输送到 细胞核中。优选采用上述两种方法给药。采用上述两种方法给药可W提高受体对药物的敏 感性，保证疗效。尤其优选为经电荷翻转型药物载体将药物输送到细胞核中。由于该给药方 法为将该基因直接携带至细胞核中ACTL6A基因处给药，药效持久可W避免耐药性的发生。
[0102] 本发明另一方面还提供了一种药物组合物，该药物组合物主要作用为通过向癌细 胞核给药，从而抑制由ACTL6A基因编码的相应蛋白的表达量。该药物的给药方式并不限于 W下两种，也可W为其他能实现输送作用的给药方式。优选该药物组合物中包含敲除了表 达ACTL6A基因的慢病毒载体。
[0103] 具体给药方式说明如下：
[0104] 1.慢病毒shRNA敲除ACTL6A质粒载体尾静脉注射给药。
[0105]载体；GV248,元件顺序；hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin，敲除序列 5'-GGGATAGTTTCCAAGCTAT-3'。SMCTL6A质粒经慢病毒转染后进入宿主细胞，在宿主细胞内 经转录翻译，抑制ACTL6A蛋白的表达，从而在体内发挥作用。该方法在最近如Ambrogio, C. 等（Lentiviral-based approach for the validation of cancer therapeutic targets in vivo. Biotechniques，2014, 57(4):179, 181-187)的研究中被采用静脉注射法进行体 内实验，获得了良好的体内治疗效果。慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒，经改造的慢 病毒作为外源基因载体，具有其独特的特点和优势。慢病毒载体可W将外源基因或外源的 ShRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方 面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、屯、肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的 细胞。使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的ShRNA的转导效率，且目的基因或目的 ShRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的 ShRNA的长期、稳定表达，从而达到良好的基因治疗效果。因慢病毒作用时间长且滴度稳定， 裸鼠成瘤一般在1-2个月W内，因此可在成瘤周期的第一周内仅注射一次即可。
[0106] 给药方法；裸鼠尾静脉注射方法；1.使用尾静脉注射架将裸鼠固定好，将尾己拉 直，綱紧；2.用酒精棉球擦拭尾己，使血管扩张，有利于注射，注射状态为尾己发白，紧靠白 色的尾骨两侧清晰可见两根红色静脉；3.用左手的食指，中指，无名指及大拇指将小鼠尾 己固定；4.注射时左手化尾，使尾己紧贴桌面，一般选择距裸鼠尾尖1/4或1/3处进针，使 用1ml膜岛素注射器注射，进针时针头与桌面平行，针尖稍稍朝下，从中指及无名指与拇指 接触处稍上方进针点针头入皮肤后马上把针头略往上，平行进针，针扎入时有落空感，推 注时无阻力则成功。
[0107] 由上可见，采用上述敲除质粒方法给药时ACTL6A基因序列为序列表中SEQ ID NO. 3所不的基因序列疗效最优。其他a)序列表中SEQ ID NO. 1所不的基因序列；b)序列 表中SEQ ID NO. 2所示的基因序列；虽然也对肝癌有疗效，但效果相较该基因序列稍微差一 些。
[010引本发明另一方面还提供了一种药物组合物，该药物组合物主要作用为通过向癌细 胞核给药，从而抑制由ACTL6A基因编码的相应蛋白的表达量。该药物的给药方式并不限于W下两种，也可W为其他能实现输送作用的给药方式。优选该药物组合物中所述SMCTL6A 与递送载体相连接后用于所述药物组合物中。
[0109] 2.经电荷翻转型药物载体给药
[0110] 阳离子聚合物如聚己締亚胺（polyet的leneimine，阳I)和聚L赖氨酸 (pol^ysine，化L)W及聚酷胺胺（PAMAM)树枝状大分子等被广泛地用来作为基因载体。实 验表明它们能够进入细胞核内，也能够将生物活性物质输送到细胞核中。然而，该些带正电 荷的聚合物会被网状内皮系统（reticuloendothelialsystem,RE巧识别而很快被清除出 血液循环系统，因此，理想的方法是对该些阳离子聚合物进行可逆修饰，使其在血液中带负 电荷，W抑制它们与正常细胞和组织的作用，而到达肿瘤组织或癌细胞内后去掉该些修饰 而再生原来的阳离子聚合物，重新获得细胞核定位的能力。实体瘤组织间液和细胞的溶酶 体呈酸性，因此可W应用肿瘤组织和细胞中的酸性环境作为信号来触发阳离子保护基团的 离去。根据癌组织内容易产生代谢性酸中毒导致肿瘤细胞内PH低于7. 4,因此有关利用 pH响应的载体输送抗癌药物已有大量的报道。该些高分子载体能够在细胞间质和溶酶体的 酸性抑刺激下将药物释放在细胞间隙或溶酶体中，但是无法将药物输送至细胞核中。駿基 酷胺基团具有在酸性条件下自催化水解的性质。因此申有青（电荷翻转型药物载体用于肿 瘤细胞核祀向药物输送的研究。高分子通报，2010,（12):22-29。）等设计了对胺基进行可 逆保护，用1，2环己二酸酢与聚己内醋-聚己締亚胺的嵌段共聚物（P化bPEI)的阳I段反 应，将阳I的胺基酷胺化为駿基酷胺，得到带负电荷的酷胺化PEI(PEI/amide)。根据该一理 论将祀向敲除SMCTL6A治疗进一步引入到阳I/amide上。在正常生理条件下，双亲性的 P化阳I/amide-sMCTL6A自组装成为带负电的纳米颗粒；在抑小于6时，駿基酷胺基团自 催化水解，重新生成胺基，使得载体带正电荷。而在肿瘤组织、内涵体或溶酶体中显正电性， 使纳米颗粒在细胞内能够成功地实现电荷翻转。根据该一研究得到了得到不同结构的駿基 酷胺化的化L使原来阳离子聚合物化L呈负电性，避免了伯胺基团带来的系统生物毒性。
