Mir-15微小rna家族的抑制剂的制作方法
【专利说明】MIR-15微小RNA家族的抑制剂
[0001] 相关申请
[0002] 本申请主张2012年6月21日提交的美国临时申请第61/662, 772号和2013年3 月13日提交的美国临时申请第61/780, 352号的优先权和权益，其各自以全文引用并入本 文中。
[0003] 电子提交文本的描述
[0004] 本发明电子提交文本的内容通过全文引用并入本文：序列表的计算机可读形式副 本（文件名：MIRG-037_02US_SeqList_ST25.txt，记录日期2013年6月19日，文件大小10 千字节。） 发明领域
[0005] 本发明是关于微小RNA(miRNA或miR)抑制剂的化学基序（motif)。更具体的是， 本发明是关于化学修饰的寡核苷酸，其靶向一个或多个miR-15家族成员，并且当给予患者 时具有效力、递送效率、靶向特异性、稳定性、和/或毒性的益处。
[0006] 发明背景
[0007] 微小RNAs(miR)已牵涉于多个生物过程中，包括调节和维护心脏功能（参 见E.VanRooij等人.，J.Clin.Invest. 117(9): 2369-2376(2007) ;K.Chien,Nature 447:389-390(2007))。因此，miR代表了针对诸如心脏肥大（cardiachypertrophy)、心肌 梗塞（myocardialinfarction)、心力衰竭（heartfailure)、血管损伤（vasculardamage) 及病理性心脏纤维化（pathologiccardiacfibrosis)等状况的一类相对新的治疗革巴物。 miR为约18至约25个核苷酸长的非蛋白质编码的小RNA，且当与其革EmRNA完全互补时通 过促进靶mRNA降解，或当它们的序列含有错配时通过抑制翻译，来充当靶mRNA的抑制剂。 其机制涉及将成熟miRNA链整合到RNA诱导的沉默复合物（RISC)中，其中通过碱基互补配 对来与靶RNA结合。
[0008] 可以通过反义多核苷酸或通过模拟miRNA功能的多核苷酸（miRNA模拟剂）治 疗性革G向miRNA功能。然而，用基于寡核苷酸的试剂革E1向处理miRNA具有若干挑战，包 括RNA结合亲和力和特异性，细胞摄取的效率，核酸酶抗性。例如，当多核苷酸导入到 完整细胞中时它们被核酸酶攻击并降解，导致活性丢失。虽然已经制备了多核苷酸类似 物以试图避免被其降解，例如通过2'取代（B.Sproat等人，NucleicAcidsResearch 17:3373-3386,（1989))，该修饰常影响多核苷酸对于其预定生物作用（intended biologicalaction)的效力。在每个情况下，这类减少的效力可归因于经修饰的多核苷酸 不能与靶RNA形成稳定双螺旋和/或与细胞机器间相互作用的丢失。其他修饰包括锁核酸 (lockednucleicacid)，其具有改善RNA结合亲和力的潜能。（参见，R.Veedu等人.，RNA Biology6(3):321-323(2009)).
[0009] 用于miRNA抑制剂的寡核苷酸化学模式或基序具有改善抑制剂的递送、稳定性、 效力、特异性和/或毒性形态的潜能，并且在治疗情况下这些是有效地靶向miRNA功能所需 的。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明提供化学修饰的寡核苷酸，其能够降低或抑制包含11111?-15&，11111?-1513，11111?-16，miR-195，miR-424,和miR-497在内的一个或多个miR-15家族成员的活性。本发明进一 步提供包含寡核苷酸的组合物，以及治疗患有与一个或多个miR-15家族成员有关或涉及 一个或多个miR-15家族成员的状况或病症的受试者的方法。在各个实施方案中，所公开的 寡核苷酸在效力、递送效率、靶特异性、毒性和/或稳定性的一个或多个方面提供益处。
[0012] -方面，本发明提供了一种能减少或抑制一个或多个miR-15家族成员的活性的 化学修饰寡核苷酸。寡核苷酸的活性或效力可以在体外和/或体内测定。例如，在约50nM 或更低，在其他实施方案中约40nM或更低，约20nM或更低，或约10nM或更低的浓度时，寡 核苷酸可显著抑制（例如，约50%抑制）一个或多个miR-15家族成员的活性（如例如以 两步实时荧光定量PCR分析或双重萤光素酶分析）。或者，或此外，寡核苷酸的活性可以 在适合的小鼠或大鼠模型，或非人类灵长类动物模型中测定，其中在约50mg/kg或更低，诸 如约25mg/kg或更低，约10mg/kg或更低，或约5mg/kg或更低的剂量下观测对一个或多 个miR-15家族成员的抑制（例如，至少约50%)。本文描述了用于测定祀物去抑制作用 (de-r印ression)的示例性标记物。在这些实施方案中，寡核苷酸可经皮下或静脉内（如本 文中所描述）给与，并可以以水性制剂（例如，盐水）中配制。
