Cart19用于耗减正常b细胞以诱导耐受的用图
【专利说明】CART19用于耗减正常B细胞以诱导耐受的用途
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2012年7月13日提交的美国临时申请号61/671，508的优先权，其内容通过引用整体并入于此。
[0003]发明背景
[0004]使用基因转移技术，T细胞可被遗传改造以在其表面稳定表达赋予独立于主要组织相容性复合物(MHC)的新的抗原特异性的抗体结合域。嵌合抗原受体(CAR)是此方法的应用，该方法将特异性抗体的抗原识别域与CD3-Z链或FcgRI蛋白的胞内域组合成单个嵌合蛋白(格罗斯(Gross)等人，1989《美国科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.)86:10024 - 10028 ;欧文(Irving)等人，1991《细胞》(Cell)64:891 - 901)。目前正在多个学院的医学中心进行测试CAR的临床试验(科恩(Kohn)等人，2011《分子疗法》(Mol.Ther.) 19:432 - 438;耶拿(Jena)等人，2010《血液》(Blood) 116:1035 - 1044)。在大部分癌症中，尚未明确限定肿瘤特异性抗原，但在B细胞恶性肿瘤中，CD19是一种有吸引力的肿瘤靶标。CD19的表达限制于正常的和恶性的B细胞(Uckun等人，1988《血液》(Blood) 71:13 - 29)，CD19是一种广泛认可的用于安全地测试CAR的靶标。尽管CAR能以一种类似于内源T细胞受体的方式引发T细胞活化，到目前为止这种技术的临床应用的主要障碍是CAR+T细胞有限的体内扩增、注射后细胞快速消失和令人失望的临床活性(耶拿(Jena)等人，2010《血液》(Blood) 116:1035 - 1044 ;萨德兰(Sadelain)等人，2009《免疫学新见》(Curr.0pin.1mmunol.)21:215 - 223)。
[0005]CAR介导的T细胞应答可通过增加共刺激域进一步增强。在临床前模型中，发现加入⑶137(4-1BB)信号传导域比只加入⑶3-z链显著增加CAR的抗肿瘤活性和体内留存(米洛内(Milone)等人，2009《分子疗法》(Mol.Ther.) 17，1453 - 1464 ;卡本托尼(Carpenito)等人，2009《美国科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.) 106:3360-3365)。为评估经基因改造以表达此类CAR的T细胞的继承性转移的安全性和可行性，进行了使用多个表达同时包含⑶3-z和4-1BB共刺激域的抗⑶19CAR的自体T细胞(CART19细胞)靶向⑶19+恶性肿瘤的试验性临床试验。三位患者按此方案被治疗。来自这些患者之一的部分发现在(波特(Porter)等人，2011《新英格兰医学杂志》(N.Engl.J.Med.) 365:8)中得以描述，后者报道了此治疗导致肿瘤消退、CART19细胞存留以及延迟性肿瘤细胞溶解综合征的意外出现。也观察到，在被治疗的全部三位患者中，CART19细胞介导了有效的临床抗肿瘤效果。平均每个注射的CAR T细胞和/或其后代在罹患晚期化疗抵抗性慢性淋巴细胞白血病(CLL)的患者体内消除了超过1000个白血病细胞。CART19细胞经历健壮的体内T细胞增殖，在血液和骨髓(BM)中以高水平维持至少6个月，在具有记忆表型的细胞上持续表达功能受体，并维持体内抗CD19效应子功能。然而，仍然不清楚CART19细胞如何避开人宿主的排斥，鉴于CAR19构建物包含鼠序列(抗体决定簇)和CAR19构建物的不同组分之间独特的连接片段。
[0006]因此，本领域仍存在关于CART19细胞的长期留存和这些细胞为何不被人宿主排斥的机制的需求。本发明解决了这种需求。
[0007]发明概述
[0008]本发明提供了一种耗减受试者中B细胞的方法。在实施方式中，该方法包括向受试者给予有效量的经遗传改造以表达CAR的细胞，其中该CAR包含抗原结合域、共刺激信号传导区和CD3 ζ信号传导域，其中该抗原结合域靶向B细胞表面标志物，从而耗减受试者中的B细胞。
