融化，1000 rpm离心5 分钟，弃上清液，加入悬浮专用培养基（配制：BBSM培养基中按I. 15g/L加入碳酸氢钠，再 添加3%-5% (体积百分比）新生牛血清，调节pH值至7. 2±0. 5。BBSM培养基购自北京 清大天一科技有限公司，产品代码：MD910)，重悬，调节接种密度为0. 2-0. 5XIO6细胞/mL， 转至125mL细胞培养瓶中培养，培养体积：30-50mL，37°C、100rpm培养。
[0030] 2、细胞传代
[0031] 细胞培养48h后取样计数，若细胞密度多2.OXIO6细胞/mL时进行细胞传代， 否则继续培养，取需要传代的细胞，加入悬浮专用培养基（配制同上），将细胞液稀释至 0. 2-0. 5XIO6细胞/mL，将稀释好的细胞液分装培养瓶中悬浮培养1-3代，扩增至反应器所 需体积和密度（细胞密度彡2.OXIO6细胞/mL)。
[0032] 二、反应器悬浮培养BHK21-C13细胞
[0033] 1、BHK21-C13细胞5L反应器悬浮培养
[0034] 将步骤一培养得到的符合要求的悬浮细胞（细胞密度多2. OX IO6细胞/mL，存活 率大于90%)250-1000mL混合在专用接种瓶内。将接种瓶内的细胞转移至5L反应器中，补 加悬浮专用培养基（配制同上）至5000mL，细胞密度稀释至0.2-0. 5 X IO6细胞/mL，设定 细胞培养温度：36. 5±0. 5°C，pH值：7. 20±0. 1，DO值：20% -60%(饱和度百分比），转速 随着细胞密度、培养体积、搅拌方式的不同而不同，一般在60-1 lOrpm。细胞培养48h后取样 计数，当细胞密度多2. OX IO6细胞/mL时将细胞液转至50L反应器内培养，或作为培养病 毒使用（可用于伪狂犬生产用悬浮种毒培养，根据生产毒需求量不同，从而使用不同规格 的反应器培养），否则继续培养至所需细胞密度。经测，细胞密度达2-4 X IO6细胞/mL。
[0035] 2、BHK21-C13细胞50L反应器悬浮培养
[0036] 取步骤1培养的符合要求（细胞密度彡2.OXIO6细胞/mL)的悬浮细胞，加入50L 反应器中，补加悬浮专用培养基（组成同上）至50L，使细胞密度稀释至0.2-0.5X106细胞 /mL，设定细胞培养温度：36. 5±0. 5°C，pH值：7. 20±0. 1，DO值：20% -60% (饱和度百分 比），转速随着细胞密度、培养体积、搅拌方式的不同而不同，一般在60-llOrpm。细胞培养 48h后取样计数，当细胞密度彡2.OXIO6细胞/mL时，可将细胞转至500L反应器内继续培 养或培养病毒使用，否则继续培养至所需细胞密度。
[0037] 3、BHK21-C13细胞500L反应器悬浮培养
[0038] 取步骤2培养的符合要求（细胞密度彡2. 0XIO6细胞/mL)的悬浮细胞，加入500L 反应器中，补加悬浮专用培养基（组成同上）至500L，使细胞密度稀释至0. 2-0. 5XIO6细 胞/mL，设定细胞培养温度：36. 5±0. 5°C，pH值：7. 20±0. 1，DO值：20% -60% (饱和度百 分比），转速随着细胞密度、培养体积、搅拌方式的不同而不同，一般在60-llOrpm。细胞培 养48h后取样计数，当细胞密度多2.OXIO6细胞/mL时，可将细胞转至5000L反应器继续 培养或病毒培养使用，否则继续培养至所需细胞密度（细胞密度达到2-4XIO6细胞/mL)。
[0039] 4、BHK21-C13细胞5000L反应器悬浮培养
[0040] 取步骤3培养的符合要求（细胞密度彡2.0X106细胞/mL)的悬浮细胞，加 入5000L反应器中，补加悬浮专用培养基（组成同上）约4500L，使细胞密度稀释至 0. 2-0. 5XIO6细胞 /mL，设定细胞培养温度：36. 5±0. 5 °C，pH值：7. 20±0. 1，DO值： 20% -60% (饱和度百分比），转速随着细胞密度、培养体积、搅拌方式的不同而不同，一般 在60-1lOrpm。细胞培养48h后取样计数，当细胞密度多2.OXIO6细胞/mL时用于病毒培 养，否则继续培养至所需细胞密度（细胞密度达2-4XIO6细胞/mL)。
