三羟甲基 氨基甲烷（Tris)碱溶解。在515nm处测定每孔的光密度（OD)值。存活率的计算公式：存 活率=实验组OD值/对照组OD值，其中实验组和对照组均为扣除空白对照组后的值。
[0043] 实验证明，于近红外光下照射2min，本发明药物转运系统可直接影响MCF-7细胞 的增殖。
[0044] 二、近红外激光照射时，功能化氧化石墨烯温敏水凝胶的体内抗肿瘤活性测定
[0045] 取小鼠 S1J复水瘤细胞，用注射用生理盐水以3:1比例稀释后，每只小鼠于腹腔注 射0. 3ml，小鼠喂养7天后，抽取小鼠 S1J复水瘤细胞，计数后以注射用生理盐水稀释成浓 度为2X IO6个/ml的细胞悬液，皮下接种与小鼠右前肢上部。小鼠接种肿瘤7天后，取其 中24只肿瘤体积彡IOOmm 3昆明小鼠，随机分为4组，每组6只。具体分组如下：⑴对照组 (NS组）：生理盐水；（2)生理盐水合并激光组；（3)负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏 水凝胶组；(4)负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶合并激光组。4组均采用瘤内 注射的方式，其中光照组使用的光源为808nm近红外光源，功率为2. 5W，给药3h后激光照 射肿瘤部位，一次照射时间为lmin，给药4h和第二天激光照射肿瘤部位各一次。每3天给 药一次，每次注射生理盐水或者lmg/ml的负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶 200 μ I，共给药4次。整个实验过程中每日观察小鼠生活状态，每3d称其体重并使用游标 卡尺测量小鼠肉瘤的长径（A)与短径（B)，按公式肿瘤体积V= 计算肿瘤体积。
[0046] 当给予负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶合并激光照射时，小鼠的肿 瘤体积的增加得到了明显的抑制。
[0047] 三、功能化氧化石墨烯温敏水凝胶理化性质考察
[0048]负载多西他赛的功能化氧化石墨烯给药系统的粒子大小和表面带电量的确定，使 用Nan〇-ZS90型激光粒度分析仪进行测定，折射率设置为1. 590,吸收系数设置为0. 010,温 度设置为25°C，测量模式设置为自动，以Z平均统计值作为测定结果。每一水平缩合体均配 制3份，每份测量一次，取三次测量值的平均值作为测量结果。介电常数设置为79,黏度系 数设置为〇. 8872,温度设置为25°C，测量模式设置为自动。每一水平缩合体均配制3份，每 份测量一次，取三次测量值的平均值作为测量结果。测得的结果是粒径为300-500nm，电位 是 25mV。
[0049] 温敏水凝胶胶凝温度的测定，将一系列不同配比的P4(l7/P188温敏水凝胶溶液，各取 2ml置于试管中，放置于不同温度的水浴中恒温2min后，将试管倒置，当凝胶溶液倒置2min 未发生流动，即形成凝胶，此时温度为此比例的凝胶溶液的胶凝温度。
[0050] 温敏水凝胶体外释放度试验。试验分两组：（1)负载多西他赛的功能化氧化石墨 烯温敏水凝胶组（2)原料药多西他赛溶液组。每组各取2ml加入透析袋（8000-12000Da) 中，释放介质为中性（PH7. 4)和酸性（pH 5.0)的PBS 80ml，温度为体温（37°C )和模拟热 疗时温度（42°C)。将透析袋放入释放介质中，置于恒温振荡器（转速lOOr/min)中，在不 同时间点取出释放介质2ml，并补充等体积的新鲜释放介质。取出的样品通过紫外分光光度 计进行测量定量，根据样品的药物含量可以计算不同时间点的累积释放量，直至释放完全， 分别绘制不同组药物累计释放百分比曲线。由结果可见，负载多西他赛的功能化氧化石墨 烯温敏水凝胶具有明显的缓释作用，且具有温度和PH依赖性，高温和酸性环境有利于药物 释放。
[0051] 五、负载多西他赛的功能化氧化石墨烯给药系统的体外抗肿瘤活性