[0009]本发明提供了一种促进受试者中耐受的方法。在一个实施方式中，该方法包括向受试者给予有效量的经遗传改造以表达CAR的细胞，其中该CAR包含抗原结合域、共刺激信号传导区和CD3 ζ信号传导域，其中该抗原结合域靶向B细胞表面标志物，从而促进受试者中的耐受。
[0010]在一个实施方式中，该耐受是对移植的组织的移植耐受。
[0011]在一个实施方式中，该经遗传改造的细胞耗减B细胞。
[0012]在一个实施方式中，该经遗传改造的细胞与该移植的组织同时给予。
[0013]在一个实施方式中，该经遗传改造的细胞在该移植的组织给予前给予。
[0014]在一个实施方式中，该经遗传改造的细胞在移植的组织给予后给予。
[0015]本发明提供一种治疗移植物抗宿主病(GVHD)的方法。在一个实施方式中，该方法包括向需要的受试者给予经遗传改造以表达CAR的细胞，其中该CAR包含抗原结合域、共刺激信号传导区和CD3 ζ信号传导域，其中该抗原结合域靶向B细胞表面标志物，从而治疗受试者中的GVHD。
[0016]在一个实施方式中，该经遗传改造的细胞耗减B细胞。
[0017]在一个实施方式中，该经遗传改造的细胞与移植的组织同时给予。
[0018]在一个实施方式中，该经遗传改造的细胞在该移植的组织给予前给予。
[0019]在一个实施方式中，该经遗传改造的细胞在该移植的组织给予后给予。
[0020]附图简述
[0021]以下本发明的优选的实施方式的详细说明在结合附图阅读时将会被更好地理解。为说明本发明的目的，在附图中说明了目前优选的实施方式。然而，应当理解，本发明不限于附图中说明的实施方式的精确安排和机构。
[0022]图1，包括图1A至图1F，是证明CART19细胞持续的体内增殖以及在血液和骨髓中留存的一系列图像。如图1A至IC所示从全血，或如图1D至IF所示从骨髓分离的DNA，如图1A和ID所示从UPN 01获得，如图1B和IE所示从UPN 02获得和如图1C和IF所示从UPN 03获得的样品进行大量Q-PCR分析，用适当的测定以检测和定量CART19序列。每个数据点代表对100-200ng基因组DNA的三次测量的平均值，其中最大％ CV小于1.56%。该测定的合格/不合格参数包括预先确定的斜率和扩展效率的范围，以及参考样品的扩增。用标准曲线范围建立的该测定的定量下限是2个拷贝转基因/微克基因组DNA;如果至少2/3的重复产生具有15%值的％ CV的Ct值，低于此数的样品值被视为估计并呈现。CART19细胞在第0、1和2天向UPN 01和UPN 03注射，在第0、1、2和11天向UPN 02注射。
[0023]图2，包括图2A至图2D，是说明体内延长的表面CART19表达和功能记忆CAR的建立的一系列图像。图2A描述了在外周和骨髓中检测到表达CAR的CD3+淋巴细胞以及B细胞不存在。用流式细胞术评估新鲜处理的在CART19细胞注射后第169天从UPN 03获得的外周血或骨髓单核细胞的CAR19(顶部)表面表达或B细胞(底部)的存在；从健康供体ND365获得的PBMC被染色作为对照。为了评估⑶3+淋巴细胞中的CAR19表达，用⑶14_PE_Cy7和⑶16-PE-Cy7 (废液通道)以及⑶3-FITC抗体共染色样品，在⑶3+阳性分门，并通过用⑶8a-PE和与Alexa-647结合的抗CAR19独特型抗体共染色评估⑶8+和⑶8-淋巴细胞区域中的CAR19表达。图中的数据是在废液通道-阴性/⑶3-阳性的细胞群体上分门的。为了评估B细胞的存在，用⑶14-APC和⑶3-FITC(废液通道)抗体共染色样品并通过用⑶20-PE和⑶19-PE-Cy-7抗体共染色评估废液通道-阴性部分中B细胞的存在。在所有情况下，阴性分门象限是用如图2B和2C所描述的非染色对照建立的。表明了 CD4+(图2B)和⑶8+(图2C) T细胞亚群的T细胞免疫表型。将在T细胞注射后第56和169天通过分离采血获得的来自UPN 03的冷冻外周血样品在没有添加因子的培养基中静置过夜，冲洗，并进行对T细胞记忆、活化和耗减的标志物表达的多参数免疫表型。如图6中所描述的分门策略包括对废液通道(⑶14、⑶16、活/死水性)-阴性和⑶3-阳性细胞的初步分门，然后对⑶4+和CD8+细胞阳性分门。