紫茎女贞总苷诱导抗病毒细胞因子的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及紫茎女贞总苷，具体是紫茎女贞总苷诱导抗病毒细胞因子的应用。
【背景技术】
[0002]紫莖女贞(Ligustrum purpurascensY.C Yang)为木樨科女贞属植物，主要分布在我国西南地区的云南、贵州、四川等地，是民间传统的药用植物，多以植物的嫩叶或叶入药，性味苦甘，具有疏风清热、明目生津功效；主治风热头痛、齿痛、目赤、脖耳、口疮、热病烦渴、痢疾等症，在我国民间已有两千多年的药用历史。
[0003]紫茎女贞主要含苯丙素苷类化合物、黄酮类化合物、萜类化合物等。其中苯丙素类化合物包括:紫莖女贞苷(ligupurpuroside)A、B、M、N，阿克苷(acteoside)，顺式紫莖女贞苷(cis-ligupurpuroside)B，异阿克苷(isoacteoside)，松果菊苷(echinacoside)，松果菊昔(echinacoside) A 和紫蔵昔(campenoside) II ;黄酬类化合物包括槲皮素(quercentin)，金丝桃苷(hyperoside)，木庫草素-rJ-葡萄糖苷(leuteolin-7-glucoside)，大波斯菊苷(cosmosiin)，野漆树苷(rhoifolin)，山柰酸(kaempferol)，异鼠李素(isorhamnetin)，烟花苷(nicotif1rin)和序菜素(apigenin)等。
[0004]抗病毒细胞因子是由机体细胞分泌的，具有联动机体固有免疫和特异性免疫应答，进而抑制或捕杀体内病毒的小分子蛋白。抗病毒细胞因子可分两大类:一类可直接作用体细胞产生抗病毒蛋白，即(I)干扰素:IFN-a、IFN-β、IFN-γ和IFN-λ (IL-28、IL-29)，
(2)肿瘤坏死因子:TNF-a和TNF-β ;干扰素和肿瘤坏死因子可直接激活细胞内JAK(Janusactivated kinase) -STAT (Signal transducer and activator of transcript1n)信号通路，随后引起下游信号级联反应，包括MTOR信号通路、PI3K信号通路、MAPK信号通路均被激活，最终启动细胞核中一些关键的蛋白基因进行转录，翻译出抗病毒蛋白进而对细菌、病毒以及癌细胞等产生防御作用。另一类是能激活巨噬细胞、自然杀伤细胞和毒性T淋巴细胞等细胞，进而捕杀或吞噬体内病毒的细胞因子，即白介素:IL_1 β、IL-2、IL-6、IL_8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-27 等。
[0005]根据目前的资料显示，尚未检索到有关紫茎女贞总苷诱导抗病毒细胞因子的应用的报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提出紫茎女贞总苷的新应用，特别是紫茎女贞总苷诱导抗病毒细胞因子的应用。
[0007]进一步地，所述紫茎女贞总苷按照以下方法提取而得:取木樨科女贞属植物紫茎女贞的干叶，加入乙醇，加热回流提取，将所得乙醇提取物用水溶解，水溶物用Dia1n或大孔吸附树脂柱层析分离，以水-乙醇或水-甲醇混合液洗脱，浓缩洗脱液得到紫茎女贞总苷。
[0008]进一步地，所述加入乙醇的量为紫茎女贞干叶重量的8?10倍。
[0009]进一步地，所述加热回流提取的次数是三次。
[0010]进一步地，所述加热回流提取的温度是60?100°C。
[0011 ] 进一步地，所述水-乙醇或水-甲醇混合液的体积比为0.5?1.5:1。
[0012]进一步地，所述水-乙醇或水-甲醇混合液的体积比为1:1。
[0013]进一步地，所述紫茎女贞总苷为淡黄色粉末，有香味，易溶于水，其水溶液为淡黄色或棕黄色。
[0014]进一步地，所述紫茎女贞总苷在薄层色谱的硅胶板上有七个斑点，比移值Rf依次为 0.035,0.129,0.259,0.483,0.603,0.638,0.922。
[0015]进一步地，所述抗病毒细胞因子为IFN-a、IFN-β和IFN-γ。
[0016]进一步地，所述抗病毒细胞因子是淋巴细胞和/或巨噬细胞分泌的。
[0017]一种紫茎女贞总苷制剂，所述制剂含有上述任一项权利要求的紫茎女贞总苷，以及药用载体、辅料或稀释剂，本领域技术人员可以通过本领域专业书籍获知这些在药学上可接受的药用载体、辅料或稀释剂。
[0018]本发明紫茎女贞总苷制剂可以是胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、注射剂、滴丸、粉针剂和口服液剂中的一种。
[0019]本发明通过实验证明紫茎女贞总苷能在体外诱导小鼠淋巴细胞和巨噬细胞分泌细胞因子:分离得到小鼠淋巴细胞和巨噬细胞，加入不同浓度的紫茎女贞总苷，通过ELISA实验检测细胞培养上清液中抗病毒细胞因子(IFN-α、IFN-β和IFN-γ)的水平，证明紫茎女贞总苷对淋巴细胞和巨噬细胞分泌IFN-a，IFN-β和IFN-γ有促进作用。当紫茎女贞总苷浓度是50 μ g/ml时，紫茎女贞总苷诱导淋巴细胞分泌IFN- a和IFN- β的量达到最高，当紫茎女贞总苷浓度是25 μ g/ml时，紫茎女贞总苷诱导淋巴细胞分泌IFN-γ达到最高，当紫茎女贞总苷浓度是50?100 μ g/ml时，紫茎女贞总苷诱导巨噬细胞分泌IFN- a和IFN-β的量达到最高，当紫茎女贞总苷浓度是50 μ g/ml时，紫茎女贞总苷诱导巨噬细胞分泌IFN-γ达到最高。
