加入的碳酸氢钠，添加1% -3% 新生牛血清，调节pH值至7. 4±0. 5)恢复至原培养体积，再加入1 % (体积百分比）伪狂犬 悬浮生产种毒（步骤三得到），设定病毒培养的pH值为7. 40-7. 60,DO值：20%-60%，转 速：60-110rpm，温度：36. 0±0. 5°C。悬浮培养，待细胞病变彡75%时收获病毒液，-20°C冷 冻保存。取样检测TCID5tl，每0.ImL中病毒含量应多IO6tlTCID5ci。将符合要求的病毒液用于 配制疫苗。
[0054] 3、5000L反应器培养伪狂犬生产用悬浮病毒液
[0055]将反应器内培养合格的悬浮BHK21-C13细胞（步骤二获得），弃掉悬浮专用培养 基，加入病毒维持液（维持液配方：BBSM培养基按I. 15g/L加入碳酸氢钠，添加1% -3% (体积百分比）新生牛血清，调节PH值至7.4±0. 5)恢复至原培养体积，再加入1% (体 积百分比）伪狂犬悬浮生产种毒（步骤三得到），设定病毒培养的pH值为7. 40-7. 60,DO: 20%-60% (饱和度百分比），转速：60-110rpm，温度：36.0±0.5°C。悬浮培养，待细胞病变 彡75% (体积百分比）时收获病毒液，-20°C冷冻保存。取样检测TCID5tl，每0.ImL中病毒 含量应》IO6tlTCID5ci。将符合要求的病毒液用于配制疫苗。
[0056] 五、澄清、配苗、分装、冻干、成品检验
[0057] 1、澄清
[0058] 将步骤四收获的悬浮生产毒液从冷库中提出，室温解冻，用0.45ym的已灭菌澄 清过滤器预处理病毒液至带降温系统的中转储存罐内。
[0059] 2、配苗、分装
[0060] 将检验合格的半成品加入适量冻干保护剂定量分装，每份疫苗至少含5000TCID5Q。 分装后迅速进行冷冻真空干燥。
[0061] 3、冻干
[0062] 预冻阶段：常温进箱，l_2h将制品降至_42°C并维持2h;
[0063] 升华干燥阶段：l-2h将制品从_42°C升至_8°C并维持IOh;0. 5-lh将制品从_8°C 升至(TC并维持0. 5-lh;
[0064] 解吸干燥阶段：l_2h将制品从0°C升至28°C并维持7h，冻干结束。
[0065] 4、成品检验
[0066] 对成品苗进行以下项目的检测：物理性状、无菌检验、剩余水分测定、真空度测定、 安全检验、效力检验、热稳定性试验、细菌内毒素检查、异常毒性检查。相关检测方法及标准 符合《中华人民共和国兽药典2010版第三部》之规定。
[0067] 检验结果如表1所示。
[0068] 表1兽用伪狂犬弱毒活疫苗成品检验结果
[0069]
【主权项】
1. 一种兽用伪狂犬弱毒活疫苗的规模化生产方法，是利用细胞悬浮工艺培养伪狂犬病 毒弱毒株，使反应器内悬浮培养的BHK21-C13细胞密度大于或等于2 X IO6细胞/mL，然后用 含伪狂犬病悬浮种毒的病毒维持液进行培养，再将收获的伪狂犬弱毒病毒液经澄清、配苗、 分装、冻干后得到兽用伪狂犬弱毒活疫苗。
2. 根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于： 反应器内悬浮培养BHK21-C13细胞过程为：利用复苏的BHK21-C13悬浮细胞株在营养 液中传代悬浮培养至BHK21-C13悬浮细胞的细胞密度彡2. OX IO6细胞/mL，将悬浮细胞转 移至反应器中，加入悬浮专用培养基至细胞密度0. 2-0. 5 X IO6细胞/mL，在36. 5 ±0. 5 °C， pH值7. 20±0. l，DO值30% -60% (溶解度百分比），转速60-110rpm下培养48-72小时至 反应器内的BHK21-C13细胞密度大于等于2X IO6细胞/mL。
3. 根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于：所述营养液或悬浮专用培养基为：在 BBSM培养基中按I. 15g/L加入碳酸氢钠，再添加3%-5% (体积百分比）新生牛血清，调节 pH 值至 7. 2±0. 5。