[0013] 寡核苷酸包含核苷酸序列5' -GTGCTGCT-3'，并与一个或多个miR-15家族成员的 核苷酸序列实质上互补。寡核苷酸进一步含有至少一个锁核苷酸。在一实施方案中，寡核 苷酸含有至少8个锁核苷酸。锁核苷酸可以具有如W0 2012/083005 (以全文的方式并入本 文中）中所描述的2'至4'桥结构。例如，锁核苷酸可具有包含乙烯基或亚甲基的2'至4' 桥。在其他实施方案中，锁核苷酸可具有2'至4'亚甲基桥。
[0014] 一般而言，寡核苷酸的长度和锁核苷酸的数量以及位置是使得该寡核苷酸在体外 实时荧光定量PCR分析或萤光素酶分析中在约50nM或更低的寡核苷酸浓度下，或在如本文 所描述的适合啮齿动物模型或非人类灵长动物模型中在约25mg/kg或更低剂量下，降低一 个或多个miR-15家族成员的活性。在一实施方案中，寡核苷酸的长度为约8个至约18个 核苷酸。在另一实施方案中，寡核苷酸的长度为约12个至约17个核苷酸。
[0015] 在一个示例性实施方案中，寡核苷酸的长度为约16个核苷酸。寡核苷 酸可包含选自于以下的核苷酸序列或基本上由选自于以下的核苷酸序列所构成： 5'-ACCATTATGTGCTGCT-3'（SEQIDN0.1)，5'-ACCATGATGTGCTGCT-3'（SEQIDN0.2)， 5'-ATATTTACGTGCTGCT-3'（SEQIDN0.3)jP5'-ATATTTCTGTGCTGCT-3'（SEQIDN0.4)。 寡核苷酸可以包含9个锁核苷酸或7个非锁核苷酸。锁核苷酸的模式可以是在至少位置1、 5、8、10和16为锁核苷酸。
[0016] 在另一个示例性实施方案中，寡核苷酸的长度为约12个核苷酸。寡核苷酸可包含 选自以下的核酸序列或基本上由选自以下的核酸序列所构成：5' -TTATGTGCTGCT-3'（SEQ IDN0.5)，5'-TTACGTGCTGCT-3'（SEQIDN0.6)，5'-TTCTGTGCTGCT-3'（SEQID NO. 7),5? -TTCCGTGCTGCT-3,(SEQIDNO.8),5' -TGATGTGCTGCT-3'（SEQID N0.9)，5'-TGACGTGCTGCT-3'（SEQIDN0.10)，5'-TGCTGTGCTGCT-3'（SEQIDN0.11),和 5'-TGCCGTGCTGCT-3'（SEQIDNO. 12)。寡核苷酸可包含8个锁核苷酸和4个非锁核苷酸。 锁核苷酸的模式可以是在至少位置1，4,9和12为锁核苷酸。
[0017] 在又一示例性实施方案中，寡核苷酸的长度为约8个核苷酸。寡核苷酸可基本上 由或由序列5' -GTGCTGCT-3'构成，其中全部或基本上全部（例如，至少6个或至少7个） 为锁核苷酸。
[0018] 在各个实施方案中，与一个或多个miR-15家族成员的种子区互补的区域包含至 少约4个锁核苷酸，在另一个实施方案中，寡核苷酸不含有具有超过3个连续非锁核苷酸和 /或超过3个连续锁核苷酸的核苷酸段。
[0019] 关于非锁核苷酸，核苷酸可含有关于2'羟基的2'修饰。在一些实施方案中，2'修 饰可独立地选自脱氧基、0-烷基，0-甲基，卤基，和氟基。例如，2'修饰可以为脱氧基。在 一实施方案中，寡核苷酸中所有的非锁核苷酸为2'脱氧基。
[0020] 寡核苷酸还可包含一个或多个硫代磷酸酯连接。例如，寡核苷酸可为完全硫代磷 酸酯连接的或可含有约半数或3/4的硫代磷酸酯连接。
[0021] 示例性的寡核苷酸抑制剂示于表1中。
[0022] 在其他实施方案中，寡核苷酸可含有5'和或3'帽结构。在又一实施方案中，寡核 苷酸可进一步包括侧接的亲脂性基团（pendentlipophilicgroup)。
[0023]另一方面，本发明提供了包含本发明寡核苷酸的药学组合物和配制剂，其可涉及 将寡核苷酸并入到用于细胞递送的多种大分子装配体（macromolecularassembly)、胶束 或脂质体组合物中。在某些实施方案中，寡核苷酸配制用于传统的静脉内、皮下或肌肉内剂 量给药。这样的配制剂可以为传统的水性制剂，例如盐水配制剂。在某些实施方案中，组合 物可适用于或配制为皮内、皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射，或直接注射至靶组织（例 如，心脏组织）。
[0024] 在其他方面中，本发明提供了一种用于将寡核苷酸和药学组合物在体外或离体递 送到哺乳动物细胞的方法，例如，用于治疗、改善或预防哺乳动物受试者的状况的进展。该 方法可包含以