的1640培养基调整细胞浓度至I X 16个/ml，接种至24孔培养板，在5% C02、37°C培养箱中孵育4h，弃上清液，然后用1640培养基洗去未黏附细胞，即得巨噬细胞。
[0053]3.细胞培养
[0054](I)试药组处理:将紫莖女贞总苷配制成1650 μ g/ml、1100 μ g/ml、550 μ g/ml、275 μ g/ml、110 μ g/ml、55 μ g/ml、11 μ g/ml系列浓度溶液，将培养板分成A、B两组，每组21个孔，精确吸取不同浓度的紫茎女贞总苷溶液100 μ I加入培养板的孔中，每个浓度重复添加三个孔，A组每孔加入Iml淋巴细胞悬液(1.5 X 16个/ml)，B组每孔加入Iml巨噬细胞(IX 16个/ml)，作为不同浓度的药物组，药物终浓度分别为150 μ g/mlUOO μ g/ml,50 μ g/ml、25 μ g/ml、10 μ g/ml、5 μ g/ml、I μ g/ml，每孔总体积为 1100 μ I ；
[0055](2)阳性对照组处理:将刀豆素(ConA)配制成1650 μ g/ml、1100 μ g/ml、550 μ g/ml、275 μ g/ml、110 μ g/ml、55 μ g/ml、11 μ g/ml系列浓度溶液，将培养板分成C、D两组，每组21个孔，精确吸取不同浓度的ConA溶液100 μ I加入培养板的孔中，每个浓度重复添加三个孔，C组每孔加入Iml淋巴细胞悬液(1.5X 16个/ml)，D组每孔加入Iml巨噬细胞(I X 16个/ml)，作为阳性对照组，ConA终浓度分别为150 μ g/ml、100 μ g/ml、50 μ g/ml,25 μ g/ml、10 μ g/ml、5 μ g/ml、I μ g/ml，每孔总体积为 1100 μ I ；
[0056](3)空白对照组处理:加入100 μ I无血清培养基和Iml淋巴细胞悬液作为A、C组的空白对照，加入100 μ I无血清培养基和Iml巨噬细胞作为B、D组的空白对照。
[0057]4.通过ELISA实验检测细胞培养上清液中抗病毒细胞因子(IFN_ a、IFN-β和IFN- γ )的水平，结果见图3?8:
[0058]图3是不同浓度的紫茎女贞总苷诱导淋巴细胞产生IFN-α的图；图4是不同浓度的紫茎女贞总苷诱导淋巴细胞产生IFN-β的图；图5是不同浓度的紫茎女贞总苷和ConA诱导淋巴细胞产生IFN-γ的图；图6是不同浓度的紫茎女贞总苷诱导巨噬细胞产生IFN-α的图；图7是不同浓度的紫茎女贞总苷诱导巨噬细胞产生IFN-β的图；图8是不同浓度的紫茎女贞总苷和ConA诱导巨噬细胞产生IFN-γ的图。
[0059]由图3?8的实验结果可知，在I?150 μ g/ml范围内，紫茎女贞总苷对淋巴细胞和巨噬细胞分泌IFN- a，IFN- β和IFN- γ有促进作用。当紫茎女贞总苷浓度是50 μ g/ml时，紫茎女贞总苷诱导淋巴细胞分泌IFN-α和IFN-β的量达到最高，IFN-α分泌量是空白对照组约2倍，IFN-β分泌量是空白对照组约3倍，当紫茎女贞总苷浓度是25 μ g/ml时，紫茎女贞总苷诱导淋巴细胞分泌IFN-γ达到最高，IFN-γ分泌量与ConA相当。当紫茎女贞总苷浓度是50?100 μ g/ml时，紫茎女贞总苷诱导巨噬细胞分泌IFN- α和IFN- β的量达到最高，IFN-α分泌量是空白对照组约2倍，IFN-β分泌量是空白对照组约3倍，当紫茎女贞总苷浓度是50 μ g/ml时，紫茎女贞总苷诱导巨噬细胞分泌IFN- γ达到最高，IFN- γ分泌量与ConA相当。从本试验可以看出，紫茎女贞总苷能诱导巨噬细胞和淋巴细胞分泌抗病毒细胞因子IFN-α、IFN-β和IFN-γ。
[0060]实施例3
[0061]紫茎女贞总苷(LPGs)体内诱导免疫低下小鼠分泌细胞因子实验
[0062]1.将昆明小鼠随机分组，每组12只，分别为:空白对照组:生理盐水10ml/kg ;模型组:生理盐水10ml/kg ;盐酸左旋咪唑组:50mg/kg ;紫茎女贞总苷高剂量组:800mg/kg ；紫茎女贞总苷中剂量组:400mg/kg ;紫茎女贞总苷低剂量组:200mg/kg。对各组小鼠连续灌胃10天，给药第I天开始，空白对照组隔日腹腔注射灭菌生理盐水10ml/kg，其余各组隔日腹腔注射环磷酰胺80mg/kg，共5次。
[0063]2.通过ELISA实验测定外周血中IFN-β，IFN-γ含量，结果如图9所示。
[0064]由图5可知，环磷酰胺会引发血清中IFN-β和IFN-γ下调，紫茎女贞总苷对环磷酰胺引起的血清中IFN-β和IFN-γ低下具有一定的恢复作用，其中，中剂量组上调血清中IFN-β和IFN-γ水平的效果最明显，证明在动物模型中，紫茎女贞总苷能够诱导免疫低下小鼠分泌抗病毒细胞因子IFN-β和IFN-γ。
[0065]实施例4
[0066]胶囊剂的制备
[0067]取20g紫茎女贞总苷，40g食用纤维素及适量胶囊剂辅料，混合均匀，填充胶囊，胶囊为0#胶囊，填充规格为0.45g/粒。
[0068]实施例5
[0069]片剂的制备
[0070]取30g紫茎女贞总苷、50g微晶纤维素、1g乳糖、Ig硬脂酸镁以及适量片剂辅料，混合均匀，按公知的片剂制作技术和装备制成片剂，产品规格为0.5g/片。