4. 根据权利要求1或2或3所述的生产方法，其特征在于：培养伪狂犬生产用悬浮 病毒液过程为：将反应器内培养合格的BHK21-C13悬浮细胞弃掉悬浮专用培养基，加入病 毒维持液恢复至原培养体积，再按1 %体积加入伪狂犬悬浮种毒，在36. 5±0. 5°C，pH值 7. 40-7. 60, DO值30% -60% (溶解度百分比），转速60-1 IOrpm下培养，待细胞病变彡75% 时收获病毒液。
5. 根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于：所述病毒维持液为：BBSM培养基中 按I. 15g/L加入碳酸氢钠，再添加1% -3% (体积比）新生牛血清，pH值7. 4±0. 5。
6. 根据权利要求1至5任一所述的生产方法，其特征在于：视生产规模由小至大反应 器容积依次为5L、50L、500或5000L ;且，大规模的生产使用大容积的反应器，该反应器中使 用前一小规模生产容器中培养的BHK21-C13悬浮细胞。
7. 根据权利要求6所述的生产方法，其特征在于：51、501、5001、50001反应器中的培养 方法及培养条件相同。
8. 根据权利要求1至7任一所述的生产方法，其特征在于：所述伪狂犬病悬浮种毒是 用BHK21-C13悬浮细胞培养伪狂犬基础种毒培养的伪狂犬生产用悬浮种毒，具体获得过程 如下： 1) 伪狂犬基础种毒培养 取贴壁培养得到的长势良好且已铺满单层的BHK21-C13贴壁细胞，弃去原培养液，加 入含1% (体积百分比）伪狂犬病弱毒种毒的病毒维持液（维持液同权利要求5)，在37°C 培养，当细胞病变彡75% (数量百分比）时收获病毒液，-20°C冷冻保存，取样检测TCID5tl, 每0? ImL病毒含量应彡IO6 tlTCID50; 2) 伪狂犬生产用悬浮种毒培养 将反应器内培养合格的悬浮BHK21-C13细胞，弃掉细胞营养液，加入病毒维持液 恢复至原培养体积，再按1% (体积百分比）加入伪狂犬基础种毒，pH值7.40-7.60， 0020%-60%(溶解度百分比），转速60-110印111，温度36.0±0.51：条件下累计悬浮培养 72-96h，待细胞病变彡75% (数量百分比）时收获病毒液，-20°C冷冻保存。
9. 根据权利要求8所述的生产方法，其特征在于：所述伪狂犬生产用悬浮种毒还包括 将步骤2)收获的病毒液经反应器扩大培养1-2代得到的生产用伪狂犬病悬浮种毒批。
10.根据权利要求1至9任一所述的生产方法，其特征在于：兽用伪狂犬弱毒病毒液的 澄清采用〇. 45 y m滤芯正压过滤； 冻干包括： 预冻阶段：常温进箱，l_2h将制品降至-42°C并维持2h ; 升华干燥阶段：1-2h将制品从-42°C升至_8°C并维持IOh ;0. 5-lh将制品从-8°C升至 0°C并维持 0. 5-lh ; 解吸干燥阶段：l_2h将制品从0°C升至28°C并维持7h，冻干结束。
【专利摘要】本发明公开了一种兽用伪狂犬弱毒活疫苗的规模化生产方法，是利用细胞悬浮工艺培养伪狂犬病毒弱毒株，使反应器内悬浮培养的BHK21-C13细胞密度大于或等于2×106细胞/mL，然后用含伪狂犬病悬浮种毒的病毒维持液进行培养，再将收获的伪狂犬弱毒病毒液经澄清、配苗、分装、冻干后得到兽用伪狂犬弱毒活疫苗。本发明能够实现伪狂犬弱毒病毒大量增殖，大大提高病毒滴度与抗原产量，实现工艺自动化，提高了疫苗的质量，不仅能提高BHK21-C13细胞密度，自动监控细胞生长或病毒繁殖的最适生化条件，提高病毒滴度，而且工艺规模放大相对容易，疫苗质量稳定、批间差小，生产和应用前景广阔。
【IPC分类】A61K39-245, A61P31-22, C12N7-00, C12R1-93
【公开号】CN104740627
【申请号】CN201510148904
【发明人】郝鹏, 刘国英, 苍枫, 范秀丽, 孔彩平, 纪燕, 温谢
【申请人】金宇保灵生物药品有限公司
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年3月31日