人乳头瘤病毒感染相关癌症的治疗用组合物的制作方法
【专利说明】人乳头瘤病毒感染相关癌症的治疗用组合物 【技术领域】
[0001] 本申请基于申请号为KR10-2012-0084820、申请日为2012/08/02的韩国专利申请 来要求优先权，其全部内容在此引入本申请作为参考。
[0002] 本发明涉及包括宫颈癌在内的人乳头瘤病毒感染相关疾病的基因治疗用组合物。 【【背景技术】】
[0003] 高危型（High-risk)人乳头瘤病毒（Human Papilloma Virus :以下称为 HPV) I6型、人乳头瘤病毒18型是引起宫颈癌及宫颈非典型增生的主要因素，也是引起生殖器癌和 头颈部鳞状细胞癌的原因。宫颈癌是女性恶性肿瘤中最为普通的类型之一。虽然浸润性宫 颈癌的发病率正在逐渐减少，但作为在发展中国家的所有女性人群中最频繁发病的癌症， 占女性癌症的25%。人乳头瘤病毒为具有约8000个碱基序列的引起良性、恶性肿瘤的小的 脱氧核糖核酸（DNA)病毒。目前为止，根据基因组的差异，确认了 100多个以上的人乳头瘤 病毒亚型，并完全分析了约90个左右的人乳头瘤病毒的基因型。在这种类型中，几乎90% 的宫颈癌与高危型人乳头瘤病毒（例如，人乳头瘤病毒16型、人乳头瘤病毒18型、人乳头 瘤病毒31型、人乳头瘤病毒33型、人乳头瘤病毒35型、人乳头瘤病毒45型、人乳头瘤病毒 51型、人乳头瘤病毒52型、人乳头瘤病毒56型）有关。50%以上的感染了人乳头瘤病毒 的宫颈癌与人乳头瘤病毒16型有关，之后与人乳头瘤病毒18型（12% )、人乳头瘤病毒45 型（8% )、人乳头瘤病毒31型（5% )有关。这种人乳头瘤病毒将2个致癌（oncogenic) 蛋白E6和E7编码化。这些蛋白质均与由人乳头瘤病毒介导的细胞无限增殖化及细胞转化 有关。致癌性E6蛋白与野生型的p53肿瘤抑制蛋白相结合来通过泛素途径分解p53。另 一方面，E7蛋白直接与Rb相结合来进行过度磷酸化。首先，E6与作为E3泛素蛋白连接酶 (ubi quit in-protein ligase)的 E6 相关蛋白（E6-AP，E6_associated protein)形成复合 体。之后，E6/E6-AP复合体与野生型的p53相结合来进行泛素化，从而妨碍由对DNA损伤 的P53介导的细胞的反应。虽然主要借助由Mdm2介导的泛素化来调节p53肿瘤抑制蛋白， 但在感染人乳头瘤病毒的宫颈癌细胞中，p53的分解在Mdm2中完全被由E6介导的泛素化 所代替。因此，与其他很多癌症不同，感染人乳头瘤病毒的宫颈癌几乎具有野生型的P53基 因。但是，一贯被E6蛋白分解，因而p53蛋白的表达水平非常低。尤其，人乳头瘤病毒E6 蛋白为只能够杀死宫颈癌细胞的特定靶，因而相当受瞩目。将E6或E6/E6-AP复合体作为 靶的这种战略包括多种治疗方法。
[0004] 有细胞毒素药物的使用、放出病毒的E6致癌蛋白的锌的抑制剂、模拟E6-AP的模 拟表位（mimotope)、抗E6核酶、将病毒的E6致癌蛋白作为靶的肽适体、将病毒的E6致癌基 因作为靶的小干扰核糖核酸（RNA)以及它们的并用处理等。最近，证明了小干扰核糖核酸 不仅可在动物细胞中选择性地使内部基因沉默，还可在由病毒引起的疾病中选择性地使病 毒的基因沉默。由小干扰核糖核酸的转染引起的核糖核酸干扰（RNAi)成为了用于治疗人 类的病毒感染的新的治疗方法。在感染人乳头瘤病毒的宫颈癌细胞中，将E6和E7的基因 作为祀的小干扰核糖核酸引起p53和pRb的积累，导致细胞凋亡（apoptosis)或细胞衰老。 证实了在感染人乳头瘤病毒16型的宫颈癌细胞株和感染人乳头瘤病毒18型的宫颈癌细胞 株的情况下，将病毒的E6及E7癌基因作为靶的核糖核酸干扰选择性地使这些蛋白的表达 沉默。