[0052] 将MCF-7乳腺癌细胞（由上海细胞库提供）用作待考察的癌细胞。将MCF-7细胞 培养在含胎牛血清（FBS) 10 %，青链霉素混合液1 %的RPMI 1640培养基中，培养箱条件为 37°C、5% CO2，每2~3天传代一次。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板每孔加 入200 μ 1，铺板使待测细胞调密度至6X IO3个/孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。置于5% C02,37°C孵育24h，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度（0.001、0.01、0. 1、 1 μ g/ml)的实施例1中的负载多西他赛的功能化氧化石墨烯，设置复孔为4~6个。光照组 放置在808nm近红外光2. 5W中2min，保持光照过程中温度在37°C，光照结束后将细胞板置 于CO2培养箱中孵育24h，对于无光照组而言，则直接将细胞板置于CO 2培养箱中孵育24h， 终止培养，加入预冷的50% TCA 50 μ 1，4°C放置lh。倒掉固定液，每孔用去离子水洗5遍， 甩干，空气干燥。每孔加入50μ1的SRB溶液，静置放置30min，未与蛋白结合的SRB用1% 醋酸洗5遍，空气干燥。结合的SRB用150μ1 lOmmol/L非缓冲Tris碱溶解。在515nm处 测定每孔的OD值。存活率的计算公式：存活率=实验组OD值/对照组OD值，其中实验组 和对照组均为扣除空白对照组后的值。
[0053] 已经证实，功能化氧化石墨稀作为药物载体时能装载药物进入肿瘤细胞内部，更 好的发挥出抗肿瘤药物的疗效，而且结合激光照射后，肿瘤细胞的增殖抑制率可增加10% 左右。
[0054] 六、负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶给药系统的体内抗肿瘤活性
[0055] 负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶给药系统的体内抗肿瘤活性，取小 鼠318』复水瘤细胞，用注射用生理盐水以3:1比例稀释后，每只小鼠于腹腔注射0. 3ml，小鼠 喂养7天后，抽取小鼠 S18tl腹水瘤细胞，计数后以注射用生理盐水稀释成浓度为2 X 10 6个/ ml的细胞悬液，皮下接种与小鼠右前肢上部。小鼠接种肿瘤7天后，取其中24只肿瘤体积 彡IOOmm3昆明小鼠，随机分为4组，每组6只。具体分组如下：⑴对照组（NS组）：生理盐 水；（2)多西他赛注射液组；（3)负载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶组；(4)负 载多西他赛的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶合并交变磁场组。4组均采用瘤内注射的方式， 其中光照组使用的光源为808nm近红外光源，功率为2. 5W，给药后激光照射肿瘤部位，照射 时间为lmin，给药后和第二天激光照射肿瘤部位各一次。每3天给药一次，每次注射生理盐 水或者lmg/ml的负载阿霉素的功能化氧化石墨烯温敏水凝胶200 μ 1，共给药4次。整个实 验过程中每日观察小鼠生活状态，每3d称其体重并使用游标卡尺测量小鼠肉瘤的长径（A) 与短径（B)，按公式肿瘤体积
【主权项】
1. 一种基于功能化氧化石墨烯温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，该水凝胶作为药 物载体系统，是由负载药物的功能化氧化石墨烯和泊洛沙姆P4OT/P188凝胶混合制成，负载抗 肿瘤药物的功能化氧化石墨烯和泊洛沙姆P4OT/P188凝胶的体积比为1-3:1，具体由以下步骤 实现： 1) 称取氧化石墨稀80-120mg和壳聚糖400-600mg溶于40-60ml的2-(N-吗啡啉） 乙磺酸缓冲液中，超声Ih得到均匀分散的悬浮液，称取1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳 二亚胺盐酸盐480-720mg和N-羟基琥珀酰亚胺640-960mg，依次加入上述混合液中，继 续超声6h;接着，将反应液室温下磁力搅拌16h，反应停止后，将混合液通过0.2ym的水 膜过滤，用超纯水抽洗至中性以除去未反应的壳聚糖，将所得滤饼用16-24ml超纯水重悬 后，-20°C预冻，冷冻干燥48h，即得功能化氧化石墨烯； 所述的2- (N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液是由2- (N-吗啡啉）乙磺酸加水，调制成pH值为 5的溶液； 2)称取功能化氧化石墨稀4-6mg溶于超纯水4-6ml中，在功率400w下探超40次， 每间隔5s探超一次，每次5s，成为功能化氧化石墨烯分散液；然后称取抗肿瘤药物多西 他赛4-6mg，溶于200-300 y 1的二甲基亚砜中，制成多西他赛溶液；将功能化氧化石墨烯 分散液边超声边缓慢滴加到多西他赛溶液中；滴加完毕，在功率400