Actl6a基因在制备治疗肝癌或术后预防肝癌复发药物中的应用
【技术领域】
[000。 本发明设及肝癌治疗领域，特别地，设及一种ACTL6A基因在制备治疗肝癌或术后 预防肝癌复发药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 肝细胞癌化巧atocelluarCarcinoma,肥C)是一种严重威胁人类生命健康的常 见疾病，全世界每年约有超过700, 000人死于肥C，而中国每年新发病例约占全球总数的一 半。近年来随着诊断方法、手术技术和综合治疗手段的进步，为HCC的诊治提供了更多的选 择，使肥C的疗效得到了一定的提高。然而肥C是一种具有高度恶性生物学行为的肿瘤，极 易在早期发生侵袭、转移，大部分患者就诊时已到中晚期，失去了根治该疾病的机会，导致 总生存率仍不乐观，术后5年生存率徘徊在30%左右。因此有效控制肥C的侵袭和转移是 改善HCC患者治疗效果及获得长期生存的根本办法。
[0003] 近年来许多研究发现上皮性肿瘤细胞在侵袭转移过程中往往呈现出上皮细胞 表型丧失现象，从而使其获得间充质细胞表型的特点，该一现象称之为上皮-间质转变 巧pithelial-mesenchymaltransition,EMT)，EMT密切参与多种常见上皮性肿瘤的发生 发展。如最近研究通过微流体捕获技术发现乳腺癌患者血液中的癌细胞向间充质细胞表 型转变时，则提示复发、转移、治疗抵抗等现象发生。当癌细胞向上皮细胞表型转变（MET) 时，患者治疗转归逐渐好转，该一研究为EMT在肿瘤侵袭转移中所起作用提供了重要证据。 深入研究后发现，肿瘤侵袭转移级联反应的各步骤中均有EMT的参与，肿瘤细胞通过连续 的EMT-MET过程进行侵袭转移并最终在远处脏器形成新的转移灶。因此寻找能调控EMT与 HCC侵袭转移级联反应的基因，并根据其设计相应的祀向治疗药物，将为控制HCC的转移提 供有效的生物学治疗手段。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种ACTL6A基因在制备治疗肝癌或术后预防肝癌复发药物中的应 用，W解决现有技术中对于肝癌患者术后肝癌细胞容易在人体内侵袭转移导致癌细胞扩散 的技术问题。
[0005] 根据本发明的一个方面，提供了一种ACTL6A基因在治疗肝癌和抑制肝癌术后癌 细胞侵袭转移的药物中的应用。
[0006] 进一步地，应用包括在慢病毒载体中敲除带有ACTL6A基因质粒的给药方式。
[0007] 进一步地，应用包括W电荷翻转载体为载体对肝癌肿瘤细胞核祀向给药的应用。
[0008] 进一步地，ACTL6A基因序列为序列表中a)~C)中的一种基因；a)序列表中SEQ IDNO. 1所示的基因序列；b)序列表中SEQIDNO. 2所示的基因序列；C)序列表中SEQID NO. 3所示的基因序列。
[0009] 进一步地，ACTL6A基因序列为序列表中SEQIDNO. 3所示的基因序列。
[0010] 根据本发明的另一方面还提供了一种药物组合物，包含敲除了表达ACTL6A基因 的慢病毒载体。
[0011] 根据本发明的另一方面还提供了一种药物组合物，ACTL6A基因与递送载体相连接 后用于药物组合物中。
[0012] 进一步地，载体为电荷翻转型药物载体。
[0013] 本发明具有W下有益效果：
[0014] 1.本发明提供通过实验发现ACTL6A基因编码的相应蛋白，在细胞核内存在高表 达时，患者术后癌症复发几率增高。通过已知各种给药方式，实现对ACTL6A基因编码的相 应蛋白的表达抑制，从而达到有效防止肝癌细胞术后在人体内的EMT作用，降低肝癌细胞 在体内的转移机会，从而提局患者术后的生存质量。
[0015] 2.本发明提供的ACTL6A基因的应用包括对肝癌的治疗或肝癌术后预防癌细胞在 人体内转移侵袭其他组织中的药物应用。
[0016] 3.本发明通过研究首次证实名为ACTL6A的基因在肝癌组织的核蛋白中存在高表 达，利用该基因的该一特性，可W用于制备检测潜在肝癌患者的试剂盒。
[0017] 除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。 下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
【附图说明】
[0018] 构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实 施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0019] 图1为ACTL6A基因在肝癌细胞和肝组织中的表达相关结果图；
[0020] 图2为ACTL6A高表达与肥C患者不良预后明显相关结果图；
[0021] 图3为细胞慢病毒转染效率验证相关结果图；
[0022] 图4为ACTL6A过表达/敲除效能验证相关结果图；
[0023] 图5为ACTL6A可在体外促进肝癌细胞的运动、侵袭和转移能力的相关结果图；
[0024] 图6为ACTL6A可在体内促进肝细胞癌生长及侵袭转移的相关结果图；
[00巧]图7为慢病毒转染敲除ACTL6A的质粒可抑制肝癌皮下瘤生长的相关结果图；W及
[0026] 图8为敲除ACTL6A可抑制肝癌原位瘤生长及侵袭转移的相关结果图。
【具体实施方式】