[0005] 另一方面，具有对多种核酸的变形（例如，碱基、糖和/或磷酸盐）的核酸的、 基于血清核糖核酸酶的分解被抑制，因而可增加功效。在本领域中，众所周知的有记 述可作为核酸导入的糖、碱基及磷酸盐变形的几种例。例如，使寡核苷酸以借助基于 核酸酶耐药组的变形，如2' -氨基、2' -C-烯丙基、2' -氟基、2' -0-甲基、2' -H核苷 酸碱基变形来增大稳定性和/或生物学活性的方式变形（参照Eckstein et al.，PCT 公开公报 WO 92/07065 ;文献[Perrault et al. ,Nature 344:565-568, 1990];文献 [Pieken et al. , Science 253:314-317,1991];文献[Usman and Cedergren, Trends in Biochem.Sci. 17:334-339, 1992] ;Usman et al. PCT 公开公报 TO 93/15187 ;Sproat, 美国专利第 5334711 号及文献[Beigelman et al. , J. Biol. Chem. , 270:25702, 1995]; Beigelman et al·, PCT 公开公报WO 97/26270 ;Beigelman et al·,美国专利第 5716824 号；Usman et al.,美国专利第 5627053 号；Woolf et al. ,PCT 公开公报 WO 98/13526 Jhompson et al.,美国专利申请第 60/082404 号（1998 年 4 月 20 日申 请）；文献[Karpeisky et al·, Tetrahedron Lett·,39: ΙΟΙ, I"8];文献[Earnshaw and Gait, Biopolymers(Nucleic acid Sciences)48:39-55, 1998];文献[Verma and Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 67:99-134, 1998];以及文献[Burlina et al.,Bioorg. Med. Chem. 5:1999-2010, 1997])。可将类似的变形用于使本发明的核酸变形。
[0006] 1999年，并用处理了基于顺铂（Cisplatin)的化疗和放射治疗，其结果，明显改善 了局部患有重度宫颈癌的女性的生存率。当前，顺铂为广泛用于治疗包括卵巢癌、子宫颈 癌、头颈癌、非小细胞肺癌等的癌症的DNA损伤药物。最近，调查出基于钼（Platinum)的药 剂的作用机制。但是，尚未完全理解包括在细胞上基于顺铂治疗的药物的吸收及排出的调 节、DNA损伤的信号化、细胞周期的追踪、DNA修复及细胞死亡的过程。在人乳头瘤病毒18 型海拉（HeLa)细胞中，在顺铂治疗后，p53蛋白从由E6介导的分解中脱离，并优先积累于核 仁。并且，在人乳头瘤病毒16型SiHa细胞中，借助同时放射疗法和顺铂治疗来恢复了 p53 功能，从而增加了放射线感受性。
[0007] 因此，本发明人努力探索能够使对E6/E7特异性的小干扰核糖核酸发生化学变形 来表现单独或复合组合的抗癌效果，或者当与现有的化学疗法或放射疗法并用执行时，能 够表现协同效应的有效的新序列的小干扰核糖核酸，其结果，确认了在以下实施例及发明 要求保护范围中所罗列的核苷酸及它们的特定组合减少作为相关蛋白的TP53及E7的表达 和人乳头瘤病毒E6信使核糖核酸（mRNA)，并诱导细胞的死亡，通过实验证明了在单独或与 抗癌剂并用给药方面，功效更优于碱基序列残基无变形的核糖核酸。
[0008] 本说明书全文中，参照了多篇论文及专利文献，并表示了其引用。所引用的论文及 专利文献的公开内容全部插入于本说明书作为参照，从而更加明确说明本发明所属的技术 领域的水平及本发明的内容。 【
【发明内容】
】
[0009] 【发明要解决的技术课题】
[0010] 本发明人为了开发对由人乳头瘤病毒感染引起的多种疾病的有效的基因治疗剂 而锐意研宄努力。其结果发现了在利用将人乳头瘤病毒16型或人乳头瘤病毒18型病毒的 E6/E7基因作为靶的表达抑制用特定核糖核酸或它们的碱基变形的核糖核酸序列的情况 下，可有效抑制人乳头瘤病毒的基因表达，对包括宫颈癌在内的人乳头瘤病毒感染相关疾 病表现出优秀的治疗活性，从而完成了本发明。
[0011] 因此，本发明的目的在于，提供人乳头瘤病毒（HPV，human papilloma virus)感染 相关疾病，具体地人乳头瘤病毒感染相关癌症，更具体地宫颈癌（cervical cancer)的预防 或治疗用组合物。