[0071]实施例6
[0072]丸剂的制备
[0073]将紫茎女贞总苷和微晶纤维素分别过100目筛，并称取紫茎女贞总苷30g、微晶纤维素50g以及适量丸剂辅料，混合均匀，往混合好的物料中添加一定比例的炼制蜂蜜，按公知的丸剂制作技术和装备制成丸剂，产品规格为0.25g/粒。
[0074]实施例7
[0075]颗粒剂的制备
[0076]取紫茎女贞总苷40g、微晶纤维素70g以及适量颗粒剂辅料混合均匀，使用喷雾干燥工艺进行制粒。
[0077]实施例8
[0078]注射剂的制备
[0079]取50g茎女贞总苷及适量注射剂辅料加注射用水制成100ml溶液，过滤至澄明，灌封，高温瞬时灭菌即得。注射剂的溶液配制、过滤、灌封都在10万级以上的车间完成。
[0080]实施例9
[0081]口服液制剂的制备
[0082]称取紫茎女贞总苷10g、蜂蜜8g以及适量口服液剂辅料，用纯化水配制成10ml的溶液，过滤、灌装，高温瞬时灭菌即得。
[0083]实施例10
[0084]滴丸的制备
[0085]加液体石蜡于冷凝管内和滴丸接收瓶内，将注射器安在针头上，在水浴槽内加水至适宜高度，加热，维持温度70°C?80°C，让注射器针头对准液体石蜡管，按处方称取PEG6000于蒸发皿中，在水浴上加热熔化，加入紫茎女贞总苷lg，搅拌使溶解，迅速全部转移至注射器内，慢慢推进注射器活塞，或由重力作用滴入液状石蜡冷凝液内，药液滴完后，放置1.5?2小时，将冷却器移走，倾出液体石蜡留待回收，取出滴丸，沥净，用滤纸搽去丸上液状石蜡，放置自然干燥，称重计数，计算收得率、平均丸重及丸重差异。
[0086]实施例11
[0087]粉针剂的制备
[0088]取50g茎女贞总苷及适量粉针剂辅料加注射用水制成100ml溶液，进行无菌过滤，分装、冻干、封品，最后进行漏气检查即得。
[0089]实施例12
[0090]紫茎女贞总苷的提取
[0091]取紫茎女贞干叶，加入干叶8倍重量的乙醇，加热至100°C回流提取三次，将所得乙醇提取物用水溶解，水溶物用大孔吸附树脂柱层析分离，以体积比为0.5:1的水-甲醇混合液洗脱，浓缩洗脱液得到紫茎女贞总苷。
[0092]以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
【主权项】
1.紫茎女贞总苷诱导抗病毒细胞因子的应用，其中所述紫茎女贞总苷按照以下方法提取而得:取木樨科女贞属植物紫茎女贞的干叶，加入乙醇，加热回流提取，将所得乙醇提取物用水溶解，水溶物用Dia1n或大孔吸附树脂柱层析分离，以水-乙醇或水-甲醇混合液洗脱，浓缩洗脱液得到紫茎女贞总苷。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述加入乙醇的量为紫茎女贞干叶重量的8?10倍。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述加热回流提取的次数是三次。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水-乙醇或水-甲醇混合液的体积比为 0.5 ?1.5:1。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述紫茎女贞总苷为淡黄色粉末，有香味，易溶于水，其水溶液为淡黄色或棕黄色。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述紫茎女贞总苷在薄层色谱的硅胶板上有七个斑点，比移值 Rf 依次为 0.035，0.129，0.259，0.483，0.603，0.638，0.922。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗病毒细胞因子为IFN-a、IFN- β和IFN- γ。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗病毒细胞因子是淋巴细胞和/或巨噬细胞分泌的。
9.一种紫茎女贞总苷制剂，其特征在于，所述制剂含有上述任一项权利要求的紫茎女贞总苷，以及药用载体、辅料或稀释剂。
10.根据权利要求9所述的紫茎女贞总苷制剂，其特征在于，所述制剂是胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、注射剂、滴丸、粉针剂和口服液剂中的一种。
【专利摘要】本发明公开了紫茎女贞总苷的新应用，特别是紫茎女贞总苷诱导抗病毒细胞因子的应用，该紫茎女贞总苷由乙醇提取后用层析柱分离得到。本发明还公开了一种紫茎女贞总苷制剂，所述制剂含有紫茎女贞总苷，以及药用载体、辅料或稀释剂。本发明通过一系列实验证明紫茎女贞总苷能在体内能诱导机体产生内源性抗病毒细胞因子，也能在体外诱导细胞产生抗病毒细胞因子。
【IPC分类】A61K127-00, A61P37-04, A61K36-638, A61P31-12
【公开号】CN104688828
【申请号】CN201510083455
【发明人】贺震旦, 廖程晖, 宋勋, 胡小鹏, 李晨阳
【申请人】深圳大学
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年2月14日