蛋白质；用表达抗原表达蛋白质的表达载体接种动物；用疾病攻击动物；鉴定提供由接种疫苗诱导的治疗性效果的表达载体和表达蛋白质；并测定由表达载体编码的抗原表达蛋白质的基因序列。
19.权利要求15-18任一项的方法，其中文库是翻译成支原体多肽的核苷酸序列文库，该方法包括下列步骤由支原体样品提供核苷酸序列来源；提供包含标记物的表达载体；将核苷酸序列导入表达载体；通过测定包含与由核苷酸序列翻译得到的表达蛋白质共表达的标记物之融合蛋白质的存在，来鉴定由表达载体表达的支原体表达蛋白质；并测定支原体表达蛋白质的核苷酸序列。
20.权利要求19的方法，其中支原体是猪肺炎支原体。
21.权利要求15-20任一项的方法，其中标记物是聚His标签。
22.一种由权利要求16-21任一项的方法鉴定的核苷酸序列。
23.一种具有依照图1-42任一项的序列，或SEQ ID NO1、SEQ IDNO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23、SEQ ID NO25、SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ ID NO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37、SEQ ID NO39、SEQ ID NO41、SEQ ID NO43、SEQ ID NO45、SEQ ID NO47、SEQ ID NO49、SEQID NO51、SEQ ID NO53、SEQ ID NO55、SEQ ID NO57、SEQ ID NO59、SEQ ID NO61、SEQ ID NO63、SEQ ID NO65、SEQ ID NO67、SEQ ID NO69、SEQ ID NO71、SEQ ID NO73、SEQ ID NO75、SEQ ID NO77、SEQ ID NO79、SEQ ID NO81、SEQ ID NO83的支原体核苷酸序列或其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段。
24.一种包含权利要求22或23的核苷酸序列的重组载体。
25.一种包含权利要求24的重组载体的宿主细胞。
26.一种编码由权利要求1-12任一项的方法鉴定的蛋白质之氨基酸序列。
27.一种具有依照图1-42任一项的序列，或SEQ ID NO2、SEQ IDNO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ ID NO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36、SEQ ID NO38、SEQ ID NO40、SEQ ID NO42、SEQ ID NO44、SEQ ID NO46、SEQ ID NO48、SEQ ID NO50、SEQ ID NO52、SEQ ID NO54、SEQ ID NO56、SEQ ID NO58、SEQ ID NO60、SEQ ID NO62、SEQ ID NO64、SEQ ID NO66、SEQ ID NO68、SEQ ID NO70、SEQ ID NO72、SEQ ID NO74、SEQ ID NO76、SEQ ID NO78、SEQ ID NO80、SEQ ID NO82、SEQ ID NO84的支原体氨基酸序列，或其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段。
28.一种由权利要求26的氨基酸序列编码的分离的和纯化的多肽。
29.一种由权利要求27的氨基酸序列编码的分离的和纯化的多肽。
30.一种由权利要求22或23的核苷酸序列翻译得到的分离的和纯化的多肽。
31.一种对权利要求13、28、29、或30任一项的多肽特异的抗体。
32.权利要求31的抗体，该抗体是单克隆抗体。
33.一种治疗感染的方法，该方法包括施用有效量的权利要求28-30任一项的抗原多肽。
34.一种治疗感染方法，该方法包括对需要的动物施用有效量的包含权利要求22或23的核苷酸序列的DNA分子。
35.权利要求34的方法，其中DNA分子通过权利要求24的重组载体进行施用。
36.一种治疗感染方法，该方法包括施用有效量的对权利要求31或32的多肽特异的抗体。
37.权利要求33-36任一项的方法，其中感染是支原体感染。
38.权利要求37的方法，其中感染是猪肺炎支原体感染。
39.权利要求34或35的方法，其中核苷酸序列包含依照图1-42任一项的序列，或SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ IDNO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ IDNO23、SEQ ID NO25、SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ IDNO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37、SEQ IDNO39、SEQ ID NO41、SEQ ID NO43、SEQ ID NO45、SEQ IDNO47、SEQ ID NO49、SEQ ID NO51、SEQ ID NO53、SEQ IDNO55、SEQ ID NO57、SEQ ID NO59、SEQ ID NO61、SEQ IDNO63、SEQ ID NO65、SEQ ID NO67、SEQ ID NO69、SEQ IDNO71、SEQ ID NO73、SEQ ID NO75、SEQ ID NO77、SEQ IDNO79、SEQ ID NO81、SEQ ID NO83，或其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段。
40.权利要求33或36的方法，其中多肽由依照图1-42任一项的氨基酸序列，或SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ IDNO8、SEO ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ IDNO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ IDNO24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO28、SEQ ID NO30、SEQ IDNO32、SEQ ID NO34、SEQ ID NO36、SEQ ID NO38、SEQ IDNO40、SEQ ID NO42、SEQ ID NO44、SEQ ID NO46、SEQ IDNO48、SEQ ID NO50、SEO ID NO52、SEQ ID NO54、SEO IDNO56、SEQ ID NO58、SEQ ID NO60、SEQ ID NO62、SEQ IDNO64、SEQ ID NO66、SEQ ID NO68、SEQ ID NO70、SEQ IDNO72、SEQ ID NO74、SEQ ID NO76、SEQ ID NO78、SEQ IDNO80、SEQ ID NO82、SEQ ID NO84，或其突变体、类似物、衍生物、或功能活性片段编码。
全文摘要
本发明涉及鉴定可能地疫苗抗原的基因序列的方法。还包括了基因序列和由基因序列编码的多肽,以及这种序列在动物中诱导保护性免疫应答的用途。特别地,本发明涉及鉴定支原体,优选猪肺炎支原体的可能地抗原基因序列。在本发明的一个方面,提供了一种鉴定由表达载体中的核苷酸序列翻译的表达蛋白质之方法,所述方法包括与由核苷酸序列翻译的蛋白质共表达的标记的用途。在本发明的又一方面,提供了一种从核苷酸序列样品中鉴定编码疾病治疗性抗原蛋白质的治疗性抗原基因序列的方法。优选地,标记为聚His标签。
文档编号A61K35/76GK1331699SQ99814733
公开日2002年1月16日 申请日期1999年11月19日 优先权日1998年11月20日
发明者R·J·穆尔, T·J·多兰 申请人:联邦科学和工业研究组织