[0012] 本发明的另一目的在于，提供人乳头瘤病毒（HPV，human papilloma virus)感染 相关疾病，具体地人乳头瘤病毒感染相关癌症，更具体地宫颈癌（cervical cancer)的预防 或治疗方法。
[0013] 以下发明的详细说明、发明要求保护范围及附图，将更加明确本发明的其他目的 及优点。
[0014] 【解决课题的技术方案】
[0015] 根据本发明的一实施方式，本发明提供人乳头瘤病毒（HPV，human papilloma virus)感染相关疾病的预防或治疗用组合物，上述人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治 疗用组合物包含选自由序列表中序列16、序列22、序列28、序列34、序列40、序列66、序列 72、序列84、序列90、序列108及它们的反义核苷酸序列组成的组中的一种以上的核苷酸序 列作为有效成分。
[0016] 本发明人为了开发对由人乳头瘤病毒感染引起的多种疾病的有效的基因治疗剂 而锐意研宄努力。其结果发现了在利用将人乳头瘤病毒16型或人乳头瘤病毒18型病毒的 E6/E7基因作为靶的表达抑制用特定核糖核酸或它们的碱基变形的核糖核酸序列的情况 下，可有效抑制人乳头瘤病毒的基因表达，对包括宫颈癌在内的人乳头瘤病毒感染相关疾 病表现出优秀的治疗活性。
[0017] 根据本发明，序列表中序列16、序列22、序列28、序列34及序列40将人乳头瘤病 毒16型病毒作为靶，序列表中序列72、序列84、序列90及序列108为将人乳头瘤病毒16 型病毒作为靶的表达抑制用核糖核酸序列。
[0018] 在本说明书中，术语"核苷酸"意味着以单链或双链形态存在的核 糖核苷酸，只要不以其他特殊的方式提及，那么就包含天然核苷酸的类似物 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980) ;Uhlman 及 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990))〇
[0019] 在本说明书中，术语"表达抑制"意味着引起靶基因的功能下降，优选地，意味着由 此靶基因的表达无法被检测到或以无意义的水平存在。
[0020] 根据本发明的优选实例，本发明的核苷酸序列为具有对人乳头瘤病毒18型病毒 或人乳头瘤病毒16型病毒的E6/E7基因的基因沉默（silencing)能力的核糖核酸序列，更 优选为小干扰核糖核酸、短发夹核糖核酸、微小核糖核酸（miRNA)或反义寡核苷酸。
[0021] 在本说明书中，术语"小干扰核糖核酸"意味着可通过特定信使核糖核酸的裂解 (cleavage)诱导核糖核酸干扰（RNAi，RNA interference)现象的短的双链核糖核酸。小 干扰核糖核酸由具有与靶基因的信使核糖核酸同源的序列的正义核糖核酸和具有与其互 补的序列的反义核糖核酸链构成。小干扰核糖核酸可抑制靶基因的表达，因而提供为有效 的基因敲减方法或基因治疗（gene therapy)方法。
[0022] 小干扰核糖核酸并不局限于核糖核酸之间成对的双链核糖核酸部分完全成对，而 是可包括借助错配（对应的碱基不互补）、凸起（没有与一侧链相对应的碱基）等不成对的 部分。总长为10至100个碱基，优选为15至80个碱基，最优选为17至23个碱基。只要 可借助核糖核酸干扰效果来抑制革G基因的表达，钝性（blunt)末端或粘性（cohesive)末端 均可成为小干扰核糖核酸末端结构。粘性末端结构均可为3末端突出的结构和5末端侧突 出的结构。突出的碱基数并不受限制。例如，碱基数可以为1至8个碱基，优选为2至6个 碱基。并且，小干扰核糖核酸在可维持靶基因的表达抑制效果的范围内，例如可在一侧末端 的突出部分包含低分子核糖核酸（例如，转运核糖核酸（tRNA)、核糖体核糖核酸（rRNA)、病 毒核糖核酸等的天然核糖核酸分子或人工核糖核酸分子）。小干扰核糖核酸末端结构无需 两侧均具有裂解结构，也可以为双链核糖核酸的一侧的末端部位借助连接核糖核酸相连接 的茎环型结构。作为连接核糖核酸的长度，只要不妨碍茎部分成对，就不受特殊限制。
[0023] 在本说明书中，术语"