[0027]W下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可W由权利要求限定 和覆盖的多种不同方式实施。
[0028] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0029] 本文中设及到的百分号"％ "，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比， 除另有规定外，是指溶液100ml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20°C时容量 的比例。
[0030] 本发明一方面提供了一种ACTL6A基因在治疗肝癌和抑制肝癌术后癌细胞侵袭转 移的药物中的应用。
[0031]Actin-l;Lke6A(ACTL6A)是一种编码肌动蛋白相关蛋白（actin-related proteins，ARPs)的基因，基因定位于染色体3q26. 33。在哺乳动物中，ACTL6A主要具有调 节转录、胞核转移、染色质重构等重要功能。最新研究发现ACTL6A具有许多独特的特点，其 高表达能诱导上皮性细胞发生EMT并促进迁移、增殖，因此可能参与肿瘤的发生发展。我们 前期研究亦证实ACTL6A可能在肥C复发转移中发挥重要作用，针对ACTL6A设计抑制药物 将能很好的抑制肝癌的侵袭和转移。
[0032]肝癌细胞系（PLC/PRF5,SMMC7721，HepG2,Hep3B，Huh7,M肥C97-L]fflCC97-H， 肥化M3)上述是肝癌研究常用的肝癌细胞系名称，其中PLC/PRF5,化pG2,化p3B来源于美国 模式培养物保藏所，SMMC7721，Huh7,M肥C97-L]fflCC97-H，肥化M3来源于复旦大学肝癌研 究所。
[003引 ACTL6A基因的功能通过W下实验进行了验证：
[0034] 1.肝癌标本及临床资料收集
[00巧]随机捜集2006年1月至2009年12月间在湘雅医院手术切除，术后病理证实为肝 细胞癌，病例资料和随访资料及标本完整的病例100例。其中取小肝癌、孤立性大肝癌和结 节性肝癌冰冻标本各10例。肝癌组织切除后，立即切取黄豆粒大小的肝癌组织（T)和距离 肿瘤边缘1cm的邻近非肿瘤肝组织（ANLT)，将组织置于无菌离屯、管中，并立即于液氮中冻 存，然后转移至-80°C超低温冰箱（型号化ermo化rma905)。另切除带有癌旁肝组织的肝 癌标本，将之放入5%的福尔马林溶液中固定，再将肝癌组织标本依次置于50%己醇溶液、 75%己醇溶液、95%己醇溶液和无水己醇中各5分钟，进行梯度脱水后置于二甲苯中使肝 癌标本透明，将透明后的肝癌组织标本放入融化的石蜡中浸透。在包埋器中倒入融化的石 蜡，在石蜡凝固之前迅速将组织标本放入其中。石蜡凝固后将其切割成1cm3的方块。用切 片机切取4um的连续切片，用于免疫组织化学实验。
[0036] 详细收集上述100例患者的各项临床病理资料、手术资料及术后随访资料，如患 者性别、年龄、合并疾病、肝炎病史、有无肝硬化、肝功能化ild-化曲分级、凝血功能、血清 甲胎蛋白、肿瘤位置、手术方式、手术时间、止血方式、术中出血及输血量、术后并发症、围手 术期死亡、切除标本大小、肿块数目、有无包膜、血管浸润、病理类型、细胞分化程度及肿瘤 临床分期等。术后通过口诊复查、电话或面对面沟通的方式定期（前2年每3-6个月随访 1次，2年后每年随访1次）进行临床随访，建立完善的随访数据库。肝癌病人术后是否发 生复发转移则依据肝脏超声检查、CT、MRI、血清甲胎蛋白含量W及再次手术等方法确定。若 病人在此时间内发生死亡或者复发转移则作为随访的终止点；若患者未因肝癌死亡或者未 出现复发转移或因其他原因死亡者则作为删失数据。患者的生存时间为患者手术之日到患 者死亡的时间。患者的无瘤生存时间为患者手术之日起到出现复发转移的时间。
[0037] 2.巧光实时定量PCR与半定量RT-PCR
[0038] 细胞和新鲜冰冻组织RNA提取、测定及cDNA合成详见CelanoP等Celano P,VertinoPM,Casero民A Jr. Isolation of polyadenylated RNA from cultured cells and intact tissues. Biotechniques. 1993Jul ; 15 (1) : 26-8和Yang,L.Y.等Yang LY, Tao YM,Ou DP,et al. Increased expression of Wiskott-Aldrich syndrome protein family verprolin-homologous protein 2correlated with poor prognosis of h邱atocellular carcinoma. Clin Cancer Res, 2006, 12:5673-5679.中公开的方法进行。
[0039] 实时定量PCR引物由上海生工生物技术公司设计并合成，引物的特异性和匹配性 经NCBI的Primer-BLAST验证。ACTL6A的正向引物序列为；5 '-GGTCGTTCTACTGGGCTGATT-3 '，ACTL6A的反向引物序列为；5' -AGCAAGAGGGGATTTCACAAT-3'，产物的大小为108bp。同 时应用人GAPDH(甘油醒-3磯