[0020]本发明通过实验证明紫茎女贞总苷能在体内诱导免疫低下小鼠分泌细胞因子:将小鼠分组，用环磷酰胺造模，灌胃给予不同剂量的紫茎女贞总苷，通过ELISA实验测定外周血中IFN-β，IFN-y含量，证明紫茎女贞总苷对环磷酰胺引起的血清中IFN-β和IFN-γ低下具有一定的恢复作用，其中，中剂量组上调血清中IFN-β和IFN-γ水平的效果最明显O
[0021]本发明的有益效果是:
[0022]1.本发明从紫茎女贞提取出总苷，并利用HPLC、TLC等手段对其进行表征。
[0023]2.本发明提取制备紫茎女贞总苷的方法快速有效，安全可靠，而且原料来源广泛，适合大规模生产。
[0024]3.本发明通过实验证实紫茎女贞总苷能在体内能诱导机体产生内源性抗病毒细胞因子，也能在体外诱导细胞产生抗病毒细胞因子，可以开发成治疗与抗病毒细胞因子相关的疾病的制剂，其制剂是任何经胃肠道或非经胃肠道给药剂型，包括胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、注射剂、滴丸、粉针剂和口服液剂等。
【附图说明】
[0025]图1是实施例1紫茎女贞总苷的HPLC色谱图；
[0026]图2是实施例1紫茎女贞总苷的薄层色谱图；
[0027]图3是实施例2不同浓度的紫茎女贞总苷诱导淋巴细胞产生IFN-α的图；
[0028]图4是实施例2不同浓度的紫茎女贞总苷诱导淋巴细胞产生IFN-β的图；
[0029]图5是实施例2不同浓度的紫茎女贞总苷和ConA诱导淋巴细胞产生IFN-γ的图；
[0030]图6是实施例2不同浓度的紫茎女贞总苷诱导巨噬细胞产生IFN-α的图；
[0031]图7是实施例2不同浓度的紫茎女贞总苷诱导巨噬细胞产生IFN-β的图；
[0032]图8是实施例2不同浓度的紫茎女贞总苷和ConA诱导巨噬细胞产生IFN-γ的图；
[0033]图9是实施例3紫茎女贞总苷体内诱导免疫低下小鼠分泌IFN-β，IFN-γ的图。
【具体实施方式】
[0034]本发明中使用的试剂、材料均是本领域技术人员公知的，可通过商业机构购买获得。本发明所使用的方法，如HPLC、ELISA等均为本领域公知的方法，可通过教科书或相关文献的描述进行，不再赘述，本发明说明书中有描述的，参照本发明中描述的方法进行。
[0035]实施例1
[0036]紫茎女贞总苷的提取
[0037]取1.92kg紫茎女贞干叶，加入19.2kg乙醇，加热至60°C回流提取三次，将所得乙醇提取物用水溶解，水溶物用Dia1n柱层析分离，以体积比为1:1的水-乙醇混合液洗脱，浓缩洗脱液得到230.4g紫茎女贞总苷。
[0038]所得紫茎女贞总苷为淡黄色粉末，有香味，易溶于水，水溶液为淡棕黄色。
[0039]将所得紫茎女贞总苷用HPLC检测，色谱条件为:流动相为含0.1%甲酸的水和甲酉享，水:甲醇=90:10?10:90梯度洗脱，时间为60min，流速lml/min，进样体积10 μ 1，检测波长227nm，色谱图如图1所示，在7min、20min、31min、38min、44min出现主峰。
[0040]将所得紫茎女贞总苷用薄层色谱法检测，展开剂为CMW(氯仿:甲醇:水=7:3:1)系统上层，分别用碘显色和硫酸显色，结果如图2所示，硅胶板上有七个斑点，比移值Rf依次为 0.035，0.129，0.259，0.483，0.603，0.638，0.922。
[0041]实施例2
[0042]紫茎女贞总苷(LPGs)体外诱导小鼠淋巴细胞和巨噬细胞分泌细胞因子的实验
[0043]1.淋巴细胞的制备和纯化
[0044](I)脱颈处死小鼠，然后将小鼠放入75%的酒精中浸泡5min，使其皮肤尽可能多地接触酒精；
[0045](2)将消毒好的小鼠放入超净工作台，剪开左腹部，取出脾脏，放入预冷的无血清RPM1-1640培养液中(3?5ml)，剔除脂肪、结缔组织，再用预冷无血清的培养基洗涤；
[0046](3)将洗净的小鼠脾脏剪碎，用玻璃注射器栓研磨，过200目尼龙网，用预冷的无血清培养基冲洗尼龙网；
[0047](4)吸取上层淋巴细胞悬液于试管内，加入4?5ml小鼠淋巴细胞分离液，以8OOrcf (相对离心力)离心3Omin ；
[0048](5)取出试管，弃除上清液，加入1640培养基，颠倒数次，以250rcf离心1min ；
[0049](6)将细胞沉淀用适量的含10%胎牛血清的RPM1-1640培养液重悬，得单个淋巴细胞悬液；
[0050](7)细胞计数:吸取试管中的淋巴细胞悬液100 μ 1，台盼兰染色计数，保证活细胞数大于95%，并调整细胞浓度为1.5X 16个/ml。
[0051]2.巨噬细胞的分离
[0052]给小鼠腹腔注射4?5ml RPM1-1640培养基，轻柔小鼠腹部lmin，静置5min，颈椎脱臼处死，在75%酒精浸泡约5min，收集腹腔液，以1500r/min离心5min，弃上清液，用10%胎牛血清