[0111] 因此，DNA毒化物类抗癌药物可经静脉注射或口服吸收入血被直接输送到它们在 细胞核中的祀点周围，避开了癌细胞在细胞膜和细胞浆中多种药耐药机制，大大提高了药 物的利用度及疗效。因此，可W利用电荷翻转载体进行肿瘤细胞核祀向SMCTL6A给药。W ACTL6A-RNAi(26884-1)为祀序列，按照短发夹RNA设计原理，构建得到的ACTL6A短发夹 RNA质粒。
[0112] 实施例 [011引实施例1
[0114]将化區病毒为载体，敲除质粒中的ACTL6A后进行动物体给药过程及结果如下；
[01巧]将Ifep3B敲除ACTL6A细胞和H巧3B对照组细胞分别约5X106个/只注射到裸鼠 左腹股沟皮下组织后，所得结果列于图7A中。参见图7中的A图：裸鼠皮下成瘤实验显示 敲除ACTL6A的化p3B敲除ACTL6A细胞皮下瘤明显较对照组化p3B对照组细胞皮下成瘤体 积小。而如图7A显示，化p3B敲除ACTL6A细胞组所行成的皮下瘤体积明显小于化p3B对 照组细胞所形成的皮下瘤体积，进行体积的测量后成组比较亦得出类似结果，所得结果列 于图7B中。参见图7中的B图；统计分析两组皮下瘤大小可见化p3B敲除ACTL6A细胞皮 下瘤明显较对照组化p3B对照组细胞皮下成瘤体积小有统计学差异。
[011引实施例2
[0117]将经电荷翻转型药物载体P化阳I/amide作为载体携带SMCTL6A后进行动物体 给药后，实验过程及所得结果如下：
[0118]肝脏原位种植成瘤实验所得结果如图8中的A图和B图所示，参见图8中的A图； 肝脏原位成瘤图片显示化p3B敲除ACTL6A细胞肝脏原位成瘤体积明显较对照组化p3B对 照组细胞原位瘤体积小。参见图8中的B;两组体积差异有统计学意义。如图8A，B显示， Ifep3B敲除ACTL6A细胞组所行成的肝脏肿瘤体积明显小于化p3B对照组细胞所形成的肝脏 肿瘤。检测肝脏原位成瘤的肝内转移灶及肺转移灶情况发现，Hep3B敲除ACTL6A细胞组的 肝转移及肺转移率明显低于相应的化p3B对照组细胞组，结果参见图8中的C和D。参见 图8中的C;敲除ACTL6A的化p3B对照组细胞构建的原位瘤较化p3B敲除ACTL6A细胞易 发生肝内转移。参见图8中的D;敲除ACTL6A的化p3B对照组细胞构建的原位瘤较化p3B 敲除ACTL6A细胞易发生肺转移。
[0119] 由实施例1~2可知，通过上述两种给药方式给药后，小鼠体内的癌细胞转移受到 有效抑制，抑制肝癌原位瘤生长和转移。
[0120] W上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可W有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. ACTL6A基因在治疗肝癌和抑制肝癌术后癌细胞侵袭转移的药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括在慢病毒载体中敲除带有 所述ACTL6A基因质粒的给药方式。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括以电荷翻转载体为载体对 所述肝癌肿瘤细胞核靶向给药的应用。4. 根据权利要求1~3中任一项所述的应用，其特征在于，所述ACTL6A基因序列为序 列表中a)~c)中的一种基因： a) 序列表中SEQIDNO. 1所示的基因序列； b) 序列表中SEQIDNO. 2所示的基因序列； c) 序列表中SEQIDNO. 3所示的基因序列。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述ACTL6A基因序列为序列表中SEQID NO. 3所不的基因序列。6. -种药物组合物，其特征在于，包含敲除了表达ACTL6A基因的慢病毒载体。7. -种药物组合物，其特征在于，ACTL6A基因与递送载体相连接后用于所述药物组合 物中。8. 根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述载体为电荷翻转型药物载体。
【专利摘要】本发明提供了一种ACTL6A基因在制备治疗肝癌或术后预防肝癌复发药物中的应用，本发明提供通过实验发现ACTL6A基因编码的相应蛋白，在细胞核内存在高表达时，患者术后癌症复发几率增高。通过已知各种给药方式，实现对ACTL6A基因编码的相应蛋白的表达抑制，从而达到有效防止肝癌细胞在人体内的EMT作用，降低肝癌细胞在体内的转移机会，从而提高患者术后的生存时间和减少转移复发。
【IPC分类】A61P35/00, A61K48/00
【公开号】CN104906598
【申请号】CN201510290964
【发明人】杨连粤, 肖帅
【申请人】中南大学湘雅医院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月1日