物中心提供，3月龄，体重15-25千 克；肝素钠（成都市科龙化工试剂厂）；1-(3_二甲氨基丙基）_3乙基碳二亚胺（l-ethyl-3 -3-dimethylaminopropylcarbodiimide hydrochloride，EDC，日本 T0SHIMA 公司）；聚二甲 基二稀丙基氯化按（polyelectrolyte polydiallydimethylammonium chloride，PDADMAC， 美国SIGEMA-ALDRIH公司）；氰基硼氢化钠（NaBH3CN，成都市科龙化工试剂厂）；
[0039] 酶标仪（ΒΙ0ΤΕΚ，美国）；CA-50半自动血凝仪（SYSMEX，日本）。
[0040] 实施例1本发明具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架的制备
[0041] I、实验方法
[0042] (1)获取去细胞化猪肝脏生物支架
[0043] 本发明去细胞化肝脏生物支架可以以猪离体肝脏为原材料，采用常规的去细胞化 方法处理得到，比如，可以按照如下方法制备：
[0044] 从体重15_25kg实验用巴马香猪上取出肝脏，行0. 1%乙二胺四乙酸（elhylene diamine tetraacetic acid, EDTA)液体灌注至肝脏内血液完全流尽，得猪离体肝脏，_20°C 保存。
[0045] 取猪离体肝脏，4°C解冻，用1 % Triton X-100溶液以200mL/min流速灌注3h，1 % 十二烷基磺酸钠 （sodium dodecylsulphate，SDS)溶液以200mL/min流速灌注6h，之后用 1% Triton X-100溶液和去离子水灌洗去除残留SDS，获得去细胞化猪肝脏生物支架。
[0046] (2)抗凝修饰
[0047] a、抗凝修饰
[0048] 制备肝素钠灌注液：在(TC的条件下配制浓度为lg/L的肝素钠水溶液，调整pH值 为2. 7 ;然后加入亚硝酸钠至终浓度为33mg/L，在0°C的条件下搅拌2小时，调整pH值至 7. 〇 ;再加入NaBH3CN和NaCl至终浓度分别为10mg/L和0· 15mol/L，调整pH至3. 5。
[0049] 室温条件下，向去细胞化猪肝支架中灌入制备好的肝素钠灌注液，循环灌注6小 时，流速为l〇〇mL/min。
[0050] b、灭菌
[0051] 用PBS配置成含有青霉素（lOOU/mL) /链霉素（100 μ g/mL)的PBS溶液。
[0052] 完成抗凝修饰后，灌注PBS溶液以达到无菌处理的目的，流速为200mL/min，灌注 时间为6小时，即得本发明具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架。
[0053] 2、检测方法
[0054] 将制备的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架分割成直径为1cm、厚度为 300um的厚片，部分材料用于1%甲苯胺蓝水溶液染色，另部分用2. 5%戊二醛固定后，经梯 度酒精脱水处理，用扫描电镜观察材料表面形态。
[0055] 为了检测整肝修饰中猪肝脏生物支架不同部位肝素分布的均一性，随机选取位于 不同肝叶的不同部位的支架材料进行肝素含量测定。具体方法如下：将25mg甲苯胺蓝溶于 500mL含有0. 2% NaCl的0.0 lN HCl溶液中，配制成甲苯胺蓝染色液。配置不同浓度梯度 的肝素溶液，各取2. 5mL肝素溶液与2. 5mL甲苯胺蓝染色液混合均匀，然后加入5mL己烷。 摇晃混合液，使甲苯胺蓝和肝素形成混合物，溶解于有机相中。用酶标仪测定水相中的甲苯 胺蓝残余量，测定波长为631nm，计算出肝素浓度的标准曲线。用木瓜蛋白酶消化待测材料， 根据标准曲线测定消化液中肝素的含量。
[0056] 3、检测结果
[0057] (1)去细胞化检测结果
[0058] 结果如图1和图2所示：经过去细胞化过程使猪肝中的细胞成分得到清除，但细胞 外基质成分得到保留（图1);从未去细胞化猪肝（1、3、5、7、9和11泳道）和去细胞化猪肝 支架（2、4、6、8、10和12泳道）样品中提取DNA后经过聚合酶链式反应扩增出的猪特异性 DNA片段电泳结果（图2)。
[0059] 实验结果证明，本发明得到的去细胞化肝脏生物支架中无 DNA残留。
[0060] (2)本发明具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架的表面形态检测结果
[0061] 结果如图3所示：
[0062] 与未修饰的去细胞化肝脏生物支架相比，本发明抗凝修饰后的去细胞化肝脏生物 支架能够被甲苯胺蓝染成蓝色，说明经过本发明抗凝修饰过程后，肝素大量且均匀地分布 于支架材料表面（详见图3A、C)。
[0063] 与未修饰的去细胞化肝脏生物支架相比，本发明抗凝修饰后的去细胞化肝脏生物 支架然保留了细胞外基质疏松多孔的结构（详见图3B、D)。
[0064] 实验结果说明，本发明抗凝修饰方法既可以使得去细胞化肝脏生物支架表面均匀 肝素化，又不会改变其本身的多孔结构。
