胸苷酸合成酶抑制剂在制备构建神经管畸形小鼠模型中的应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于应用基础医学研宄领域，涉及胸苷酸合成酶抑制剂制备构建神经管畸 形小鼠模型的应用。
【背景技术】：
[0002] 神经管畸形（NeuralTubeDefects,NTDs)是指在胚胎发育早期的神经管闭合不 全而产生的脑部和脊柱部位畸形，是一类发病率高且后果严重的出生缺陷，主要包括无脑 畸形、脑或脑脊膜膨出、脊柱裂等，其发生的机制至今仍不清楚。构建具有人类NTDs疾病模 拟性表现的动物模型，有助于更方便有效地认识人类NTDs的发生发展规律，了解其病因、 发病机制和病理特点，对研宄防治措施具有重大的意义。妊娠早期叶酸缺乏是NTDs发生的 重要危险因素，补充0. 4-4.Omg/d的叶酸能预防大约50% -70%NTDs的发生。然而仅通过 控制饮食诱导叶酸缺乏的NTDs动物模型尚未建立，且叶酸缺乏引起NTDs的具体机制也不 清楚。
[0003] 叶酸缺乏的本质问题就是叶酸代谢障碍的问题。叶酸作为载体参与体内活性一碳 单位代谢，而活性一碳单位参与了体内的嘌呤和胸腺嘧啶从头合成及甲基化代谢。dTMP(脱 氧胸苷酸）的从头合成是由5,10-亚甲基四氢叶酸提供一碳单位，胸腺嘧啶合成酶催化 dUMP(脱氧尿苷酸）甲基化而成，生成的dTMP则参与了DNA的合成与修复。有研宄表明，对 叶酸缺乏敏感的基因突变型NTDs小鼠模型中，检测到一碳单位的代谢障碍及胸腺嘧啶从 头合成受损，可以通过补充叶酸或胸腺喃啶降低NTDs的发生率，表明增补叶酸可补救胸腺 嘧啶从头合成的障碍，可以预防和改善NTDs的发生。换言之，叶酸缺乏引起胸腺嘧啶从头 合成受损，从而影响DNA合成与修复。胸腺嘧啶从头合成受损会导致dTTP(脱氧胸苷三磷 酸）池失衡，dUMP/dTMP比例失调，从而引起尿嘧啶错掺，DNA合成异常。
[0004] 胸腺嘧啶的从头合成提供唯一甲基的供体，是由N5,NlO-甲烯四氢叶酸提供，在 叶酸的代谢过程中，由丝氨酸与四氢叶酸（THF)在丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT)的催化下生 成N5,NlO-甲烯四氢叶酸，而dUMP在胸苷酸合成酶催化下，由N5,NlO-甲烯四氢叶酸作为 甲基供体，甲基化生成dTMP，5,10-甲烯四氢叶酸提供甲基后生成为二氢叶酸，后者在二氢 叶酸还原酶作用下，重新生成四氢叶酸，从而构成胸腺嘧啶循环，为DNA合成提供原料。胸 苷酸合成酶还是体内调节四种核苷酸平衡的关键酶，是DNA合成和修复的限速酶，在快速 增值的细胞中（如胚胎发育阶段的细胞），胸苷酸合成酶高度表达，该酶受到抑制后会导致 胸腺嘧啶缺失，TTP池受损，dUTP聚集，大量尿嘧啶错掺入DNA，引起DNA单链或双链断裂， 造成DNA不稳定和突变增加。叶酸缺乏的人和动物细胞中已经观察到尿嘧啶错掺，DNA双链 断裂。在肿瘤研宄中，抑制胸苷酸合成酶造成胸腺喃啶缺失（thymidylatedeprivation)， 可以导致胸腺喃啶缺失性死亡（thymidylatedeath)，从而达到治疗肿瘤的效果。叶酸代谢 及其叶酸相关代谢，具体通过哪条代谢途径发挥作用以及叶酸相关代谢中哪些代谢是引起 NTDs的独立因素尚不完全清楚。因此人们更需要一个可以模拟出dTMP代谢障碍诱导引起 NTDs的动物模型来探索其机制。