门和象限是用FMO对照(CAR、CD45RA、PD-1、CD25、CD127、CCR7)或通过对阳性细胞群(⑶3、⑶4、⑶8)和明显限定的亚群(⑶27、⑶28、⑶57)分门建立的；数据在双指数变换后展示以客观呈现结果。图2D描述了留存的CAR细胞的功能活性。将在T细胞注射后第56和169天通过分离采血获得的来自UPN 03的冷冻外周血样品在没有添加因子的培养基中静置过夜，冲洗，并用CD107脱粒测定直接离体评估识别表达CD19的靶标细胞的能力。在抗⑶28、抗⑶49d和⑶107-FITC存在下温育2小时后，收集细胞混合物，冲洗并进行多参数流式细胞分析以评估CART19细胞应答表达CD19的靶标脱粒的能力。分门策略包括对废液通道(CD14-PE-Cy7、CD16-PE_Cy7、活/死水性)-阴性和CD3-PE-阳性细胞的初步分门，然后对CD8-PE-TexaS Red-阳性细胞阳性分门；展示的数据用于CD8+分门的细胞群。在所有情况下，阴性分门象限是用非染色对照建立的。
[0024]图3，包括图3A至3C，是说明评估注射CART19细胞后临床应答的实验结果的一系列图像。图3A说明UPN 02用两轮利妥昔单抗和苯达莫司汀以最小应答治疗(R/B，箭头)。在只给予苯达莫司汀(B，箭头)后的前4天注射CART19细胞。如绝对淋巴细胞计数(ALC)在注射18天内从60，600/ μ I至200/ μ I的下降所指示，利妥昔单抗和苯达莫司汀抗性白血病被迅速从血液中清除。由于不适和非感染性发热综合征，在注射后第18天开始皮质类固醇治疗。参考线(虚线)指示ALC的正常上限。图3Β说明了对来自患者UPN 01和03的连续骨髓活体检查或凝块样品染色的CD20的示例实验的结果。在两个患者中都存在的白血病预处理渗透在治疗后的样品中消失，伴随细胞构成和三系造血的正常化。在UPN 01的骨髓或血液中不具有任何由流式细胞术、细胞遗传学以及荧光原位杂交评估而检测到的CLL细胞，或者任何由流式细胞术检测到的正常B细胞。在第+23天，UPN 03具有5%残留的正常由流式细胞术确定的CD5-阴性B细胞，也显示这些细胞是多克隆的；在第+176天未检测到正常的B细胞。图3C说明了使用连续CT成像以评估化疗抗性全身性淋巴结病的快速消退的实验结果。双侧腋肿块在注射后83天(UPN 01)和31天(UPN 03)消退，如箭头和圆圈所指不。
[0025]图4，包括图4Α至4C，是说明UPN 01、02、03的绝对淋巴细胞计数和循环的总CART19+细胞的一系列图像。对全部三位患者的淋巴细胞总数(总正常和CLL细胞)针对循环的总CART19+细胞画图，使用来自CBC值的绝对淋巴细胞计数，假设血液体积为5.0L。循环的CART19细胞总数是用串联CBC值和如图1中所描述的绝对淋巴细胞计数和Q-PCR标志值计算的，如本文其他部分所描述，将拷贝数/ μ g DNA转化为平均％标志。发现Q-PCR%标志与注射产品的流式细胞特征以及与来自可获得伴随的流式细胞术数据以用染色直接计数CART19细胞的样品的数据密切相关(〈2倍变异)。
[0026]图5，包括图5A至是说明涉及在T细胞注射后71天直接离体检测UPN-OIPMBC中CART19-阳性细胞的实验的一系列图像。将在注射后第71天新鲜分离采血收集的，或在为制备T细胞产品(基线)分离采血时冷冻的并在染色前可活地融化的UPN-OIPBMC进行流式细胞分析以检测在表面表达CAR19分子的CART19细胞的存在。为评估淋巴细胞中CAR19的表达，样品用⑶3-PE和与Alexa-647结合的抗CAR19独特型抗体共染色，或只用⑶3-PE单独共染色(FM0代表CAR19)。图5A说明了基于前向和侧向散射(FSC vs.SSC)建立的初始淋巴细胞分门，然后对CD3+细胞分门。图5B说明了 CD3+淋巴细胞分门；图5C说明了CAR独特型染色；图说明了 CAR独特型FMO。CAR19-阳性分门是在CAR19 FMO样品上建立的。
[0027]图6，包括图6A至6C，是说明了用多色流式细胞术在UPN 03血液样品中识别CART19表达的分门策略的一系列图像。图6C的分门策略用于展示UPN 03第56天样品，代表了用在UPN 03第169天样品的策略。图6A说明了初级分门:废液(⑶14、⑶1