[0041] 三、伪狂犬悬浮种毒培养
[0042] 1、伪狂犬基础种毒培养
[0043] 贴壁培养：从液氮中取出一支冻存的BHK21贴壁细胞株，37°C快速融化，1000 rpm 离心5分钟，弃上清液，加入少量MEM营养液（MEM培养基，用7. 5% (质量体积百分比W/V) 碳酸氢钠溶液调节pH值至7. 2 ±0. 5,添加8 % -10% (体积百分比）的新生牛血清；MEM培 养基购自宜兴市赛尔生物科技有限公司，产品代码：1605-030)重悬后加入75cm2细胞培养 瓶中，补加MEM营养液至30mL，至37°C培养箱静置培养，待细胞长满单层后取用或继续传 代。
[0044] 细胞传代：取长满单层的贴壁细胞，弃去原培养液，加入消化液（0. 25%胰蛋白 酶-0. 02%EDTA) 5-10ml，细胞消化分散后按所需比例加入MEM营养液，将细胞液按比例分 装至新细胞瓶中，至37°C培养箱静置培养，待细胞长满单层后取用或继续传代。
[0045] 基础种毒培养：取长势良好且已铺满单层的BHK21-C13贴壁细胞，弃去原培养液， 加入病毒维持液（维持液配方:MEM培养基，用7. 5% (质量体积百分比W/V)碳酸氢钠溶液 调节PH值至7.4±0.5,添加1%-3% (体积百分比）的新生牛血清；MEM培养基购自宜兴 市赛尔生物科技有限公司，产品代码：1605-030)补充至原体积，再按1% (体积比）的比 例加入伪狂犬种毒（例如Bartha-K61毒株，来源中国农业科学院哈尔滨兽医研宄所），于 37°C培养，当细胞病变多75% (数量百分比）时收获病毒液得到伪狂犬基础种毒，-20°C冷 冻保存，取样检测TCID5tl，每0.ImL病毒含量应彡106_°TCID5Q。
[0046] 2、伪狂犬生产用悬浮种毒培养
[0047] 将反应器内培养合格的悬浮BHK21-C13细胞（步骤二获得，取用量依据规模调 整），弃掉原培养液，加入病毒维持液（维持液配方：BBSM培养基按I. 15g/L加入的碳酸氢 钠，添加1%-3% (体积百分比）新生牛血清，调节pH值至7.4±0.5)恢复至原培养体积， 再加入1 % (体积百分比）伪狂犬基础种毒（上述步骤1得到），设定病毒培养的PH值为 7. 40-7. 60，D0 :20% -60% (饱和度百分比），转速：60-110rpm，温度：36. 0±0. 5°C，累计悬 浮培养72-96h，待细胞病变多75% (数量百分比）时收获病毒液作为悬浮生产种毒，-20°C 冷冻保存。
[0048] 更大规模生产时，可用收获的生产用悬浮种毒液，经反应器再连续培养2-3代作 为悬浮生产种毒，-20°C保存。
[0049] 四、伪狂犬生产用悬浮毒液培养
[0050] 1、50L反应器培养伪狂犬生产用悬浮病毒液
[0051]将反应器内培养合格的悬浮BHK21-C13细胞（步骤二获得），弃掉悬浮专用培养 基，加入病毒维持液（维持液配方：BBSM培养基按I. 15g/L加入碳酸氢钠，添加1% -3% (体积百分比）新生牛血清，调节PH值至7. 4±0. 5)恢复至原培养体积，再加入1% (体积 百分比）伪狂犬悬浮生产种毒（步骤三得到），设定病毒培养的pH值为7. 40-7. 60,DO值： 20%-60% (饱和度百分比），转速：60-110rpm，温度：36.0±0.5°C。悬浮培养，待细胞病变 彡75% (数量百分比）时收获病毒液，-20°C冷冻保存。取样检测TCID5tl，每0.ImL中病毒 含量应》IO6tlTCID5ci。将符合要求的病毒液用于配制疫苗。
[0052] 2、500L反应器培养伪狂犬生产用悬浮病毒液
[0053]将反应器内培养合格的悬浮BHK21-C13细胞（步骤二获得），弃掉悬浮专用培养 基，加入病毒维持液（维持液配方：BBSM培养基按I. 15g/L