[0005] 在制备构建饮食缺乏叶酸直接导致NTDs的动物模型中存在几个问题，机体存在 着强大的代偿作用，在叶酸缺乏的情况下机体可以通过提高叶酸利用率满足体内代谢的需 要，特别是对于母体，在缺乏叶酸的环境下，会通过消融自身组织供给胎儿的需要，另一方 面，很难控制饮食来源的叶酸和动物自身的营养状况，短时间叶酸不足却可以通过机体代 偿供给。现有NTDs动物模型主要有以下几种构建方法：1)通过物理因素诱导，构建妊娠期 高温、高糖的环境诱发出NTDs的动物模型；2)利用化学因素诱导，通过维甲酸、顺铂、环磷 酰胺、丙戊酸等注射孕鼠，诱导出NTDs动物模型；3)通过基因敲除手段，敲除对胚胎发育具 有关键作用的基因（Mthfr、Pax3、Ptchl、Wnt)诱发NTDs动物模型。然而，以上构建模型的 方式均未能真正模拟出叶酸缺乏引起dTMP代谢障碍诱导NTDs的模型，未能影响dTMP代谢 及其相关代谢。基因敲出的方式从遗传学上改变了基因组的结构和稳定性。所以，迫切需 要新的角度和思路构建NTDs动物模型。
[0006] 本发明应用胸苷酸合成酶抑制剂干扰dTMP的从头合成过程，模拟体内叶酸缺乏 引起胸腺嘧啶从头合成受损，导致dTTP池失衡，dUMP/dTMP比例失调，从而引起尿嘧啶错 掺，DNA合成异常。本发明所述模型，为研宄NTDs提供了研宄的实验平台和理论依据。
[0007] 根据化学结构的不同，胸苷酸合成酶抑制剂主要有非叶酸结构类似物和叶酸结构 类似物两大种类的抑制剂。
[0008] 非叶酸结构类似物主要为5-氟尿嘧啶（5-FU)及其衍生物。5-FU是尿嘧啶的嘧 啶环上，5-位上的氢原子被氟原子所取代，因为氟原子的半径和氢原子半径接近，从而使其 在代谢过程中不易被分解，取代了正常的代谢物。5-FU在体内可以通过尿苷磷酸化酶转化 为FUrd后，由尿苷激酶转化为FUMP，参与了RNA的错配合成；还会由胸苷磷酸化酶转化为 FdUrd，再经过胸苷激酶转化为FdUMP，其与dUMP竞争结合TS酶的催化位点，在正常由dUMP 甲基化成为dTMP中，N5,NlO-甲烯四氢叶酸上的甲基基团被转移到dUMP，是需要伴随嘧啶 第5个碳原子上的氢原子丢失过程中完成的。而FdUMP上是氟原子，导致TS被竞争性抑 制，形成了一个"复合体"（TS、N5,NlO-甲烯四氢叶酸、FdUMP)，使胸苷酸合成酶失活，从而 抑制DNA合成。最早开发药物是5-FU，随后又在5-FU基础上对其进行了修饰，研制出一些 衍生药，卡培他滨、替氟加，双呋氟尿嘧啶，卡莫氟，氟铁龙。卡培他滨在羧酸酯酶、胞嘧啶脱 氨酶、胸苷磷酸化酶作用下转化为5-FU发挥作用。替加氟是5-FU的前药，通过2条代谢途 径缓慢代谢为5-FU，一条是通过细胞色素P450调节，形成（5' -羟呋喃尿嘧啶），再发生自 燃断裂产生5-FU，另一途径是通过脱氧胸苷磷酸化酶调节。
[0009] 叶酸结构类似物抑制剂能与胸苷酸合成酶很好的结合，干扰其活性和正常功 能，从而抑制DNA合成。叶酸结构类似物大致分为了两大类，一类是雷替曲塞，培美曲 CB3717, 1843U89,这类化合物的特点是含有谷氨酸残基结构，是一种经典的胸苷酸合成酶 抑制剂，进入细胞的方式要通过位于细胞膜上还原叶酸载体的载运，然后被叶酸聚谷氨酸 合成酶催化形成聚谷氨酸化，这个过程使药物的浓度在细胞内增加，延长了其在细胞内的 滞留作用时间，并且增强了和胸苷酸合成酶的结合性，增加了抑制作用。雷替曲塞（RTX)是 四氢叶酸类似物，与5-Fu不同，它不会掺入DNA分子中，发挥作用也不需要辅助因子，它的 抑制作用不受尿嘧啶聚集的影响。雷替曲塞进入体内后，通过还原型叶酸载体（RFC)进入 细胞，然后被多聚谷氨酸合成酶催化成多聚谷氨酸形式。它与多聚谷氨酸合成酶亲和力较 强，可被快速多聚谷氨酸化。雷替曲塞不仅对二氢还原酶有抑制作用，还和胸苷酸合成酶在 叶酸结合位点特异结合。雷替曲塞只在细胞内被聚谷氨酸化后进行代谢发挥作用，其他方 式会以原形经尿排出。
[0010] 非经典的胸苷酸合成酶抑制剂，有ZD9331，AG331，AG337等药物不含有谷氨酸 残基，与经典胸苷酸合成酶抑制剂的主要区别是，进入细胞的方式不需要谷氨酸化，其中 ZD9331药物需要还原型叶酸载体（RFC)转运入细胞，而AG331，AG337不需要谷氨酸化，也 不需要还原型叶酸载体（RFC)，可以更好的发挥药效。
[0011] 本项研宄的目的是，通过抑制母体胸苷酸合成酶阻碍胸腺嘧啶脱氧核苷（dTMP) 的生成，诱导