[0065] (3)本发明具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架的肝素均匀分布检测结果
[0066] 结果如图4和下表1所示：
[0067] 表1不同部位的肝素含量（μ g/mg组织干重）
【主权项】
1. 一种具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架的制备方法，其特征在于：它包括如 下步骤： (a) 取去细胞化肝脏生物支架，用含有肝素和/或肝素盐的溶液灌注，灌注的速度是 80-150mL/min，灌注的时间是5-12小时； (b) 灭菌，即可。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤a)中，所述去细胞化肝脏生物 支架是用1%TritonX-IOO溶液和1%SDS溶液去细胞化处理得到的去细胞化肝脏生物支 架。
3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述去细胞化肝脏生物支架按照如 下方法制备： 取离体肝脏，用1 %的TritonX-100溶液以200mL/min流速灌注3h，再用1 %SDS溶液 以200mL/min流速灌注6h，最后用1 %TritonX-100溶液和去离子水灌洗去除残留SDS，获 得去细胞化猪肝脏生物支架。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（a)中，所述含有肝素和/或肝 素盐的溶液中，肝素或肝素钠的浓度为1-3. 3g/L。
5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述含有肝素和/或肝素盐的溶液 中，肝素或肝素钠的浓度为3. 3g/L。
6. 根据权利要求1、3或4所述的制备方法，其特征在于：所述含有肝素和/或肝素盐 的溶液中还含有亚硝酸钠、NaBH3CN和NaCl，它们的浓度依次为亚硝酸钠33mg/L、NaBH3CN 10mg/L、NaCl0.15mol/L。
7. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（a)中，所述灌注为循环灌注。
8. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（a)中，所述灌注的速度为 100mL/min，灌注的时间为5-8小时。
9. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述灌注的速度为100mL/min，灌注 的时间为6小时。
10. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（a)中，灌注时，环境温度为室 温。
11. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（b)中，所述灭菌采用含有抗 生素的PBS溶液灌注，所述抗生素为青霉素/链霉素。
12. 根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于：所述灌注的速度为100_300mL/ min，灌注的时间为6-24小时。
13. 根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于：所述灌注的速度为200mL/min，灌 注的时间为6小时。
14. 根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于：所述含有抗生素的PBS溶液是 含有青霉素/链霉素的PBS溶液，其中，青霉素的终效价为100U/mL，链霉素的终浓度为 100yg/mL。
15. 权利要求1-14任意一项方法制备的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架。
【专利摘要】本发明提供了一种具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架的制备方法，它包括如下步骤：(a)取去细胞化肝脏生物支架，用含有肝素和/或肝素盐的溶液灌注，灌注的速度是80-150mL/min，灌注的时间是5-12小时；(b)灭菌，即可。本发明还提供了上述方法制备得到的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架。本发明制备得到的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架抗凝血性能强、细胞相容性好，对种植于其上的细胞的生存、分化和增殖等起到了极为重要的支撑作用，为构建具有临床应用价值的异源性组织工程化生物抗凝支架提供了一种方便廉价的来源和制备方法。
【IPC分类】A61L33-10, A61L27-36
【公开号】CN104841017
【申请号】CN201510283871
【发明人】包骥, 步宏, 王宇嘉, 吴琼
【申请人】四川大学华西医院
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月28日